Summary
MDS diagnosen er vanskelig i fravær av morfologiske vilkår eller ikke-informative cytogenetics. MFC kan avgrense MDS diagnostiseringsprosessen. For å bli nyttig for klinisk praksis, MFC analyse må være basert på parametere med tilstrekkelig spesifisitet og følsomhet, og dataene bør være reproduserbar mellom forskjellige operatører.
Abstract
En gruppe startet i fransk cytometri Association (AFC) ble utviklet for å harmonisere anvendelse av multiparameter flowcytometri (MFC) for myelogen sykdom diagnose i Frankrike. Protokollen presenteres her var avtalt og anvendt mellom September 2013 og November 2015 i seks franske laboratorier (University sykehus Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nice, og Lille Institut Paoli-Calmettes i Marseille) og standardisering av benmarg eksempel forberedelse og datafangst. Tre modning databaser ble utviklet for nøytrofile, monocytic, og erythroid linjene med benmarg fra "sunn" donor individer (individer uten noen bevis på en blodkreft sykdom). En robust metode for analyse for hver myelogen avstamning skulle gjelde for rutinemessig diagnostisk bruk. Nye tilfeller kan analyseres på samme måte og sammenlignet mot vanlige databasene. Dermed kvantitative og kvalitative fenotypiske abnormiteter kan identifiseres, og de over 2SD sammenlignet med data av normal benmarg prøver bør vurderes om patologi. Større begrensningen er høyere variasjon mellom dataene ved hjelp av monoklonale antistoffer med metodene basert på hybridoma-teknologi og brukt i klinisk diagnose. Angi kriterier for teknisk validering av data ervervet kan forbedre nytten av MFC for MDS diagnostikk. Etableringen av disse kriteriene krever analyse mot en database. Reduksjon av etterforsker subjektivitet i dataanalyse er en viktig fordel med denne metoden.
Introduction
I fravær av fenotypiske merkene gjelder dysplastic endringene skjer i myeloide celler under MDS initiering og progresjon, har en ny tilnærming blitt foreslått i årene basert på vurderingen av modning veier (endret uttrykk for myeloid antigener i produksjonen av modne myeloide celler) eller av unormal fordelingen av ulike celletyper i benmargen (BM) celle rom1,2.
Denne artikkelen presenterer en ny metode for standardisert anvendelsen av MFC for å registrere dysplastic endringer i BM myelogen celle rom AML syndromer (MDS) eller andre myelogen Hematologisk sykdommer. Denne studien viser også nytten av bruker modning databaser for MFC dataanalyse.
Standardisering av eksempel forberedelse prosedyre, datainnsamling og analyse ved hjelp av databasene ville tillate identifikasjon av de mest relevante fenotypiske unormalt knyttet til dysplastic endringer i BM myeloide celler. Derfor kreves statistisk valgte delsett basert på godt merket og anerkjente formater (automatisk befolkningen skilletegn (APS) diagrammer, histogrammer og dot tomter) for å utvikle en analyse strategi som kan brukes i påfølgende analyse runder. Oppdagelsen av robust fenotypiske unormalt i MDS ville lette diagnosen i tilfeller med eller uten minimal morfologiske dysplasia og uten cytogenetic aberrancies. Identifikasjon av diskriminerende parametere tillater for reduksjon av immunophenotypic paneler kan forenkle gjeldende score2, tillater deres anvendelse i klinisk rutinelaboratorier.
Denne metoden begrenser de subjektive fortolkninger av cytometri data, som har vært varsles på MDS diagnose3. Dette er en forutsetning for utviklingen av automatiserte verktøy for prosessering og analysere flyt data4.
MDS omfatter en heterogen gruppe klonal blodkreft stem cell (HSC) lidelser der den spliceosome mutasjoner samarbeide med spesifikke epigenetic modifikatorer til MDS fenotypen. Det er nå kjent at sammen med HSC mutasjoner, andre er involvert i MDS patofysiologi, som avvikende immun-mediert betennelse og interaksjoner mellom ondartet HSCs og stromal microenvironment av BM. Disse mekanismene beholdes imidlertid dårlig forstått. Den brede klinisk og biologisk mangfold i MDS gjør diagnose og utvalg av optimal terapi en utfordring. I det siste tiåret, har flere studier vist at MFC er ofte mer følsom oppdage dysplasia2 enn morfologi, men teknisk og økonomisk begrensninger gjør denne teknikken vanskelig å standardisere, med resultater ofte avhengig av erfaring av tolk3. Dessuten, er det uklart hvordan MFC kan tips balansen mot MDS i tilfeller med eller uten minimal morfologiske dysplasia og i fravær av cytogenetic anomalier, eller i borderline tilfeller hypocellular MDS, med en lav blast teller, fra andre ikke-klonal BM lidelser som benmarg feil (dvs., aplastisk anemi). Det er fortsatt vanskelig å skille borderline tilfeller av MDS med et overskudd av støt fra akutt myelogen leukemi (AML). For alle disse grunner, de kliniske retningslinjene ikke integreres MFC testing i MDS endelige diagnose. I 2011 anbefales det amerikanske National omfattende Cancer Network (NCCN) MFC for estimering av andelen CD34 + celler, oppdagelsen av paroxysmal nattlige hemoglobinuria kloner, og tilstedeværelsen av cytotoksiske T-cellen kloner i hypocellular MDS5. De to sistnevnte situasjonene også innebære et terapeutisk mål fordi kliniske data har vist god respons av disse pasientene til suppressive terapi6. 2017 NCCN retningslinjene, siterer International arbeider gruppe (IWG)-anbefalingene oppført avvikende immunophenotyping oppdagelsen av MFC blant co kriteriene for MDS diagnose, men uten å gjøre noen spesifikasjoner6. I tillegg fastsetter til nylig publisert WHO klassifisering at MFC alene ikke er tilstrekkelig til å etablere en primærdiagnose på MDS i fravær av avgjørende morfologiske og/eller cytogenetic data7. MFC kan imidlertid brukes som en ekstra test viser feilregulering myelogen cellen modning mønstre og kvantifisere "avstand fra normal" for en pasient på et bestemt tidspunkt i sykdom kurset.
Denne metoden gjelder på kliniske laboratorier interessert i evalueringen av dysplasia inne BM myeloide celler ved hjelp av MFC-immunophenotyping, for å avgrense diagnosen MDS eller andre myelogen lidelser med dysplastic unormalt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen nedenfor er godkjent av den «Comité de beskyttelse des Personnes"(Independent etikk) Sud-Est 1 fra University Hospital av Saint-Etienne, Frankrike.
1. Cytometer innstillinger
Merk: Innstillingen cytometer ble utført etter Frankrike Flow anbefalinger, i samsvar med EuroFlow prosedyre "EuroFlow Standard Operating protokoll (SOP) for apparatet oppsett og kompensasjon (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php).
- Månedlig instrument oppsett
- Slå på cytometer. Kontroller at alle væskenivåer er hensiktsmessig og åpne Diva 6.1.3. Utføre fluidics oppstart: i menylinjen, velger du ' Cytometer | Fluidics oppstart '. Klikk "OK" når spørsmål. Tillate cytometer å varme opp minst 30 min.
- Gjennomførelse sjekk - CST perler
Merk: For dette trinnet klargjør 12 75 mm polystyren tube, CST perler og skjede væske (se Tabell for materiale).- Merke en 12 x 75 mm2 polystyren rør 'CST'. Bland gitt perle ampullen mild inversjon eller svært skånsom vortexing. Legg til merket røret: 0,35 mL skjede væske og 1 dråpe CST perler. Vortex tube forsiktig og videre til oppkjøpet. Lagre røret for opptil 8 timer på 2-25 ° C i mørket hvis ikke skaffe umiddelbart.
- Utføre ytelse sjekken: i menylinjen, velger du ' Cytometer | CST'.
- I kategorien "Oppsett" modulen CST: bekrefte Canto II som i 4-2 H-2V standardkonfigurasjonen og også bekrefte at det finnes en opprinnelig opprettet med det gjeldende partiet av CST perler for denne konfigurasjonen. Hvis en opprinnelig plan ikke finnes, se CST perler IFU. Bekrefte at denne planlagte ikke er utløpt: under "styrer", velg "sjekk Performance" fra det miste-ned menyen.
- Sjekk "Last røret manuelt" og klikk "Kjør". Bekreft partinummeret vises. Forsiktig vortex utvannet perler utarbeidet over og når du blir bedt, laste utvannet perler og klikk "OK".
- Når gjennomførelse sjekk er fullført, må du bekrefte at Cytometer ytelse passerte. Klikk 'Vis rapport'. Kjør gjennomførelse sjekk hvis resultatene ikke bestått. Lagre rapporten i PDF-format med ytelse sporing rapport dato.
- Juster "Fluorescerende avdrag spenninger" med Rainbow perler (Tabell for materiale).
Merk: Målverdiene er fastsatt i Euroflow Standard prosedyre (SOP) med tittelen "20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads". Denne SOP er tilgjengelig på Euroflow nettsted (www.euroflow.org; i fellesområdene; Kategorien protokoller).- Opprett et nytt eksperiment via ' månedlige Instrument Setup dato | Prøven '.
- ', velger du optisk parametere og fluorochromes tilsvarer rør bekymret (FITC, PE, PerCPCy5.5, PE-Cy7, APC, APC-H7, V450, V500), og når ønsket oppkjøpet parameterne (Logg, A, H og / eller W). Bruk gjeldende CST innstillinger (Høyreklikk på "Cytometer innstillinger" av eksperimentet). Angi terskelen for FSC parameteren på 10.000.
- På cytometer, slå kompensasjon av mens sette fluorescens avdrag spenninger for målet MFI innstillingen. for dette formålet, gå i "Inspektør", gå til kategorien 'Erstatning' Deaktiver kompensasjon av unchecking "aktiverer kompensasjon" alternativet.
- Opprette et regneark ' mål MFI' med alle nødvendige dot tomter (n = 2; FSC versus SSC, FITC versus PE), histogrammer (n = 8, et histogram for hvert fluorescens detektor) og statistikk som viser referansen peak verdier (MFI og CV) for hver fluorescens kanal.
- Fortynne 1 dråpe av 8-peak Rainbow perler kalibrering partikler i 1 mL destillert vann og vortex før bruk. Tilegne seg uten å registrere 8-peak Rainbow perler løsningen på 'Lav' strømningshastighet. Lagre røret for opptil 8 timer på 2-25 grader i mørket hvis ikke skaffe umiddelbart.
- Gate singlet perler ' befolkning P1' i FSC versus SSC bivariate dot plot og 8 eller 7 toppen i FITC versus PE bivariate dot plot (smarteste toppen eller neste nedover, som det er fastsatt i Euroflow dokument kalt "20180302_7th_ Peak_Target_Values_Rainbow_Beads") og gi denne gate befolkningen P2.
- Fortsette oppkjøpet av 8-topper Rainbow perle suspensjon og justere avdrag spenninger i alle fluorescens kanaler til MFI målverdier ifølge Euroflow dokumentet "20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads".
- Når målet MFI verdier for 8 eller 7 toppen er nådd, registrere målet MFI oppnådd og tilsvarende siste avdrag verdier. Skaffe 5.000 arrangementer og registrere data.
Merk: At avdrag verdier må brukes under trinn 1.2.3 (ytelse sjekk - bekreftelse av avdrag verdier med Rainbow perler). - Registrere disse verdiene gjør en utskrift skjermen med regneark ' mål MFI' og instrument og lagre som JPG bilde.
Merk: Når en "Ny" rør opprettes, avdrag verdiene variere uventet. For dette er en dobbel kontroll av avdrag viktig. Sammenligne hver gang avdrag verdiene i notatene, dobbeltsjekke at ' mål MFI' og avdrag verdiene er riktige! - Lagre 'Innstillinger'. Høyreklikk på "Cytometer innstillinger"i leseren. Fra rullegardinmenyen, velg "innstillinger"og lagre. Klikk "OK". Hvis du blir spurt, klikker du Ja for å beholde terskelverdier.
Merk: Lagre programmet innstillingene med standardnavnet. IKKE kan endre innstillingene.
- Juster 'FCS' og "SSC spenninger" med lysed vasket blod (LWB).
Merk: For dette trinnet, 50 µL av en perifert blod (PB) prøve fra en sunn frivillige, lysing løsning (Tabell for materiale) og vaske bufferen er nødvendig.- Pipetter for flergangsbruk 50 µL av PB i et rør. Legg 2 mL av fersk utvannet lysing løsning. Bland forsiktig og Inkuber i 10 min på RT.
- Sentrifuger i 5 min 540 x g.
- Sug opp nedbryting uten å forstyrre det cellen pellet, forlater ca 50 µL residualvolum i røret. Bland forsiktig og tilsett 2 mL filtrerte vaskeløsning.
- Sentrifuger i 5 min 540 x g.
- Gjenta en gang trinn 1.1.4.3–1.1.4.4.
- Legg 250 µL filtrerte vaske bufferen og bland forsiktig.
- Opprett en ny i eksperimentet opprettet for Rainbow perler oppkjøp ' prøven | Nytt regneark ': tegne en bi-parametriske SSC-A / FSC-en graf.
- Skaffe cellene, gate lymfocytter i en FSC versus SSC bivariate dot plot og justere FSC og SSC spenninger for å nå de følgende mener målverdiene for gated lymfocytt befolkningen: FSC: 55.000 (range 50 000 – 60 000) og SSC: 13.000 (range 11.000 –15,000).
- Kjøpe og registrere data med 10.000 hendelser. Kontroller de mener FSC og SSC målverdiene for gated lymfocytter. Justere FSC og SSC spenning om nødvendig.
- Skriv ut skjermen og lagre ut av målet kanalverdiene som hentes.
- Fluorescens kompensasjon innstillinger.
Merk: Single-farget kompensasjon kontrollene må settes etter målet MFI innstillingene og FSC/SSC innstillinger er etablert. For dette trinnet, en PB fra sunn frivillig, kompensasjon partikler (Tabell for materiale), er lysing løsning og vaske bufferen nødvendig. Listen over fluorochrome-konjugerte antistoffer reagenser pleide setup fluorescens kompensasjon matriser og deres referanse populasjoner er oppført i tabell 1.- Merke en tube per reagens i konfigurere fluorescens kompensasjon (FITC, PE, PerCPCy5.5, APC, V450, V500, PECy7 - CD117, APC-H7 - CD10, APC-H7 - CD14 og APC-H7 - CD71) og en "blank/unstained kvinne".
- Pipetter 50 µL av PB i hver rør eller 1 dråpe "negative" kompensasjon partikler + 1 dråpe av "positiv" kompensasjon partikler i kompensasjon kontrollrørene angitt ovenfor i tabell 1.
- Legge til riktig mengde antistoff reagensen i røret. Legg filtrerte vaske bufferen for å nå et siste volum på 100 µL per rør og bland forsiktig. Inkuber i 15 min på RT, beskyttet mot lyset.
- Legg 2 mL av fersk utvannet lysing løsning i rør med celler og bland forsiktig. Inkuber i 10 min på RT, beskyttet mot lyset.
- Sentrifuger i 5 min 540 x g.
- Sug opp nedbryting uten å forstyrre den cellen pellet forlate ca 50 µL residualvolum i hver retning. Bland forsiktig. Legg 2 mL filtrerte vaske bufferen.
- Sentrifuge 5 min 540 x g.
- Sug opp nedbryting uten å forstyrre den cellen pellet forlate ca 50 µL residualvolum i hver retning. Legg filtrerte vaske bufferen for å nå et endelig antall 250 µL per rør og bland forsiktig.
- Opprette kompensasjon kontroller.
- Velg eksperiment opprettet for Rainbow perler oppkjøp på menylinjen. Opprette en ny ' prøven | Kompensasjonsoppsett | Opprette kompensasjon Kontroller.
- Den resulterende dialogboksen Merk av "inkluderer separate unstained kvinne kontroll rør/vel" . Opprette generiske (ikke etiketten-spesifikk) kompensasjon-kontroller for FITC, PE, PerCPCy5.5, APC, HV450, HV500. Opprette etikett-spesifikke kompensasjon kontroller for PE-Cy7-CD117, APC-H7 - CD10, APC-H7 - CD14 og APC-H7 - CD71. Klikk "OK".
- I et nytt regneark, opprette en bi-parametriske SSC-A / FSC-en graf og trekke en gate på lymfocytter (P1) og histogrammet tilsvarer fluorochrome som vil bli oppdaget i hver rør og trekke en P2 gate for positiv toppen. Vise hierarkiet (Høyreklikk på et diagram og velg ' Vis befolkningen hierarki ') for å se antall hendelser i P2, bortsett unstained kvinne kontroll røret.
- Utvid kompensasjon kontroller prøven i leseren.
- Vortex unstained kvinne cellene, forberedte ovenfor, 3 – 5 s. Installer forberedt unstained kvinne cellene i cytometer. Justere infusjonshastigheten til 'Medium' og klikk ' skaffe Data'. FSC-A vs SSC-A dot tomten, justere P1 porten å fullt omfatte lymfocytt befolkningen. Høyreklikk P1 porten. Velg 'Bruk alle kompensasjon kontroll'.
- 'Acquisition' Dashboard, klikk 'postdataene ' å kjøpe 5.000 arrangementer. For alle én farge farget kontroll cellene, kontroller at P2 intervall porten omfatter positiv befolkningen.
- For PE-Cy7 og APCH7 rør, legge til en P3 intervall gate histogrammet og sikre at det omfatter befolkningen negativ, og at P2 omfatter positiv befolkningen.
- Beregne kompensasjon. Velg fra menylinjen ' eksperiment | Kompensasjonsoppsett | Beregne kompensasjon '. Navnet kompensasjonsplanen: 'Kompensasjoner dato'. Velg 'Koble og lagre'.
- Lagre kompensasjonsplanen i katalogen Applikasjonsinnstillinger: Klikk på "Cytometer innstillinger | Programinnstillinger | Lagre ', navnet kompensasjonsmatrise 'Kompensasjon dato' og klikk "OK".
- Klikk på "Cytometer innstillinger"i leseren. I Inspector, gå til 'Erstatning' kategorien klikker Skriv ut i nedre høyre hjørne.
Merk: Denne informasjonen kan også hentes fra katalogen. - Kontroll av kompensasjonsplanen.
- Bland i en tube alle enkelt farget røret (APCH7 valg).
- Opprett et nytt eksperiment heter 'Kompensasjon bekreftelse dato', legge til ny prøve, klikk høyre "Cytometer innstillinger" i dette eksperimentet og velg ' Link | Koble | Programinnstilling ' lagret i trinn 1.1.3.10. Få 50 000 hendelser fra denne rør med de nye innstillingene.
- Bruke en ny globale regnearket. Opprette 1 dot tomten FSC-/ SSC AA og trekke en gate for å visualisere lymfocytter og n x (n-1) / 2 andre tomter fokusert på lymfocytter porten å visualisere to og to parametrene.
- Daglig Instrument oppsett
- Slå på cytometer. Kontroller at alle væskenivåer er hensiktsmessig og åpne Diva 6.1.3. Utføre fluidics oppstart: i menylinjen, velger du ' Cytometer | Fluidics oppstart '. Klikk "OK" når spørsmål. Tillate cytometer å varme opp minst 30 min.
- Gjennomførelse sjekk - CST perler: Gjenta trinn 1.1.2.1–1.1.2.5.
- Gjennomførelse sjekk - bekreftelse av avdrag verdier med Rainbow perler.
- Merk en polystyren rør som "regnbuen perler" og kontroller at partinummeret er i bruk. Grundig blande Rainbow perle ampullen. Forberede Rainbow perler, legge til 1 dråpe av Rainbow perler i 1 mL av deionisert eller destillert vann. Beskytte mot lyset.
Merk: Gå til anskaffelse eller lagre røret på 2-8 grader til oppkjøpet. - Opprett et nytt eksperiment: ' Rainbow perler dato '.
- Koble kompensasjoner: Høyreklikk på ' Cytometer innstillinger ', ' Linkinnstilling ', velge riktig kompensasjonsplanen opprettet i trinn 1.1.5.9.9 og velg 'Overskriv'.
- Koble kompensasjon: Høyreklikk på "Cytometer innstillinger", velg "Koble fra fra det tidligere tilkoblede setup" og klikk "OK".
- Bruk ' innstillinger ': Høyreklikk på "Cytometer innstillinger", velg ' innstillinger ', bruke innstillingen opprettet i trinn 1.1.3.10 under den månedlige installasjonen og velg 'beholde verdien for kompensasjon '.
- Velg bort 'Bruk kompensasjon'.
- Opprette en ny prøve i eksperimentet med mal for Rainbow perler. Erverve røret i 'Lav' oppkjøpet.
- Under perler oppkjøpet, justere P1 porten for å inkludere bare singlet perle befolkningen. Justere P2 porten på FITC-A / PE-A dot tomten inkludere bare singlet perle befolkningen. Registrer 10.000 hendelser.
- Kontroller at MFI og CV verdiene hentes for P2 befolkning er i pre-definerte mål for protokollen. Ellers vaske cytometer og starte på nytt. Lagre rapporten som PDF-format.
- Merk en polystyren rør som "regnbuen perler" og kontroller at partinummeret er i bruk. Grundig blande Rainbow perle ampullen. Forberede Rainbow perler, legge til 1 dråpe av Rainbow perler i 1 mL av deionisert eller destillert vann. Beskytte mot lyset.
2. BM eksempel forberedelse
Merk: Utføre cellen vaske protokollen like før farging prosedyren.
- Pipetter 600 µL av primære prøve i et 15 mL sentrifuge rør.
- Legge til 10 mL vaske bufferen (PBS + 0,5% BSA [> 98% ren BSA] + 0.09% NaN3 filtrert løsning, pH 7.4). Bland celle suspensjon godt med en pipette.
- Sentrifuger i 5 min på 540 x g (vask 1). Kast nedbryting uten å forstyrre det cellen pellet.
- Gjenta trinn 2.2-2.3 (vask 2).
- Avbryte celle pellet 400 µL vaske bufferen.
- Farging av ryggraden markører. Overføre hele volumet av ryggraden antistoffer til en polypropylen rør for FACS analyse, identifisert med pasientdataene og "ryggraden". Legge til 350 µL av vasket prøve (mengden vasket prøven må fylle alle rørene på panelet). Bland godt med en pipette.
Merk: Beregne det totale volumet av ryggraden antistoffer for overflate membran flekker (som vist i tabell 2). - Pipetter lik mengde utvalg-ryggraden blandingen inn 3 polypropylen rør for FACS analyse, identifisert med pasientdata og "rør nummer 1" å "tuben nummer 3". Om nødvendig kan du bruke vaske bufferen til et endelig antall 200 µL per rør.
FORSIKTIG: Pass på ikke å etterlate noen spor av prøven på veggene i rør; ellers vil disse cellene ikke bli farget. Eventuelt vortex celler og sentrifuger røret. - I hver retning, kan du legge det riktige volumet av antistoffer rettet mot celle overflate markører (unntatt ryggraden markører), som angitt i tabell 2. Bland godt med en pipette. Inkuber i 30 min på RT beskyttet mot lyset.
- Legg 2 mL lysing løsning. Bland godt med en pipette. Inkuber i 10 min på RT beskyttet mot lyset.
- Sentrifuger i 5 min 540 x g. Kast nedbryting uten å forstyrre det cellen pellet, forlater ca 50 µL residualvolum i hver retning. Bland godt med en pipette.
- Legg 2 mL vaske bufferen til celle pellets. Bland godt med en pipette.
- Gjenta trinn 2.10-2.11 (vask 2).
- Sentrifuger i 5 min 540 x g. Forkast nedbryting uten å forstyrre det cellen pellet og re avbryte celle pellet 200 µL av PBS. Bland godt med en pipette.
- Skaffe cellene, helst umiddelbart etter farging eller lagre ved 4 ° C, beskyttet fra lys, mer enn 1 h til målt i flyt-cytometer.
3. datainnsamling
- Åpne et nytt eksperiment i Diva programvare og gi det etter navn, type utvalg og dato.
- Opprette en ny prøve som inneholder 3 rør. Angi i oppsettet eksperiment antistoffer brukt i hver retning.
- Klikke rett på "Cytometer innstillinger", velge "innstillinger" og bruke verdiene innhentet i månedlige Setup (trinn 1.1.3.10).
- Åpne et nytt globale regneark og opprette dot tomter: SSC-A / FSC-A, SSC-A / CD45-HV500-A, SSC-A / FITC-A, SSC-A / PE-A, SSC-A / CD34-PerCP-Cy5.5, SSC-A / CD117-PECy7-A, SSC-A / APC-A, SSC-A / APCH7-A, SSC-A / HLA-DR-HV450-A. I SSC-A/FSC-A dot handlingen, kan du opprette en gate for å velge singlet celler. SSC-A/CD45-BV500-A dot tomten, opprette portene å velge 4 ulven: granulocytter, monocytter, støt og lymfocytter. Prosjektet populasjonene dot tomter opprettet tidligere.
- Opprette et nytt globale regneark for kompensasjon kontroll som beskrevet i trinn 1.1.5.9.11.3.
- Erverve røret i "MEDIUM" oppkjøp og post 500.000 hendelser/rør. Etter teknisk validering (evalueringen av kompensasjon og den riktige flekker), kan du eksportere data som FCS3.0-filer.
4. dataanalyse
Merk: for å konstruere normal BM databasene var brukte filer fra friske blodgivere og enkeltpersoner uten noen bevis for en blodkreft sykdom som følger 11 av 18 filer for Neutrophils_NM database, 10 fra 18 filer for Monocytes_NM databasen og 14 18 filer for NRC_NM-databasen. Filer forkastet viste ulike tekniske problemer, som presenteres i delen representant resultater. Filene ble individuelt analysert ved hjelp av Infinicyt programvare (Tabell for materiale), til ulike strategier avbildet i figur 1A(1-3) for nøytrofile avstamning (profil Neutrophils_Maturation.inp), figur 2 A for monocytt avstamning (profil Monocytes_Maturation.inp) og Figur 3A(1-2) for erythroid celle avstamning (profil NRC_Maturation.inp).
- Strategi for analyse for nøytrofile -Neutrophils_NM databasen konstruksjon
- Identifisere CD34 + nøytrofile forpliktet eksplosjonene bruker et veikryss syv porter, tillate valg av CD34 + CD117 + HLADR + lav CD10 - CD13 + CD11b-arrangementer (figur 1A.1). Tilordne disse hendelsene til kategorien 'Nøytrofile' i befolkningen hierarki treet og deretter Fjern denne kategorien for å fjerne disse cellene (avbildet i blått) fra visning av gjenværende hendelsene (grå).
- Isolere CD117 + CD34 - CD13 + CD11b-HLADR + lav nøytrofile forløpere med kryssing av seks porter som avbildet i figur 1A(2) og tilordne dem til kategorien 'Nøytrofile' .
- Identifisere mer moden nøytrofile bruker et veikryss fire porter, slik at diskriminering av CD45dim SSCint-Hei CD117-HLADR-celler og oppdrag 'Nøytrofile' kategorien.
- Fjern gjenværende hendelsene, holder bare nøytrofile vises, Eksporter befolkningen ved ' filen | Eksportere ' og kontrollere at alle de nødvendige parameterne kontrolleres og lagre dataene som FCS-filer.
- I en sammenslått fil som består av alle eksporterte FCS-filer, kan du utføre kvalitetskontroll ved å evaluere intensiteten av uttrykk for markører for hver subpopulation. Bruke APS tomter med medians for hver fil og SD kurver for hver subpopulation vist, fjerne saker utenfor 2SD kurver (se detaljer i delen representant resultater) (figur 1B).
- I sammensatt resultatfilen med "Nøytrofile" synlige tegn modning veien på en APS diagram (figur 1C til venstre) og lagre som .cyt fil.
Merk: En sammenligning modning diagrammet kan visualisering av alle parameterne fra alle filer i Neutrophils_NM databasen representert mot normalisert databasen. Diagrammet i figur 2C, høyre side, viser at alle filer er inkludert i Neutrophils_NM databasen (n = 11) passer i 2 SD sammenlignet med medianen for gruppen.
- Strategi for analyse for monocytter - Monocytes_NM databasen konstruksjon
- Identifisere monocytic avstamning cellene (CD117 + / CD64 + Hei HLADR + Hei) bruker et kryss av fire portene (figur 2A). Tilordne disse hendelsene til 'Monocytic' -fanen i befolkningen hierarki treet.
- Fjern gjenværende hendelsene, holder bare monocytic cellene vises, Eksporter befolkningen ved ' filen | Eksportere ' og kontrollere at alle de nødvendige parameterne kontrolleres og lagre dataene som FCS-filer.
- I en sammenslått fil som består av alle eksporterte FCS filer, utføre kvalitetskontroll ved å evaluere intensiteten av uttrykk for markører for hver subpopulation, og deretter fjerne saker utenfor 2SD kurver (detaljer i representant resultatinndelingen) (figur 2 B).
- I filen "Monocytic" cellene synlig, trekke modning veien på APS diagrammet (figur 2C venstre) og lagre det som en .cyt fil.
Merk: En sammenligning modning diagrammet kan visualisering av alle parameterne fra alle filer i Monocytes_NM databasen representert mot normalisert databasen. Diagrammet i figur 2C, høyre side, viser at alle filer er inkludert i Monocytes_NM databasen (n = 10) passer i 2 SD sammenlignet med medianen for gruppen.
- Strategi for analyse for kjerne røde celler (NRC) - NRC_NM databasen konstruksjon
- Identifisere CD34 + erythroid begått eksplosjonene bruker et veikryss syv porter som tillater valg av CD34 + CD117 + HLADR + lav CD105 + CD33 - CD36 + CD71 + hendelser (Figur 3A(1)). Tilordne disse hendelsene til kategorien "NRC" i befolkningen hierarki treet og så uncheck denne kategorien for å fjerne disse cellene (avbildet i rødt) fra visning av gjenværende hendelsene (grå).
- Identifisere mer moden referansesentrene bruker et veikryss fire porter at diskriminering av CD45-/ + svak SSClow CD36 + Hei CD71 + Hei CD105 +/-celler. Tilordne disse hendelsene til kategorien "NRC" (Figur 3A(2)). Blodplater (CD36 + Hei SSClow celler) må fjernes fra befolkningen NRC (Figur 3A(2)).
- Fjern gjenværende hendelsene, holder bare NRC cellene vises, Eksporter befolkningen ved ' filen | Eksportere ' og kontrollere at alle de nødvendige parameterne kontrolleres og lagre dataene som FCS-filer.
- I en sammenslått fil som består av alle eksporterte FCS filer, utføre kvalitetskontroll ved å evaluere intensiteten av uttrykk for markører for hver subpopulation, etterfulgt av fjerning av tilfellene utenfor 2SD kurver (se detaljer i representant resultatinndelingen) ( Figur 3 B).
- I resultatfilen med "NRC" celler synlig trekke modning veien på APS diagrammet (Figur 3C, venstre) og lagre det som en .cyt fil.
Merk: En sammenligning modning diagrammet kan visualisering av alle parameterne fra alle filer i NRC_NM databasen representert mot normalisert databasen. Diagrammet i Figur 3C, høyre side, viser at alle filer er inkludert i NRC_NM databasen (n = 14) passer i 2 SD sammenlignet med medianen for gruppen.
- Evaluering av modning i BM myelogen rom med modning databaser
- Åpne filen .cyt tilsvarer linjen rundt (i.e., Neutrophils_NM_GMFF.cyt for nøytrofile avstamning, Monocytes_NM_GMFF.cyt for monocytic avstamning, og NRCs_NM_GMFF.cyt for erythroid avstamning).
- Høyreklikk "Modning" kategorien under kategorien tilsvarer linjen av interesse (' nøytrofile | Monocytic | NRC') og lagre modning til modning databasen.
- Åpne en ny FCS-fil og utføre analyse som tidligere forklart (gå 4.1.1–4.1.3 for nøytrofile, steg 4.2.1 for Monocytic celler, og gå 4.3.1–4.3.2 for NRC).
- Tegne modning veien for befolkningen av interesse.
- Åpne den tilsvarende databasen i kategorien 'Verktøy' (Database analyse) og sammenligne befolkningen som skal analyseres med tilsvarende modning databasen. Når dataene for kompatibilitet med tilgjengelig database: fullføre kompatibilitet (grønn trekant); delvis kompatibilitet, i de fleste tilfeller avvik i parameterne (gul trekant); og uforeneligheten (rød trekant).
- Hvis dataene er kompatible eller delvis kompatible, opprettes "normalisert modning forskjeller" diagrammet. For å visualisere "Parameter bandet modning forskjeller", åpner et nytt diagram i "Diagram" -kategorien, klikk "Modning" og velg hvor mange parametere vises, klikker du vises "OK" og diagrammet. Med Høyreklikk i diagrammet; endringer kan gjøres i datavisualisering, Database visualisering og modning Diagram visualisering.
- For å visualisere betydningen av forskjellene mellom filen eller data i databasen, kan du konfigurere en zoom (Høyreklikk på "normalisert modning forskjeller" og bruke 'Zoom').
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
54 BM prøvene høstet i K-EDTA antikoagulerende ble inkludert i studien. MFC dataene ble analysert i fravær av informasjon om pasienter. Retrospektiv studie viste at BM prøvene var fra 7 sunn givere (5 menn og 2 kvinner med en median alder av 47,4 [35-48], 11 personer med ingen bevis for en blodkreft sykdom (8 menn og 3 kvinner med en median alder av 57,9 [35-72]) og 36 tilfeller med forskjellige patologiske forhold: 1 tilfelle med anemi og lav creatinine nivå, 3 tilfeller med anemi og høy creatinine nivå, 8 tilfeller med anemi av betennelse, 1 tilfelle med anemi skyldes vitamin B12 mangel, 4 tilfeller med anemi ± andre cytopenias skyldes leverskade, 3 tilfeller med autoimmune Hemolytisk anemi, 5 tilfeller med idiopatisk thrombocytopenic purpura, 1 fall med macrophage aktivisering syndrom, 3 tilfeller med komplett remisjon etter lymfom behandling (minimal gjenværende sykdom < 0,01%) og 7 tilfeller bærer Hematologisk lidelser (4 MDS, 1 AML, 1 kronisk myelomonocytic leukemi og 1 myeloproliferative syndrom JAK2 positive). Denne siste kategorien inkludert 18 menn og 18 kvinner med en gjennomsnittlig alder 60.3 [17-100]. Alle prøvene var fra kaukasiske individer. Bygge databaser tillatt identifisere og løse flere problemer knyttet til eksempel forberedelse og oppkjøp. I vårt tilfelle inkludert siste databasene 11/18 filer for nøytrofile modning, 10/18 filer for monocytt modning og 14/18 filer for NRC modning. Filer som ikke ble inkludert i databaser poserte ulike tekniske problemer. De vanligste flekker problemene ble observert for CD11b og CD13 i nøytrofile, CD300e og HLADR i monocytter, og CD71 og HLADR i referansesentrene. eksporterer kan være en kilde til feil. den mest hyppige i våre datasett var fravær av FSC-H i eksporterte filer og inversjon av FSC-W med FSC-H som skjer i eksport DIVA filer8. Evalueringen av nye tilfeller av cytopenias mistenkt for å være MDS mot myelogen Normal modning databaser tillater identifikasjon av unormal uttrykk for modning antigener av nøytrofile avstamning (Figur 4), monocytter (figur 5 ), og NRC (figur 6) selv i tilfeller uten fargemaskin eller cytogenetic avvik (figur 7). Ellers ville bruker rutinemessig oppkjøpet programvare, som Diva, dette være vanskelig eller umulig å realisere.
Figur 4 : Representant flyt cytometri analyse av nøytrofile i del(7) MDS tilfelle. (A) i de normalisert modning forskjeller er dette det grå området samsvarer med vanlig uttrykk for antigener skyldes analyse av 11 normal filene i nøytrofile databasen (median± 2SD). Unormal uttrykk for flere antigener ble observert i forhold del(7) MDS saken mot Neutrophils_NM databasen (n = 1 versus n = 11 vanlige kontroller utvalg). (B) parameteren bandet modning diagrammer at sammenligninger mellom median intensiteten av uttrykk for hver indikator på ulike stadier av modning (kontinuerlig full linjer) og 2SD kurver beregnet for 11 normal BM tilfeller i databasen (kontinuerlig stiplede linjer). Fenotypiske unormalt av nøytrofile observert i en del(7) MDS sak mot nøytrofile Normal modning databasen er som følger: samlede økt uttrykk for CD34, svak økning av CD11b uttrykk i umodne nøytrofile (trinn 2), redusert uttrykk for CD13 på umodne nøytrofile (trinn 1-3) og svak økning av CD16 uttrykk i de to første stadiene av nøytrofile modning etterfulgt av moderat økning av CD16 uttrykk på de eldre nøytrofile (trinn 4-5). (C) viser tilsvarende punkt tomter som visualisert DIVA programvare. Bildet evaluering ved hjelp av DIVA programvaren tillater identifikasjon av et lite antall fenotypiske unormalt i dette tilfellet for MDS: en økt andel av CD34 + CD13 + prekursorer og downregulation CD13 uttrykk. Unormal uttrykk for CD16 er vanskelig å observere i denne representasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Representant flyt cytometri analyse av monocytter i del(7) MDS tilfelle. (A) Normalized modning forskjellene diagrammet tilbud er en samlet visning av antigen uttrykk på ulike stadier av monocytic celle avstamning modning. Det grå området samsvarer med vanlig uttrykk for antigener skyldes analyse av 10 vanlige filer i monocytic databasen (gjennomsnittlig ± 2SD). Unormal uttrykk for flere antigener overstiger 2SD, men for noen markører, som CD35 og HLADR, den overskrider 4SD. (B) i the parameteren bandet modning diagrammer, fenotypiske forandringene av monocytic celler i en SMD del(7) tilfellet når sammenlignet med Monocyte Normal modning Database (n = 1 versus n = 10 vanlige kontroller prøver) er som følger: redusert uttrykk for CD45 under trinn 1-4 av monocytic celler, av CD117 på trinn 1-2 monocytic prekursorer og HLA-DR generelt. Økt uttrykk for CD35 i de 3 første stadiene av modning monocytic cellene var den viktigste abnormiteten for denne linjen. (C) The DIVA prikk tomter som tillater evaluering av monocytic celler i en enkelt BM. (D) The DIVA normal.dot tomter som tillater evaluering av monocytic celler i del(7) MDS tilfelle. Bildet evaluering ved hjelp av DIVA programvaren tillater for identifikasjon av to fenotypiske unormalt i dette tilfellet for MDS: redusert uttrykk for HLA-DR og økt uttrykk for CD35 i en del av monocytic prekursorer (rød befolkning). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Representant flyt cytometri analyse av kjerne røde celler i en del(7) MDS sak. (A) Normalized modning forskjellene diagrammet tilbud er en samlet visning av antigen uttrykk på ulike stadier av NRC avstamning modning. Det grå området samsvarer med vanlig uttrykk for antigener skyldes analyse av 14 normal filene i NRC Normal modning databasen (gjennomsnittlig ± 2SD). Unormal uttrykk for flere antigener overstiger 2SD, men for noen markører, som CD34, CD117, CD71 og CD105, den overskrider 4SD. (B) i the parameteren bandet modning diagrammer, fenotypiske forandringene observert i SMD del(7) tilfelle sammenlignet med NRC Normal modning databasen (n = 1 versus n = 14 vanlige kontroller utvalg) er som følger: redusert uttrykk for CD34 i de to første stadiene av modning, CD117, CD105, CD71 og HLA-DR på trinn 1 av erythroid avstamning prekursorer. Bildet evaluering ved hjelp av DIVA programvaren tillater for identifikasjon av CD71 unormal uttrykk med erythroid cellene i denne MDS saken, men andre endringer gjenkjennes ikke. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 : Representant flyt cytometri analyse av nøytrofile og monocytter referansesentrene på et tidlig MDS saken uten morfologiske dysplasia og uten cytogenetic aberrancies. (A) distribusjon av umodne og modne celler i forskjellige modning stadier for tre myelogen linjen: nøytrofile og monocytter referansesentrene. Et økt antall eldre monocytter (trinn 5) og litt reduksjon av monocytic umodne celler (trinn 2 av modning) ble observert. (B) de normalisert modning forskjeller diagram viser at fenotypiske forandringene overstiger 2SD, men for CD34, CD117, CD11b, CD16 og HLADR, de er høyere på 4SD. fenotypiske avvik observert for nøytrofile er som følger: litt økt SSC verdier i nøytrofile umodne prekursorer (trinn 1), reduksjon av uttrykk for CD34 (1. etappe), av CD117 (1. etappe), av CD16 (1 - 2) og av HLADR (trinn 1-3 av modning). Økt uttrykk for CD11b ble observert på nøytrofile umodne prekursorer (trinn 1). (C) de normalisert modning forskjeller diagrammet viser at de viktigste fenotypiske avvik observert i den monocytic avstamning (over 10SD) er økt uttrykk for CD35 og tidlig oppkjøpet av CD300e på den umodne monocytic prekursorer. Andre fenotypiske avvik observert på monocytic linjen er som følger: reduksjon av FSC og SSC på mer moden monocytter (trinn 3-5) og liten reduksjon i uttrykket av CD14 på fase 2-3 av monocytic celler. (D) Normalized modning forskjellene diagram og parameteren bandet modning diagrammene viser at de viktigste fenotypiske avvik observert i NRC er: økt uttrykk for CD117 (over 10SD) på etapper 2-3 av NRC modning, økt uttrykk for CD34 (over 5SD) under den andre fasen av modning av NRC og redusert uttrykk for CD36 på de tidlige erythroid forløperne (trinn 1-3). I tillegg er SSC på umodne NRC lavere enn på vanlige motstykker. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Videre gir tolkningen av betydningen av forskjellene mellom antigen uttrykk på patologisk innstillinger og normal kolleger "kvantifisering" av disse unormalt, med identifikasjon av de som er discriminant for en gruppe tilfeller. Dette kan også gjøre det mulig å rangere dem basert på viktighet for å følge. I denne studien var alle 7 tilfeller av Hematologisk lidelser med myelogen dysplasia funksjoner (4 MDS, 1 AML, 1 kronisk myelomonocytic leukemi og 1 myeloproliferative syndrom JAK2 positive) klassifisert som unormale sammenlignet med NBM databaser. I tillegg eliminert evalueringen mot Neutrophils_NM databasen mistanke om myelogen dysplasia inne 7 saker med giftig, provoserende, autoimmune Hemolytisk anemi og anemi fra kronisk nyresykdom. Evalueringen mot Monocytes_NM databasen eliminert mistanke om myelogen dysplasia inne 4 tilfeller med idiopatisk thrombocytopenic purpura (ITP), mens evalueringen mot NRC_NM tillatt for differensiering i 3 tilfeller 2 av inflammatoriske anemi og 1 av ITP. BM aspirates fra pasienter i fullstendig remisjon etter lymfom eller solid tumor behandlinger var innen 2 SD fra medianen til normal databasene for alle tre linjene, og dermed disse prøvene kan være alternativer til frisk donor BM eksempler.
Figur 1 : Analyse strategier for nøytrofile celle avstamning. (A) utvalg av CD34 + CD117 + HLADR + lav CD10 - CD13 + CD11b-nøytrofile progenitors ble realisert ved skjæringspunktet mellom syv porter som avbildet i A1. Neste trinn i modning, CD117 + CD34 - CD13 + CD11b-HLADR + lav nøytrofile forløpere ble valgt med kryssing av seks porter som avbildet i A2. De mer modne nøytrofile er endelig identifisert med kryssing av fire porter at diskriminering av CD45dim SSCint-Hei CD117-HLADR-celler (A3). De fleste discriminant markører for nøytrofile slekten var CD34, CD117, CD11b og CD16. Sammen med CD13, disse parametere kan identifikasjon av fem subpopulasjoner: CD34 + progenitors (CD34 + CD117 + CD13 +lav CD11b - CD16-) (mørk blå); CD34 - CD117 + CD13 +Hei CD11b-CD16-nøytrofile prekursorer (blå); CD34 - CD117 - CD13 +lav CD11b-CD16-nøytrofile (3rd trinn for modning, lys blå); CD34 - CD117 - CD13 +lav CD11b + CD16 +lav nøytrofile (4th trinn i modning, rosa); eldre nøytrofile (CD34 - CD117 - CD13 +Hei CD11b +Hei CD16 +Hei, fiolett). Hver farget sirkel representerer medianen til en subpopulasjon for markøren rundt fra ett utvalg (B). (C) viser homogen fordelingen av parameterne testet under nøytrofile celle modning sammenlignet med 2 SD i normal modning databasen (n = 11). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Analyse strategi for monocytter. Identifikasjon av monocytic avstamning celler (CD117 + / CD64 + Hei HLADR + Hei) ved hjelp av et kryss av fire portene (A). Mest discriminant markører for monocytic slekten var CD14, CD300e (IREM2), CD35 og HLA-DR. sammen med CD117, disse parametere kan identifikasjon av tre subpopulasjoner: CD34 - CD117 +lav/ - HLADR +Hei CD35 - CD14 - CD300e - (rød); CD34 - CD117 - HLADR +med CD35 +med CD14 +med CD300e - (oransje); eldre monocytter CD34 - CD117 - HLADR +med CD35 +Hei CD14 +Hei CD300e + (grønn) (B). (C) viser homogen fordelingen av parameterne testet under monocytic celle modning sammenlignet med 2 SD i normal modning databasen (n = 10). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Analyse strategier for referansesentrene. (A) identifikasjon av CD34 + erythroid begått eksplosjonene ble realisert ved hjelp av et kryss syv porter som tillater valg av CD34 + CD117 + erythroid progenitors (A1). De mer modne referansesentrene identifiseres av et kryss av fem gates (A2). Utelukkelse av blodplater (CD36 + Hei SSClow celler) fra NRC befolkningen kreves (A2). De fleste discriminant markører for erythroid celle avstamning var CD34, CD117, CD71 og CD105. Sammen med CD33, disse parametere kan identifikasjon av tre subpopulasjoner: CD45 +lav CD34 + CD117 + HLADR +med CD71 +med CD36 +med CD105 +Hei (rød); CD34 - CD117 + HLADR +lav CD71 +Hei CD36 +Hei CD105 +Hei referansesentrene (2nd trinn i modning, rosa); CD34-CD117-HLADR-/ +lav CD71 +Hei CD36 +med CD105 +lav/-referansesentrene (mer moden referansesentrene, rosa laks) (B). (C) viser homogen fordelingen av parameterne testet under NRC modning sammenlignet med 2 SD i normal modning databasen (n = 14). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: liste over fluorochrome-konjugerte antistoffer reagenser pleide setup fluorescens kompensasjon matriser med sine referanse befolkninger. Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.
Tabell 2: Kombinasjon og mengder av antistoffer brukes for evaluering av modning av nøytrofile, monocytter og erythroid celler i BM. Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.
Supplerende fil 1: Monocytes_Maturation.inp Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende filen 2: Monocytes_NM_GMFF.cyt Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende filen 3: Neutrophils_Maturation.INP Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende filen 4: Neutrophils_NM_GMFF.cyt Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende fil 5: NRC_Maturation.INP Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende filen 6: NRC_NM_GMFF.cyt Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kvaliteten på BM leveringstanken kan påvirke sluttresultatet. Hemodilution av BM leveringstanken kan forvrenge fordelingen av celler i ulike stadier av modning på grunn av fravær av progenitors eller forløpere celler. Sannsynligvis ansette bulk lysing metoden kan hjelpe normalisering av BM aspirates for hemodilution i flyt cytometric analyser. I tillegg er de avgjørende skritt for vurdering av BM myelogen dysplasi av flowcytometri prøve behandling og flekker, datainnsamling og tolkning2,3. Prøven behandling og flekker skal utføres opptil 72 h etter BM høsting. Dataene skal anskaffes, helst umiddelbart etter farging eller lagre prøver på 4 ° C, beskyttet fra lys, mer enn 1 h til måling i flyt-cytometer. Database-guidede tolkningen unngår subjektive evalueringen av BM myelogen celle modning.
Antistoff kombinasjonene og prøve utarbeidelse var bredt likedannet EuroFlow prosedyrer9,10. Forskjellen sammenlignet med EuroFlow panelet var at alle antistoffer unntatt CD300e ble levert av BD Bioscience. Flow cytometri standardisering gjorde det mulig å få data med høye nivåer av reproduserbarhet11, men dette innebærer å bli en gruppe arbeider på standardisering av panelene i spørsmålet. I vår gruppe fortsatt standardisering av SSC et område forbedres. Store spørsmålet om MFC databaser bygge er flekker prosedyren. Første distribusjon av ikke-ryggraden antistoffer i FACS rør før du legger til like mengder sample-ryggraden mix unngår gjentatte ryggraden flekker i tilfelle eventuelle feil i distribusjonen av andre ikke-ryggraden antistoffer. I tillegg til å overvinne den flekker problemer der er to muligheter: enten øke inkubering av antistoffer fra 15 til 30 minutter, eller bruk rekombinant antistoffer, som gir større reproduserbarhet, i henhold til produsentens spesifikasjoner12. Analysen ble utført i samsvar til nylig publiserte data13,14,15. Om monocytter analyse observert vi ofte fravær av CD34 + CD117 - monocytic forløpere, som har rapportert tidligere Shen et al. 16. derfor vi eliminert fra analyse strategi en supplerende gate for isolering av denne bestemt populasjon. Skjæringspunktet mellom portene slik at isolering av CD64 + F HLADR + F/int og CD117 +/-inkluderer umodne forløpere (CD117 + CD34 + lav /-) og de mer modne monocytter.
Evalueringen av nye FCS filer sammenlignet med en database bidrar til en mer objektiv, standardisert strekkodeanalyse og tolkning og unngår feiltolkninger av såkalte mønstre anerkjennelse, som er vanskelig å standardisere3. Kvantifisering av amplituden til fenotypiske unormalt sammenliknet med vanlige databaser gjør det mulig å rangere disse unormalt, som kan forbedre MFC score for MDS diagnose. Videre, denne metoden tillater presis identifikasjon av fenotypiske forandringene umodne CD34 + og/eller CD117 + prekursorer og i mer modne celler, som ikke er tydelig når du bruker gjeldende analyse strategier i oppkjøpet programvare. Denne metoden er relevant i diagnostisering av MDS tilfeller som gjør eller ikke har tydelig morfologiske avvik, eller som gjør eller ikke bære cytogenetic tilbakevendende aberrancies.
Forbedring av antistoff flekker er nødvendig, og tillegg av nye normal BM data i databaser er nødvendig for å øke robustheten, påliteligheten og følsomhet for analysen. Denne metoden kan brukes, med videre undersøkelser, cytopenias fra andre årsaker eller klonal hematopoiesis ubestemte potensial (CHIP), for å identifisere de fenotypiske endringene pålitelig dysplastic prosesser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser. Flowcytometri avdelingen, hematologi laboratorium ved University Hospital av Saint-Etienne er medlem av EuroFlow Consortium.
Acknowledgments
Antistoffer brukt i denne studien ble levert av BD biovitenskap. Forfatterne ønsker å takke sin kollega, Dr. Pascale Flandrin-Gresta, fra den instituttet for molekylær biologi, hematologi laboratorium, University Hospital av Saint-Etienne, Frankrike, som leverte kompetanse for tolkning av NGS dataene for andre MDS tilfelle. Forfatterne er takknemlig for de klinikerne hematologists deres interesse og engasjement i denne studien og for pasienter og sunn givere for skal delta i denne studien. Forfatterne vil også gjerne takke "Les Amis de Rémi" grunnlaget for økonomisk støtte for publisering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSCanto II flow-cytometer | BD Biosciences, CA, USA | SN: V33896301336 | 3-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf |
| Awel C48-R Centrifuge | AWEL Industries, FR | SN: 910120016; Model No: 320002001 | low speed centrifuges; capacity 60 FACS tubes |
| Pipetts of 10µL and 200µL | |||
| Pasteur pipettes | |||
| 15 mL Falcon tubes | |||
| polypropylene tube for FACS | |||
| Mouse Anti-Human HLA-DR | BD Biosciences, CA, USA | 655874 | clone L243 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm) |
| Mouse Anti-Human CD45 | BD Biosciences, CA, USA | 560777 | clone HI30 Mouse IgG1, κ Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm) |
| Mouse Anti-Human CD16 | BD Biosciences, CA, USA | 656146 | clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD13 | BD Biosciences, CA, USA | 347406 | clone L138 Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD34 | BD Biosciences, CA, USA | 347222 | clone 8G12 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm) |
| Mouse Anti-Human CD117 | BD Biosciences, CA, USA | 339217 | clone 104D2 Mouse BALB/c IgG1 Fluorochrome PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm) |
| Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, CA, USA | 333143 | clone D12 Mouse BALB/c IgG2a, κ D12, Fluorochrome APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm |
| Mouse Anti-Human CD10 | BD Biosciences, CA, USA | 646783 | clone HI10A Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Mouse Anti-Human CD35 | BD Biosciences, CA, USA | 555452 | clone E11 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD64 | BD Biosciences, CA, USA | 644385 | clone 10.1 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD300e | Immunostep | IREM2A-T100 | clone UP-H2 Mouse BALB/c IgG1, k Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, CA, USA | 641394 | clone MoP9 Mouse BALB/c IgG2b, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Mouse Anti-Human CD36 | BD Biosciences, CA, USA | 656151 | clone CLB-IVC7 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD105 | BD Biosciences, CA, USA | 560839 | clone 266 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD33 | 345800 | clone P67.6 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
|
| Mouse Anti-Human CD71 | BD Biosciences, CA, USA | 655408 | clone M-A712 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Lysing Solution 10x Concentrate (IVD) | BD Biosciences, CA, USA | 349202 | |
| FACSFlow Sheath Fluid | BD Biosciences, CA, USA | 342003 | |
| FACSDiva CS&T IVD beads | BD Biosciences, CA, USA | 656046 | |
| RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS | Cytognos, Salamanca, Spain | SPH-RCP-30-5A | lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01 |
| Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD) | BD Biosciences, CA, USA | ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291 | |
| Diva software versions 6.1.2 and 6.1.3 | BD Biosciences, CA, USA | ||
| Phosphate buffered saline tablets | R&D Systems, Minneapolis, USA | 5564 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, France | A9647 | |
| Sodium azide 99% | Sigma-Aldrich, France | 199931 | |
| Infinicyt software version 1.8.0.e | Cytognos, Salamanca, Spain |
References
- Orfao, A., Ortuño, F., de Santiago, M., Lopez, A., San Miguel, J. Immunophenotyping of Acute Leukemias and Myelodysplastic Syndromes. Cytometry Part A. 58, 62-71 (2004).
- Porwit, A., et al. Revisiting guidelines for integration of flow cytometry results in the WHO classification of Myelodysplastic Syndromes - proposal from the International/European LeukemiaNet Working Group for Flow Cytometry in MDS (IMDSFlow). Leukemia. 28 (9), 1793-1798 (2014).
- Westers, M. T., et al. Implementation of flow cytometry in the diagnostic work-up of myelodysplastic syndromes in a multicenter approach: Report from the Dutch Working Party on Flow Cytometry in MDS. Leukemia Research. 36, 422-430 (2012).
- Meehan, S., et al. AutoGate: automating analysis of flow cytometry data. Immunologic Research. 58, 218-223 (2014).
- Greenberg, P. L., et al. NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology: myelodysplastic syndromes. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 9, 30-56 (2011).
- Greenberg, P. L., et al. Myelodysplastic Syndromes, Version 2.2017, Clinical Practice Guidelines in Oncology. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 15, (2017).
- WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Revised 4th Edition. Swerdlow, S. H., et al. (2), IARC Press. Lyon, France. 86-128 (2017).
- https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html. , Available from: https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html (2018).
- Composition of EuroFlow panels and technical information on reagents Version 1.5. , (2017).
- EuroFlow Standard Operating Procedure (SOP) for sample preparation and staining Version 1.2.1. , (2015).
- Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26, 1986-2010 (2012).
- http;//www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-flow-cytometry/reagents/antibodies-and-dyes/recombinant-antibodies.aspx. , Available from: http;//www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-flow-cytometry/reagents/antibodies-and-dyes/recombinant-antibodies.aspx (2018).
- van Dongen, J. J. M., et al. EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. Leukemia. 26, 1908-1975 (2012).
- Matarraz, S. Introduction to the Diagnosis and Classification of Monocytic-Lineage Leukemias by Flow Cytometry. Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 92 (3), 218-227 (2015).
- Westers, M. T. Immunophenotypic analysis of erythroid dysplasia in myelodysplastic syndromes. A report from the IMDSFlow working group). Haematologica. 102, 308-319 (2017).
- Shen, Q., et al. Flow cytometry immunophenotypic findings in chronic myelomonocytic leukemia and its utility in monitoring treatment response. European Journal of Haematology. 95, 168-176 (2015).
