Summary
La diagnosi MDS è difficile in assenza di criteri morfologici o citogenetica non informativo. MFC potrebbe contribuire ad affinare il processo diagnostico MDS. Per diventare utile per la pratica clinica, l'analisi MFC deve basarsi su parametri con sufficiente sensibilità e specificità, e i dati devono essere riproducibili tra operatori diversi.
Abstract
Un gruppo di lavoro avviato entro l'associazione di Cytometry francese (AFC) è stato sviluppato al fine di armonizzare l'applicazione della citometria a flusso multiparametrica (MFC) per la diagnosi di malattia mieloide in Francia. Il protocollo presentato qui è stato concordato e applicata tra settembre 2013 e novembre 2015 in sei laboratori diagnostici francesi (ospedali dell'Università di Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nizza e Lille e Institut Paoli-Calmettes in Marsiglia) e ha permesso la standardizzazione dell'acquisizione di dati e preparazione del campione del midollo osseo. Tre database di maturazione sono stati sviluppati per neutrofilo, monocytic e stirpi degli eritrociti con midollo osseo da individui "sani" donatore (individui senza alcuna prova di una malattia ematopoietica). Un metodo affidabile di analisi per ogni linea mieloide dovrebbe essere applicabile per uso diagnostico sistematico. Nuovi casi possono essere analizzati nello stesso modo e confrontati con i database di solito. Così, le anomalie fenotipiche quantitative e qualitative possono essere identificate e quelli sopra 2SD rispetto ai dati dei campioni di midollo osseo normale dovrebbe essere considerate indicative di patologia. La maggiore limitazione è la maggiore variabilità tra i dati ottenuti utilizzando gli anticorpi monoclonali ottenuti con i metodi basati su tecnologie di ibridoma e attualmente utilizzati nella diagnosi clinica. L'impostazione di criteri per la validazione tecnica dei dati acquisiti possono contribuire a migliorare l'utilità di MFC per la diagnostica MDS. La definizione di questi criteri richiede analisi in un database. La riduzione della soggettività investigatore nell'analisi dei dati è un importante vantaggio di questo metodo.
Introduction
In assenza di marcatori fenotipici specifici per i cambiamenti dysplastic che si verificano nelle cellule mieloidi durante MDS iniziazione e progressione, un nuovo approccio è stato proposto negli ultimi anni sulla base della valutazione delle vie di maturazione (alterata espressione di gli antigeni mieloidi durante la produzione di cellule mieloidi mature) o della distribuzione anomala di tipi differenti delle cellule all'interno del midollo osseo (BM) delle cellule scomparti1,2.
Questo articolo presenta un metodo nuovo per applicazione standardizzata di MFC al fine di rilevare i cambiamenti dysplastic in compartimenti delle cellule mieloidi BM correlati a sindromi mielodisplastiche (MDS) o altre malattie ematologiche mieloidi. Questo studio inoltre mostra l'utilità dell'utilizzo di database di maturazione per l'analisi dei dati MFC.
Standardizzazione della procedura di preparazione del campione, acquisizione dati e analisi utilizzando i database consentirebbe l'identificazione delle anomalie fenotipiche più rilevanti legate a cambiamenti dysplastic in cellule mieloidi BM. Pertanto, sono necessari per lo sviluppo di una strategia di analisi che può essere utilizzata in successive analisi statisticamente selezionati sottogruppi basati su formati ben identificati e incontestati (dot grafici, istogrammi e diagrammi separatore automatico di popolazione (APS)) Arrotonda. La scoperta di anomalie fenotipiche robuste in MDS faciliterebbe la diagnosi nei casi con o senza displasia morfologica minima e senza aberrancies citogenetica. Identificazione dei parametri discriminanti consentendo la riduzione di immunophenotypic pannelli può semplificare l'attuale punteggi2, permettendo loro applicabilità nei laboratori di patologia clinica.
Questo metodo limita le interpretazioni soggettive dei dati cytometry, come è stato segnalato in MDS diagnosi3. Questo passaggio è un prerequisito per lo sviluppo di strumenti automatizzati per l'elaborazione e l'analisi di flusso dati4.
MDS comprende un gruppo eterogeneo di disordini clonali di cellule staminali ematopoietiche (HSC) in cui le mutazioni spliceosoma cooperano con modificatori epigenetici specifici per produrre il fenotipo MDS. È ormai noto che, insieme con le mutazioni di HSC, altri meccanismi sono coinvolti nella fisiopatologia MDS, come aberrante infiammazione immune-mediata e interazioni tra HSCs maligno ed il microambiente stromale del BM. Tuttavia, questi meccanismi rimangono poco compresi. L'eterogeneità larga clinico e biologico di MDS rende la diagnosi e la selezione della terapia ottima di una sfida. Nell'ultimo decennio, gli studi multipli hanno indicato che MFC è spesso più sensibile nel rilevare displasia2 rispetto alla morfologia, ma i vincoli tecnici ed economici rendono questa tecnica difficile da standardizzare, con risultati spesso dipende il Esperienza di interprete3. Inoltre, non è chiaro come MFC può pendere la bilancia verso MDS in casi con o senza displasia morfologica minima e in assenza di anomalie citogenetiche o in casi limite come hypocellular MDS, con un conteggio basso blast, da altri non-clonale BM disturbi come guasto del midollo osseo (cioè., anemia aplastica). Inoltre rimane difficile da differenziare i casi limite di MDS con un eccesso di scoppi dalla leucemia mieloide acuta (AML). Per tutti questi motivi, le linee guida cliniche non integrano MFC test nella diagnosi finale di MDS. Nel 2011, US nazionale completa Cancer Network (NCCN) consigliato MFC per la stima della percentuale di cellule CD34 +, rilevamento dei cloni di emoglobinuria parossistica notturna e la presenza di cloni di cellula T citotossici in hypocellular MDS5. Queste due situazioni di quest'ultime comportano anche un obiettivo terapeutico poiché dati clinici hanno dimostrato una buona risposta di questi pazienti alla terapia immunosopressiva6. Linee guida NCCN 2017, citando le raccomandazioni dell'International Working Group (IWG), elencati aberrante immunophenotyping rilevamento da MFC tra i co-criteri per la diagnosi MDS, ma senza fare alcun specifiche6. Inoltre, la classificazione del WHO pubblicata di recente stipula che MFC risultati da soli non sono sufficienti per stabilire una diagnosi primaria di MDS in assenza di dati morfologici e/o citogenetica conclusivi7. Tuttavia, MFC può essere utilizzato come un ulteriore test mostrano la disregolazione della cellula mieloide maturazione modelli e quantificare la "distanza dal normale" per un paziente in un momento specifico nel corso della malattia.
Questo metodo è applicabile a laboratori clinici interessati nella valutazione della displasia nelle cellule mieloidi BM usando MFC immunophenotyping, al fine di perfezionare la diagnosi in MDS o altri disordini mieloidi con anomalie dysplastic.
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Protocol
Il protocollo elencato di seguito è stato approvato dal "Comité de Protection des Personnes" (comitato etico indipendente) 1 Sud-Est da Università ospedale di Saint-Etienne, Francia.
1. citometro impostazioni
Nota: Le impostazioni del citometro sono state eseguite conformemente alle raccomandazioni di flusso di Francia, secondo la procedura di EuroFlow "EuroFlow Standard operativo protocollo (SOP) per la messa in funzione e compensazione (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php).
- Mensile setup dello strumento
- Accendere il citometro. Assicurarsi che tutti i livelli del fluido siano appropriata e aperta Diva 6.1.3. Eseguire avvio fluidica: nella barra dei menu, selezionare ' citometro | Avvio della fluidica '. Fare clic su 'OK' quando richiesto. Consentire il citometro si riscaldi per almeno 30 min.
- Controllo delle prestazioni - perle di CST
Nota: Per questo passaggio, preparare tubo 12 75 mm in polistirolo, CST perline e guaina fluido (Vedi Tabella materiali).- Etichettare una provetta polistirolo da 12 x 75 mm2 'CST'. Mescolare la fiala di sfere fornito inversione leggera o tramite vortex molto delicato. Aggiungere nella provetta etichettata: 0,35 mL di fluido di guaina e 1 goccia di perline CST. Vortice del tubo delicatamente e procedere all'acquisizione. Conservare la provetta per fino a 8 ore a 2-25 ° C al buio se non acquisendo immediatamente.
- Eseguire il controllo delle prestazioni: nella barra dei menu, selezionare ' citometro | CST'.
- Nella scheda 'Setup' del modulo CST: confermare il Canto II come nella configurazione di default 4-2h-2V e anche verificare l'esistenza di una linea di base creato utilizzando il lotto attuale di perline CST per questa configurazione. Se non esiste una linea di base, consultare la CST perline IFU. Verificare che la linea di base non è scaduto: in ' installazione Control', selezionare ' verifica Performance' dal menu a discesa.
- Verifica 'Caricare manualmente il tubo' e fare clic su 'Esegui'. Confermare il numero di lotto visualizzato. Delicatamente vortice le perline diluite preparato in precedenza e quando richiesto, caricare le perline diluite e fare clic su 'OK'.
- Quando il controllo di prestazioni è completo, verificare che le prestazioni citometro passato. Fare clic su 'Visualizza Report'. Eseguire nuovamente il controllo di prestazioni se non hanno superato i risultati. Salvare il Report in formato PDF con la data del Report di monitoraggio prestazioni.
- Regolare 'Tensioni PMT fluorescente' con perle dell'arcobaleno (Tabella materiali).
Nota: I valori di destinazione sono stipulati in Euroflow Procedure operative Standard (SOP) dal titolo "20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads". Questa SOP è disponibile sul sito Euroflow (www.euroflow.org; nell'area pubblica; Scheda protocolli).- Creare un nuovo esperimento via ' mensile data di impostazione dello strumento | Campione '.
- ', scegliere i parametri ottici e fluorocromi corrispondente ai tubi interessati (FITC, PE, PerCPCy5.5, PE-Cy7, APC, APC-H7, V450, V500) e controllare i parametri di acquisizione desiderata (Log, A, H e / o W). Applicare le impostazioni correnti di CST (fare clic destro su ' impostazioni citometro ' dell'esperimento). Imposta la soglia per parametro FSC a 10.000.
- Il citometro, disattivare la compensazione durante l'impostazione di fluorescenza tensioni PMT per impostazione destinazione MFI; per questo scopo, andare in «Ispettore», passare alla scheda «Compensazione» disattiva compensazione da deselezionando ' abilitare la compensazione ' opzione.
- Creare un foglio di ' destinazione MFI' con tutte le necessarie dot trame (n = 2; FSC vs SSC, FITC versus PE), istogrammi (n = 8; un istogramma per ogni rivelatore a fluorescenza) e statistiche che indicano il riferimento i valori di picco (MFI e CV) per ogni canale di fluorescenza.
- Diluire 1 goccia di particelle di calibrazione di 8-picco arcobaleno perle in 1 mL di acqua distillata e vortex prima dell'uso. Acquisire senza registrare la soluzione di perle arcobaleno 8-picco alla portata di 'LOW' . Conservare la provetta per fino a 8 ore a 2-25 ˚ c nel buio se non acquisendo immediatamente.
- Canottiera porta perline ' popolazione P1' in FSC contro bivariata dot plot SSC e il picco 8 ° o 7 ° in FITC contro trama bivariata dot PE (il picco più brillante o quello successivo verso il basso, come è previsto nel documento Euroflow intitolato "20180302_7th_ Peak_Target_Values_Rainbow_Beads") e il nome di questo cancello popolazione P2.
- Continuare l'acquisizione della sospensione 8-cime Rainbow perlina e regolare tensioni PMT in tutti i canali di fluorescenza per raggiungere valori di MFI di destinazione secondo il documento Euroflow "20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads".
- Una volta raggiunto il valore di destinazione MFI per il 7 ° o 8 ° picco, registrare l'IFM di Target raggiunto e i corrispondenti valori finali di PMT. 5.000 eventi di acquisire e registrare i dati.
Nota: Che PMT valori deve essere utilizzato sotto al punto 1.2.3 (Performance Check - conferma di PMT valori con perle dell'arcobaleno). - Registrare questi valori facendo una stampa dello schermo con le impostazioni di ' destinazione MFI' e strumento di foglio di lavoro e salvare come immagine. jpg.
Nota: Quando viene creato un "Nuovo" tubo, a volte i valori PMT variano in modo imprevisto. Per questo, un duplice controllo di PMT è essenziale. Confrontare ogni volta i valori PMT alle tue note, doppio controllo che ' destinazione MFI' valori e valori di PMT sono corretti! - Salvare l' 'Applicazione Impostazioni'. Nel Browser, fare clic destro su ' citometro impostazioni '. Dal menu a discesa, selezionare ' Impostazioni applicazione 'e salvare. Fare clic su 'OK'. Se richiesto, fare clic su Sì per mantenere i valori di soglia.
Nota: Salvare le impostazioni dell'applicazione utilizzando il nome predefinito. Non rinominare le impostazioni.
- Regolare il 'FCS' e 'SSC tensioni' con sangue lisato lavato (LWB).
Nota: Per questo passaggio, sono necessari 50 µ l di un campione di sangue periferico (PB) da un sano volontariato soluzione lisante (Tabella materiali) e il tampone di lavaggio.- Pipette di 50 µ l di PB in un tubo. Aggiungere 2 mL di soluzione lisante appena diluita. Mescolare delicatamente e incubare per 10 minuti a TA.
- Centrifugare per 5 min a 540 x g.
- Aspirare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare, lasciando circa 50 µ l di volume residuo nel tubo. Mescolare delicatamente e aggiungere 2 mL di soluzione di lavaggio filtrata.
- Centrifugare per 5 min a 540 x g.
- Ripetere ancora una volta i passi 1.1.4.3–1.1.4.4.
- Aggiungere 250 µ l di tampone di lavaggio filtrato e mescolare delicatamente.
- Nell'esperimento creato per acquisizione di perle dell'arcobaleno, creare un nuovo ' esemplare | Nuovo foglio di lavoro ': disegnare un grafico bi-parametrico di SSC-A / FSC-A.
- Acquisire le cellule, i linfociti in un FSC contro bivariata dot plot SSC del cancello e regolare tensioni FSC e SSC per raggiungere i seguenti valori di destinazione di media per la popolazione dei linfociti gated: FSC: 55.000 (gamma 50.000 – 60.000) e SSC: 13.000 (gamma 11.000 –15,000).
- Acquisire e registrare i dati con circa 10.000 eventi. Verificare i valori medi di destinazione FSC e SSC per linfociti gated. Se necessario, regolare nuovamente tensione FSC e SSC.
- Stampa schermo e la stampa dei valori di canale di destinazione che si ottengono.
- Impostazioni di compensazione di fluorescenza.
Nota: I controlli di singolo-macchiato compensazione devono essere impostati dopo le impostazioni di destinazione MFI e impostazioni di FSC/SSC sono state stabilite. Per questo passaggio, un PB da un volontario sano, particelle di compensazione (Tabella materiali), soluzione lisante e tampone di lavaggio sono necessari. L'elenco dei reagenti fluorocromo-coniugate dell'anticorpo utilizzato per configurare le matrici di compensazione di fluorescenza e le loro popolazioni di riferimento sono elencati in tabella 1.- Etichettare una provetta per reagente da utilizzare nella creazione di compensazione di fluorescenza (PerCPCy5.5, FITC, PE, APC, V450, V500, PECy7 - CD117, APC-H7 - CD10, APC-H7 - CD14 e APC-H7 - CD71) e un tubo "vuoto/senza macchia".
- Pipettare 50 µ l di PB in ciascuna provetta o 1 goccia di "negativo" compensazione particelle + 1 goccia di "positivo" compensazione particelle nei tubi controllo compensazione sopra indicate in tabella 1.
- Aggiungere una quantità appropriata di reagente anticorpo al tubo. Aggiungere tampone di lavaggio filtrata per raggiungere un volume finale di 100 µ l per provetta e mescolare delicatamente. Incubare per 15 min a RT, al riparo dalla luce.
- Aggiungere 2 mL di soluzione lisante fresco diluito solo nei tubi con le cellule e mescolare delicatamente. Incubare per 10 min a RT, al riparo dalla luce.
- Centrifugare per 5 min a 540 x g.
- Aspirare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare lasciando circa 50 µ l di volume residuo in ogni provetta. Mescolare delicatamente. Aggiungere 2 mL di tampone di lavaggio filtrata.
- Centrifugare 5 min a 540 x g.
- Aspirare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare lasciando circa 50 µ l di volume residuo in ogni provetta. Aggiungere tampone di lavaggio filtrata per raggiungere un volume finale di 250 µ l per provetta e mescolare delicatamente.
- Creare controlli di compensazione.
- Dalla barra dei menu, selezionare esperimento creato per acquisizione di perle dell'arcobaleno. Creare un nuovo ' esemplare | Installazione di compensazione | Creare compensazione controlli.
- Nella finestra di dialogo risultante, selezionare la casella di controllo ' Includi separata non macchiate controllo tubo/ben ' . Creare controlli generici (non specifico per etichetta) compensazione per FITC, PE, PerCPCy5.5, APC, HV450, HV500. Creare controlli etichetta specifica compensazione per PE-Cy7-CD117, APC-H7 - CD10, APC-H7 - CD14 e APC-H7 - CD71. Fare clic su 'OK'.
- In un nuovo foglio di lavoro, creare un grafico di SSC-A / FSC-A bi-parametrico e disegnare un cancello su linfociti (P1) e l'istogramma corrispondente al fluorocromo che verrà rilevato in ciascun tubo e disegnare un cancello P2 per il picco positivo. Visualizzare la gerarchia (clic destro su un grafico e selezionare "Visualizza gerarchia di popolazione") per visualizzare il numero di eventi in P2, fatta eccezione per il tubo di controllo non colorati.
- Nel Browser, espandere l'esemplare di controlli di compensazione.
- Vortice le cellule non macchiate, preparato in precedenza, per 3 – 5 s. installare le cellule non colorate disposti sul citometro. Regolare la portata a 'Medium' e fare clic su ' acquisire dati '. Nella trama FSC-A vs SSC-A puntino, regolare il gate di P1 per comprendere pienamente la popolazione linfocitaria. Pulsante destro del mouse sul cancello di P1. Selezionare 'Applica a tutti i controllo di compensazione'.
- Dal cruscotto «Acquisizione» , fare clic su 'Record dati ' di acquisire 5.000 eventi. Per tutte le celle di singolo-colore tinto controllo, verificare che il cancello di intervallo P2 comprende la popolazione positiva.
- Per il PE-Cy7 e tubi APCH7, aggiungere un cancello di intervallo P3 l'istogramma e assicurarsi che essa comprende la popolazione negativa, e che la P2 comprende la popolazione positiva.
- Calcolare la compensazione. Dalla barra dei menu, selezionare ' esperimento | Installazione di compensazione | Calcolare la compensazione '. La matrice di compensazione il nome: "Data di compensazioni". Selezionare 'Link e salvare'.
- Salvare la matrice di compensazione nelle impostazioni dell'applicazione catalogo: clicca su 'citometro impostazioni | Le impostazioni dell'applicazione | Salva ', un nome di matrice di incremento retributivo 'Data di compensazione' e fare clic su 'OK'.
- Nel Browser, fare clic su ' impostazioni citometro '. Nella finestra di ispezione, passare alla scheda «Compensazione» fare clic su stampa nell'angolo inferiore destro.
Nota: Queste informazioni possono essere recuperate anche dal catalogo. - Controllo della matrice compensazione.
- Mescolare in una provetta di tutto il singolo tubo macchiato (APCH7 di scelta).
- Creare un nuovo esperimento denominato 'Data di verifica di compensazione', aggiungere nuovo campione, fare clic destro su ' impostazioni citometro ' di questo esperimento e scegliete ' Link | Scollegare | Impostazione dell'applicazione ' salvato al passaggio 1.1.3.10. Acquisire 50.000 eventi da questo tubo con le nuove impostazioni.
- Applicare un nuovo foglio di lavoro globale. Creare 1 dot plot FSC-A/SSC-A e disegnare un cancello per visualizzare i linfociti e n x (n-1) / 2 altri appezzamenti incentrata sul cancello di linfociti per visualizzare i parametri di due a due.
- Configurazione dello strumento quotidiano
- Accendere il citometro. Assicurarsi che tutti i livelli del fluido siano appropriata e aperta Diva 6.1.3. Eseguire avvio fluidica: nella barra dei menu, selezionare ' citometro | Avvio della fluidica '. Fare clic su 'OK' quando richiesto. Consentire il citometro si riscaldi per almeno 30 min.
- Prestazioni Check - CST perline: ripetere la procedura 1.1.2.1–1.1.2.5.
- Controllo delle prestazioni - conferma dei valori PMT con perle dell'arcobaleno.
- Etichettare una provetta polistirolo come ' arcobaleno perle ' e controllare che il numero di lotto è quella in uso. Agitare bene il flacone di Rainbow Bead. Preparare le perle arcobaleno, aggiungere 1 goccia di perle dell'arcobaleno a 1 mL di acqua distillata o deionizzata. Proteggere dalla luce.
Nota: Procedere all'acquisizione o conservare la provetta a 2-8 ° c fino alla acquisizione. - Creare un nuovo esperimento: ' Rainbow perline data '.
- Collegare le compensazioni: fare clic con il pulsante destro su ' citometro impostazioni ', selezionare ' Link Setup', selezionare la matrice di adeguato compenso creata nel passaggio 1.1.5.9.9 e selezionare 'Sovrascrivi'.
- Scollegare la compensazione: fare clic con il pulsante destro su ' citometro impostazioni ', selezionare 'Scollega dal setup precedentemente collegato' e scegliere 'OK'.
- Applicare ' applicazione Impostazioni ': fare clic con il pulsante destro su ' citometro impostazioni ', selezionare ' Impostazioni applicazione ', applicare l'impostazione creata nel passaggio 1.1.3.10 durante l'installazione del mensile e selezionare 'mantenere il valore di compensazione '.
- Deselezionate l'opzione 'Attiva compensazione'.
- Creare un nuovo campione nell'esperimento con modello di foglio di lavoro per perle dell'arcobaleno. Acquisire il tubo nell'acquisizione di 'LOW' .
- Durante l'acquisizione di perline, regolare il cancello di P1 per includere solo la popolazione del branello di singoletto. Regolare il cancello P2 sulla trama del FITC-A / PE-A puntino per includere solo la popolazione del branello di singoletto. Registrare eventi di 10.000.
- Controllare che l'IFM e i valori di CV ottenuti per P2 popolazione siano gli obiettivi pre-definiti del protocollo. In caso contrario, lavare il citometro e avviare nuovamente l'operazione. Salvare il report in formato PDF.
- Etichettare una provetta polistirolo come ' arcobaleno perle ' e controllare che il numero di lotto è quella in uso. Agitare bene il flacone di Rainbow Bead. Preparare le perle arcobaleno, aggiungere 1 goccia di perle dell'arcobaleno a 1 mL di acqua distillata o deionizzata. Proteggere dalla luce.
2. preparazione del campione BM
Nota: Eseguire la cella protocollo appena prima la procedura di colorazione di lavaggio.
- Pipettare 600 µ l di campione primario in una provetta da centrifuga da 15 mL.
- Aggiungere 10 mL di tampone di lavaggio (PBS + 0,5% BSA [> BSA puro 98%] + 0,09% NaN3 filtrata soluzione a pH 7,4). Mescolare la sospensione cellulare bene usando una pipetta.
- Centrifugare per 5 min 540 x g (lavaggio 1). Scartare il sopranatante senza disturbare il pellet cellulare.
- Ripetere i passaggi 2.2 – 2.3 (programma 2).
- Sospendere il pellet cellulare in 400 µ l di tampone di lavaggio.
- Colorazione dei marcatori di spina dorsale. Trasferire l'intero volume degli anticorpi spina dorsale ad un tubo in polipropilene per analisi FACS, identificato con i dati del paziente e la "spina dorsale". Aggiungere 350 µ l di campione lavato (il volume di campione lavato necessario per riempire tutti i tubi sul pannello). Mescolare bene usando una pipetta.
Nota: Calcola il volume totale degli anticorpi di spina dorsale per la superficie della membrana di colorazione (come mostrato nella tabella 2). - Pipettare uguali quantità del mix di campione-backbone in 3 tubi in polipropilene per analisi FACS, identificato con i dati del paziente e "tubo numero 1" a "tubo numero 3". Se necessario, è possibile utilizzare tampone di lavaggio per raggiungere un volume finale di 200 µ l per provetta.
Attenzione: Fare attenzione a non lasciare alcuna traccia del campione sulle pareti dei tubi; in caso contrario, queste cellule non saranno colorate. Se necessario, vortice le cellule e centrifugare la provetta. - In ogni provetta, aggiungere il volume appropriato di anticorpi diretti contro marcatori di superficie cellulare (tranne che per i marcatori di spina dorsale), come specificato nella tabella 2. Mescolare bene usando una pipetta. Incubare per 30 min a temperatura ambiente al riparo dalla luce.
- Aggiungere 2 mL di soluzione lisante. Mescolare bene usando una pipetta. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce.
- Centrifugare per 5 min a 540 x g. Scartare il sopranatante senza disturbare il pellet cellulare, lasciando circa 50 µ l di volume residuo in ogni provetta. Mescolare bene usando una pipetta.
- Aggiungere 2 mL di buffer per il pellet cellulare di lavaggio. Mescolare bene usando una pipetta.
- Ripetere i passaggi 2.10 – 2.11 (programma 2).
- Centrifugare per 5 min a 540 x g. Scartare il sopranatante senza disturbare il pellet cellulare e risospendere il pellet cellulare in 200 µ l di PBS. Mescolare bene usando una pipetta.
- Acquisire le cellule, preferibilmente, immediatamente dopo la colorazione o conservare a 4 ° C, al riparo dalla luce, per non più di 1 ora fino a quando misurato nel citometro a flusso.
3. acquisizione dati
- Aprire un nuovo esperimento nel software Diva e rinominarlo secondo il nome, il tipo di campione e data.
- Creare un nuovo campione contenente 3 tubi. Specificare il layout di esperimento gli anticorpi utilizzati in ciascun tubo.
- Fare clic destro su ' impostazioni citometro ', scegliere ' Impostazioni applicazione ' e applicare i valori ottenuti nel Setup mensile (punto 1.1.3.10).
- Aprire un nuovo foglio di lavoro globale e creare le trame di puntino: SSC-A / FSC-A, SSC-A / CD45-HV500-A, SSC-A / FITC-A, SSC-A / PE-A, SSC-A / CD34-PerCP-Cy 5.5, SSC-A / CD117-PECy7-A, SSC-A / APC-A, SSC-A / APCH7-A, SSC-A / HLA-DR-HV450-A. Nella trama SSC-A/FSC-A puntino, creare un cancello per selezionare celle di singoletto. Nella trama SSC-A/CD45-BV500-A puntino, creare cancelli per selezionare 4 popolazioni: granulociti, monociti, esplosioni e linfociti. Progetto queste popolazioni nelle trame dot create in precedenza.
- Creare un nuovo foglio di lavoro globale per il controllo di compensazione come descritto nel passaggio 1.1.5.9.11.3.
- Acquisire il tubo in 'MEDIUM' acquisizione e record 500.000 eventi/tubo. Dopo la validazione tecnica (valutazione della compensazione e la macchiatura corretta), è possibile esportare i dati come file di FCS3.0.
4. analisi dei dati
Nota: Per costruire i database BM normali erano come segue il file utilizzati da donatori sani e da individui senza alcuna prova per una malattia ematopoietica 11 da 18 file per il Neutrophils_NM database, 10 da 18 file per Monocytes_NM database e 14 da 18 file di database NRC_NM. I file eliminati ha mostrato vari problemi tecnici, come presentato nella sezione risultati rappresentante. I file sono stati analizzati singolarmente utilizzando il software Infinicyt (Tabella materiali), conforme alle varie strategie raffigurate in Figura 1A(1-3) per lignaggio del neutrofilo (profilo Neutrophils_Maturation.inp), Figura 2 A per lignaggio del monocito (profilo Monocytes_Maturation.inp) e Figura 3A(1-2) per stirpe delle cellule degli eritrociti (profilo NRC_Maturation.inp).
- Strategia di analisi per i neutrofili -Costruzione di database Neutrophils_NM
- Identificare CD34 + neutrofilo-commesso blasti utilizzando un'intersezione di sette cancelli, consentendo la selezione di CD34 + CD117 + HLADR + basso CD10 - CD13 + CD11b-eventi (Figura 1a. 1). Assegnare questi eventi alla scheda 'Del neutrofilo' nella struttura della gerarchia di popolazione e da allora in poi deselezionare questa scheda al fine di rimuovere queste cellule (raffigurate in blu) dal display dei restanti eventi (grigio).
- Isolare il CD117 + CD34 - CD13 + CD11b-HLADR + Bassi precursori dei neutrofili utilizzando un'intersezione di sei porte, come illustrato nella Figura 1a (2) e assegnarli alla scheda 'Del neutrofilo' .
- Identificare più maturi neutrofili utilizzando un'intersezione di quattro cancelli, permettendo la distinzione del CD45dim SSCint-Ciao CD117-HLADR-cellule e loro assegnazione alla scheda 'Del neutrofilo' .
- Deselezionare gli eventi restanti, mantenendo solo i neutrofili visibili, quindi esportare questa popolazione facendo clic ' File | Esportare ' e verificare che tutti i parametri necessari vengono controllati e salvare i dati come file di FCS.
- In un file Unito composto da tutti i file esportati di FCS, eseguire un controllo di qualità da valutare l'intensità di espressione degli indicatori per ciascuna sottopopolazione. Utilizzando APS Piazzole con mediane per ogni file e curve di SD per ciascuna sottopopolazione mostrato, rimuovere i casi fuori le curve 2SD (Vedi dettagli nella sezione risultati rappresentante) (Figura 1B).
- Nel file risultante composto con "Neutrofili" visibili, disegnare il percorso di maturazione in un diagramma APS (Figura 1C a sinistra) e salvare come file .cyt.
Nota: Un confronto diagramma di maturazione permette la visualizzazione di tutti i parametri da tutti i file inclusi nel database Neutrophils_NM rappresentati nel database normalizzato. Il diagramma presentato nella Figura 2C, lato destro, Mostra che tutti i file inclusi nel database Neutrophils_NM (n = 11) montare in 2 SD rispetto con mediana del gruppo.
- Strategia di analisi per i monociti - costruzione di database Monocytes_NM
- Identificare le cellule di stirpe monocytic (CD117 + /-CD64 + HLADR + Ciao) utilizzando un'intersezione delle quattro porte (Figura 2A). Assegnare questi eventi alla scheda 'Monocytic' nella struttura della gerarchia di popolazione.
- Deselezionare gli eventi restanti, mantenendo solo le cellule monocytic visibili, quindi esportare questa popolazione facendo clic ' File | Esportare ' e verificare che tutti i parametri necessari vengono controllati e salvare i dati come file di FCS.
- In un file Unito composto da tutti i file esportati di FCS, eseguire un controllo di qualità da valutare l'intensità di espressione di marcatori per ogni sottopopolazione, quindi rimuovere i casi fuori le curve 2SD (dettagli nella sezione risultati rappresentante) (Figura 2 B).
- Nel file risultante con "Monocytic" celle visibili, disegnare il percorso di maturazione del diagramma di APS (Figura 2C a sinistra) e Salva come un file di .cyt.
Nota: Un confronto diagramma di maturazione permette la visualizzazione di tutti i parametri da tutti i file inclusi nel database Monocytes_NM rappresentati nel database normalizzato. Il diagramma presentato nella Figura 2C, lato destro, Mostra che tutti i file inclusi nel database Monocytes_NM (n = 10) montare in 2 SD rispetto con la mediana del gruppo.
- Strategia di analisi per globuli rossi nucleati (NRC) - costruzione di database NRC_NM
- Identificare degli eritrociti commit scoppi di CD34 + utilizzando un'intersezione di sette cancelli che permettono la selezione delle cellule CD34 + CD117 + HLADR + basso CD105 + CD33 - CD36 + CD71 + eventi (Figura 3a (1)). Assegnare questi eventi alla scheda "NRC" nella struttura della gerarchia di popolazione e quindi deselezionare questa scheda al fine di rimuovere queste cellule (raffigurate in rosso) dal display dei restanti eventi (grigio).
- Identificare più maturo NRCs utilizzando un'intersezione delle quattro porte che permettono la discriminazione CD45-/ + dim SSClow CD36 + Ciao CD71 + Ciao CD105 + /-cellule. Assegnare questi eventi alla scheda "NRC" (Figura 3a (2)). Le piastrine (CD36 + Ciao SSClow cellule) deve essere rimosso dalla popolazione NRC (Figura 3a (2)).
- Deselezionare gli eventi restanti, mantenendo solo le celle di NRC visibili, quindi esportare questa popolazione facendo clic ' File | Esportare ' e verificare che tutti i parametri necessari vengono controllati e salvare i dati come file di FCS.
- In un file Unito composto da tutti i file esportati di FCS, eseguire un controllo di qualità da valutare l'intensità di espressione di marcatori per ogni sottopopolazione, seguita dalla rimozione dei casi di fuori della 2SD curve (Vedi dettagli nella sezione risultati rappresentante) ( Figura 3 B).
- Nel file risultante con cellule "NRC" visibile, disegnare il percorso di maturazione del diagramma di APS (Figura 3C, sinistra) e Salva come un file di .cyt.
Nota: Un confronto diagramma di maturazione permette la visualizzazione di tutti i parametri da tutti i file inclusi nel database NRC_NM rappresentati nel database normalizzato. Il diagramma presentato nella Figura 3C, lato destro, Mostra che tutti i file inclusi nel database NRC_NM (n = 14) montare in 2 SD rispetto con mediana del gruppo.
- Valutazione di maturazione nei compartimenti mieloide BM utilizzando i database di maturazione
- Aprire il file di .cyt corrispondente al lignaggio di interesse (cioè., Neutrophils_NM_GMFF.cyt per lignaggio del neutrofilo, Monocytes_NM_GMFF.cyt per stirpe monocytic e NRCs_NM_GMFF.cyt per la stirpe degli eritrociti).
- Pulsante destro del mouse nella scheda 'Maturazione' sotto la scheda corrispondente alla stirpe di interesse (' neutrofili | Monocytic | NRC') e salvare il Database di maturazione a maturazione.
- Aprire un nuovo file di FCS ed eseguire l'analisi come spiegato in precedenza (passaggio 4.1.1–4.1.3 per i neutrofili, passo 4.2.1 per cellule Monocytic, e passaggio 4.3.1–4.3.2 per NRC).
- Disegnare il percorso di maturazione per la popolazione di interesse.
- Aprire il database corrispondente nella scheda 'Strumenti' (analisi del Database) e confrontare la popolazione per essere analizzati con il corrispondente Database di maturazione. Controllare i dati per la compatibilità con il database disponibile: completa compatibilità (triangolo verde); compatibilità parziale, nella maggior parte delle discrepanze di casi nel nome i parametri (triangolo giallo); e incompatibilità (triangolo rosso).
- Se i dati sono compatibili o parziale compatibili, il software crea il diagramma ' normalizzato le differenze di maturazione ' . Per visualizzare le ' parametro Band maturazione differenze ', apre un nuovo diagramma in 'Schema' scheda, fare clic su 'Maturazione' e scegliere quanti parametri venga visualizzata, fare clic su 'OK' e nel diagramma vengono visualizzati. Con fate clic destro nel diagramma; possono essere apportate modifiche nella visualizzazione dei dati, la visualizzazione di Database e la visualizzazione diagramma di maturazione.
- Per visualizzare il significato delle differenze tra il nuovo file e dati inclusi nel database, configurare uno zoom (tasto destro del mouse su ' normalizzato le differenze di maturazione ' e applicare 'Zoom').
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Representative Results
I 54 campioni di BM raccolti in K-EDTA anticoagulante sono stati inclusi nello studio. In assenza di tutte le informazioni sui pazienti sono stati analizzati i dati MFC. Studio retrospettivo hanno dimostrato che i campioni di BM erano 7 donatori sani (5 maschi e 2 femmine con un'età mediana di 47,4 [35-48], 11 individui senza prova di una malattia ematopoietica (8 maschi e 3 femmine con un'età mediana di 57,9 [35-72]) e 36 casi con varie condizioni patologiche: 1 caso con l'anemia e il livello della creatinina bassa, 3 casi con l'anemia e il livello elevato della creatinina, 8 casi con l'anemia di infiammazione, 1 caso con l'anemia causata dalla vitamina carenzaB12 , 4 casi con l'anemia ± altre citopenie causate da danni al fegato, 3 casi con l'anemia emolitica autoimmune, 5 casi con purpura thrombocytopenic idiopatico, 1 caso con sindrome da attivazione macrofagica, 3 casi con remissione completa dopo il trattamento di linfoma (malattia minima residua < 0.01%) e 7 casi che trasportano i disordini ematologici (4 MDS, 1 AML, 1 leucemia mielomonocitica cronica e 1 sindrome mieloproliferativa JAK2 positivo). Quest'ultima categoria incluso 18 maschi e 18 femmine con una media di età 60,3 [17-100]. Tutti i campioni erano da individui caucasici. I database di costruzione ha permesso di identificare e risolvere diversi problemi relazionati alla acquisizione e preparazione del campione. Nel nostro caso, i database finali inclusi 11/18 per la maturazione dei neutrofili, 10/18 file per maturazione del monocito e file 14/18 per maturazione NRC. I file che non sono stati inclusi nei database pone vari problemi tecnici. I più comuni problemi di colorazione sono stati osservati per CD11b e CD13 in neutrofili, CD300e e HLADR in monociti, e CD71 e HLADR in NRCs. esportazione dei dati può essere una fonte di errori; il più frequente nel nostro dataset è stata l'assenza di FSC-H nei file esportati e le inversioni di FSC-W con FSC-H che a volte si verificano nell'esportazione DIVA file8. La valutazione di nuovi casi di cytopenias sospettati di essere MDS contro i database di maturazione mieloide normale consentono l'identificazione dell'espressione anormale degli antigeni di maturazione del lignaggio di neutrofili (Figura 4), monociti (Figura 5 ) e NRC (Figura 6) anche nei casi senza anomalie citologiche o citogenetiche (Figura 7). In caso contrario, utilizzando software di acquisizione sistematica, come Diva, questi sarebbero difficili o impossibili da realizzare.
Figura 4 : Analisi di citometria a flusso rappresentativo dei neutrofili in un caso MDS del(7). (A) diagramma In the Differences normalizzato maturazione, l'area grigia corrisponde all'espressione normale di antigeni risultanti dall'analisi dei file normali 11 inclusi nel database del neutrofilo (median± 2SD). L'espressione anormale degli antigeni diversi è stata osservata in paragone il caso MDS del(7) contro Neutrophils_NM database (n = 1 verso n = 11 comandi normali campioni). (B) parametro Band maturazione diagrammi consentono il confronto tra l'intensità mediana di espressione di ogni marcatore a diversi stadi di maturazione (linee continue complete) e curve 2SD calcolato per 11 case BM normale inclusi nel database (linee continue e tratteggiate). Le anomalie fenotipiche dei neutrofili osservate in un caso MDS del(7) rispetto al Database di maturazione dei neutrofili normale sono come segue: complessiva aumentata espressione di CD34, lieve aumento di espressione di CD11b sui neutrofili immaturi (fase 2), diminuita espressione di CD13 sui neutrofili immaturi (fasi 1-3) e lieve aumento di espressione di CD16 sulle prime due fasi di maturazione dei neutrofili, seguita dagli aumenti moderati di CD16 espressione su neutrofili maturi (fasi 4-5). (C) Mostra che il punto corrispondente traccia come visualizzato nel software DIVA. Valutazione dell'immagine utilizzando il software DIVA consente per l'identificazione di un piccolo numero di anomalie fenotipiche in questo caso MDS: una percentuale aumentata delle cellule CD34 + CD13 + precursori e il downregulation dell'espressione di CD13. L'espressione anormale di CD16 è difficile da osservare in questo tipo di rappresentazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Analisi di citometria a flusso rappresentativo dei monociti in un caso MDS del(7). (A) le differenze di maturazione Normalized offerte diagramma: Veduta di espressione dell'antigene nelle varie fasi di maturazione di lineage delle cellule monocytic. L'area grigia corrisponde all'espressione normale di antigeni risultanti dall'analisi dei 10 normali file inclusi nel database monocitica (mediana ± 2SD). L'espressione anormale degli antigeni diversi supera 2SD, ma per alcuni indicatori, quali CD35 e HLADR, supera 4SD. (B) In the parametro Band maturazione diagrammi, le anomalie fenotipiche delle cellule monocytic osservate in un SMD del(7) caso in cui rispetto ai monociti normale maturazione Database (n = 1 e n = 10 comandi normali campioni) sono come segue: diminuita espressione di CD45 durante le fasi 1-4 di cellule monocytic, di CD117 alle fasi 1-2 di precursori monocytic e di HLA-DR in generale. L'espressione aumentata di CD35 nelle prime 3 fasi di maturazione delle cellule monocytic era l'anomalia più significativo per questo lignaggio. (C) The DIVA punteggiano trame che consentono la valutazione delle cellule monocytic in un punto singolo normale considerando (D) il DIVA trame che consentono la valutazione delle cellule monocytic in del(7) caso MDS. Valutazione dell'immagine utilizzando il software DIVA permette un'identificazione di due anomalie fenotipiche in questo caso MDS: la diminuita espressione di HLA-DR e l'espressione aumentata di CD35 in una parte dei precursori monocytic (popolazione rosso). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 : Analisi di citometria a flusso rappresentativo degli eritrociti nucleati in un caso MDS del(7). (A) le differenze di maturazione Normalized offerte diagramma: Veduta di espressione dell'antigene nelle diverse fasi di maturazione del lignaggio di NRC. L'area grigia corrisponde all'espressione normale di antigeni risultanti dall'analisi dei file normali 14 inclusi nel Database di maturazione normale NRC (mediana ± 2SD). L'espressione anormale degli antigeni diversi supera 2SD, ma per alcuni indicatori, quali CD34, CD117, CD71 e CD105, supera 4SD. (B) In the parametro Band maturazione diagrammi, le anomalie fenotipiche osservate in un caso di del(7) SMD rispetto con il Database di maturazione normale NRC (n = 1 verso n = 14 campioni di comandi normali) sono come segue: diminuita espressione di CD34 nelle prime due fasi di maturazione, CD117, CD105, CD71 e di HLA-DR sulla fase 1 dei precursori degli eritrociti lignaggio. Valutazione dell'immagine utilizzando il software DIVA permette un'identificazione di CD71 anormale espressione sulle cellule eritroidi in questo caso MDS, ma altre modifiche non sono rilevabili. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7 : Analisi di citometria a flusso rappresentativo dei neutrofili, monociti e NRC in uno stadio precoce caso MDS senza displasia morfologica e senza citogenetica aberrancies. (A) la distribuzione delle cellule immature e mature all'interno delle fasi di maturazione diversi per i tre lignaggi mieloidi: neutrofili, monociti e NRC. È stato osservato un aumento del numero dei monociti maturi (fase 5) e il leggermente la diminuzione delle cellule acerbe monocitica (fase 2 di maturazione). (B) differenze di maturazione ha normalizzato il diagramma mostra che le anomalie fenotipiche superano 2SD, ma per CD34, CD117, CD11b, CD16 e HLADR, sono superiori alle 4SD. anomalie fenotipiche osservate per i neutrofili sono come segue: leggermente i valori di aumento SSC in precursori dei neutrofili immaturi (fase 1), diminuzione dell'espressione di CD34 (fase 1), di CD117 (fase 1), di CD16 (fase 1 - 2) e di HLADR (fasi 1-3 di maturazione). Un'aumentata espressione di CD11b è stata osservata sui precursori dei neutrofili immaturi (fase 1). (C) The normalizzato maturazione differenze diagramma mostra che le più importanti anomalie fenotipiche osservate per la stirpe monocytic (superiore a 10SD) sono aumentata espressione di CD35 e acquisizione precoce delle CD300e su immaturi monocytic precursori. Altre anomalie fenotipiche osservate sulla stirpe monocytic sono come segue: diminuzione del FSC e SSC sui monociti più maturi (fasi 3-5) e lieve diminuzione dell'espressione di CD14 sulle fasi 2-3 delle cellule monocytic. Diagramma (D) le differenze di maturazione normalizzato e i diagrammi di maturazione Band parametro Mostra che le più importanti anomalie fenotipiche osservate per il NRC sono: aumentata espressione del CD117 (superiore a 10SD) su fasi 2-3 del NRC maturazione, aumentata espressione di CD34 (superiore a 5SD) durante la seconda fase di maturazione del NRC e diminuita espressione di CD36 sui primi precursori eritroidi (fasi 1-3). Inoltre, il CSD su NRC immaturo è inferiore su controparti normali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Inoltre, l'interpretazione del significato delle differenze tra l'espressione dell'antigene su impostazioni patologiche e controparti normali consente di "quantificazione" di queste anomalie, con l'identificazione di coloro che sono la discriminante per un gruppo dei casi. Questo può anche rendere possibile classificarli in base alla importanza ai fini di un follow-up. In questo studio, tutti i 7 casi di disordini ematologici con caratteristiche di displasia mieloide (4 MDS, 1 AML, 1 leucemia mielomonocitica cronica e 1 sindrome mieloproliferativa JAK2 positivo) sono stati classificati come anormale se confrontato con i database NBM. Inoltre, la valutazione sul database Neutrophils_NM eliminato il sospetto di displasia mieloide in 7 casi con anemia emolitica tossica, infiammatoria, autoimmune e l'anemia da malattia renale cronica. La valutazione sul database Monocytes_NM eliminato il sospetto di displasia mieloide in 4 casi con purpura thrombocytopenic idiopatico (ITP), mentre la valutazione contro NRC_NM consentito per differenziazione in 3 casi, 2 di anemia infiammatoria e 1 di ITP. La BM aspira dai pazienti in remissione completa dopo linfoma o tumore solido trattamenti erano entro 2 SD dalla mediana dei database normale per tutti e tre i stirpi e così questi campioni possono essere alternative ai campioni di donatori sani BM.
Figura 1 : Analisi delle strategie per stirpe delle cellule del neutrofilo. (A) selezione di CD34 + CD117 + HLADR + basso dei progenitori di CD10 - CD13 + CD11b-neutrofilo è stata realizzata da intersezione di sette cancelli, come raffigurato in A1. Il passo successivo di maturazione, CD117 + CD34 - CD13 + CD11b-HLADR + Bassi precursori dei neutrofili è stato scelto utilizzando un'intersezione di sei porte, come raffigurato in A2. I neutrofili più maturi finalmente vengono identificati mediante un'intersezione di quattro cancelli che permettono la discriminazione delle CD45dim SSCint-Ciao CD117-HLADR-cellule (A3). La maggior parte dei indicatori discriminante per lignaggio del neutrofilo erano CD34, CD117, CD11b e CD16. Insieme a CD13, questi parametri consentono l'identificazione di cinque sottopopolazioni: CD34 + progenitori (CD34 + CD117 + CD13 +basso CD11b - CD16-) (blu scuro); CD34 - CD117 + CD13 +Ciao CD11b-CD16-neutrofilo precursori (blu); CD34 - CD117 - CD13 +basso CD11b-CD16-neutrofili (3rd passaggio di maturazione azzurro); CD34 - CD117 - CD13 +basso CD11b + CD16 + neutrofiliBassi (4° passo di maturazione; rosa); neutrofili maturi (CD34 - CD117 - CD13 +Ciao CD11b +Ciao CD16 +Ciao; viola). Ogni cerchio colorato rappresenta la mediana di una sottopopolazione per l'indicatore di interesse da un campione (B). (C) consente di visualizzare la distribuzione omogenea dei parametri testati durante la maturazione delle cellule del neutrofilo quando confrontato con 2 SD del database maturazione normale (n = 11). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Strategia di analisi per i monociti. Identificazione delle cellule di stirpe monocytic (CD117 + /-CD64 + HLADR + Ciao) viene eseguita utilizzando un'intersezione delle quattro porte (A). Più discriminante gli indicatori per stirpe monocytic erano CD14, CD300e (IREM2), CD35 e HLA-Dr. lungo con CD117, questi parametri consentono l'identificazione di tre sottopopolazioni: CD34 - CD117 +basso/ - HLADR +Ciao CD35 - CD14 - CD300e - (rosso); CD34 - CD117 - HLADR +med CD35 +med CD14 +med CD300e - (arancione); maturo monociti CD34 - CD117 - HLADR +med CD35 +Ciao CD14 +Ciao CD300e + (verde) (B). (C) consente di visualizzare la distribuzione omogenea dei parametri testati durante la maturazione cellulare monocytic se confrontato con 2 SD del database maturazione normale (n = 10). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Analisi delle strategie per NRCs. (A) l'identificazione di CD34 + scoppi degli eritrociti commit è stato realizzato utilizzando un'intersezione di sette porte che consente la selezione delle cellule CD34 + CD117 + progenitori eritroidi (A1). La NRC più maturi vengono identificati tramite un incrocio di cinque cancelli (A2). Esclusione delle piastrine (CD36 + Ciao SSClow cellule) da NRC popolazione è richiesta (A2). La maggior parte dei indicatori discriminante per stirpe delle cellule degli eritrociti erano CD34, CD117, CD71 e CD105. Insieme a CD33, questi parametri consentono l'identificazione di tre sottopopolazioni: CD45 +basso CD34 + CD117 + HLADR +med CD71 +med CD36 +med CD105 +Ciao (rosso); CD34 - CD117 + HLADR +basso CD71 +Ciao CD36 +Ciao CD105 +Ciao NRC (2nd passo di maturazione; rosa); CD34-CD117-HLADR-/ +basso CD71 +Ciao CD36 +med CD105 +basso/-NRCs (più maturo NRCs; rosa salmone) (B). (C) consente di visualizzare la distribuzione omogenea dei parametri testati durante la maturazione di NRC se confrontato con 2 SD del database maturazione normale (n = 14). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: elenco dei reagenti fluorocromo-coniugate dell'anticorpo utilizzato per configurare le matrici di compensazione di fluorescenza con le loro popolazioni di riferimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa tabella.
Tabella 2: Combinazione e quantità di anticorpi utilizzati per la valutazione della maturazione delle cellule dei neutrofili, monociti e degli eritrociti in considerando Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa tabella.
File complementare 1: Monocytes_Maturation.inp per favore clicca qui per scaricare questo file.
File supplementari 2: Monocytes_NM_GMFF.CYT Per favore clicca qui per scaricare questo file.
File supplementari 3: Neutrophils_Maturation.inp Per favore clicca qui per scaricare questo file.
File supplementari 4: Neutrophils_NM_GMFF.CYT Per favore clicca qui per scaricare questo file.
File supplementari 5: NRC_Maturation.inp Per favore clicca qui per scaricare questo file.
File supplementari 6: NRC_NM_GMFF.CYT Per favore clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
La qualità dell'aspirato BM poteva avere un impatto sui risultati finali. L'emodiluizione dell'aspirato BM potrebbe distorcere la distribuzione delle cellule in diversi stadi di maturazione a causa dell'assenza dei progenitori o precursori cellule. Probabilmente che impiegano un metodo di lisi di massa può aiutare nella normalizzazione del BM aspira per hemodilution in analisi cytometric di flusso. Inoltre, i passaggi critici per la valutazione di displasia mieloide BM di citometria a flusso sono l'esempio di elaborazione e di colorazione, acquisizione dati e interpretazione2,3. L'esempio di lavorazione e colorazione dovrebbe essere effettuata fino a 72 h dopo la raccolta di BM. I dati dovrebbero essere acquistati, preferibilmente, immediatamente dopo la colorazione o conservare i campioni a 4 ° C, al riparo dalla luce, per non più di 1 h fino a misura nel citometro a flusso. L'interpretazione di database-Guida evita la valutazione soggettiva della maturazione delle cellule mieloidi BM.
Le combinazioni di anticorpo e la preparazione del campione sono stati largamente conformati al EuroFlow procedure9,10. La differenza con il pannello di EuroFlow era che tutti gli anticorpi tranne CD300e sono stati forniti da BD Bioscience. La standardizzazione di citometria a flusso ha permesso di ottenere dati con elevati livelli di riproducibilità11, ma questo comporta entrare in un gruppo di lavoro sulla standardizzazione dei pannelli in questione. Nel nostro gruppo, la standardizzazione della SSC rimane un'area di essere migliorata. Il problema principale per quanto riguarda i database MFC edificio è la procedura di colorazione. La distribuzione iniziale degli anticorpi non-backbone in FACS tubi prima di aggiungere gli importi uguali del campione-backbone mix evita ripetendo la spina dorsale macchiatura in caso di eventuali errori nella distribuzione di altri anticorpi non-backbone. Inoltre, per superare la macchiatura problemi ci sono due possibilità: aumentare il tempo di incubazione di anticorpi da 15 a 30 minuti, oppure utilizzare gli anticorpi ricombinanti, che forniscono una maggiore riproducibilità, secondo il produttore specifiche tecniche12. L'analisi è stata eseguita in conformità ai dati recentemente pubblicati13,14,15. Per quanto riguarda i monociti analisi, abbiamo osservato frequentemente l'assenza di cellule CD34 + CD117 - monocytic precursori, come precedentemente è stato segnalato da Shen et al. 16. per questo motivo, abbiamo eliminato dalla strategia di analisi un cancello complementare per l'isolamento di questa particolare popolazione. L'intersezione delle porte consentendo isolamento di CD64 + F HLADR + F/int e CD117 + /-include i precursori immaturi (CD117 + CD34 + basso /-) e il più maturo dei monociti.
La valutazione di nuovi file di FCS, rispetto a un database contribuisce ad un obiettivo più, standardizzata interpretazione analisi e dati e consente di evitare interpretazioni errate del riconoscimento pattern cosiddetto, che è difficile da standardizzare3. La quantificazione dell'ampiezza di anomalie fenotipiche rispetto al normale database rende possibile classificare queste anomalie, che possono contribuire a migliorare i punteggi MFC per la diagnosi MDS. Inoltre, questo metodo permette l'identificazione precisa delle anomalie fenotipiche immaturi CD34 + e/o CD117 + precursori e nelle cellule più mature, che non sono evidenti quando si utilizzano le attuali strategie di analisi nel software di acquisizione. Questo metodo è rilevante nella diagnosi di casi MDS che o non hanno evidenti anomalie morfologiche, oppure che non o non trasportare citogenetiche ricorrenti aberrancies.
Miglioramento di macchiatura dell'anticorpo è necessaria, e l'aggiunta di nuovi dati di BM normali nei database è necessaria al fine di aumentare la robustezza, affidabilità e la sensibilità dell'analisi. Questo metodo potrebbe essere applicato, con ulteriori indagini, citopenie da altre cause, o ematopoiesi clonale del potenziale indeterminato (CHIP), al fine di identificare i cambiamenti fenotipici attendibilmente relativi ai processi displastici.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari. Il dipartimento di citometria a flusso, il laboratorio di Ematologia presso l'ospedale universitario di Saint-Etienne è un membro del Consorzio EuroFlow.
Acknowledgments
Gli anticorpi utilizzati in questo studio sono stati forniti da BD Biosciences. Gli autori vorrei ringraziare loro collega, Dr. Pascale Flandrin-Gresta, dal dipartimento di biologia molecolare, laboratorio di ematologia, Università ospedale di Saint-Etienne, Francia, che hanno fornito le competenze per l'interpretazione di dati NGS per la seconda Caso MDS. Gli autori sono grati per gli ematologi clinico per il loro interesse e la partecipazione a questo studio e per i pazienti e donatori sani per il loro accordo partecipare a questo studio. Gli autori inoltre ringraziare la Fondazione di "Les Amis de Rémi" per il sostegno finanziario per la pubblicazione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSCanto II flow-cytometer | BD Biosciences, CA, USA | SN: V33896301336 | 3-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf |
| Awel C48-R Centrifuge | AWEL Industries, FR | SN: 910120016; Model No: 320002001 | low speed centrifuges; capacity 60 FACS tubes |
| Pipetts of 10µL and 200µL | |||
| Pasteur pipettes | |||
| 15 mL Falcon tubes | |||
| polypropylene tube for FACS | |||
| Mouse Anti-Human HLA-DR | BD Biosciences, CA, USA | 655874 | clone L243 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm) |
| Mouse Anti-Human CD45 | BD Biosciences, CA, USA | 560777 | clone HI30 Mouse IgG1, κ Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm) |
| Mouse Anti-Human CD16 | BD Biosciences, CA, USA | 656146 | clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD13 | BD Biosciences, CA, USA | 347406 | clone L138 Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD34 | BD Biosciences, CA, USA | 347222 | clone 8G12 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm) |
| Mouse Anti-Human CD117 | BD Biosciences, CA, USA | 339217 | clone 104D2 Mouse BALB/c IgG1 Fluorochrome PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm) |
| Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, CA, USA | 333143 | clone D12 Mouse BALB/c IgG2a, κ D12, Fluorochrome APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm |
| Mouse Anti-Human CD10 | BD Biosciences, CA, USA | 646783 | clone HI10A Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Mouse Anti-Human CD35 | BD Biosciences, CA, USA | 555452 | clone E11 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD64 | BD Biosciences, CA, USA | 644385 | clone 10.1 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD300e | Immunostep | IREM2A-T100 | clone UP-H2 Mouse BALB/c IgG1, k Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, CA, USA | 641394 | clone MoP9 Mouse BALB/c IgG2b, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Mouse Anti-Human CD36 | BD Biosciences, CA, USA | 656151 | clone CLB-IVC7 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD105 | BD Biosciences, CA, USA | 560839 | clone 266 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD33 | 345800 | clone P67.6 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
|
| Mouse Anti-Human CD71 | BD Biosciences, CA, USA | 655408 | clone M-A712 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Lysing Solution 10x Concentrate (IVD) | BD Biosciences, CA, USA | 349202 | |
| FACSFlow Sheath Fluid | BD Biosciences, CA, USA | 342003 | |
| FACSDiva CS&T IVD beads | BD Biosciences, CA, USA | 656046 | |
| RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS | Cytognos, Salamanca, Spain | SPH-RCP-30-5A | lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01 |
| Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD) | BD Biosciences, CA, USA | ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291 | |
| Diva software versions 6.1.2 and 6.1.3 | BD Biosciences, CA, USA | ||
| Phosphate buffered saline tablets | R&D Systems, Minneapolis, USA | 5564 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, France | A9647 | |
| Sodium azide 99% | Sigma-Aldrich, France | 199931 | |
| Infinicyt software version 1.8.0.e | Cytognos, Salamanca, Spain |
References
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