Summary
MDS diagnosen är svår i avsaknad av morfologiska kriterier eller icke-informativa cytogenetik. MFC kunde bidra till att förfina den diagnostiska processen för MDS. För att bli användbart för klinisk praxis, MFC analysen måste baseras på parametrar med tillräcklig specificitet och känslighet, och data bör vara reproducerbar mellan olika operatörer.
Abstract
En arbetsgrupp som initierats inom franska flödescytometri Association (AFC) utvecklades för att harmonisera tillämpningen av multiparametrar flödescytometri (MFC) för myeloisk sjukdomsdiagnos i Frankrike. Det protokoll som presenteras här var överenskomna och tillämpad mellan September 2013 och November 2015 i sex franska diagnostiska laboratorier (universitetssjukhusen i Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nice, och Lille och Institut Paoli-Calmettes i Marseille) och tillät en standardisering av benmärgen prov förberedelse och datainskaffning. Tre mognad databaser har utvecklats för neutrofiler, monocytic, och erytroid härstamningar med benmärg från ”friska” givare individer (individer utan bevis på en hematopoetisk sjukdom). En robust metod för analys av varje myeloisk härstamning bör tillämpas för rutinmässig diagnostisk användning. Nya fall kan analyseras på samma sätt och jämfört mot de vanliga databaserna. Således, kvantitativa och kvalitativa fenotypiska avvikelser kan identifieras och dessa ovanstående 2SD jämföras med data av normal benmärg prover övervägas vägledande av patologi. Den största begränsningen är det högre variabilitet mellan data som uppnås med de monoklonala antikroppar erhållits med de metoder utifrån Hybridomteknik tekniker och för närvarande används i klinisk diagnos. Ställer upp kriterier för teknisk validering av de uppgifter som erhållits kan bidra till att förbättra användbarheten av MFC för MDS diagnostik. Fastställandet av dessa kriterier kräver analys mot en databas. Minskningen av prövaren subjektivitet i analys av data är en viktig fördel med denna metod.
Introduction
I avsaknad av fenotypiska markörer specifika att de dysplastiska förändringar som sker i myeloida celler under MDS initiering och progression, har en ny strategi föreslagits under de senaste åren baserat på utvärderingen av den mognad vägar (förändrat uttryck av myeloisk antigener under produktionen av mogen myeloida celler) eller onormala fördelningen av olika celltyper i benmärgen (BM) cell fack1,2.
Denna artikel presenterar en ny metod för standardiserade tillämpningen av MFC för att upptäcka dysplastiska förändringar i BM myeloida cell fack relaterade till myelodysplastiska syndrom (MDS) eller annan myeloisk blodsjukdomar. Denna studie visar också verktyget att använda mognad databaser för MFC dataanalys.
Standardisering av provet arbetsgången, datainsamling och analys med hjälp av databaserna skulle möjliggöra identifiering av den mest relevanta fenotypiska avvikelser relaterade till dysplastiska förändringar i BM myeloida celler. Därför krävs statistiskt utvalda undergrupper baserat på väl märkta och välkänt format (automatisk befolkningen Separator (APS) diagram, histogram och dot tomter) för att utveckla en analys strategi som kan användas i efterföljande analys rundor. Upptäckten av robust fenotypiska avvikelser i MDS skulle underlätta diagnosen i fall med eller utan minimal morfologiska dysplasi och utan cytogenetiska aberrancies. Identifiering av diskriminerande parametrar möjliggör en minskning av immunophenotypic paneler kan förenkla den nuvarande noter2, tillåter deras tillämplighet i klinisk patologi laboratorier.
Den här metoden begränsar de subjektiva tolkningarna av flödescytometri data, som har varit signalerade i MDS diagnos3. Detta steg är en förutsättning för utveckling av automatiserade verktyg för bearbetning och analys av flöde data4.
MDS omfattar en heterogen grupp av klonala hematopoetiska stamceller (HSC) sjukdomar där de spliceosome mutationerna samarbeta med specifika epigenetiska modifierare att ge MDS fenotypen. Det är nu känt att, tillsammans med HSC mutationer, andra mekanismer är inblandade i MDS patofysiologi, som avvikande immunmedierad inflammation och interaktioner mellan maligna Förenta och den stromal mikromiljö av BM. Dessa mekanismer är dock fortfarande dåligt förstådd. MDS breda kliniska och biologiska heterogenitet gör diagnos och val av den optimala terapin en utmaning. Under det senaste decenniet har flera studier visat att MFC är ofta mer känsliga att upptäcka dysplasi2 än morfologi, men tekniska och ekonomiska begränsningar gör denna teknik svårt att standardisera, med resultat ofta beroende på den erfarenhet av tolk3. Dessutom är det oklart hur MFC kan rubba balansen mot MDS i fall med eller utan minimal morfologiska dysplasi och i avsaknad av cytogenetiska avvikelser eller i gränsfall såsom hypocellular MDS, med en låg blast räkna, från andra icke-klonal BM störningar såsom benmärgssvikt (dvs., aplastisk anemi). Det är också fortfarande svårt att skilja gränsfall av MDS med ett överskott av Blaster från akut myeloisk leukemi (AML). Av alla dessa skäl integrerar de kliniska riktlinjerna inte MFC testning i den slutliga diagnosen MDS. I 2011 rekommenderade den amerikanska nationella omfattande Cancer Network (NCCN) MFC för uppskattning av andelen CD34 + celler, upptäckt av paroxysmal nattlig hemoglobinuri kloner, och förekomsten av cytotoxiska T-celler kloner i hypocellular MDS5. Dessa två sistnämnda situationer också innebära ett terapeutiskt mål eftersom kliniska data har visat ett bra svar av dessa patienter på immunsuppressiv behandling6. 2017 NCCN riktlinjerna, med hänvisning till internationella arbetar gruppen (IWG) rekommendationer, listade avvikande immunophenotyping upptäckt av MFC bland Co kriterierna för MDS diagnos, men utan att göra någon specifikationer6. Den nyligen publicerade WHO-klassifikationen stadgar dessutom att MFC resultaten enbart inte är tillräckligt för att fastställa en primärdiagnos på MDS i avsaknad av avgörande morfologiska och/eller cytogenetiska uppgifter7. MFC kan dock användas som en ytterligare test visar dysreglering av myeloida cell mognad mönster och kvantifiera ”avståndet från normala” för en patient vid en viss tidpunkt i sjukdomsförloppet.
Denna metod är tillämplig på kliniska laboratorier intresserade av utvärderingen av dysplasi i BM myeloida celler med MFC immunophenotyping, för att förfina diagnosen MDS eller andra myeloiska sjukdomar med dysplastiska avvikelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet som anges nedan har godkänts av den ”Comité de Protection des Personnes” (oberoende etisk kommitté) Sud-Est 1 från universitet sjukhus av Saint-Etienne, Frankrike.
1. Cytometer inställningar
Obs: Cytometer inställningarna utfördes enligt Frankrike Flow rekommendationer, i enlighet med EuroFlow förfarande ”EuroFlow Standard Operating Protocol (SOP) för instrumentet Setup och ersättning (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php).
- Månatliga instrument setup
- Slå på cytometer. Säkerställa att alla vätskenivåer är lämpliga och öppna Diva 6.1.3. Utföra flödesteknik start: i menyraden, Välj ' Cytometer | Flödesteknik start '. Klicka på 'OK' när du uppmanas. Låt cytometer att värma upp i minst 30 min.
- Prestanda Kontrollera - CST pärlor
Obs: I detta steg måste förbereda 12 75 mm polystyren tube, CST pärlor och slida vätska (se Tabell för material).- Etikettera ett 12 x 75 mm2 polystyren rör 'CST'. Blanda injektionsflaskan medföljande pärla av varsam inversion eller mycket mild vortexa. Tillsätt till märkt röret: 0,35 mL slida vätska och 1 droppe av CST pärlor. Vortex röret försiktigt och fortsätt till förvärvet. Lagra röret för upp till 8 h på 2-25 ° C i mörker om inte förvärva omedelbart.
- Utföra kontrollen prestanda: i menyraden, Välj ' Cytometer | CST'.
- På fliken 'Inställningar' i modulen CST: bekräfta den Canto II som i 4-2 H-2V standardkonfigurationen och också bekräfta att det finns en originalplan skapas med det aktuella partiet av CST pärlor för denna konfiguration. Om en originalplan inte existerar, se den CST pärlor IFU. Bekräfta att denna baslinje inte har löpt ut: under ' Setup Control', Välj ' Kontrollera prestanda ' från droppa-ned menyn.
- Kontrollera 'Load tube manuellt' och klick 'Springa'. Kontrollera partinumret visas. Försiktigt vortex utspädda pärlorna beredd enligt ovan och när du uppmanas Ladda de utspädda pärlorna och klicka på 'OK'.
- När kontrollen prestanda är klar, kontrollera att Cytometer prestanda passerade. Klicka på 'Visa rapport'. Kör prestanda kontrollen om resultaten inte passera. Spara rapporten i PDF-format med prestanda spårning rapportdatumet.
- Justera 'Fluorescerande PMT spänningar' med Rainbow pärlor (Tabell för material).
Obs: Målvärdena som fastställs i Euroflow normalförfarande (SOP) titeln ”20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads”. Denna SOP finns på Euroflow webbplats (www.euroflow.org; i det offentliga området; Protokoll-fliken).- Skapa ett nytt experiment via ' månatliga Instrument Setup datum | Preparatet '.
- ', Välj den optiska parametrar och fluorokromer motsvarar rören berörda (FITC, PE, PerCPCy5.5, PE-Cy7, APC, APC-H7, V450, V500) och kontrollera parametrarna önskad förvärv (logg, A, H och / eller W). Tillämpa nuvarande CST inställningar (rätt klick på ' Cytometer inställningar ' av experimentet). Ange tröskelvärde för FSC parameter på 10.000.
- På cytometer, inaktivera ersättning tablåpaket fluorescens PMT spänningar för Target MFI inställningen; för detta ändamål, gå i 'Inspector', navigera till fliken 'Ersättning' inaktivera ersättning av unchecking ' Aktivera ersättning ' alternativet.
- Skapa ett kalkylblad ' Target MFI' med alla nödvändiga dot tomter (n = 2; FSC kontra SSC, FITC kontra PE), histogram (n = 8; ett histogram för varje fluorescensdetektor) och statistik som visar hänvisningen toppvärden (MFI och CV) för varje kanal som fluorescens.
- Späd 1 droppe av 8-peak Rainbow pärlor kalibrering partiklar i 1 mL destillerat vatten och skaka före användning. Förvärva utan inspelning 8-peak Rainbow pärlor lösningen med 'Låg' flödeshastighet. Lagra röret för upp till 8 h på 2-25 ° c i mörker om inte förvärva omedelbart.
- Gate singlet pärlor ' befolkning P1' i FSC kontra SSC bivariate dot tomt och den 8: e eller 7: e toppen i FITC kontra PE bivariate dot tomt (ljusaste toppen eller nästa nedåt, som det föreskrivs i Euroflow dokumentet med titeln ”20180302_7th_ Peak_Target_Values_Rainbow_Beads ”) och namnge denna grind befolkningen P2.
- Fortsätt förvärvet av 8-peaks Rainbow pärla fjädringen och justera PMT spänningar i alla fluorescens kanaler att nå målvärden MFI enligt Euroflow dokumentet ”20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads”.
- När målet MFI värden för den 8: e eller 7: e toppen är nådd, registrera mål MFI uppnåtts och motsvarande slutliga PMT värden. Förvärva 5.000 händelser och registrera data.
Obs: Att PMT värden måste användas nedan i steg 1.2.3 (prestanda Kontrollera - bekräftelse av PMT värden med Rainbow pärlor). - Spela in dessa värden att göra en print skärmen med inställningar för kalkylbladet ' Target MFI' och instrument och Spara som .jpg bild.
Obs: När en ”ny” tub skapas ibland PMT värdena variera oväntat. För detta krävs en dubbel kontroll av PMT. Jämför varje gång PMT värdena till dina anteckningar, dubbelkolla att ' Target MFI' och PMT värden är korrekta! - Spara 'Inställningar'. I webbläsaren, högerklicka på ' Cytometer inställningar '. Från den nedrullningsbara menyn, Välj ' Inställningar 'och spara. Klicka på 'OK'. Om du uppmanas, klicka på Ja för att upprätthålla tröskelvärdena.
Obs: Spara programinställningarna med standardnamnet. Byter inte inställningarna.
- Justera 'FCS' och 'SSC spänningar' med lyserat tvättade blod (LWB).
Obs: För detta steg, 50 µL av ett perifert blod (PB) prov från en friska frivilliga, lyseringslösning lösning (Tabell av material) och tvätt buffert behövs.- Pipetter 50 µL av PB i ett rör. Tillsätt 2 mL av nymalen utspädda lyseringslösning lösningen. Blanda försiktigt och inkubera i 10 min vid RT.
- Centrifugera i 5 min vid 540 x g.
- Aspirera supernatanten utan att störa cellpelleten, lämnar cirka 50 µL residualvolym i röret. Blanda försiktigt och tillsätt 2 mL av filtrerade tvättlösning.
- Centrifugera i 5 min vid 540 x g.
- Upprepa en gång den steg 1.1.4.3–1.1.4.4.
- Tillsätt 250 µL av filtrerade tvätt buffert och blanda försiktigt.
- I experimentet skapats för Rainbow pärlor förvärv, skapa en ny ' Specimen | Nya kalkylblad ': Rita en bi-parametriska SSC-A / FSC-en graf.
- Förvärva cellerna, gate lymfocyter i en FSC kontra SSC bivariate dot tomt och justera FSC och SSC spänningar för att nå de följande genomsnittliga målvärdena för gated lymfocyter befolkningen: FSC: 55.000 (intervall 50 000 – 60 000) och SSC: 13.000 (intervall 11.000 –15,000).
- Förvärva och registrera data med cirka 10 000 händelser. Kontrollera de genomsnittliga FSC och SSC målvärdena för gated lymfocyter. Justera FSC och SSC spänning om det behövs.
- Skriva ut skärmen och lagra utskriften av kanal målvärdena som erhålls.
- Fluorescens ersättning inställningar.
Obs: Singel-färgade ersättning kontrollerna måste ställas in efter målet MFI inställningarna och FSC/SSC inställningar har fastställts. För detta steg, en PB från friska volontär, ersättning partiklar (Tabell för material), behövs lyseringslösning lösningen och tvätta buffert. Listan över fluorokrom-konjugerad antikropp reagenser som används till setup fluorescens ersättning matriserna och befolkningarna referens anges i tabell 1.- Märka en tub per reagens användas vid inrättandet av fluorescens ersättning (FITC, PE, PerCPCy5.5, APC, V450, V500, PECy7 - CD117, APC-H7 - CD10, APC-H7 - CD14 och APC-H7 - CD71) och en ”blank/ofärgade” röret.
- Överför med pipett 50 µL av PB i varje rör eller 1 droppe av ”negativa” ersättning partiklar + 1 droppe av ”positiva” ersättning partiklar i ersättning kontroll rören som anges i tabell 1.
- Tillsätt lämplig mängd antikroppreagensen till röret. Lägg till filtrerade tvätt buffert för att nå en slutlig volym av 100 µL per rör och blanda försiktigt. Inkubera i 15 min på RT, skyddas från ljus.
- Tillsätt 2 mL av nymalen utspädd lyseringslösning lösning endast i rören med celler och blanda försiktigt. Inkubera i 10 min vid RT, skyddas från ljus.
- Centrifugera i 5 min vid 540 x g.
- Aspirera supernatanten utan att störa cellpelleten och lämnar cirka 50 µL residualvolym i varje rör. Blanda försiktigt. Tillsätt 2 mL av filtrerade tvätt buffert.
- Centrifugera 5 min vid 540 x g.
- Aspirera supernatanten utan att störa cellpelleten och lämnar cirka 50 µL residualvolym i varje rör. Lägg till filtrerade tvätt buffert för att nå en slutlig volym av 250 µL per rör och blanda försiktigt.
- Skapa ersättning kontroller.
- Från menyraden, Välj Experiment som skapats för Rainbow pärlor förvärv. Skapa en ny ' Specimen | Kompensationsinställningar | Skapa ersättning kontroller.
- I dialogrutan, markera kryssrutan ' inkludera separat ofärgade kontroll tube/brunn ' . Skapa generiska (inte etikett-specifik) ersättning kontroller för PerCPCy5.5, HV450, APC, FITC, PE, HV500. Skapa etikett-specifik ersättning kontroller för PE-Cy7-CD117, APC-H7 - CD10, APC-H7 - CD14 och APC-H7 - CD71. Klicka på 'OK'.
- I ett nytt kalkylblad, skapa en bi-parametriska SSC-A / FSC-A graf och rita en grind på lymfocyter (P1) och histogram motsvarar den fluorokrom som identifieras i varje rör och rita en P2 utfärda utegångsförbud för positiva topp. Visa hierarkin (Högerklicka på diagrammet och välj ' Visa befolkningen hierarki ') för att visualisera antalet händelser i P2, utom den ofärgade kontrollrör.
- Expandera förlagan som ersättning kontroller i webbläsaren.
- Vortex ofärgade celler, beredd enligt ovan, för 3 – 5 s. Installera cytometer beredda ofärgade celler. Justera flödet till 'Medium' och klicka på ' förvärva Data'. FSC-A vs SSC-A dot tomten, justera P1 grinden för att fullt ut omfattar lymfocyter befolkningen. Högerklicka på P1 grinden. Välj 'Tillämpa för all ersättning kontroll'.
- Från instrumentpanelen ”förvärv” , klicka på 'Record Data' att förvärva 5.000 händelser. För alla enfärgad färgade kontroll celler, kontrollerar du att utfärda utegångsförbud för P2-intervallet omfattar positiva befolkningen.
- PE-Cy7 och APCH7 rör, lägga till en P3 intervall grind i histogrammet och säkerställa att det omfattar negativa befolkningen och att P2 omfattar positiva befolkningen.
- Beräkna ersättning. Från menyraden, Välj ' Experiment | Kompensationsinställningar | Beräkna ersättning '. Namnge kompensationsmatrisen: 'Ersättningar datum'. Välj 'Länk och Spara'.
- Spara matrisen ersättning i katalogen Programinställningar: Klicka på 'Cytometer inställningar | Programinställningar | Spara ', namnge kompensationsmatris 'Ersättning datum' och klicka på 'OK'.
- I webbläsaren, klicka på ' Cytometer inställningar '. Navigera till fliken 'Ersättning' Klicka på Skriv ut i det nedre högra hörnet i granskaren.
Obs: Denna information kan också hämtas från katalogen. - Kontroll av matrisen ersättning.
- Blanda i en tub alla enda färgade röret (APCH7 val).
- Skapa ett nytt Experiment som heter 'Ersättning verifiering datum', lägga nytt prov, klicka höger på ' Cytometer inställningar ' av detta experiment och välja ' länk | Avlänka | Programinställning ' Sparad i steg 1.1.3.10. Förvärva 50.000 händelser från denna tube med de nya inställningarna.
- Applicera ett nytt Global kalkylblad. Skapa 1 dot handling FSC-A/SSC-A och rita en grind för att visualisera lymfocyterna och n x (n-1) / 2 andra tomter fokuserade på lymfocyter grinden att visualisera två av två parametrar.
- Dagliga Instrument setup
- Slå på cytometer. Säkerställa att alla vätskenivåer är lämpliga och öppna Diva 6.1.3. Utföra flödesteknik start: i menyraden, Välj ' Cytometer | Flödesteknik start '. Klicka på 'OK' när du uppmanas. Låt cytometer att värma upp i minst 30 min.
- Prestanda Kontrollera - CST pärlor: Upprepa de steg 1.1.2.1–1.1.2.5.
- Prestanda Kontrollera - bekräftelse av PMT värden med Rainbow pärlor.
- Märka en polystyren tub som ' Rainbow pärlor ' och kontrollera att partinumret är i användning. Grundligt blanda injektionsflaskan Rainbow pärla. Förbereda Rainbow pärlorna, tillsätt 1 droppe av Rainbow pärlor till 1 mL avjoniserat eller destillerat vatten. Ljuskänsligt.
Obs: Gå vidare till förvärv eller lagra röret vid 2-8 ˚C tills förvärv. - Skapa ett nytt Experiment: ' Rainbow pärlor datum '.
- Länka ersättningarna: Högerklicka på ' Cytometer inställningar ', Välj ' länk Setup', Välj lämplig ersättning matrisen skapade i steg 1.1.5.9.9 och välj 'Skriv över'.
- Avlänka ersättning: Högerklicka på ' Cytometer inställningar ', Välj 'Avlänka från tidigare länkad inställningar' och klicka 'OK'.
- Tillämpa ' Inställningar ': Högerklicka på ' Cytometer inställningar ', Välj ' Inställningar ', gäller den inställning som skapats i steg 1.1.3.10 under den månatliga Setup och välj 'hålla ersättning värdet '.
- Avmarkera 'Aktivera ersättning'.
- Skapa ett nytt prov i experimentet med förslagsmall för Rainbow pärlor. Förvärva röret i 'Låg' förvärv.
- Under pärlor förvärvet, justera P1 grinden för att inkludera endast singlet pärla befolkningen. Justera P2 grinden på FITC-A / PE-A dot tomten att inkludera endast singlet pärla befolkningen. 10 000 händelser registreras.
- Kontrollera att MFI och de CV-värden som erhålls för P2 befolkning är i förhand fastställda målen i protokollet. Annars tvätta cytometer och starta igen. Spara rapporten som PDF-format.
- Märka en polystyren tub som ' Rainbow pärlor ' och kontrollera att partinumret är i användning. Grundligt blanda injektionsflaskan Rainbow pärla. Förbereda Rainbow pärlorna, tillsätt 1 droppe av Rainbow pärlor till 1 mL avjoniserat eller destillerat vatten. Ljuskänsligt.
2. BM provberedning
Obs: Utföra cellen tvätt protokoll precis innan färgningsproceduren.
- Pipettera 600 µL av delprov i en 15 mL centrifugrör.
- Tillsätt 10 mL av tvätt buffert (PBS + 0,5% BSA [> 98% ren BSA] + 0,09% NaN3 filtreras lösning, pH 7,4). Blanda cellsuspensionen väl med pipett.
- Centrifugera i 5 min vid 540 x g (1 tvätt). Kasta bort vätskefasen utan att störa cellpelleten.
- Upprepa steg 2.2 – 2.3 (tvätta 2).
- Centrifugerade cell i 400 µL av tvätt buffert.
- Färgning av ryggraden markörer. Över hela volymen av ryggraden antikroppar till en polypropylen rör för FACS analys, identifierade med patientdata och ”ryggraden”. Tillsätt 350 µL av tvättat prov (volymen av tvättas provet krävs för att fylla alla rören på panelen). Blanda väl med en pipett.
Obs: Beräkna den totala volymen av ryggraden antikroppar för surface membran färgning (som visas i tabell 2). - Pipettera lika mängder prov-ryggraden blandningen i 3 polypropylene rören för FACS analys, identifieras med patientdata och ”tube nummer 1” till ”tube nummer 3”. Om nödvändigt, använda tvätt buffert för att nå en slutlig volym av 200 µL per rör.
Varning: Var noga med att inte lämna några spår av provet på väggarna i rören; dessa celler kommer annars inte att färgas. Om nödvändigt, vortex cellerna och centrifugera röret. - I varje rör, lägga till lämplig volym av antikroppar riktade mot cell yta markörer (förutom ryggrad markörer), som anges i tabell 2. Blanda väl med en pipett. Inkubera i 30 min på RT skyddas från ljus.
- Tillsätt 2 mL av lyseringslösning lösning. Blanda väl med en pipett. Inkubera i 10 min vid RT skyddas från ljus.
- Centrifugera i 5 min vid 540 x g. Kasta bort vätskefasen utan att störa cellpelleten, lämnar cirka 50 µL residualvolym i varje rör. Blanda väl med en pipett.
- Tillsätt 2 mL av tvätt buffert till cellpelleten. Blanda väl med en pipett.
- Upprepa steg 2,10 – 2.11 (tvätta 2).
- Centrifugera i 5 min vid 540 x g. Kasta bort vätskefasen utan att störa cellpelleten och slamma cellpelleten i 200 µL av PBS. Blanda väl med en pipett.
- Förvärva cellerna, helst omedelbart efter färgning eller förvaras vid 4 ° C, skyddas från ljus, för mer än 1 h tills mäts i en flödescytometer.
3. data Acquisition
- Öppna ett nytt Experiment i Diva programvara och döp om den enligt namn, typ av prov och datum.
- Skapa ett nytt prov som innehåller 3 rör. Ange i layouten Experiment de antikroppar som används i varje rör.
- Klicka på höger på ' Cytometer inställningar ', Välj ' Inställningar ' och tillämpa de värden som erhålls i månatliga Setup (steg 1.1.3.10).
- Öppna ett nytt Global kalkylblad och skapa dot tomterna: SSC-A / FSC-A, SSC-A / CD45-HV500-A, SSC-A / FITC-A, SSC-A / PE-A, SSC-A / CD34-PerCP-Cy5.5, SSC-A / CD117-PECy7-A, SSC-A / APC-A, SSC-A / APCH7-A, SSC-A / HLA-DR-HV450-A. I SSC-A/FSC-A dot tomten, skapa en grind för att markera singlet celler. I SSC-A/CD45-BV500-A dot tomten, skapa portar markera 4 populationer: granulocyter, monocyter, Blaster och lymfocyter. Projektet dessa populationer i dot tomterna skapade tidigare.
- Skapa en ny Global kalkylblad för ersättning kontroll som beskrivs i steg 1.1.5.9.11.3.
- Förvärva röret i 'MEDIUM' förvärv och posten 500.000 händelser/tube. Efter teknisk validering (utvärdering av ersättning och ordentlig färgningen), exporterar du data som FCS3.0 filer.
4. dataanalys
Obs: för att konstruera de normala BM-databaserna var använda filer från friska donatorer och individer utan några bevis för en hematopoetisk sjukdom följande 11 från 18 filer för Neutrophils_NM databas, 10 från 18 filer för Monocytes_NM databasen och 14 från 18 filer för NRC_NM databas. Filerna kasseras visade olika tekniska problem, som presenteras i avsnittet representativt resultat. Filerna analyserades individuellt med hjälp av Infinicyt programvara (Tabell för material), som överensstämmer med de olika strategier som avbildas i figur 1A(1-3) för neutrofila härstamning (profil Neutrophils_Maturation.inp), figur 2 A för monocyt härstamning (profil Monocytes_Maturation.inp) och figur 3A(1-2) för erytroid cell härstamning (profil NRC_Maturation.inp).
- Strategi för neutrofiler -Neutrophils_NM databas konstruktion
- Identifiera CD34 + neutrofiler-begått Blaster med en korsning av sju portar, vilket gör att valet av CD34 + CD117 + HLADR + låg CD10 - CD13 + CD11b-händelser (figur 1A.1). Tilldela dessa händelser till fliken 'Neutrofila' i befolkningen hierarkiträdet och därefter avmarkerar du den här fliken för att ta bort dessa celler (avbildad i blått) från visning av återstående händelserna (grå).
- Isolera den CD117 + CD34 - CD13 + CD11b-HLADR + låga neutrofila prekursorer med en korsning av sex portar som avbildas i figur 1A(2) och tilldela dem till fliken 'Neutrofila' .
- Identifiera mer mogna neutrofiler med en korsning av fyra grindar, möjliggör diskrimineringen av CD45dim SSCint-Hej CD117-HLADR-celler och deras tilldelning till fliken 'Neutrofila' .
- Avmarkera återstående händelserna, att hålla endast neutrofilerna synligt, sedan exportera denna population genom att klicka på ' fil | Exportera ' och kontrollera att alla parametrar som krävs kontrolleras och spara data som FCS filer.
- I en sammanslagen fil bestående av alla exporterade FCS filer, utföra en kvalitetskontroll genom att utvärdera intensiteten av uttryck av markörer för varje delpopulation. Tomter med medianer för varje fil och SD kurvor för varje subpopulation som visas, använder APS och avlägsna fall utanför 2SD kurvorna (se detaljer i avsnittet representativa resultat) (figur 1B).
- I den resulterande sammansatta filen med ”neutrofiler” synliga, rita mognad vägen på ett APS-diagram (figur 1C vänster) och Spara som en .cyt-fil.
Obs: En jämförelse mognad Diagram kan visualisering av alla parametrar från alla filer som ingår i databasen Neutrophils_NM representerade mot normaliserade databasen. Diagrammet presenteras i figur 2C, höger sida, visar att alla filer som ingår i databasen Neutrophils_NM (n = 11) passar i 2 SD jämfört med median i gruppen.
- Strategi för monocyter - Monocytes_NM databas konstruktion
- Identifiera cellerna som monocytic härstamning (CD117 +/-CD64 + Hej HLADR + Hej) använder en korsning av fyra grindar (figur 2A). Tilldela dessa händelser till fliken 'Monocytic' i befolkningen hierarkiträdet.
- Avmarkera återstående händelserna, att hålla endast monocytic celler synliga, sedan exportera denna population genom att klicka på ' fil | Exportera ' och kontrollera att alla parametrar som krävs kontrolleras och spara data som FCS filer.
- I en sammanslagen fil bestående av alla exporterade FCS filer, utföra en kvalitetskontroll genom att utvärdera uttryck för markörer för varje delpopulation intensitet och ta sedan bort fall utanför 2SD kurvorna (detaljer i representant Results) (figur 2 ( B).
- I den resulterande filen med ”Monocytic” celler synliga, rita mognad vägen i APS diagram (figur 2C vänster) och spara detta som en .cyt-fil.
Obs: En jämförelse mognad Diagram kan visualisering av alla parametrar från alla filer som ingår i databasen Monocytes_NM representerade mot normaliserade databasen. Diagrammet presenteras i figur 2C, höger sida, visar att alla filer som ingår i databasen Monocytes_NM (n = 10) passar i 2 SD jämfört med medianen av gruppen.
- Strategi för kärnförsedda röda blodkroppar (NRC) - NRC_NM databas konstruktion
- Identifiera CD34 + erytroid begått Blaster med en korsning av sju grindar som tillåter val av CD34 + CD117 + HLADR + låg CD105 + CD33 - CD36 + CD71 + händelser (figur 3a.1). Tilldela dessa händelser till fliken ”NRC” i hierarkiträdet befolkningen och då uncheck den här fliken för att ta bort dessa celler (avbildas i rött) från visning av återstående händelserna (grå).
- Identifiera mer mogen NRCs använder en korsning av fyra grindar som tillåter diskriminering av CD45-/ + dim SSClow CD36 + Hej CD71 + Hej CD105 +/-celler. Tilldela dessa händelser till fliken ”NRC” (figur 3a.2). Trombocyter (CD36 + Hej SSClow celler) måste tas bort från NRC befolkningen (figur 3a.2).
- Avmarkera återstående händelserna, att hålla endast NRC celler synliga, sedan exportera denna population genom att klicka på ' fil | Exportera ' och kontrollera att alla parametrar som krävs kontrolleras och spara data som FCS filer.
- I en sammanslagen fil bestående av alla exporterade FCS filer, utföra en kvalitetskontroll genom att utvärdera uttryck för markörer för varje delpopulation, följt av borttagning av fallen utanför den 2SD kurvor (se detaljer i representant Results) (intensitet Figur 3 ( B).
- I den resulterande filen med ”NRC” celler synliga, rita mognad vägen i APS diagram (figur 3C, vänster) och spara detta som en .cyt-fil.
Obs: En jämförelse mognad Diagram kan visualisering av alla parametrar från alla filer som ingår i databasen NRC_NM representerade mot normaliserade databasen. Diagrammet visas i figur 3C, höger sida, visar att alla filer som ingår i databasen NRC_NM (n = 14) passar i 2 SD jämfört med median i gruppen.
- Utvärdering av mognad i BM myeloisk fack med mognad databaserna
- Öppna filen .cyt motsvarar linjen av intresse (i.e., Neutrophils_NM_GMFF.cyt för neutrofila härstamning, Monocytes_NM_GMFF.cyt för monocytic härstamning och NRCs_NM_GMFF.cyt för erytroid härstamning).
- Högerklicka på 'Mognad' fliken under fliken motsvarar linjen av intresse (' neutrofiler | Monocytic | NRC') och spara databasen mognad till mognad.
- Öppna en ny FCS-fil och utföra analys som tidigare förklarats (steg 4.1.1–4.1.3 för neutrofiler, steg 4.2.1 för Monocytic celler, och steg 4.3.1–4.3.2 för NRC).
- Rita den mognad vägen för befolkningen av intresse.
- Öppna motsvarande databas på fliken 'Verktyg' (databasen analys) och jämför befolkningen analyseras med motsvarande mognad databas. Kontrollera data för kompatibilitet med den tillgänglig databasen: komplett kompatibilitet (grön triangel); partiell kompatibilitet, i de flesta fall diskrepanser i namn parametrarna (gul triangel); och inkompatibilitet (röd triangel).
- Om uppgifterna är kompatibla eller partiell kompatibler, skapar programvaran diagrammet ' normaliserade mognad skillnader ' . Visualisera ' Parameter Band mognad skillnader ', öppna ett nytt diagram i 'Diagram' -fliken, klicka på 'Mognad' och välja hur många parametrar att visas, klicka på visas 'OK' och diagrammet. Med Högerklicka i diagrammet; ändringar kan göras i datavisualisering, databas visualisering och mognad Diagram visualisering.
- För att visualisera betydelsen av skillnaderna mellan den nya filen och uppgifterna i databasen, konfigurera en zoom (Högerklicka på ' normaliserade mognad skillnader ' och tillämpa 'Zooma').
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De 54 BM prover som skördats i K-EDTA antikoagulans inkluderades i studien. MFC data analyserades i avsaknad av någon information om patienterna. Retrospektiv studie visade att BM proverna var från 7 friska donatorer (5 hanar och 2 honor med en medianålder av 47,4 [35-48], 11 individer utan tecken på en hematopoetisk sjukdom (8 hanar och 3 honor med en medianålder av 57,9 [35-72]) och 36 fall med olika sjukdomstillstånd: 1 fall med anemi och lågt kreatinin nivå, 3 fall med anemi och hög kreatininnivåerna, 8 fall med anemi av inflammation, 1 fall med anemi orsakad av vitamin B12 brist, 4 fall med anemi ± andra cytopenier som orsakas av leverskada, 3 fall med autoimmun hemolytisk anemi, 5 fall med idiopatisk trombocytopen purpura, 1 fall med makrofagaktiveringssyndrom, 3 fall med fullständig remission efter lymfom behandling (minimal residual sjukdom < 0,01%) och 7 fall redovisade blodsjukdomar (4 MDS, 1 AML, 1 kronisk myelomonocytär leukemi och 1 myeloproliferativa syndrom JAK2 positiva). Denna sist kategori ingår 18 män och 18 kvinnor med en genomsnittlig ålder 60,3 [17-100]. Alla prover var från kaukasiska individer. Byggnaden databaserna tillät att identifiera och åtgärda flera problem relaterade till provberedning och förvärv. I vårt fall ingår de slutliga databaserna 14/18 filer för NRC mognad, 11/18 filer för neutrofila mognad och 10/18 filer för monocyt mognad. Filer som inte ingick i databaser poserade olika tekniska problem. De vanligaste frågorna som färgning observerades för CD11b och CD13 i neutrofiler, CD300e och HLADR i monocyter, och CD71 och HLADR i NRCs. exportera data kan vara en källa till fel; de mest frekventa i vårt dataset var avsaknad av FSC-H i exporterade filer och de omkastningar av FSC-W med FSC-H som ibland uppstår i exporterande DIVA filer8. Utvärdering av nya fall av cytopenier misstänks vara MDS mot myeloisk Normal mognad databaserna möjliggöra identifiering av onormal uttryck av mognad antigener av neutrofiler härstamning (figur 4), monocyter (figur 5 ), och NRC (figur 6) även i fall utan Cytologisk eller cytogenetiska abnormiteter (figur 7). Annars skulle använder rutinmässigt förvärv programvara, såsom Diva, dessa vara svåra eller omöjliga att förverkliga.
Figur 4 : Representativa Flödesanalys för flödescytometri av neutrofiler i del(7) MDS fall. (A) i den normaliserade mognad skillnader diagram, det grå området motsvarar normala uttrycket av antigener från analysen av 11 normala filerna som ingår i databasen neutrofila (median± 2SD). Det onormala uttrycket av flera antigener observerades jämfört del(7) MDS fallet mot Neutrophils_NM databas (n = 1 kontra n = 11 normala kontroller prover). (B) parametern Band mognad diagram tillåta jämförelser mellan medianvärdet intensiteten av uttryck för varje markör på olika stadier av mognad (kontinuerlig full linjer) och 2SD kurvor beräknas för de 11 normala BM fall ingår i databasen (kontinuerlig streckade linjer). Fenotypiska avvikelser i neutrofiler som observerats i del(7) MDS fall jämfört med neutrofila Normal mognad databasen är följande: övergripande ökat uttryck av CD34, liten ökning av CD11b uttryck på omogna neutrofiler (steg 2), minskat uttryck av CD13 på omogna neutrofiler (steg 1-3) och liten ökning av CD16 uttryck på de två första etapperna av neutrofila mognad följt av måttliga ökningar av CD16 uttryck på de mogna neutrofilerna (steg 4-5). (C) visar motsvarande dot tomter som visualiseras i DIVA programvara. Bild utvärdering med hjälp av DIVA-programvara möjliggör identifiering av ett litet antal fenotypiska avvikelser i detta MDS-fall: en ökad andel av CD34 + CD13 + prekursorer och nedreglering av CD13 uttryck. Onormal uttrycket av CD16 är svåra att Observera i denna typ av representation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Representativa Flödesanalys för flödescytometri av monocyter i del(7) MDS fall. (A) Normalized mognad skillnaderna diagram erbjuder en övergripande Visa antigen uttryck i olika skeden av monocytic cell härstamning mognad. Det grå området motsvarar normala uttrycket av antigener som härrör från analysen av 10 normala filer som ingår i databasen monocytic (median ± 2SD). Onormal uttrycket av flera antigen överskrider 2SD, men för vissa markörer, såsom CD35 och HLADR, överskrider det 4SD. (B) i den parametern Band mognad diagram, de fenotypiska avvikelserna i monocytic celler som observerats i en SMD del(7) fall när jämfört med monocyt Normal mognad databas (n = 1 jämfört med n = 10 normala kontroller prover) är följande: minskat uttryck av CD45 under stegen 1-4 av monocytic celler, av CD117 skeden 1-2 av monocytic prekursorer och HLA-DR övergripande. Det ökat uttrycket av CD35 i de 3 första stadierna av mognaden av de monocytic cellerna var den mest betydande abnormitet för denna härstamning. (C) den DIVA dot tomter som gör utvärdering av monocytic celler i en enda normal BM. (D) den DIVA prick tomter som gör utvärdering av monocytic celler i del(7) MDS fall. Bild utvärdering med hjälp av DIVA-programvara möjliggör identifiering av två fenotypiska avvikelser i detta MDS-fall: det minskat uttrycket av HLA-DR och det ökat uttrycket av CD35 i en del av monocytic prekursorer (röda befolkning). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Representativa Flödesanalys för flödescytometri av kärnförsedda röda blodkroppar i en del(7) MDS fall. (A) Normalized mognad skillnaderna diagram erbjuder en övergripande Visa antigen uttryck i olika skeden av NRC härstamning mognad. Det grå området motsvarar normala uttrycket av antigener från analysen av 14 normala filerna som ingår i databasen NRC Normal mognad (median ± 2SD). Onormal uttrycket av flera antigen överskrider 2SD, men för vissa markörer, såsom CD34, CD117, CD71 och CD105, överskrider det 4SD. (B) i den parametern Band mognad diagram, de fenotypiska avvikelser observerade i SMD del(7) fall jämfört med databasen NRC Normal mognad (n = 1 kontra n = 14 normala kontroller prover) är följande: minskat uttryck av CD34 i de två första etapperna av mognad, CD117, CD105, CD71 och HLA-DR på etapp 1 av erytroid härstamning prekursorer. Bild utvärdering med hjälp av DIVA-programvara möjliggör identifiering av CD71 onormala uttryck på erytroid celler i detta MDS-fall, men andra ändringar är inte detekterbar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7 : Representativa flödescytometri Flödesanalys av neutrofiler, monocyter och NRC i ett tidigt skede MDS-fall utan morfologiska dysplasi och cytogenetiska aberrancies. (A), fördelningen av omogna och mogna celler inom olika mognad stadier för de tre myeloisk härstamningar: neutrofiler, monocyter och NRC. Ett ökat antal mogna monocyter (etapp 5) och en lätt minskning av monocytic omogna celler (steg 2 av mognad) observerades. (B) den normaliserade mognad skillnader diagram visar att den fenotypiska avvikelser överstiga 2SD utan CD34, CD117, CD11b, CD16 och HLADR, de är högre vid 4SD. fenotypiska avvikelser observerade för neutrofiler är följande: något ökad SSC värden i neutrofila prekursorer så omogna (steg 1), minskning av uttryck av CD34 (steg 1), av CD117 (steg 1), av CD16 (stadium 1 - 2) och HLADR (steg 1-3 av mognad). Ett ökat uttryck av CD11b observerades på neutrofila prekursorer så omogna (steg 1). (C) den normaliserade mognad skillnaderna diagrammet visar att de viktigaste fenotypiska avvikelserna observerats för monocytic härstamning (överstigande 10SD) är ökat uttryck av CD35 och tidig förvärv av CD300e på de omogna monocytic prekursorer. Andra fenotypiska avvikelser observerats på monocytic härstamning är som följer: försvagning av FSC och SSC på mer mogna monocyter (steg 3-5) och liten minskning av uttryck av CD14 på etapperna 2-3 i monocytic celler. (D), Normalized mognad skillnaderna diagram och parametern Band mognad diagrammen visar att de viktigaste fenotypiska avvikelser observerade för NRC: ökat uttryck av CD117 (överstigande 10SD) på steg 2-3 i NRC mognad, ökat uttryck av CD34 (överstigande 5SD) under det andra steget av mognaden av NRC och minskat uttryck av CD36 på tidiga erytroid prekursorer (steg 1-3). Vetenskapliga Styrkommittén på omogna NRC är dessutom lägre än på de normala motsvarigheterna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Dessutom tillåter tolkningen av betydelsen av skillnader mellan antigen uttryck på patologiska inställningar och normala motsvarigheter för ”kvantifiering” av dessa avvikelser, med identifiering av dem som är discriminant för en grupp av fallen. Detta kan också göra det möjligt att rangordna dem baserat på vikten för en uppföljning. I denna studie klassificerades alla 7 fall av blodsjukdomar med myeloisk dysplasi funktioner (4 MDS, 1 AML, 1 kronisk myelomonocytär leukemi och 1 myeloproliferativa syndrom JAK2 positiva) som onormala jämfört med NBM databaser. Dessutom elimineras utvärdering mot databasen Neutrophils_NM misstanken om myeloisk dysplasi i 7 fall med giftiga, inflammatorisk, autoimmun hemolytisk anemi och anemi från kronisk njursjukdom. Utvärderingen mot databasen Monocytes_NM elimineras misstanke om myeloisk dysplasi i 4 fall med idiopatisk trombocytopen purpura (ITP), medan utvärdering mot NRC_NM tillåtet för differentiering i 3 fall, 2 av inflammatoriska anemi och 1 av ITP. BM aspirates från patienterna i fullständig remission efter lymfom eller solid tumör behandlingar var inom 2 SD från medianen av de normala databaserna för alla tre utvecklingslinjerna, och därmed dessa prover kan vara alternativ till friska givare BM prover.
Figur 1 : Analys strategier för neutrofila cell härstamning. (A) val av CD34 + CD117 + HLADR + låg CD10 - CD13 + CD11b-neutrofiler föräldraparets realiserades av skärningspunkten mellan sju grindar som skildras i A1. Nästa steg i mognad, CD117 + CD34 - CD13 + CD11b-HLADR + låga neutrofila prekursorer valdes med en korsning av sex portar som skildras i A2. De mer mogna neutrofilerna identifieras slutligen genom en korsning av fyra grindar som tillåter diskriminering av CD45dim SSCint-Hej CD117-HLADR-celler (A3). De flesta discriminant markörerna för neutrofila härstamning var CD34, CD117, CD11b och CD16. Tillsammans med CD13, dessa parametrar möjliggöra identifiering av fem subpopulationer: CD34 + stamfäder (CD34 + CD117 + CD13 +låg CD11b - CD16-) (mörkblå); CD34 - CD117 + CD13 +Hej CD11b-CD16-neutrofila prekursorer (blå); CD34 - CD117 - CD13 +låg CD11b-CD16-neutrofiler (3rd steg av mognad, ljusblå); CD34 - CD117 - CD13 +låg CD11b + CD16 +lågt antal neutrofiler (4: e steg av mognad, rosa); Mogna neutrofiler (CD34 - CD117 - CD13 +Hej CD11b +Hej CD16 +Hej, violett). Varje färgade cirkeln representerar medianen av en subpopulation för markören av intresse från ett prov (B). (C) visar den homogen fördelningen av de testa parametrarna under de neutrofila cell mognaden jämfört med 2 SD av normal mognad databasen (n = 11). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Analys strategi för monocyter. Identifiering av monocytic härstamning celler (CD117 +/-CD64 + Hej HLADR + Hej) utförs med hjälp av en korsning av fyra grindar (A). De mest discriminant markörer för monocytic härstamning var CD14, CD300e (IREM2), CD35, och HLA-Dr längs med CD117, dessa parametrar medger identifiering av tre subpopulations: CD34 - CD117 +låg/ - HLADR +Hej CD35 - CD14 - CD300e - (röd); CD34 - CD117 - HLADR +med CD35 +med CD14 +med CD300e - (orange); mogen monocyter CD34 - CD117 - HLADR +med CD35 +Hej CD14 +Hej CD300e + (grön) (B). (C) visar den homogen fördelningen av de testa parametrarna under den monocytic cell mognaden jämfört med 2 SD av normal mognad databasen (n = 10). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Analys strategier för NRCs. (A) identifiering av CD34 + erytroid begått Blaster realiserades med en korsning av sju grindar som tillåter val av CD34 + CD117 + erytroid stamfäder (A1). De mer mogna NRCs identifieras genom en korsning av fem grindar (A2). Uteslutandet av trombocyter (CD36 + Hej SSClow celler) från NRC befolkningen krävs (A2). De flesta discriminant markörerna för erytroid cell härstamning var CD34, CD117, CD71 och CD105. Tillsammans med CD33, dessa parametrar möjliggöra identifiering av tre subpopulationer: CD45 +låg CD34 + CD117 + HLADR +med CD71 +med CD36 +med CD105 +Hej (röd); CD34 - CD117 + HLADR +låg CD71 +Hej CD36 +Hej CD105 +Hej NRC (2nd steg av mognad, rosa); CD34-CD117-HLADR-/ +låg CD71 +Hej CD36 +med CD105 +låg/-NRC (mer mogen NRCs; puckellax) (B). (C) visar den homogen fördelningen av de testa parametrarna under NRC mognaden jämfört med 2 SD av normal mognad databasen (n = 14). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: lista över fluorokrom-konjugerad antikropp reagenser som används till setup fluorescens ersättning matriser med befolkningarna referens. Klicka här för att se en större version av denna tabell.
Tabell 2: Kombination och mängder antikroppar används för utvärdering av mognaden av neutrofiler, monocyter och erytroid celler i BM. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna tabell.
Kompletterande fil 1: Monocytes_Maturation.inp vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande fil 2: Monocytes_NM_GMFF.CYT Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande fil 3: Neutrophils_Maturation.inp Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande fil 4: Neutrophils_NM_GMFF.CYT Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande fil 5: NRC_Maturation.inp Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande fil 6: NRC_NM_GMFF.CYT Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kvaliteten på BM aspirera skulle kunna inverka på de slutliga resultaten. Hemodilution av den BM aspirera snedvrida fördelning av celler i olika stadier av mognad på grund av avsaknad av föräldraparets eller prekursorer celler. Förmodligen anställa en bulk lyseringslösning metod kan hjälpa normalisering av BM enkelarmade för hemodilution i flödescytometrisk flödesanalyser. Dessutom är de kritiska steg för utvärdering av BM myeloisk dysplasi av flödescytometri prov beredning och färgning, datainsamling och tolkning2,3. Stickprovet bearbetning och färgning bör utföras upp till 72 h efter BM skörd. Data bör förvärvas, helst omedelbart efter färgning eller lagra proverna vid 4 ° C, skyddas från ljus, för mer än 1 h tills mätning i flödescytometer. Databas-guidad tolkningen undviker subjektiv utvärdering av BM myeloida cell mognad.
Kombinationer av antikropp och provpreparering var i stort sett överensstämde till EuroFlow förfaranden9,10. Skillnaden jämfört med panelen EuroFlow var att alla antikroppar utom CD300e tillhandahölls av BD Bioscience. Flöde flödescytometri standardiseringen gjorde det möjligt att erhålla data med hög reproducerbarhet11, men detta innebär att gå med i en grupp som arbetar med standardisering av panelerna i fråga. I vår grupp förblir standardisering av SSC ett område förbättras. Den stora frågan angående MFC databaser byggnad är färgningsproceduren. Den inledande utdelningen av icke-ryggraden antikroppar i FACS rör innan du lägger till de lika mängder prov-ryggraden mixen undviker upprepande ryggraden färgning vid eventuella fel i fördelningen av andra icke-ryggraden antikroppar. Dessutom för att övervinna färgningen problem det finns två möjligheter: antingen öka inkubationstiden av antikroppar från 15 till 30 minuter, eller använda de rekombinanta antikroppar, som ger större reproducerbarhet, enligt tillverkarens specifikationer12. Analysen utfördes i överensstämmelse med nyligen publicerade data13,14,15. När det gäller monocyter analys observerade vi frekvent avsaknad av CD34 + CD117 - monocytic prekursorer, som tidigare har rapporterats av Shen o.a. 16. av denna anledning vi eliminerat från analys strategi en kompletterande grind för isolering av denna särskild population. Skärningspunkten mellan grindarna så att isolering av CD64 + F HLADR + F/int och CD117 +/-innehåller omogna prekursorer (CD117 + CD34 + låg /-) och de mer mogna monocyter.
Utvärdering av nya FCS filer jämfört med en databas bidrar till en mer objektiva, standardiserade analys och tolkning och undviker feltolkningar av så kallade mönster erkännande, vilket är svårt att standardisera3. Kvantifiering av amplituden av fenotypiska avvikelser jämfört med normala databaser gör det möjligt att rangordna dessa avvikelser, som kan bidra till att förbättra MFC noter för MDS diagnos. Dessutom tillåter denna metod exakt identifiering av den fenotypiska avvikelser på omogna CD34 + eller CD117 + prekursorer och i mer mogna celler, som inte är uppenbart när du använder de aktuella analysen strategierna i förvärvet programvara. Denna metod är relevanta vid diagnos av MDS-fall som gör eller har inte uppenbart morfologiska abnormiteter eller som göra eller bär inte cytogenetiska återkommande aberrancies.
Förbättring av antikropp färgning behövs, och tillägg av nya normala BM data i databaser som krävs för att öka robusthet, tillförlitlighet och känslighet för analysen. Denna metod skulle kunna tillämpas, med ytterligare utredning, till cytopenier från andra orsaker eller till klonal blodbildning obestämt potential (CHIP), för att identifiera de fenotypiska förändringar på ett tillförlitligt sätt besläktade med dysplastiska processer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen. De flödescytometri institutionen, hematologi laboratorium vid University Hospital av Saint-Etienne är medlem i EuroFlow Consortium.
Acknowledgments
De antikroppar som används i denna studie gavs av BD Biosciences. Författarna vill tacka sin kollega, Dr Pascale Flandrin-Gresta, från Institutionen för molekylärbiologi, hematologi laboratorium, University Hospital i Saint-Etienne, Frankrike, som lämnat kompetens för tolkning av NGS data för andra MDS-fall. Författarna är tacksamma för de klinikern hematologer för deras intresse och engagemang i denna studie och för patienter och friska donatorer för deras avtal att delta i denna studie. Författarna vill även tacka stiftelsen ”Les Amis de Rémi” finansiellt stöd för publikation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSCanto II flow-cytometer | BD Biosciences, CA, USA | SN: V33896301336 | 3-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf |
| Awel C48-R Centrifuge | AWEL Industries, FR | SN: 910120016; Model No: 320002001 | low speed centrifuges; capacity 60 FACS tubes |
| Pipetts of 10µL and 200µL | |||
| Pasteur pipettes | |||
| 15 mL Falcon tubes | |||
| polypropylene tube for FACS | |||
| Mouse Anti-Human HLA-DR | BD Biosciences, CA, USA | 655874 | clone L243 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm) |
| Mouse Anti-Human CD45 | BD Biosciences, CA, USA | 560777 | clone HI30 Mouse IgG1, κ Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm) |
| Mouse Anti-Human CD16 | BD Biosciences, CA, USA | 656146 | clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD13 | BD Biosciences, CA, USA | 347406 | clone L138 Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD34 | BD Biosciences, CA, USA | 347222 | clone 8G12 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm) |
| Mouse Anti-Human CD117 | BD Biosciences, CA, USA | 339217 | clone 104D2 Mouse BALB/c IgG1 Fluorochrome PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm) |
| Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, CA, USA | 333143 | clone D12 Mouse BALB/c IgG2a, κ D12, Fluorochrome APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm |
| Mouse Anti-Human CD10 | BD Biosciences, CA, USA | 646783 | clone HI10A Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Mouse Anti-Human CD35 | BD Biosciences, CA, USA | 555452 | clone E11 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD64 | BD Biosciences, CA, USA | 644385 | clone 10.1 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD300e | Immunostep | IREM2A-T100 | clone UP-H2 Mouse BALB/c IgG1, k Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, CA, USA | 641394 | clone MoP9 Mouse BALB/c IgG2b, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Mouse Anti-Human CD36 | BD Biosciences, CA, USA | 656151 | clone CLB-IVC7 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD105 | BD Biosciences, CA, USA | 560839 | clone 266 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD33 | 345800 | clone P67.6 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
|
| Mouse Anti-Human CD71 | BD Biosciences, CA, USA | 655408 | clone M-A712 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Lysing Solution 10x Concentrate (IVD) | BD Biosciences, CA, USA | 349202 | |
| FACSFlow Sheath Fluid | BD Biosciences, CA, USA | 342003 | |
| FACSDiva CS&T IVD beads | BD Biosciences, CA, USA | 656046 | |
| RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS | Cytognos, Salamanca, Spain | SPH-RCP-30-5A | lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01 |
| Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD) | BD Biosciences, CA, USA | ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291 | |
| Diva software versions 6.1.2 and 6.1.3 | BD Biosciences, CA, USA | ||
| Phosphate buffered saline tablets | R&D Systems, Minneapolis, USA | 5564 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, France | A9647 | |
| Sodium azide 99% | Sigma-Aldrich, France | 199931 | |
| Infinicyt software version 1.8.0.e | Cytognos, Salamanca, Spain |
References
- Orfao, A., Ortuño, F., de Santiago, M., Lopez, A., San Miguel, J. Immunophenotyping of Acute Leukemias and Myelodysplastic Syndromes. Cytometry Part A. 58, 62-71 (2004).
- Porwit, A., et al. Revisiting guidelines for integration of flow cytometry results in the WHO classification of Myelodysplastic Syndromes - proposal from the International/European LeukemiaNet Working Group for Flow Cytometry in MDS (IMDSFlow). Leukemia. 28 (9), 1793-1798 (2014).
- Westers, M. T., et al. Implementation of flow cytometry in the diagnostic work-up of myelodysplastic syndromes in a multicenter approach: Report from the Dutch Working Party on Flow Cytometry in MDS. Leukemia Research. 36, 422-430 (2012).
- Meehan, S., et al. AutoGate: automating analysis of flow cytometry data. Immunologic Research. 58, 218-223 (2014).
- Greenberg, P. L., et al. NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology: myelodysplastic syndromes. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 9, 30-56 (2011).
- Greenberg, P. L., et al. Myelodysplastic Syndromes, Version 2.2017, Clinical Practice Guidelines in Oncology. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 15, (2017).
- WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Revised 4th Edition. Swerdlow, S. H., et al. (2), IARC Press. Lyon, France. 86-128 (2017).
- https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html. , Available from: https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html (2018).
- Composition of EuroFlow panels and technical information on reagents Version 1.5. , (2017).
- EuroFlow Standard Operating Procedure (SOP) for sample preparation and staining Version 1.2.1. , (2015).
- Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26, 1986-2010 (2012).
- http;//www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-flow-cytometry/reagents/antibodies-and-dyes/recombinant-antibodies.aspx. , Available from: http;//www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-flow-cytometry/reagents/antibodies-and-dyes/recombinant-antibodies.aspx (2018).
- van Dongen, J. J. M., et al. EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. Leukemia. 26, 1908-1975 (2012).
- Matarraz, S. Introduction to the Diagnosis and Classification of Monocytic-Lineage Leukemias by Flow Cytometry. Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 92 (3), 218-227 (2015).
- Westers, M. T. Immunophenotypic analysis of erythroid dysplasia in myelodysplastic syndromes. A report from the IMDSFlow working group). Haematologica. 102, 308-319 (2017).
- Shen, Q., et al. Flow cytometry immunophenotypic findings in chronic myelomonocytic leukemia and its utility in monitoring treatment response. European Journal of Haematology. 95, 168-176 (2015).
