Summary
من الصعب تشخيص حركة الديمقراطيين الاشتراكيين في غياب المعايير المورفولوجية أو سيتوجينيتيكس غير مفيدة. MFC يمكن أن تساعد في تحسين عملية التشخيص حركة الديمقراطيين الاشتراكيين. لتصبح مفيدة للممارسة السريرية، يجب أن تعتمد التحليل MFC على المعلمات مع خصوصية وحساسية كافية، وينبغي أن تكون البيانات قابل لإعادة الإنتاج بين مختلف العاملين.
Abstract
ووضعت مجموعة عمل بدأت داخل الرابطة الفرنسية الخلوي (الاتحاد الآسيوي) من أجل تنسيق تطبيق مولتيباراميتير التدفق الخلوي (MFC) لتشخيص الأمراض النقوي في فرنسا. كان البروتوكول المعروضة هنا المتفق عليها وتطبيقها بين عام 2013 في أيلول/سبتمبر وتشرين الثاني/نوفمبر عام 2015 في ستة مختبرات التشخيص الفرنسية (مستشفيات جامعة سانت إتيان، غرينوبل، كليرمون فران، نيس، وليل ومعهد Paoli-كالميتيس في مرسيليا) ويسمح بتوحيد اقتناء البيانات وإعداد عينة نخاع العظام. ووضعت ثلاث قواعد بيانات النضج العَدلات، مونوسيتيك، والأنساب محمر مع نخاع العظام من المانحين "صحية" الأفراد (الأفراد دون أي دليل على وجود مرض المكونة للدم). ينبغي أن تكون طريقة قوية للتحليل لكل النسب النقوي المطبقة للاستخدام التشخيصي الروتيني. يمكن تحليلها بنفس الطريقة الحالات الجديدة ومقارنتها بقواعد البيانات المعتادة. وهكذا، يمكن التعرف على التشوهات المظهرية الكمي والنوعي وتلك المذكورة أعلاه 2SD مقارنة مع بيانات عينات نخاع العظم الطبيعي ينبغي أن يدل على علم الأمراض. أن القيد الرئيسي هو تباين أعلى بين البيانات يتحقق باستخدام الأجسام المضادة التي تم الحصول عليها بطرق تعتمد على تقنيات هيبريدوما والمستخدمة حاليا في التشخيص السريري. وضع معايير تقنية التحقق من صحة البيانات المكتسبة قد تساعد في تحسين الأداة المساعدة من MFC لتشخيص حركة الديمقراطيين الاشتراكيين. ويتطلب إنشاء هذه المعايير التحليل مقابل قاعدة بيانات. أن الحد الذاتية المحقق في تحليل البيانات ميزة هامة لهذا الأسلوب.
Introduction
في غياب المظهرية علامات محددة للتغيرات ديسبلاستيك التي تحدث في خلايا النقوي أثناء بدء حركة الديمقراطيين الاشتراكيين، والتقدم، تم اقتراح نهج جديد في السنوات الأخيرة استناداً إلى تقييم مسارات النضج (التعبير غيرت من النقوي المستضدات خلال إنتاج خلايا ناضجة النقوي) أو التوزيع غير طبيعي لأنواع مختلفة من الخلايا داخل نخاع العظم (بي أم) خلية المقصورات1،2.
تقدم هذه المقالة طريقة جديدة لتطبيق MFC موحدة من أجل الكشف عن التغييرات ديسبلاستيك في المقصورات خلية النقوي BM تتصل myelodysplastic المتلازمات (حركة الديمقراطيين الاشتراكيين) أو غيرها من أمراض الدم النقوي. وتبين هذه الدراسة أيضا مدى فائدة استخدام قواعد بيانات النضج لتحليل البيانات MFC.
توحيد نماذج إعداد الإجراء والحصول على البيانات، والتحليل باستخدام قواعد البيانات سوف تسمح بتحديد شذوذ المظهرية الأكثر صلة تتعلق بالتغييرات ديسبلاستيك في الخلايا BM النقوي. ولذلك، مجموعات فرعية مختارة إحصائيا استناداً إلى صيغ المسمى جيدا والمعترف بها جيدا (فاصل السكان تلقائي (الجزائرية) مخططات ورسوم بيانية ومؤامرات دوت) مطلوبة من أجل وضع استراتيجية تحليل التي يمكن استخدامها في التحليل اللاحق جولات. اكتشاف تشوهات المظهرية قوية في حركة الديمقراطيين الاشتراكيين سيخفف التشخيص في الحالات مع أو دون الحد الأدنى من خلل التنسج المورفولوجية ودون أبرانسيس الخلوية الوراثية. يمكن تبسيط تحديد المعلمات التمييزية السماح للحد الألواح إيمونوفينوتيبيك الحالي عشرات2، يسمح بتطبيقها في مختبرات علم الأمراض السريرية.
هذا الأسلوب يحد تفسيرات ذاتية لبيانات الخلوي، وقد تم الإشارة في حركة الديمقراطيين الاشتراكيين تشخيص3. هذه الخطوة شرط أساسي لتطوير أدوات مؤتمتة لتجهيز وتحليل تدفق البيانات4.
حركة الديمقراطيين الاشتراكيين تضم مجموعة غير متجانسة من الاضطرابات الاستنساخ من الخلية الجذعية المكونة للدم (HSC) التي تتعاون بها طفرات سبليسيوسومي مع المعدلات جينية محددة تسفر عن النمط الظاهري حركة الديمقراطيين الاشتراكيين. ومن المعروف الآن أن، جنبا إلى جنب مع الطفرات HSC، آليات أخرى تشارك في حركة الديمقراطيين الاشتراكيين الفيزيولوجيا المرضية، مثل التهاب المناعي بوساطة الشاذة والتفاعلات بين هسكس الخبيثة والمكرويه اللحمية بي أم. بيد أن هذه الآليات لا تزال غير مفهومة. يجعل التغايرية السريرية والبيولوجية على نطاق واسع لحركة الديمقراطيين الاشتراكيين بالتشخيص واختيار العلاج الأمثل تحديا. في العقد الماضي، وقد أظهرت الدراسات المتعددة أن MFC غالباً أكثر حساسية في الكشف عن خلل التنسج2 من التشكل، ولكن القيود التقنية والاقتصادية تجعل من الصعب على توحيد، مع النتائج غالباً ما اعتماداً على هذه التقنية تجربة مترجم3. وبالإضافة إلى ذلك، من غير الواضح كيف MFC يمكن ترجيح كفة الميزان نحو حركة الديمقراطيين الاشتراكيين في الحالات مع أو بدون الحد الأدنى من خلل التنسج المورفولوجية وفي غياب الاختلالات الخلوية الوراثية، أو في الحالات الحدية مثل هيبوسيلولار حركة الديمقراطيين الاشتراكيين، مع عد انفجار منخفضة، من غيرها BM غير الاستنساخ اضطرابات مثل فشل نخاع العظم (أي.، فقر الدم اللاتنسجي). كذلك ما زال من الصعب التفريق بين الحالات الحدية لحركة الديمقراطيين الاشتراكيين مع وجود فائض انفجارات من سرطان الدم النقوي الحاد (مكافحة غسل الأموال). ولجميع هذه الأسباب، لا تدمج المبادئ التوجيهية السريرية الاختبار MFC إلى التشخيص النهائي حركة الديمقراطيين الاشتراكيين. في عام 2011، أوصى الولايات المتحدة وطنية شاملة سرطان شبكة (NCCN) MFC لتقدير النسبة المئوية للخلايا CD34 +، والكشف عن استنساخ انتيابيه الانتيابي، ووجود من استنساخ خلايا T السامة للخلايا في حركة الديمقراطيين الاشتراكيين هيبوسيلولار5. هاتين الحالتين الأخير ينطوي أيضا على هدف علاجي لأن البيانات السريرية أظهرت استجابة جيدة لهؤلاء المرضى للعلاج كآبته6. سرد المبادئ التوجيهية NCCN 2017، مستشهداً بتوصيات الفريق العامل الدولي (الفريق العامل)، إيمونوفينوتيبينج الشاذة الكشف بواسطة MFC بين المعايير المشتركة لتشخيص حركة الديمقراطيين الاشتراكيين، ولكن دون إجراء أي مواصفات6. وباﻹضافة إلى ذلك، تصنيف منظمة الصحة العالمية نشرت مؤخرا ينص على أن النتائج MFC وحدها ليست كافية لإثبات تشخيص الأولية لحركة الديمقراطيين الاشتراكيين في غياب بيانات قاطعة المورفولوجية و/أو الخلوية الوراثية7. ومع ذلك، يمكن استخدام MFC كاختبار إضافية تظهر التقلبات خلية النقوي أنماط النضوج وقياس "المسافة من العادي" لمريض في وقت محدد في مسار المرض.
ينطبق هذا الأسلوب في المختبرات السريرية المهتمة بالأمر في تقييم خلل التنسج في الخلايا BM النقوي استخدام MFC إيمونوفينوتيبينج، بغية تحسين التشخيص في حركة الديمقراطيين الاشتراكيين أو غيرها من اضطرابات النقوي مع شذوذ ديسبلاستيك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
قد أقرها البروتوكول المذكورة أدناه "لجنة دي حماية الأشخاص" (لجنة الأخلاقيات المستقل) 1 Est سود من جامعة مستشفى سانت إتيان "، فرنسا".
1-سيتوميتير إعدادات
ملاحظة: الإعدادات cytometer أجريت وفقا للتوصيات "تدفق فرنسا"، وفقا للإجراء يوروفلوو "معيار يوروفلوو التشغيل بروتوكول (SOP) لإعداد الصك والتعويض (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php).
- إعداد الصك الشهري
- قم بتشغيل في سيتوميتير. التأكد من وجود جميع مستويات السوائل المناسبة وفتح المغنية 6.1.3. أداء بدء التشغيل فلويديكس: في شريط القوائم، حدد ' سيتوميتير | فلويديكس بدء تشغيل '. انقر فوق 'موافق' عندما تتم مطالبتك. السماح سيتوميتير الحارة لمالا يقل عن 30 دقيقة.
- فحص الأداء-الخرز لجنة العلم والتكنولوجيا
ملاحظة: لهذه الخطوة، وإعداد 12 أنبوب البوليستيرين 75 مم، الخرز لجنة العلم والتكنولوجيا، والسوائل غمد (انظر الجدول للمواد).- تسمية أنبوب البوليستيرين2 12 × 75 مم 'لجنة العلم والتكنولوجيا'. مزيج القنينة حبة المتوفر بانعكاس لطيف أو فورتيكسينج لطيف جداً. أضف إلى الأنبوبة المسماة: 0.35 مل من "سائل غمد" وقطره 1 من الخرز لجنة العلم والتكنولوجيا. دوامة الأنبوب بلطف والشروع في اقتناء. تخزين الأنبوبة ليصل إلى 8 س في 2-25 درجة مئوية في الظلام في حالة عدم الحصول على الفور.
- إجراء تدقيق الأداء: في شريط القوائم، حدد ' سيتوميتير | لجنة العلم والتكنولوجيا '.
- في علامة التبويب 'الإعداد' وحدة لجنة العلم والتكنولوجيا: تأكيد "الثاني كانتو" كما هو الحال في التكوين الافتراضي 4-ح 2-2V وأيضا التأكد من عدم وجود خط أساس التي تم إنشاؤها باستخدام الشحنة الحالية من حبات لجنة العلم والتكنولوجيا لهذا التكوين. في حالة عدم وجود خط أساس، أشير إلى IFU الخرز لجنة العلم والتكنولوجيا. وتؤكد أن هذا الأساس لم تنته: تحت 'مراقبة الإعداد'، حدد 'التحقق من الأداء' من القائمة المنسدلة.
- تحقق من 'تحميل أنبوب يدوياً' وانقر فوق 'تشغيل'. تأكد من عرض رقم الشحنة. بلطف ودوامه الخرز المخفف أعد أعلاه وعند مطالبتك بذلك، تحميل الخرز المخفف، وانقر فوق 'موافق'.
- عند الانتهاء من التحقق من الأداء، تأكد من أن تمرير "الأداء سيتوميتير". انقر فوق 'عرض تقرير'. إعادة تشغيل تدقيق الأداء إذا لم يمر النتائج. حفظ التقرير في تنسيق PDF مع "تاريخ التقرير تتبع الأداء".
- ضبط 'PMT الفلورسنت الفولتية' مع "الخرز قوس قزح" (جدول المواد).
ملاحظة: القيم المستهدفة هي المنصوص عليها في يوروفلوو إجراءات التشغيل القياسية (SOP) بعنوان "20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads". هذا سوب متاح على الموقع يوروفلوو (www.euroflow.org; في المجال العام؛ تبويب البروتوكولات).- إنشاء تجربة جديدة عبر '"تاريخ إعداد صك الشهري" | عينة '.
- '، اختر معلمات الضوئية وفلوروتشروميس المقابلة للأنابيب المعنية (فيتك، PE، PerCPCy5.5، PE Cy7، آسيا والمحيط الهادئ، APC-H7، V450, V500)، والتحقق من معلمات اقتناء المرجوة (سجل،، ح و/أو W). تطبيق الإعدادات الحالية للعلم (الحق انقر فوق 'إعدادات سيتوميتير' من التجربة). تعيين العتبة للمعلمة FSC 10 آلاف.
- في سيتوميتير، إيقاف التعويض أثناء إعداد fluorescence الفولتية PMT لتحديد "مؤسسة مونتانيار المستهدفة"؛ ولهذا الغرض، تذهب في 'المفتش'، انتقل إلى علامة التبويب 'التعويض' تعويض تعطيل عن طريق تأشير 'تمكين تعويضاً' الخيار.
- إنشاء ورقة عمل 'مؤسسة مونتانيار الهدف' مع جميع المؤامرات دوت اللازمة (n = 2؛ منتدى التعاون الأمني مقابل التعاون بين بلدان الجنوب، فيتك مقابل PE)، رسوم بيانية (n = 8؛ وواحد من الرسم البياني لكل كاشف الأسفار) وإحصاءات تبين المرجع قيم الذروة (مؤسسة مونتانيار والسيرة الذاتية) لكل قناة الأسفار.
- تمييع قطره 1 8-ذروة قوس قزح الخرز المعايرة الجسيمات في 1 مل من الماء المقطر ودوامه قبل الاستخدام. اكتساب دون تسجيل الحل الخرز قوس قزح 8-ذروة معدل تدفق 'منخفضة' . تخزين الأنبوبة ليصل إلى 8 ح في ˚C 2-25 في الظلام في حالة عدم الحصول على الفور.
- بوابة القميص الخرز 'السكان P1' في منتدى التعاون الأمني مقابل الأرض دوت المتغيرين SSC وذروة الثامنة أو السابعة في فيتك مقابل الأرض دوت المتغيرين PE (ذروة ألمع أو المرحلة التالية أسفل، كما هو منصوص عليه في وثيقة يوروفلوو بعنوان "20180302_7th_ Peak_Target_Values_Rainbow_Beads ")، واسم هذه البوابة P2 السكان.
- مواصلة الحصول على تعليق حبة قوس قزح 8-قمم وضبط الفولتية PMT في جميع الأسفار القنوات للوصول إلى هدف مؤسسة مونتانيار القيم وفقا للوثيقة يوروفلوو "20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads".
- حالما يتم التوصل إلى القيم "المستهدفة مؤسسة مونتانيار" لذروة السابعة أو الثامنة، سجل "مؤسسة مونتانيار المستهدف" تحقيقه والقيم المناظرة في PMT النهائي. وتكتسب أحداث 5,000 وتسجيل البيانات.
ملاحظة: أن PMT القيم يجب أن يمكن استخدام أدناه في الخطوة 1.2.3 (تحقق الأداء-تأكيد قيم PMT مع الخرز قوس قزح). - تسجيل هذه القيم جعل طباعة الشاشة مع إعدادات 'مؤسسة مونتانيار الهدف' وصك ورقة العمل وحفظ كصورة.jpg.
ملاحظة: عندما يتم إنشاء أنبوب "جديدة"، في بعض الأحيان قيم PMT تختلف بشكل غير متوقع. لهذا، من الضروري التحقق المزدوج من PMT. مقارنة كل الوقت القيم PMT للملاحظات الخاصة بك، تأكد من صحة القيم 'مؤسسة مونتانيار الهدف' وقيم PMT! - حفظ 'إعدادات التطبيق'. في المستعرض، انقر بالزر الأيمن على 'إعدادات سيتوميتير'. من القائمة المنسدلة، حدد 'إعدادات التطبيق'، وحفظ. انقر فوق 'موافق'. إذا تمت مطالبتك، انقر فوق نعم للحفاظ على قيم العتبة.
ملاحظة: حفظ "إعدادات التطبيق" باستخدام الاسم الافتراضي. عدم إعادة تسمية الإعدادات.
- ضبط 'FCS' و 'SSC الفولتية' مع تفكيك الدم المغسول (LWB).
ملاحظة: لهذه الخطوة، هناك حاجة 50 ميكروليتر من عينة الدم المحيطي (PB) من التوصل إلى حل سليم المتطوعين، ليسينج (جدول المواد) والغسيل المخزن المؤقت.- بيبيتس 50 ميليلتر من الجريدة الرسمية في أنبوب. إضافة 2 مل من محلول ليسينج الطازج المخفف. المزيج بلطف واحتضان لمدة 10 دقائق في الرايت
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 540 س ز.
- نضح المادة طافية دون إزعاج بيليه الخلية، ترك حوالي 50 ميليلتر حجم المتبقية في الأنبوب. المزيج بلطف وإضافة 2 مل من محلول الغسيل التي تمت تصفيتها.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 540 س ز.
- كرر مرة أخرى 1.1.4.3–1.1.4.4 الخطوات.
- إضافة 250 ميليلتر من المخزن المؤقت للغسيل المصفاة وتخلط بلطف.
- في التجربة التي تم إنشاؤها لاقتناء "الخرز قوس قزح"، إنشاء جديدة من ' عينة | ورقة عمل جديدة ': رسم رسم بياني SSC-A/A--منتدى التعاون الأمني ثنائي حدودي.
- الحصول على الخلايا، وبوابة اللمفاوية في منتدى التعاون الأمني مقابل الأرض دوت المتغيرين SSC وضبط الفولتية منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب للوصول إلى القيم المستهدفة يعني التالية للسكان اللمفاويات المبوب: منتدى التعاون الأمني: 55,000 (مجموعة 50,000 – 60,000)، والتعاون بين بلدان الجنوب: 13,000 (طائفة 11,000 –15,000).
- حيازة وتسجيل البيانات مع الأحداث حوالي 10,000. تحقق من القيم المستهدفة يعني منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب لبوابات الخلايا الليمفاوية. إعادة ضبط الجهد منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب إذا لزم الأمر.
- طباعة الشاشة وتخزين طباعة قيم القناة المستهدفة التي تم الحصول عليها.
- إعدادات تعويض الأسفار.
ملاحظة: يجب أن يتم تعيين عناصر التعويض الملطخة بمفرده بعد الإعدادات "مؤسسة مونتانيار المستهدفة" وتم إنشاء منتدى التعاون الأمني/SSC الإعدادات. ويلزم لهذه الخطوة، الجريدة الرسمية من متطوعة صحية، "تعويض الجسيمات" (جدول المواد)، ليسينج الحل والغسيل المخزن المؤقت. يتم سرد القائمة من جسم مترافق fluorochrome الكواشف المستخدمة لإعداد مصفوفات التعويض الأسفار وسكانها المرجعية في الجدول 1.- أنبوب واحد كل كاشف لاستخدامها في إعداد التعويض fluorescence تسمية (فيتك، PE، PerCPCy5.5، وآسيا والمحيط الهادئ، V450، V500، PECy7-CD117، آسيا والمحيط الهادئ-H7-CD10، آسيا والمحيط الهادئ-H7-CD14 وآسيا والمحيط الهادئ-H7-CD71) وأنبوب "فارغة/أونستينيد".
- بيبيت 50 ميليلتر من الجريدة الرسمية في كل أنبوب أو قطره 1 "السلبية" تعويض الجسيمات + 1 قطره من الجسيمات التعويض "إيجابية" في أنابيب التحكم التعويض المشار إليها أعلاه في الجدول 1.
- إضافة القدر المناسب من جسم الكاشف للأنبوب. إضافة المخزن المؤقت الغسيل التي تمت تصفيتها للوصول إلى وحدة تخزين نهائي من 100 ميليلتر كل أنبوب وتخلط برفق. احتضان لمدة 15 دقيقة في الرايت، محمية من الضوء.
- إضافة 2 مل من محلول ليسينج الطازج المخفف فقط في الأنابيب مع الخلايا وتخلط بلطف. احتضان لمدة 10 دقيقة في الرايت، محمية من الضوء.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 540 س ز.
- نضح المادة طافية دون إزعاج بيليه الخلية ترك حوالي 50 ميليلتر حجم المتبقية في كل أنبوبة. المزيج بلطف. إضافة 2 مل من المخزن المؤقت للغسيل التي تمت تصفيتها.
- الطرد المركزي 5 دقائق في 540 س ز.
- نضح المادة طافية دون إزعاج بيليه الخلية ترك حوالي 50 ميليلتر حجم المتبقية في كل أنبوبة. إضافة المخزن المؤقت الغسيل التي تمت تصفيتها للوصول إلى وحدة تخزين نهائي من 250 ميليلتر كل أنبوب وتخلط برفق.
- إنشاء عناصر التعويض.
- من شريط القوائم، حدد التجربة التي تم إنشاؤها لاقتناء "الخرز قوس قزح". إنشاء جديدة من ' عينة | إعداد التعويض | إنشاء عناصر التعويض.
- في مربع الحوار الناتج, حدد خانة الاختيار 'التحكم أونستينيد منفصلة تشمل أنبوب/جيدا' . إنشاء عناصر التعويض (تسمية محددة لا) عامة فيتك، PE، PerCPCy5.5، وآسيا والمحيط الهادئ، HV450، HV500. إنشاء عناصر التحكم الخاصة بتسمية تعويض PE-Cy7-CD117، آسيا والمحيط الهادئ-H7-CD10، آسيا والمحيط الهادئ-H7-CD14 وآسيا والمحيط الهادئ-H7-CD71. انقر فوق 'موافق'.
- في ورقة عمل جديدة، إنشاء رسم بياني SSC-A/A--منتدى التعاون الأمني ثنائي حدودي ورسم بوابة على الخلايا الليمفاوية (P1) والرسم البياني المقابلة فلوروتشرومي التي سيتم الكشف عنها في كل أنبوب ورسم بوابة P2 لذروة الإيجابية. عرض التسلسل الهرمي (انقر على الحق في الرسم البياني، وحدد 'إظهار التسلسل الهرمي السكان') لتصور عدد الأحداث في P2، باستثناء أنبوب "التحكم أونستينيد".
- في المستعرض، قم بتوسيع العينة "ضوابط التعويض".
- دوامة إعداد الخلايا أونستينيد، أعلاه، لتثبيت 3 – 5 س. الخلايا أونستينيد مستعدة على سيتوميتير. ضبط معدل التدفق إلى 'المتوسطة' ، وانقر فوق 'الحصول على بيانات'. في مقابل منتدى التعاون الأمني بالمؤامرة دوت بالتعاون بين بلدان الجنوب، وضبط البوابة P1 ليشمل كامل السكان اللمفاويات. انقر بالزر الأيمن على بوابة P1. حدد 'تطبيق لجميع التعويضات السيطرة'.
- من لوحة 'شراء' ، انقر فوق '"سجل البيانات"' للحصول على أحداث 5,000. لكافة الخلايا التحكم الملون أحادي اللون، تحقق من أن بوابة P2 الفاصل الزمني ليشمل السكان إيجابية.
- PE Cy7 وأنابيب APCH7، إضافة بوابة P3 الفاصل زمني للرسم البياني وضمان أنه يشمل السكان سلبيا، وأن يشمل P2 السكان إيجابية.
- حساب التعويض. من شريط القوائم، حدد ' التجربة | إعداد التعويض | حساب التعويض '. اسم مصفوفة التعويض: 'تاريخ التعويضات'. حدد 'الارتباط وحفظ'.
- حفظ مصفوفة التعويض في "إعدادات التطبيق في النشرة المصورة": انقر فوق '"إعدادات سيتوميتير"| إعدادات التطبيق | حفظ '، واسم مصفوفة التعويض ' تاريخ التعويض ' ثم انقر فوق ' موافق '.
- في المستعرض، انقر فوق 'إعدادات سيتوميتير'. في المفتش، انتقل إلى علامة التبويب 'التعويض' "انقر فوق طباعة" في الزاوية اليمنى السفلي.
ملاحظة: هذا يمكن أيضا استرداد المعلومات من النشرة المصورة. - مراقبة مصفوفة التعويض.
- خلط في أنبوب واحد كل أنبوب الملون واحدة (APCH7 الاختيار).
- إنشاء تجربة جديدة المسمى 'تاريخ التحقق التعويض'، وإضافة عينات جديدة، انقر فوق اليمين في 'إعدادات سيتوميتير' من هذه التجربة واختر ' الارتباط | إلغاء ارتباط | إعداد التطبيق ' بحفظه في الخطوة 1.1.3.10. اكتساب 50,000 الأحداث من هذا الأنبوب مع الإعدادات الجديدة.
- تطبيق "ورقة العمل العالمي" الجديد. إنشاء 1 دوت الأرض منتدى التعاون الأمني-A/SSC-أ ورسم بوابة لتصور الخلايا الليمفاوية ون س (n-1)/2 قطع أخرى ركزت على بوابة لمفاوية لتصور المعلمات اثنين باثنين.
- إعداد الصك اليومية
- قم بتشغيل في سيتوميتير. التأكد من وجود جميع مستويات السوائل المناسبة وفتح المغنية 6.1.3. أداء بدء التشغيل فلويديكس: في شريط القوائم، حدد ' سيتوميتير | فلويديكس بدء تشغيل '. انقر فوق 'موافق' عندما تتم مطالبتك. السماح سيتوميتير الحارة لمالا يقل عن 30 دقيقة.
- فحص الأداء-"الخرز لجنة العلم والتكنولوجيا": تكرار 1.1.2.1–1.1.2.5 الخطوات.
- فحص الأداء-تأكيدا لقيم PMT مع الخرز قوس قزح.
- تسمية أنبوب البوليستيرين ك 'قوس قزح الخرز' وتأكد من أن رقم الشحنة في الاستخدام. مزيج دقيق القنينة "حبة قوس قزح". إعداد "الخرز قوس قزح"، إضافة 1 قطره من "الخرز قوس قزح" 1 مل من الماء المقطر أو منزوع. حماية من الضوء.
ملاحظة: الشروع في اقتناء أو تخزين الأنبوب في ˚C 2-8 حتى اقتناء. - إنشاء تجربة جديدة: 'قوس قزح الخرز تاريخ'.
- ربط التعويضات: الحق انقر فوق 'إعدادات سيتوميتير'وتحديد 'إعداد الارتباط'وتحديد التعويض المناسب المصفوفة التي تم إنشاؤها في الخطوة 1.1.5.9.9 وحدد 'الكتابة'.
- إلغاء ارتباط التعويض: الحق انقر فوق 'إعدادات سيتوميتير'وحدد 'إلغاء الارتباط من الإعداد المرتبطة سابقا' وانقر فوق 'موافق'.
- تطبيق 'إعدادات التطبيق': الحق انقر فوق 'إعدادات سيتوميتير'وتحديد 'إعدادات التطبيق'وتطبيق الإعداد التي تم إنشاؤها في الخطوة 1.1.3.10 أثناء "الإعداد الشهرية" وحدد 'الاحتفاظ بقيمة التعويض'.
- قم بإلغاء تحديد 'تمكين تعويض'.
- إنشاء نموذج جديد في التجربة مع قالب ورقة عمل بالنسبة "الخرز قوس قزح". الحصول على الأنبوب في اقتناء 'منخفضة' .
- خلال اقتناء الخرز، ضبط البوابة P1 ليشمل السكان حبة القميص فقط. ضبط بوابة P2 على الأرض دوت فيتك-A/PE-A ليشمل السكان حبة القميص فقط. سجل الأحداث 10,000.
- تحقق من أن مؤسسة مونتانيار والقيم الذاتية التي تم الحصول عليها للسكان P2 في أهداف محددة مسبقاً للبروتوكول. وبخلاف ذلك، تغسل في سيتوميتير وبدء العملية مرة أخرى. حفظ التقرير كتنسيق PDF.
- تسمية أنبوب البوليستيرين ك 'قوس قزح الخرز' وتأكد من أن رقم الشحنة في الاستخدام. مزيج دقيق القنينة "حبة قوس قزح". إعداد "الخرز قوس قزح"، إضافة 1 قطره من "الخرز قوس قزح" 1 مل من الماء المقطر أو منزوع. حماية من الضوء.
2. إعداد نموذج بي أم
ملاحظة: تنفيذ الخلية الغسيل البروتوكول قبل الإجراء المصبوغة.
- "الماصة؛" 600 ميليلتر من العينة الأولية في أنبوب الطرد مركزي 15 مل.
- أضف 10 مل من الغسيل المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني + 0.5% جيش صرب البوسنة [> 98 ٪ نقية جيش صرب البوسنة] + 0.09% نان3 تصفية الحل، درجة الحموضة 7.4). خلط جيدا باستخدام ماصة تعليق خلية.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 540 س ز (الغسيل 1). تجاهل المادة طافية دون إزعاج بيليه الخلية.
- كرر الخطوات من 2.2 – 2.3 (يغسل 2).
- تعليق بيليه الخلية في 400 ميليلتر للغسيل المخزن المؤقت.
- تلوين علامات العمود الفقري. نقل وحدة التخزين بأكملها من الأجسام المضادة العمود الفقري لأنبوب البوليبروبيلين لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية، وحددت مع بيانات المريض و "العمود الفقري". إضافة 350 ميليلتر من عينة غسلها (حجم العينة غسلها المطلوبة لملء جميع الأنابيب في الفريق). كذلك استخدام ماصة مزيج.
ملاحظة: حساب الحجم الإجمالي للعمود الفقري الأجسام المضادة للغشاء السطحي تلطيخ (كما هو موضح في الجدول 2). - "الماصة؛" كميات متساوية من مزيج عينة-العمود الفقري في 3 أنابيب البولي بروبلين لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية، وحددت مع بيانات المريض و "أنبوب رقم 1" إلى "الأنبوب رقم 3". إذا لزم الأمر، استخدام المخزن المؤقت للغسيل للوصول إلى وحدة تخزين نهائي من 200 ميليلتر كل أنبوب.
تنبيه: كن حريصا على عدم ترك أي أثر للعينة على جدران الأنابيب؛ وبخلاف ذلك، سوف لا الملون هذه الخلايا. إذا لزم الأمر، دوامة الخلايا وأجهزة الطرد المركزي الأنبوب. - في كل أنبوب، إضافة وحدة التخزين المناسبة للأجسام المضادة الموجهة ضد علامات خلية السطحية (باستثناء علامات العمود الفقري)، ك محدد في الجدول 2. كذلك استخدام ماصة مزيج. احتضان لمدة 30 دقيقة في الرايت محمية من الضوء.
- إضافة 2 مل من ليسينج الحل. كذلك استخدام ماصة مزيج. احتضان لمدة 10 دقيقة في الرايت محمية من الضوء.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 540 س ز. تجاهل المادة طافية دون إزعاج بيليه الخلية، ترك حوالي 50 ميليلتر حجم المتبقية في كل أنبوبة. كذلك استخدام ماصة مزيج.
- إضافة 2 مل الغسيل المخزن المؤقت إلى بيليه الخلية. كذلك استخدام ماصة مزيج.
- كرر الخطوات 2، 10 – 2.11 (يغسل 2).
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 540 س ز. تجاهل المادة طافية بدون إزعاج بيليه الخلية وإعادة تعليق بيليه الخلية في 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني. كذلك استخدام ماصة مزيج.
- الحصول على الخلايا، ويفضل أن يكون ذلك، فورا بعد تلطيخ أو تخزين عند 4 درجة مئوية، محمية من الضوء، للا يزيد عن 1 ح حتى يقاس في سيتوميتير التدفق.
3. الحصول على البيانات
- فتح "تجربة جديدة" في مجال البرمجيات المغنية وتسميتها حسب الاسم، ونوع العينة والتاريخ.
- قم بإنشاء نموذج جديد يحتوي على 3 أنابيب. تحديد الأجسام المضادة المستخدمة في كل أنبوبة في "تخطيط التجربة".
- انقر فوق الحق في 'إعدادات سيتوميتير'واختر 'إعدادات التطبيق' وتطبيق القيم التي تم الحصول عليها في "الإعداد الشهرية" (الخطوة 1.1.3.10).
- افتح "ورقة عمل" جديدة عالمية وإنشاء قطع دوت: SSC-أ/منتدى التعاون الأمني-أ، SSC-أ/CD45-HV500-أ، SSC-أ/فيتك-أ، SSC-أ/PE-أ، SSC-أ/CD34-بيركب-Cy5.5، SSC-أ/CD117-PECy7-أ، SSC-أ/APC-أ، SSC-أ/APCH7-أ، SSC-أ/هلا-الدكتور-HV450-ألف. في المؤامرة دوت SSC-A/منتدى التعاون الأمني-A، إنشاء بوابة لتحديد الخلايا القميص. في المؤامرة دوت SSC-A/CD45-BV500-A، إنشاء بوابات لتحديد السكان 4: الخلايا الليمفاوية وانفجارات، المحببة ووحيدات. مشروع هؤلاء السكان في نقطة المؤامرات التي تم إنشاؤها مسبقاً.
- قم بإنشاء "ورقة عمل عالمية" جديدة لتعويض عنصر التحكم كما هو موضح في الخطوة 1.1.5.9.11.3.
- الحصول على الأنبوب في اقتناء 'المتوسط' وسجل 500,000 الأحداث/الأنبوبة. بعد التحقق من التقنية (تقييم التعويض وتلطيخ السليم)، تصدير البيانات كملفات FCS3.0.
4. تحليل البيانات
ملاحظة: لبناء قواعد البيانات بي أم عادية كانت الملفات المستخدمة من المانحين صحية ومن الأفراد دون أي دليل لمرض المكونة للدم على النحو التالي 11 من 18 ملفات Neutrophils_NM من قاعدة البيانات، 10 من 18 صورة لقاعدة البيانات Monocytes_NM و 14 من 18 ملفات قاعدة البيانات NRC_NM. تجاهل الملفات أظهرت مختلف المشاكل التقنية، كما عرضت في قسم النتائج الممثل. حللت الملفات منفردة باستخدام البرمجيات إينفينيسيت (جدول المواد)، مطابقة لمختلف الاستراتيجيات المبينة في الشكل 1A(1-3) للنسب العَدلات (Neutrophils_Maturation.inp الشخصية)، رقم 2 أ لنسب الوحيدات (Monocytes_Maturation.inp الشخصية)، و الرقم 3A(1-2) للنسب خلية محمر (NRC_Maturation.inp الشخصية).
- استراتيجية التحليل العَدلات --بناء قاعدة بيانات Neutrophils_NM
- تحديد CD34 + العَدلات ارتكبت انفجارات استخدام تقاطع سبعة أبواب، مما يتيح اختيار CD34 + CD117 + هلادر + منخفض CD10-CD13 + CD11b-الأحداث (الشكل 1ألف-1). تعيين هذه الأحداث إلى علامة التبويب 'العَدلات' في "شجرة التسلسل الهرمي للسكان"، وبعد ذلك قم بإلغاء تحديد علامة التبويب هذه من أجل إزالة هذه الخلايا (المبينة باللون الأزرق) من عرض الأحداث المتبقية (رمادي).
- عزل CD117 + CD34-CD13 + CD11b-هلادر + السلائف العَدلات منخفض باستخدام تقاطع بين البوابات الستة كما هو مبين في الشكل 1A(2) وتعيينها على علامة التبويب 'العَدلات' .
- تحديد العَدلات أكثر نضجاً استخدام تقاطع أربع بوابات، مما يسمح للتمييز ضد CD45dim ستشينت-مرحبا CD117-هلادر-الخلايا وانتدابهم إلى علامة التبويب 'العَدلات' .
- قم بإلغاء تحديد الأحداث المتبقية، الإبقاء فقط العَدلات مرئية، ثم تصدير هذه الفئة من السكان بواسطة النقر فوق ' الملف | تصدير ' والتحقق من أن كافة المعلمات المطلوبة يتم إيداع وحفظ البيانات كملفات FCS.
- في ملف مدمجة تتكون من جميع الملفات المصدرة في سفح المنحدر القاري، إجراء فحص جودة عن طريق تقييم كثافة التعبير عن علامات لكل يتدنى. استخدام APS المؤامرات مع المتوسطات لكل ملف ومنحنيات SD لكل يتدنى سيظهر، إزالة الحالات خارج منحنيات 2SD (انظر التفاصيل في قسم النتائج الممثل) (الشكل 1ب).
- في ملف يتكون الناتج مع "العَدلات" مرئياً، رسم "مسار النضج" في رسم تخطيطي لوكالة الأنباء الجزائرية (الشكل 1ج اليسار) وحفظ ملف كملف.cyt.
ملاحظة: يسمح مقارنة "الرسم التخطيطي نضج" التصور من كافة المعلمات من كافة الملفات المضمنة في قاعدة Neutrophils_NM ممثلة ضد قاعدة البيانات الموحدة. المخطط في الشكل 2ج، الجانب الأيمن، يظهر أن كافة الملفات المدرجة في قاعدة البيانات Neutrophils_NM (n = 11) يصلح في 2 SD مقارنة مع متوسط المجموعة.
- استراتيجية التحليل وحيدات-بناء قاعدة بيانات Monocytes_NM
- تحديد خلايا السلالة مونوسيتيك (CD117--/+ CD64 + مرحبا هلادر + مرحبا) استخدام تقاطع أربع بوابات (الشكل 2أ). قم بتعيين هذه الأحداث إلى علامة التبويب 'مونوسيتيك' في "شجرة التسلسل الهرمي للسكان".
- قم بإلغاء تحديد الأحداث المتبقية، حفظ الخلايا مونوسيتيك فقط مرئية، ثم تصدير هذه الفئة من السكان بواسطة النقر فوق ' الملف | تصدير ' والتحقق من أن كافة المعلمات المطلوبة يتم إيداع وحفظ البيانات كملفات FCS.
- في ملف مدمجة تتكون من جميع الملفات المصدرة في سفح المنحدر القاري، إجراء فحص جودة عن طريق تقييم كثافة التعبير عن علامات لكل يتدنى، ثم إزالة الحالات خارج منحنيات 2SD (التفاصيل في قسم النتائج الممثل) (الشكل 2 ب).
- في الملف الناتج مع "مونوسيتيك" الخلايا المرئية، رسم "مسار النضج" على الرسم التخطيطي لوكالة الأنباء الجزائرية (الشكل 2ج اليسار) وحفظ هذا ملف كملف.cyt.
ملاحظة: يسمح مقارنة "الرسم التخطيطي نضج" التصور من كافة المعلمات من كافة الملفات المضمنة في قاعدة Monocytes_NM ممثلة ضد قاعدة البيانات الموحدة. المخطط في الشكل 2ج، الجانب الأيمن، يظهر أن كافة الملفات المدرجة في قاعدة البيانات Monocytes_NM (n = 10) يصلح في 2 SD مقارنة مع متوسط المجموعة.
- استراتيجية لتحليل للخلايا الحمراء المنواه (سوسيولوجيا)-بناء قاعدة بيانات NRC_NM
- تحديد محمر ارتكبت انفجارات CD34 + استخدام تقاطع بين البوابات السبع التي تتيح اختيار CD34 + CD117 + هلادر + منخفض CD105 + CD33-CD36 + CD71 + الأحداث (الشكل 3A(1)). قم بتعيين هذه الأحداث إلى علامة التبويب "مجلس اللاجئين النرويجي" في "شجرة التسلسل الهرمي للسكان" وثم قم بإلغاء تحديد علامة التبويب هذه من أجل إزالة هذه الخلايا (المبينة باللون الأحمر) من عرض الأحداث المتبقية (رمادي).
- تحديد المراسلين أكثر نضجاً استخدام تقاطع بين البوابات الأربع التي تسمح بالتمييز من CD45--/+ خافت CD36 سكلوو + مرحبا CD71 + مرحبا CD105 +/--الخلايا. قم بتعيين هذه الأحداث إلى علامة التبويب "مجلس اللاجئين النرويجي" (الشكل 3A(2)). الصفائح الدموية (CD36 + مرحبا سكلوو الخلايا) يجب إزالتها من المجلس النرويجي للاجئين السكان (الشكل 3A(2)).
- قم بإلغاء تحديد الأحداث المتبقية، حفظ الخلايا المجلس النرويجي للاجئين فقط مرئية، ثم تصدير هذه الفئة من السكان بواسطة النقر فوق ' الملف | تصدير ' والتحقق من أن كافة المعلمات المطلوبة يتم إيداع وحفظ البيانات كملفات FCS.
- في ملف مدمجة تتكون من جميع الملفات المصدرة في سفح المنحدر القاري، إجراء فحص جودة عن طريق تقييم كثافة التعبير عن علامات لكل يتدنى، متبوعاً بإزالة الحالات خارج ((انظر التفاصيل في قسم النتائج الممثل) منحنيات 2SD الشكل 3 ب).
- في الملف الناتج مع "مجلس اللاجئين النرويجي" الخلايا المرئية، رسم "مسار النضج" على الرسم التخطيطي لوكالة الأنباء الجزائرية (الشكل 3جيم، اليسار) وحفظ هذا ملف كملف.cyt.
ملاحظة: يسمح مقارنة "الرسم التخطيطي نضج" التصور من كافة المعلمات من كافة الملفات المضمنة في قاعدة NRC_NM ممثلة ضد قاعدة البيانات الموحدة. المخطط في الشكل 3جيم، الجانب الأيمن، يظهر أن كافة الملفات المدرجة في قاعدة البيانات NRC_NM (n = 14) يصلح في 2 SD مقارنة مع متوسط المجموعة.
- تقييم نضج في المقصورات النقوي BM استخدام "قواعد البيانات نضوج"
- افتح الملف.cyt المقابلة لنسب الفائدة (أي.، Neutrophils_NM_GMFF.cyt للنسب العَدلات، Monocytes_NM_GMFF.cyt للنسب مونوسيتيك، و NRCs_NM_GMFF.cyt للنسب محمر).
- زر الماوس الأيمن فوق علامة التبويب 'نضوج' أسفل علامة التبويب المقابلة لنسب الفائدة (' العَدلات | مونوسيتيك | المجلس النرويجي للاجئين ') وحفظ قاعدة بيانات النضج إلى النضج.
- فتح ملف جديد FCS وإجراء التحليل كما هو موضح سابقا (الخطوة 4.1.1–4.1.3 العَدلات، خطوة 4.2.1 للخلايا مونوسيتيك، والخطوة 4.3.1–4.3.2 للمجلس النرويجي للاجئين).
- رسم مسار النضج لسكان الفائدة.
- افتح قاعدة البيانات المقابلة في علامة التبويب 'أدوات' (تحليل قاعدة البيانات) وقارن بين السكان يتم تحليلها مع "نضوج قاعدة البيانات" المطابقة. التحقق من صحة البيانات للتوافق مع قاعدة البيانات المتاحة: استكمال التوافق (المثلث الأخضر)؛ التوافق الجزئي، في معظم الحالات تناقضات باسم المعلمات (مثلث أصفر)؛ وعدم التوافق (مثلث أحمر).
- إذا كانت البيانات متوافقة أو متوافقة جزئية، ينشئ البرنامج الرسم التخطيطي 'تطبيع' نضوج الاختلافات . تصور 'الاختلافات نضوج الفرقة المعلمة'وفتح رسم تخطيطي جديد في التبويب 'المخطط' ، انقر فوق 'نضوج' واختر كم عدد المعلمات ليتم عرضها، انقر فوق 'موافق' والمخطط تظهر. مع انقر على الحق في الرسم التخطيطي؛ يمكن إجراء تغييرات في البيانات التصور، وقاعدة بيانات التصور والتصور التخطيطي النضوج.
- لتصور أهمية الاختلافات بين الملف الجديد والبيانات المدرجة في قاعدة البيانات، قم بتكوين تكبير (انقر بالزر الأيمن على 'تطبيع' نضوج الخلافات وتطبيق 'تكبير').
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
شملت العينات BM 54 تحصد في كيدتا تخثر الدم في الدراسة. تم تحليل البيانات MFC في غياب أي معلومات عن المرضى. أظهرت دراسة استعادية أن العينات BM من المانحين صحية 7 (5 من الذكور والإناث 2 مع عمر وسيط من 47.4 [35-48]، والأفراد 11 مع أي دليل على وجود مرض المكونة للدم (8 من الذكور والإناث 3 مع عمر وسيط من 57.9 [35-72]) وحالات 36 مع مختلف الحالات المرضية: حالة واحدة مع فقر الدم ومستوى كرياتينين منخفضة، 3 حالات فقر الدم ومستوى كرياتينين عالية، 8 حالات فقر الدم التهاب، حالة واحدة مع فقر الدم الناجم عن فيتامين ب12 عوز، 4 حالات فقر الدم ± سيتوبينياس الأخرى التي تسببها تلف في الكبد، 3 حالات فقر الدم الانحلالي الذاتية، 5 حالات مع برفريات الصفيحات مجهول السبب، وحالة واحدة بمتلازمة التنشيط بلعم، 3 حالات مع مغفرة كاملة بعد علاج الأورام اللمفاوية (الحد الأدنى من الأمراض المتبقية < 0.01 ٪) و 7 حالات تحمل الاضطرابات الدموية (4 حركة الديمقراطيين الاشتراكيين، AML 1، 1 اللوكيميا حيدي المزمن ومتلازمة ميلوبروليفيراتيفي 1 JAK2 إيجابية). وشملت هذه الفئة الأخيرة 18 من الذكور والإناث 18 مع متوسط العمر 60.3 [17-100]. وكانت جميع عينات من الأفراد القوقاز. قواعد البيانات بناء يسمح التعرف وتحديد عدة مسائل تتعلق بإعداد عينة واكتساب. وفي حالتنا، تضمنت قواعد البيانات النهائية ملفات 11/18 نضج العَدلات، وملفات 10/18 نضج الوحيدات وملفات 14/18 نضج المجلس النرويجي للاجئين. الملفات التي لم يتم تضمينها في قواعد البيانات مشاكل تقنية مختلفة. ولوحظت القضايا المصبوغة الأكثر شيوعاً ل CD11b و CD13 في العَدلات، CD300e، وهلادر في وحيدات، و CD71 وهلادر في سوسيولوجيا. تصدير البيانات يمكن أن تكون مصدرا للأخطاء؛ وكان الأكثر شيوعاً في dataset لدينا غياب ح منتدى التعاون الأمني في الملفات المصدرة، والعكس من ث منتدى التعاون الأمني مع منتدى التعاون الأمني-ح التي تحدث أحياناً في تصدير ملفات المغنية8. تقييم حالات جديدة يشتبه في أنهم من حركة الديمقراطيين الاشتراكيين ضد "قواعد البيانات نضوج عادي النقوي" سيتوبينياس تسمح للتعرف على التعبير غير طبيعي المستضدات النضج من النسب العَدلات (الشكل 4)، وحيدات (الرقم 5 )، والمجلس النرويجي للاجئين (الشكل 6) حتى في حالات دون تشوهات الخلوية أو الخلوية الوراثية (الشكل 7). وبخلاف ذلك، استخدام البرمجيات اقتناء الروتينية، مثل المغنية، ستكون هذه يصعب أو يستحيل تحقيق.
الشكل 4 : تحليل تدفق الممثل الخلوي من العَدلات في حالة حركة الديمقراطيين الاشتراكيين del(7). (أ) "في تطبيع نضوج الاختلافات" الرسم التخطيطي، المنطقة الرمادية يناظر التعبير العادي من مولدات المضادات الناتجة عن تحليل الملفات العادية 11 المضمنة في قاعدة العَدلات (median± 2SD). تعبير طبيعي عن المستضدات عدة لوحظ عند مقارنة حالة حركة الديمقراطيين الاشتراكيين del(7) ضد Neutrophils_NM قاعدة البيانات (n = 1 مقابل n = 11 الضوابط العادية العينات). (ب) "المعلمة الفرقة نضوج المخططات" تسمح المقارنات بين متوسط كثافة التعبير عن كل علامة في مراحل مختلفة من النضج (خطوط الكامل المستمر) والمنحنيات 2SD المحسوبة للحالات BM 11 العادية المدرجة في قاعدة البيانات (خطوط متقطعة متواصلة). شذوذ المظهرية من العَدلات لوحظ في حالة حركة الديمقراطيين الاشتراكيين del(7) مقارنة "قاعدة نضوج عادي العَدلات" كما يلي: التعبير زيادة عموما من CD34، زيادة طفيفة للتعبير CD11b على العَدلات غير ناضجة (مرحلة 2)، قلت التعبير عن CD13 في العَدلات غير ناضجة (مراحل 1-3) وزيادة طفيفة للتعبير CD16 في المرحلتين الأوليين من العَدلات النضج تليها زيادات معتدلة في التعبير CD16 على العَدلات الناضجة (المراحل 4-5). (ج) يظهر يرسم النقطة المقابلة كتصور في البرمجيات المغنية. تقييم الصورة باستخدام البرمجيات المغنية يسمح بالتعرف على عدد صغير من شذوذ المظهرية في هذه الحالة حركة الديمقراطيين الاشتراكيين: زيادة النسبة مئوية CD34 + CD13 + السلائف و downregulation التعبير CD13. تعبير طبيعي عن CD16 من الصعب أن نلاحظ في هذا النوع من التمثيل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : الممثل التدفق الخلوي تحليل وحيدات في حالة حركة الديمقراطيين الاشتراكيين del(7). () الخلافات نضوج Normalized الرسم التخطيطي يقدم عرض شامل للتعبير مستضد في مراحل مختلفة من النضج النسب خلية مونوسيتيك. المنطقة الرمادية يطابق التعبير العادي من مولدات المضادات الناتجة عن تحليل الملفات العادية 10 المدرجة في قاعدة البيانات مونوسيتيك (2SD ± متوسط). تعبير طبيعي عن المستضدات عدة يتجاوز 2SD، ولكن لبعض علامات، مثل CD35 وهلادر، فإنه يتجاوز 4SD. (ب) "في المعلمة الفرقة نضوج المخططات"، شذوذ المظهرية للخلايا مونوسيتيك في del(7) مصلحة الأرصاد الجوية القضية عندما مقارنة مع "قاعدة بيانات نضوج عادي الوحيدات" (n = 1 مقابل n = 10 عينات الضوابط العادية) هي كما يلي: تضاءل التعبير عن CD45 خلال مراحل 1-4 من الخلايا مونوسيتيك، CD117 في المراحل 1-2 من السلائف مونوسيتيك، والدكتور هلا عموما. وكان زيادة التعبير عن CD35 في المراحل الأولى 3 من نضج الخلايا مونوسيتيك الشذوذ الأكثر أهمية لهذا النسب. (ج) "المغنية" دوت المؤامرات التي تسمح بتقييم الخلايا مونوسيتيك في نقطة BM. (د) "المغنية" عادية واحدة المؤامرات التي تسمح بتقييم الخلايا مونوسيتيك في حالة حركة الديمقراطيين الاشتراكيين del(7). تقييم الصورة باستخدام البرمجيات المغنية يسمح للتعرف على تشوهات المظهرية اثنين في هذه الحالة حركة الديمقراطيين الاشتراكيين: التعبير تقلص الدكتور هلا وزيادة التعبير عن CD35 في جزء من السلائف مونوسيتيك (سكان الحمراء). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 : تحليل تدفق الممثل الخلوي للخلايا الحمراء المنواه في حالة حركة الديمقراطيين الاشتراكيين del(7). () الخلافات نضوج Normalized الرسم التخطيطي يقدم عرض شامل للتعبير مستضد في مراحل مختلفة من النضج النسب المجلس النرويجي للاجئين. المنطقة الرمادية يطابق التعبير العادي من مولدات المضادات الناتجة عن تحليل الملفات العادية 14 المضمنة في "قاعدة نضوج عادي المجلس النرويجي للاجئين" (2SD ± متوسط). تعبير طبيعي عن المستضدات عدة يتجاوز 2SD، ولكن لبعض علامات، مثل CD34، CD117، CD71، و CD105، فإنه يتجاوز 4SD. (ب) "في المعلمة الفرقة نضوج المخططات"، شذوذ المظهرية التي لوحظت في قضية del(7) مصلحة الأرصاد الجوية بالمقارنة مع مع "قاعدة نضوج عادي المجلس النرويجي للاجئين" (n = 1 مقابل n = 14 الضوابط العادية عينات) هي كما يلي: تناقص التعبير عن CD34 في المراحل الأولى والثانية من نضج، CD117، CD105، CD71، والدكتور هلا في المرحلة 1 من السلائف محمر النسب. تقييم الصورة باستخدام البرمجيات المغنية يسمح بتحديد هوية CD71 التعبير غير طبيعي في الخلايا محمر في هذه الحالة حركة الديمقراطيين الاشتراكيين، ولكن تعديلات أخرى لا يمكن الكشف عنها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 7 : تحليل الخلوي الممثل تدفق العَدلات ووحيدات والمراسلين في مرحلة مبكرة حالة حركة الديمقراطيين الاشتراكيين دون خلل التنسج المورفولوجية ودون الخلوية الوراثية أبرانسيس. (أ) توزيع خلايا غير ناضجة وناضجة في مراحل مختلفة من النضج للأنساب النقوي ثلاثة: العَدلات ووحيدات والمراسلين. وقد لوحظ زيادة عدد وحيدات ناضجة (المرحلة الخامسة)، وتناقص قليلاً من خلايا غير ناضجة مونوسيتيك (المرحلة 2 من النضج). الاختلافات نضوج تطبيع (ب) رسم بياني يظهر أن يتجاوز شذوذ المظهرية 2SD CD34، CD117، CD11b، CD16 وهلادر، أعلى في 4SD-شذوذ المظهرية لاحظ العَدلات هي كما يلي: قليلاً قيم زيادة التعاون بين بلدان الجنوب في العَدلات السلائف غير ناضجة (المرحلة 1)، انتقاص تعبير عن CD34 (المرحلة 1)، من CD117 (المرحلة 1)، من CD16 (المرحلة 1-2) ومن هلادر (مراحل 1-3 من النضج). ولوحظ تعبير زيادة عن CD11b على السلائف غير ناضجة العَدلات (المرحلة 1). (ج) "تطبيع نضوج الاختلافات" تظهر الرسم التخطيطي الذي لوحظ شذوذ المظهرية أهم لنسب مونوسيتيك (التي تتجاوز 10SD) زيادة التعبير عن CD35 واقتناء المبكر من CD300e على غير ناضجة مونوسيتيك السلائف. الأخرى شذوذ المظهرية يحتفل في نسب مونوسيتيك كما يلي: تضاؤل منتدى التعاون الأمني والتعاون بين بلدان الجنوب في أكثر نضجاً وحيدات (المراحل 3-5) وتناقص طفيف للتعبير عن CD14 على مراحل 2-3 من الخلايا مونوسيتيك. (د) الاختلافات نضوج Normalized الرسم التخطيطي و "المخططات نضوج الفرقة المعلمة" يبين أن شذوذ المظهرية الأكثر أهمية التي لوحظت بالنسبة للمجلس النرويجي للاجئين: زيادة التعبير عن CD117 (التي تتجاوز 10SD) على مراحل 2-3 من المجلس النرويجي للاجئين النضج، زيادة التعبير عن CD34 (تتجاوز 5SD) خلال المرحلة الثانية من النضج للمجلس النرويجي للاجئين وانخفض التعبير عن CD36 على السلائف محمر المبكر (مراحل 1-3). وباﻹضافة إلى ذلك، التعاون بين بلدان الجنوب في المجلس النرويجي للاجئين غير ناضجة أقل من شأن نظيراتها العادية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
وعلاوة على ذلك، يتيح تفسير أهمية الاختلافات بين التعبير مستضد على إعدادات المرضية ونظيراتها العادية "الكمي" لهذه التشوهات، مع تحديد من هم أولئك الذين المميزة لمجموعة من الحالات. هذا قد أيضا يتيح لرتبة لهم استناداً إلى أهمية لأغراض المتابعة. في هذه الدراسة، صنفت جميع 7 حالات من الاضطرابات الدموية مع ميزات خلل التنسج النقوي (4 حركة الديمقراطيين الاشتراكيين، AML 1، 1 اللوكيميا حيدي المزمن ومتلازمة ميلوبروليفيراتيفي 1 JAK2 إيجابية) كغير طبيعي بالمقارنة مع قواعد بيانات مولدوفا. وباﻹضافة إلى ذلك، ألغى التقييم ضد قاعدة البيانات Neutrophils_NM الشك في وقوع خلل التنسج النقوي في 7 حالات فقر الدم الانحلالي السامة، والالتهابات، والمناعة الذاتية وفقر الدم من أمراض الكلي المزمنة. التقييم مقابل قاعدة بيانات Monocytes_NM إلغاء الشك في وقوع خلل التنسج النقوي في 4 حالات مع برفريات الصفيحات مجهول السبب (ITP)، بينما يسمح بتقييم ضد NRC_NM للتفريق في الحالات 3, 2 من فقر الدم التحريضية و 1 من ITP. بي أم أصوات من المرضى في مغفرة كاملة بعد أن كانت الأورام اللمفاوية أو علاجات الأورام الصلبة في حدود 2 SD من الوسيط لقواعد البيانات العادية لجميع الأنساب الثلاثة، وبالتالي هذه العينات قد تكون بدائل صحية المانحة BM عينات.
الشكل 1 : تحليل استراتيجيات لسلالة الخلايا العَدلات. () التحديد CD34 + CD117 + هلادر + المتكفل CD10-CD13 + CD11b-العَدلات منخفض وأدرك تقاطع مجموعة من سبعة أبواب كما هو مبين في A1. واختير الخطوة التالية من النضج، CD117 + CD34-CD13 + CD11b-هلادر + السلائف العَدلات منخفض استخدام تقاطع بين البوابات الستة كما هو مبين في الخلية A2. وأخيراً تحديد العَدلات أكثر نضجاً استخدام تقاطع بين البوابات الأربع التي تسمح بالتمييز CD45dim ستشينت-مرحبا CD117-هلادر-الخلايا (A3). وكانت معظم العلامات المميزة للنسب العَدلات CD34، CD117، CD11b، و CD16. جنبا إلى جنب مع CD13، تسمح هذه المعلمات لتحديد الفئات السكانية الفرعية الخمس: CD34 + موروث (CD34 + CD117 + CD13 +منخفض CD16 CD11b----) (أزرق داكن)؛ CD34-CD117 + CD13 +مرحبا CD11b-CD16-العَدلات السلائف (أزرق)؛ CD34-CD117-CD13 +منخفض CD11b-CD16-العَدلات (3 الخطوةالثالثة من النضج؛ أزرق فاتح)؛ CD34-CD117-CD13 + العَدلاتمنخفض منخفض CD11b + CD16 + (الخطوةال 4 من النضج؛ الوردي)؛ العَدلات الناضجة (CD34-CD117-CD13 +مرحبا CD11b +مرحبا CD16 +مرحبا؛ البنفسجي). ويمثل كل دائرة ملونة متوسط يتدنى للعلامة لمصلحة من عينة واحدة (ب). (ج) يعرض توزيع متجانسة من المعلمات تم اختبارها خلال نضوج الخلايا العَدلات بالمقارنة مع 2 SD قاعدة نضوج العادي (n = 11). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : تحليل استراتيجية وحيدات. تحديد خلايا السلالة مونوسيتيك (CD117--/+ CD64 + مرحبا هلادر + مرحبا) تتم باستخدام تقاطع أربع بوابات (A). كانت معظم المميزة في العلامات للنسب مونوسيتيك CD14، CD300e (IREM2)، CD35، والدكتور هلا على طول مع CD117، تسمح هذه المعلمات لتحديد الفئات السكانية الفرعية الثلاثة: CD34-CD117 +منخفضة/-هلادر +مرحبا CD35-CD14-CD300e-(أحمر)؛ CD34-CD117-هلادر +ميد CD35 +ميد CD14 +ميد CD300e--(برتقالي)؛ الناضجة وحيدات CD34-CD117-هلادر +ميد CD35 +مرحبا CD14 +مرحبا CD300e + (الأخضر) (ب). (ج) يعرض توزيع متجانس للمعلمات اختبار خلال نضوج الخلية مونوسيتيك بالمقارنة مع 2 SD قاعدة نضوج العادي (n = 10). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : تحليل استراتيجيات للمراسلين. (أ) تحديد محمر ارتكبت انفجارات CD34 + أدرك استخدام تقاطع بين البوابات السبع التي تتيح اختيار محمر المتكفل CD34 + CD117 + (A1). يتم تعريف المراسلين أكثر نضجاً استخدام تقاطع لخمسة أبواب (A2). استبعاد الصفائح الدموية (CD36 + مرحبا سكلوو الخلايا) مطلوب من المجلس النرويجي للاجئين السكان (A2). وكانت معظم العلامات المميزة للنسب خلية محمر CD34، CD117، CD71، و CD105. جنبا إلى جنب مع CD33، تسمح هذه المعلمات لتحديد الفئات السكانية الفرعية الثلاثة: CD45 +منخفض CD34 + CD117 + هلادر +ميد CD71 +ميد CD36 +ميد CD105 +مرحبا (أحمر)؛ CD34-CD117 + هلادر +منخفض CD71 +مرحبا CD36 +مرحبا CD105 +مرحبا المراسلين (الخطوة 2nd نضج الوردي)؛ CD34-CD117-هلادر--/+منخفض CD71 +مرحبا CD36 +ميد CD105 +منخفضة/-سوسيولوجيا (سوسيولوجيا أكثر نضجاً؛ سمك السلمون الوردي) (ب). (ج) يعرض توزيع متجانس للمعلمات اختبار خلال نضوج المجلس النرويجي للاجئين بالمقارنة مع 2 SD قاعدة نضوج العادي (n = 14). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الجدول 1: قائمة بالأجسام المضادة مترافق fluorochrome الكواشف المستخدمة لإعداد مصفوفات التعويض الأسفار مع سكانها مرجع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الجدول.
الجدول 2: تركيبة وكميات من الأجسام المضادة المستخدمة لتقييم نضج الخلايا العَدلات ووحيدات ومحمر في BM. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الجدول.
الملف التكميلي 1: Monocytes_Maturation.inp اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الملف التكميلي 2: Monocytes_NM_GMFF.cyt اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الملف التكميلي 3: Neutrophils_Maturation.inp اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الملف التكميلي 4: Neutrophils_NM_GMFF.cyt اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الملف التكميلي 5: NRC_Maturation.inp اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
ملف تكميلي 6: NRC_NM_GMFF.cyt اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نوعية أسبيراتي بي أم يمكن أن تؤثر على النتائج النهائية. تخفيف الدم أسبيراتي بي أم يمكن أن تشوه توزيع الخلايا في مراحل مختلفة من النضج بسبب الغياب من فروعه أو خلايا السلائف. ربما تستخدم الجزء الأكبر ليسينج الأسلوب قد تساعد في تطبيع تبين BM لتخفيف الدم في تحليل تدفق سيتوميتريك. وبالإضافة إلى ذلك، يتم الخطوات الحاسمة للتقييم لخلل التنسج النقوي BM بالتدفق الخلوي العينة تجهيز وتلطيخ، والحصول على البيانات، وتفسير2،3. ينبغي أن يقوم نموذج تجهيز وتلطيخ تصل إلى 72 ساعة بعد الحصاد BM. ينبغي الحصول، يفضل أن يكون ذلك، فورا بعد تلطيخ البيانات أو تخزين العينات في 4 درجات مئوية، محمية من الضوء، للا يزيد عن 1 ح حتى قياس في سيتوميتير التدفق. ويتجنب تفسير قاعدة البيانات--تسترشد تقييم ذاتي لنضوج الخلية النقوي BM.
مجموعات جسم وإعداد عينة كانت تتفق على نطاق واسع إلى9،إجراءات يوروفلوو10. وكان الفرق بالمقارنة مع الفريق يوروفلوو أن جميع الأجسام المضادة إلا CD300e تقدمها العلوم البيولوجية دينار بحريني. توحيد التدفق الخلوي جعلت من الممكن الحصول على البيانات بمستويات عالية من إمكانية تكرار نتائج11، ولكن هذا يتطلب الانضمام إلى فريق العمل المعني بتوحيد الأفرقة المعنية. في مجموعتنا، وتوحيد التعاون بين بلدان الجنوب يظل مجالاً تحسين. أن القضية الرئيسية فيما يتعلق بقواعد بيانات MFC بناء هو الإجراء المصبوغة. أنابيب التوزيع الأولى للأجسام المضادة غير العمود الفقري في نظام مراقبة الأصول الميدانية قبل إضافة كميات متساوية من مزيج عينة-العمود الفقري يتجنب تكرار العمود الفقري تلطيخ في حالة حدوث أخطاء في نهاية المطاف في توزيع سائر الأجسام المضادة غير العمود الفقري. وبالإضافة إلى ذلك، للتغلب على تلطيخ المشاكل هناك احتمالين: أما زيادة فترة الحضانة من الأجسام المضادة من 15 إلى 30 دقيقة، أو استخدام الأجسام المضادة المؤتلف، التي توفر أكبر إمكانية تكرار نتائج، وفقا للشركة المصنعة 12من المواصفات. وأجرى التحليل وفقا للبيانات المنشورة مؤخرا13،،من1415. وفيما يتعلق بتحليل وحيدات، أننا كثيرا ما لوحظ غياب CD34 + CD117-السلائف مونوسيتيك، كما أفيد سابقا بشين et al. 16-ولهذا السبب، تخلصنا من استراتيجية تحليل بوابة تكميلية للعزل لهذه الفئة من السكان. تقاطع غيتس السماح لعزل CD64 + و هلادر + F/int و CD117 +/--ويشمل غير ناضجة والسلائف (CD117 + CD34 + منخفض/--) ووحيدات أكثر نضجاً.
تقييم الملفات FCS الجديدة مقارنة بقاعدة يسهم قدر أكبر من موضوعية وتوحيد تحليل وتفسير البيانات ويتجنب تفسيرات خاطئة للاعتراف بأنماط ما يسمى، التي من الصعب توحيد3. التحديد الكمي السعة لشذوذ المظهرية مقارنة بقواعد البيانات العادية يجعل من الممكن لترتيب هذه التشوهات، مما قد يساعد في تحسين عشرات MFC لتشخيص حركة الديمقراطيين الاشتراكيين. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب يسمح تحديد دقيق من شذوذ المظهرية على غير ناضجة CD34 + و/أو CD117 + السلائف وفي خلايا أكثر نضجاً، غير واضح عند استخدام استراتيجيات التحليل الحالي في اقتناء البرمجيات. هذا الأسلوب ذات الصلة في تشخيص الحالات حركة الديمقراطيين الاشتراكيين التي أو لم يكن لديك شذوذ مورفولوجك واضحة، أو أن تفعل أو لا تحمل أبرانسيس المتكررة الخلوية الوراثية.
بحاجة إلى التحسين من تلطيخ جسم، وإضافة بيانات BM طبيعية جديدة في قواعد البيانات مطلوب من أجل زيادة متانة وموثوقية، وحساسية للتحليل. يمكن أن تطبق هذا الأسلوب، مع مزيد من التحقيق، إلى سيتوبينياس لأسباب أخرى، أو إلى هيماتوبويسيس الاستنساخ من إمكانات غير محدد (شريحة)، بغية تحديد التغيرات المظهرية موثوق بها ذات الصلة بعمليات ديسبلاستيك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية. إدارة التدفق الخلوي، مختبر أمراض الدم في "مستشفى جامعة من سانت إتيان" عضو في اتحاد يوروفلوو.
Acknowledgments
الأجسام المضادة التي استخدمت في هذه الدراسة قدمت "العلوم دينار بحريني". الكتاب أود أن أشكر زميلهم، الدكتور باسكال فلاندرين-جريستا، من قسم البيولوجيا الجزيئية، مختبر أمراض الدم، جامعة مستشفى سانت إتيان "، فرنسا"، الذين قدموا الخبرة لتفسير البيانات خ ع و للمرة الثانية حالة حركة الديمقراطيين الاشتراكيين. الكتاب شاكرون للطبيب هيماتولوجيستس للاهتمام والمشاركة في هذه الدراسة، والمرضى والجهات المانحة صحية لموافقتها على المشاركة في هذه الدراسة. الكتاب أيضا يود أن يشكر مؤسسة "Les بعثة الاتحاد الأفريقي دي ريمي" للدعم المالي للنشر.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSCanto II flow-cytometer | BD Biosciences, CA, USA | SN: V33896301336 | 3-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf |
| Awel C48-R Centrifuge | AWEL Industries, FR | SN: 910120016; Model No: 320002001 | low speed centrifuges; capacity 60 FACS tubes |
| Pipetts of 10µL and 200µL | |||
| Pasteur pipettes | |||
| 15 mL Falcon tubes | |||
| polypropylene tube for FACS | |||
| Mouse Anti-Human HLA-DR | BD Biosciences, CA, USA | 655874 | clone L243 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm) |
| Mouse Anti-Human CD45 | BD Biosciences, CA, USA | 560777 | clone HI30 Mouse IgG1, κ Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm) |
| Mouse Anti-Human CD16 | BD Biosciences, CA, USA | 656146 | clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD13 | BD Biosciences, CA, USA | 347406 | clone L138 Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD34 | BD Biosciences, CA, USA | 347222 | clone 8G12 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm) |
| Mouse Anti-Human CD117 | BD Biosciences, CA, USA | 339217 | clone 104D2 Mouse BALB/c IgG1 Fluorochrome PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm) |
| Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, CA, USA | 333143 | clone D12 Mouse BALB/c IgG2a, κ D12, Fluorochrome APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm |
| Mouse Anti-Human CD10 | BD Biosciences, CA, USA | 646783 | clone HI10A Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Mouse Anti-Human CD35 | BD Biosciences, CA, USA | 555452 | clone E11 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD64 | BD Biosciences, CA, USA | 644385 | clone 10.1 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD300e | Immunostep | IREM2A-T100 | clone UP-H2 Mouse BALB/c IgG1, k Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, CA, USA | 641394 | clone MoP9 Mouse BALB/c IgG2b, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Mouse Anti-Human CD36 | BD Biosciences, CA, USA | 656151 | clone CLB-IVC7 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD105 | BD Biosciences, CA, USA | 560839 | clone 266 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD33 | 345800 | clone P67.6 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
|
| Mouse Anti-Human CD71 | BD Biosciences, CA, USA | 655408 | clone M-A712 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Lysing Solution 10x Concentrate (IVD) | BD Biosciences, CA, USA | 349202 | |
| FACSFlow Sheath Fluid | BD Biosciences, CA, USA | 342003 | |
| FACSDiva CS&T IVD beads | BD Biosciences, CA, USA | 656046 | |
| RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS | Cytognos, Salamanca, Spain | SPH-RCP-30-5A | lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01 |
| Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD) | BD Biosciences, CA, USA | ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291 | |
| Diva software versions 6.1.2 and 6.1.3 | BD Biosciences, CA, USA | ||
| Phosphate buffered saline tablets | R&D Systems, Minneapolis, USA | 5564 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, France | A9647 | |
| Sodium azide 99% | Sigma-Aldrich, France | 199931 | |
| Infinicyt software version 1.8.0.e | Cytognos, Salamanca, Spain |
References
- Orfao, A., Ortuño, F., de Santiago, M., Lopez, A., San Miguel, J. Immunophenotyping of Acute Leukemias and Myelodysplastic Syndromes. Cytometry Part A. 58, 62-71 (2004).
- Porwit, A., et al. Revisiting guidelines for integration of flow cytometry results in the WHO classification of Myelodysplastic Syndromes - proposal from the International/European LeukemiaNet Working Group for Flow Cytometry in MDS (IMDSFlow). Leukemia. 28 (9), 1793-1798 (2014).
- Westers, M. T., et al. Implementation of flow cytometry in the diagnostic work-up of myelodysplastic syndromes in a multicenter approach: Report from the Dutch Working Party on Flow Cytometry in MDS. Leukemia Research. 36, 422-430 (2012).
- Meehan, S., et al. AutoGate: automating analysis of flow cytometry data. Immunologic Research. 58, 218-223 (2014).
- Greenberg, P. L., et al. NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology: myelodysplastic syndromes. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 9, 30-56 (2011).
- Greenberg, P. L., et al. Myelodysplastic Syndromes, Version 2.2017, Clinical Practice Guidelines in Oncology. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 15, (2017).
- WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Revised 4th Edition. Swerdlow, S. H., et al. (2), IARC Press. Lyon, France. 86-128 (2017).
- https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html. , Available from: https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html (2018).
- Composition of EuroFlow panels and technical information on reagents Version 1.5. , (2017).
- EuroFlow Standard Operating Procedure (SOP) for sample preparation and staining Version 1.2.1. , (2015).
- Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26, 1986-2010 (2012).
- http;//www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-flow-cytometry/reagents/antibodies-and-dyes/recombinant-antibodies.aspx. , Available from: http;//www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-flow-cytometry/reagents/antibodies-and-dyes/recombinant-antibodies.aspx (2018).
- van Dongen, J. J. M., et al. EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. Leukemia. 26, 1908-1975 (2012).
- Matarraz, S. Introduction to the Diagnosis and Classification of Monocytic-Lineage Leukemias by Flow Cytometry. Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 92 (3), 218-227 (2015).
- Westers, M. T. Immunophenotypic analysis of erythroid dysplasia in myelodysplastic syndromes. A report from the IMDSFlow working group). Haematologica. 102, 308-319 (2017).
- Shen, Q., et al. Flow cytometry immunophenotypic findings in chronic myelomonocytic leukemia and its utility in monitoring treatment response. European Journal of Haematology. 95, 168-176 (2015).
