Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Cytometry זרימה מונחה מסד הנתונים להערכה של התבגרות התא מיאלואידית מח עצם

Published: November 3, 2018 doi: 10.3791/57867
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 4, 5, 4, 6, 1
1Department of Hematology, University Hospital of Saint-Etienne, 2Department of Immunology, University Hospital of Grenoble-Alpes, 3Department Hematology, University Hospital of Clermont-Ferrand, 4Department of Immunology, University Hospital of Nice, 5Department of Biopathology, Institute Paoli-Calmettes, 6Department of Hematology, University Hospital of Lille

Summary

האבחנה MDS קשה בהיעדר קריטריון מורפולוגי או ציטוגנטיקה אינפורמטיבי. MFC יכול לעזור לעדן את תהליך האבחון של MDS. כדי להיות שימושי עבור הקלינית, הניתוח MFC חייבת להתבסס על פרמטרים מספיקה ירידה לפרטים ורגישות, נתונים צריכים להיות לשחזור בין המפעילים השונים.

Abstract

קבוצת עבודה יזם בתוך האגודה Cytometry צרפתית (AFC) פותחה ומשתלבת בהרמוניה היישום של cytometry זרימה multiparameter (MFC) עבור אבחון מחלת מיאלואידית בצרפת. פרוטוקול המובאת כאן הייתה מוסכמת ושימושית בין ספטמבר 2013 בנובמבר 2015 שש מעבדות אבחון צרפתי (בתי חולים אוניברסיטאיים Saint-Etienne, גרנובל, פראנד, ניס, ואת ליל אינסטיטוט פאולי-Calmettes ב מרסיי) והתירו את התקינה של הכנה דגימת מח עצם ורכישת נתונים. שלושה מסדי נתונים ההבשלה פותחו עבור נויטרופילים, monocytic, ו erythroid שושלות עם מח עצם מאנשים התורם "בריא" (יחידים ללא ראיות של מחלה hematopoietic). שיטה חזקה של ניתוח עבור כל השושלת מיאלואידית צריך להיות ישימים עבור שימוש לאבחון שגרתי. מקרים חדשים יכול להיות מנותח באופן זהה, לעומת נגד מסד הנתונים הרגיל. לפיכך, ניתן לזהות חריגות פנוטיפי כמותיים ואיכותניים, אלה מעל 2SD לעומת הנתונים של דגימות מח עצם נורמלי לשקול מעידה על פתולוגיה. המגבלה העיקרית היא ההשתנות גבוה יותר בין נתוני מושגת באמצעות נוגדנים חד-שבטיים שהושג עם השיטות המבוססים על טכנולוגיות ליפידים ומשמשים כיום אבחון קליני. הגדרת קריטריונים עבור אימות טכני של הנתונים רכשה עשוי לסייע בשיפור השירות של MFC לאבחונים MDS. הקמתה של קריטריונים אלה דורש ניתוח מול מסד נתונים. ההפחתה של החוקר הסובייקטיביות בניתוח נתונים היא יתרון חשוב של שיטה זו.

Introduction

בהיעדר ספציפית לשינויים dysplastic המתרחשים בתאי מיאלואידית במהלך החניכה MDS, התקדמות פנוטיפי סמנים, גישה חדשה הוצע בשנים האחרונות, בהתבסס על הערכת המסלולים ההבשלה (ביטוי שונה של אנטיגנים מיאלואידית במהלך הייצור של התאים מיאלואידית בוגרים) או של התפלגות נורמלית של סוגי תאים שונים בתוך מח העצם (מוניטור) תאים תאים1,2.

מאמר זה מציג שיטה חדשה עבור יישום מתוקננת של MFC כדי לזהות שינויים dysplastic בתאים התאים מיאלואידית מוניטור הקשורות תסמונות myelodysplastic (MDS) או מחלות אחרות hematological מיאלואידית. מחקר זה מראה גם את תוכנית השירות של שימוש ההבשלה מסדי נתונים עבור ניתוח נתונים MFC.

סטנדרטיזציה של הליך הכנת המדגם, חדרי קירור והקפאה, ניתוח באמצעות מסדי הנתונים יאפשר זיהוי ליקויים פנוטיפי הרלוונטיים ביותר הקשורים לשינויים dysplastic בתאי מיאלואידית מוניטור. לכן, קבוצות משנה סטטיסטית הנבחר בהתבסס על תבניות הלחצנים הוסף מוכרת היטב (דיאגרמות מפריד האוכלוסייה אוטומטי (APS), היסטוגרמות, וחלקות נקודה) נדרשים עבור פיתוח אסטרטגיית ניתוח יכול לשמש לאחר מכן ניתוח סיבובים. גילוי מומים פנוטיפי חזק ב- MDS תקל את האבחנה במקרים עם או ללא דיספלזיה מורפולוגי מינימלית וללא cytogenetic aberrancies. זיהוי של פרמטרים מפלה המאפשר צמצום של לוחות immunophenotypic עשויה לפשט הנוכחי ציונים2, המתיר שלהם הישימות במעבדות קליניות פתולוגיות.

שיטה זו מגבילה את הפרשנות הסובייקטיבית של cytometry נתונים, כמו היה לשלוח אותן ב- MDS אבחון3. שלב זה הוא תנאי הכרחי להתפתחות של כלים אוטומטיים עבור עיבוד וניתוח זרימת נתונים4.

MDS כוללת קבוצה הטרוגנית של הפרעות המשובטים תאי גזע hematopoietic (HSC) שבו מוטציות ספלייסוזום לשתף פעולה עם הספציפיים המגבילים epigenetic להניב תשואה של פנוטיפ MDS. כיום ידוע כי יחד עם מועדון הכדורגל מונפלייה מוטציות, מנגנונים אחרים המעורבים פתופסיולוגיה MDS, כגון דלקת בתיווך החיסונית סוטה אינטראקציות בין ממאיר HSCs את microenvironment סטרומה של ויטביע. עם זאת, מנגנונים אלה נשארים ממעטים להבין. הטרוגניות לרווחה קליניים והביולוגיה של MDS הופך האבחון, הבחירה של הטיפול האופטימלי אתגר. בעשור האחרון, מחקרים רבים הראו כי ה-MFC הוא לעיתים קרובות יותר רגיש באיתור דיספלזיה2 יותר מורפולוגיה, אבל אילוצים טכניים וכלכליים לעשות את הטכניקה הזו קשה לתקנן, עם תוצאות קרובות בהתאם ניסיון של מתורגמן3. בנוסף, לא ברור איך MFC יכול להטות את הכף לכיוון MDS במקרים עם או ללא דיספלזיה מורפולוגי מינימלי, בהיעדר חריגות cytogenetic, או במקרים גבוליים כגון hypocellular MDS, עם ספירה נמוכה הפיצוץ, מן מוניטור אחרים שאינם המשובטים הפרעות כגון אי ספיקת מח עצם (כלומר., אנמיה אפלסטית). זה גם נשאר קשה להבדיל בין מקרים גבוליים של MDS עם עודף של תקיעות לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML). מכל הסיבות האלה, ההנחיות הקלינית אינם משתלבים MFC בדיקות לתוך האבחנה הסופית של MDS. בשנת 2011, ארצות הברית הלאומית מקיף סרטן רשת (NCCN) מומלצת MFC ההערכה של האחוז של תאי CD34 +, זיהוי של שיבוטים hemoglobinuria ליליות התקפי, ונוכחות של שיבוטים ציטוטוקסיות תא T ב- MDS hypocellular5. אלה שני מצבים האחרון כרוך גם מטרה טיפולית כי נתונים קליניים הראו תגובה טובה של חולים אלו טיפול לדיכוי המערכת החיסונית6. הנחיות NCCN 2017, בצטטו את המלצות קבוצת העבודה הבינלאומית (IWG), רשום immunophenotyping סוטה זיהוי על-ידי MFC מהקריטריונים שיתוף לאבחון MDS, אך ללא ביצוע כל מפרטי6. בנוסף, סיווג WHO שפורסמו לאחרונה קובע כי הממצאים MFC לבד אינן מספיקות כדי לבסס אבחון ראשי של MDS, בהעדר נתונים מורפולוגיים ו/או cytogenetic חד7. עם זאת, MFC יכול לשמש מבחן נוסף מציג dysregulation של התאים מיאלואידית ההבשלה דפוסי וכימות "מרחק מן הרגיל" עבור חולה בזמן מסוים בקורס המחלה.

שיטה זו ישימה במעבדות קליניות מעוניין בהערכה של דיספלזיה בתאי מיאלואידית מוניטור באמצעות MFC immunophenotyping, על מנת לחדד את האבחנה MDS או הפרעות אחרות מיאלואידית עם מומים dysplastic.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקול המפורטים להלן אושרה על ידי "Comité דה הגנה des Personnes" (ועדת האתיקה Independant) Sud-Est 1 מ אוניברסיטת בית החולים של Saint-Etienne, צרפת.

1. Cytometer הגדרות

הערה: ההגדרות cytometer בוצעו על פי המלצות צרפת לזרום, על פי נוהל EuroFlow "EuroFlow תקן הפעלה פרוטוקול (SOP) עבור כלי ההתקנה ופיצויים (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php).

  1. התקנת מכשיר חודשי
    1. הפעל את cytometer. להבטיח כי כל רמות הנוזלים הדיווה המתאים ופתוח 6.1.3. לבצע אתחול פלואידיקה: שורת התפריט, בחר ' Cytometer | פלואידיקה אתחול '. לחץ על 'אישור' כאשר תתבקש לעשות זאת. אפשר cytometer את לחמם במשך לפחות 30 דקות.
    2. בדיקת הביצועים - החרוזים CST
      הערה: בשלב זה, להכין 12 75 מ מ פוליסטירן שפופרת, חרוזים CST ונוזלים נדן (ראה טבלה של חומרים).
      1. תווית צינור פוליסטירן של2 מ מ 12 x 75 'CST'. מערבבים את המבחנה חרוז שסופק על-ידי היפוך עדין או vortexing עדין מאוד. להוסיף הצינור שכותרתו: 0.35 מ של נוזל הנרתיק וטיפה 1 של חרוזים CST. מערבולת הצינור בעדינות והמשך רכישה. אחסן את הצינור עבור עד 8 שעות ב 2-25 ° C בחושך אם לא רכישת מיד.
      2. לבצע את בדיקת ביצועים: שורת התפריט, בחר ' Cytometer | CST'.
      3. בכרטיסיה 'הגדרות' של המודול CST: לאשר את Canto II כמו תצורת ברירת המחדל של 4-2 H-2V, גם לאשר כי תוכנית בסיסית שנוצרו באמצעות המגרש הנוכחי של חרוזים CST קיים עבור תצורה זו. אם לא קיימת תוכנית בסיסית, להפנות IFU חרוזים CST. לאשר כי בסיסית זו לא פג: תחת ' הגדרת בקרה ', בחר ' לבדוק את הביצועים מתוך התפריט הנפתח.
      4. בדוק 'לטעון את הרכבת התחתית באופן ידני' ולחץ על 'הפעל'. אשר מוצג המספר רבים. מערבולת החרוזים מדולל המוכן מעל ובעדינות כשתתבקש, לטעון את החרוזים מדולל ולחץ על 'אישור'.
      5. בסיום בדיקת ביצועים, ודא כי עברה Cytometer ביצועים. לחץ על 'הצג דוח'. הפעל מחדש את הבדיקה ביצועים אם התוצאות לא עבר. לשמור את הדוח בפורמט PDF עם תאריך דוח מעקב אחר ביצועים.
    3. התאם 'PMT פלורסנט המתחים' עם קשת חרוזים (טבלה של חומרים).
      הערה: ערכי היעד הם התנה ב Euroflow סטנדרטי (SOP) שכותרתו "20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads". נוהל זה זמינה באתר Euroflow (www.euroflow.org; באזור הציבורי; הכרטיסיה פרוטוקולים).
      1. ליצור התנסות חדשה באמצעות ' חודשי תאריך ההתקנה מכשיר | הדגימה '.
      2. ', לבחור את הפרמטרים אופטי fluorochromes המקביל מודאג הצינורות (FITC, PE, PerCPCy5.5, PE-Cy7, APC, APC-H7, V450, V500), ולבדוק את הפרמטרים הרצויים רכישה (היומן, א, ח ו / או W). החלת הגדרות CST הנוכחי (הימני, לחץ על ' הגדרות Cytometer' של הניסוי). להגדיר את הסף עבור פרמטר FSC 10,000.
      3. -Cytometer, לבטל את הפיצוי בעת הגדרת פלורסצנטיות PMT מתחים עבור הגדרת היעד MFI; לענין זה, נכנסים 'מפקח', נווט אל הכרטיסיה 'פיצויים' בטל פיצוי על-ידי האפשרות ' לאפשר פיצוי ' unchecking.
      4. ליצור גליון עבודה ' היעד MFI' עם כל נקודה הכרחי חלקות (n = 2; FSC נגד האס, FITC לעומת PE), היסטוגרמות (n = היסטוגרמה 8; אחד עבור כל גלאי קרינה פלואורסצנטית) ונתונים סטטיסטיים מציג ההפניה השיא לערכים (MFI, CV) לכל ערוץ זריחה.
      5. לדלל טיפה 1 של 8-לשיא הקשת חרוזים כיול חלקיקים ב 1 מ"ל של מים מזוקקים, מערבולת לפני השימוש. רוכשים ללא הקלטה הפתרון חרוזים 8-לשיא הקשת בקצב זרימה 'נמוך' . אחסן את הצינור עבור עד 8 שעות ב- 2-25 הלעפה תרוטרפמט בחושך אם לא רכישת מיד.
      6. שער גופיה חרוזים ' האוכלוסייה P1' ב FSC מול מגרש נקודה bivariate האס, הפסגה ח' או ז' ב FITC לעומת PE נקודה bivariate עלילה (הפסגה המבריקים או שאחריו כלפי מטה, כמו זה כאמור במסמך Euroflow שכותרתו "20180302_7th_ Peak_Target_Values_Rainbow_Beads") בשם שער זה אוכלוסייה P2.
      7. המשך הרכישה של המתלה חרוז הקשת 8-פסגות ולהתאים PMT המתחים בתוך כל הערוצים פלורסצנטיות להגיע ערכי MFI יעד לפי המסמך Euroflow "20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads".
      8. ברגע ערכי היעד MFI הפסגה ח' או ז' נגישים, להקליט את MFI המטרה מושגת והערכים PMT הסופית המתאימה. לרכוש אירועים 5,000 ולהקליט את הנתונים.
        הערה: PMT ערכי חייב לשמש מתחת בשלב 1.2.3 (ביצועים בדוק - אישור של PMT ערכים עם קשת חרוזים).
      9. שיא ערכים אלה להכין הדפסה מסך ' היעד MFI' גליון העבודה והגדרות כלי ולשמור כתמונה. jpg.
        הערה: כאשר נוצר צינור "חדש", לפעמים PMT הערכים משתנים באופן בלתי צפוי. בשביל זה, בדיקת זוגי PMT הוא חיוני. השווה בכל פעם את הערכים PMT להערות שלך, שח כפול כי ' היעד MFI' וערכי PMT נכונים!
      10. לשמור את 'הגדרות יישום'. בדפדפן, לחץ לחיצה ימנית על ' הגדרות Cytometer''. בתפריט הנפתח, בחר ' הגדרות יישום 'ושמור. לחץ על 'אישור'. אם תתבקש, לחץ על כן כדי לשמור את ערכי סף.
        הערה: לשמור את הגדרות היישום באמצעות שם ברירת המחדל. לא תשנה את ההגדרות.
    4. להתאים את 'FCS' ואת 'האס המתחים' עם lysed שטף דם (LWB).
      הערה: בשלב זה, µL 50 של דגימת דם היקפיים (PB) בריאים המתנדבים, lysing פתרון (טבלה של חומרים), כביסה מאגר הדרושים.
      1. Pipets 50 µL של PB לתוך צינור. להוסיף 2 מ"ל של פתרון lysing טרי מדולל. לערבב בעדינות, תקופת דגירה של 10 דקות ב- RT.
      2. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב x 540 גרם.
      3. וארוקן את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר תא, עוזב כ 50 µL נפח שיורית בצינור. מערבבים בעדינות ומוסיפים 2 מ"ל של פתרון מסונן לשטוף.
      4. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב x 540 גרם.
      5. חוזר עוד פעם אחת את 1.1.4.3–1.1.4.4 צעדים.
      6. מוסיפים 250 µL מאגר מסונן כביסה ומערבבים בעדינות.
      7. הניסוי יצר עבור רכישת חרוזים הקשת, ליצור החדש ' הדגימה | גליון חדש ': לצייר גרף האס-A / FSC-A bi-פרמטרית.
      8. לרכוש את התאים, שער של לימפוציטים FSC נגד האס נקודה bivariate עלילה ולהתאים FSC ואת האס המתחים להגיע ערכי היעד הממוצע עבור האוכלוסייה לימפוציט מגודרת: FSC: 55,000 (טווח 50,000 – 60,000) ואת האס: 13,000 (טווח 11,000 –15,000).
      9. לרכוש ולתעד את הנתונים עם-10,000 אירועים. ודא רשע FSC ואת האס ערכי היעד עבור לימפוציטים מגודרת. להסתגל מתח FSC ואת האס במידת הצורך.
      10. הדפסה המסך ולאחסן עותק של ערכי היעד של הערוץ שמושגות.
    5. קרינה פלואורסצנטית פיצוי הגדרות.
      הערה: הפקדים פיצוי שהוכתמו יחיד חייב להיות מוגדר לאחר ההגדרות MFI היעד ואת הגדרות FSC/האס הוקמו. בשלב זה, PB של מתנדבים בריאים, פיצוי חלקיקים (טבלה של חומרים), יש צורך lysing פתרון ושטיפת מאגר. הרשימה של נוגדן fluorochrome מצומדת ריאגנטים המשמש להגדרת מטריצות פיצוי פלורסצנטיות ואוכלוסיות ההתייחסות שלהם מפורטים בטבלה 1.
      1. תווית שפופרת אחת לכל מגיב כדי לשמש להגדרת פיצוי קרינה פלואורסצנטית (FITC, PE, PerCPCy5.5, APC, V450, V500, PECy7 - CD117, APC-H7 - CD10, APC-H7 - CD14 וגם APC-H7 - CD71), צינור "ריק/מוכתם".
      2. Pipet 50 µL של PB לתוך כל שפופרת או טיפה 1 של חלקיקים פיצוי "שלילית" + טיפה 1 של חלקיקים פיצוי "חיובית" את החצוצרות שלה שליטה פיצוי המצוין לעיל טבלה 1.
      3. להוסיף הכמות המתאימה של נוגדן הכימית ברכבת התחתית. להוסיף מאגר כביסה מסוננים כדי להגיע נפח סופי של µL 100 למחזור ומערבבים בעדינות. תקופת דגירה של 15 דקות ב- RT, מוגן מפני אור.
      4. מוסיפים 2 מ"ל של טרי מדולל פתרון lysing רק ב הצינורות עם תאי ומערבבים בעדינות. תקופת דגירה של 10 דקות-RT, מוגן מפני אור.
      5. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב x 540 גרם.
      6. וארוקן את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר תא משאיר כ נפח שיורית 50 µL כל שפופרת. מערבבים בעדינות. להוסיף 2 מ של מאגר מסונן כביסה.
      7. צנטריפוגה 5 דקות ב x 540 גרם.
      8. וארוקן את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר תא משאיר כ נפח שיורית 50 µL כל שפופרת. להוסיף מאגר מסונן כביסה כדי להגיע נפח סופי של µL 250 למחזור ומערבבים בעדינות.
      9. ליצור פקדים פיצוי.
        1. שורת התפריטים, בחר הניסוי יצר עבור רכישת חרוזים הקשת. ליצור החדש ' הדגימה | פיצוי ההתקנה | ליצור פיצוי פקדים.
        2. בתיבת הדו-שיח שתופיע, בחר בתיבת הסימון ' בקרה וללא רבב נפרדת כלול צינור/נו ' . ליצור פקדים (לא תווית ספציפי) פיצוי כללי עבור FITC, PE, PerCPCy5.5, APC, HV450, HV500. ליצור פקדים ספציפיים תווית פיצוי עבור PE-Cy7-CD117, APC-H7 - CD10, APC-H7 - CD14 וגם APC-H7 - CD71. לחץ על 'אישור'.
        3. בגליון עבודה חדש, ליצור גרף האס-A / FSC-A bi-פרמטרית וצייר שער על לימפוציטים (P1), ההיסטוגרמה התואם fluorochrome כי יזוהו בתוך כל שפופרת וצייר שער P2 הפסגה חיובי. הצגת ההירארכיה (קליק ימני גרף, בחר ' הצג האוכלוסייה הירארכיה ') כדי להמחיש את מספר האירועים ב- P2, מלבד הצינור בקרה וללא רבב.
        4. בדפדפן, הרחב את הדגימה פיצוי פקדים.
        5. מערבולת תאי וללא רבב, מוכן לעיל, להתקנה ס' 3 – 5 התאים מוכתם מוכן על cytometer. להתאים את קצב הזרימה כדי 'בינוני ' ולחץ על ' לרכוש נתונים '. העלילה האס-A נקודה vs FSC-A, להתאים את השער P1 ולחלוש באופן מלא את אוכלוסיית לימפוציטים. לחץ לחיצה ימנית על השער P1. בחר "החל על כל פיצוי השליטה".
        6. מלוח המחוונים 'רכישה' , לחץ על 'נתונים רשומה ' לרכוש אירועים 5,000. עבור כל התאים שליטה מוכתם צבע יחיד, ודא כי השער מרווח P2 מקיף את האוכלוסייה חיובי.
        7. עבור PE-Cy7 ו APCH7 צינורות, להוסיף שער מרווח P3 ההיסטוגרמה ולהבטיח כי הוא מקיף את האוכלוסייה שלילי, כי P2 משתרע על האוכלוסייה חיובי.
        8. חישוב פיצויים. שורת התפריטים, בחר ' ניסוי | פיצוי ההתקנה | חישוב פיצוי '. שם המטריקס פיצוי: 'פיצוי על תאריך'. בחרו 'קישור ולשמור'.
        9. להציל את המטריצה פיצוי בהגדרות יישום קטלוג: לחץ על ' הגדרות Cytometer| הגדרות יישום | שמירת ', שם במטריצת פיצוי 'פיצוי תאריך' ולחץ על 'אישור'.
        10. בדפדפן, לחץ על ' הגדרות Cytometer'. במפקח, נווט אל הכרטיסיה 'פיצויים' הדפסה לחץ על פינה הימנית התחתונה.
          הערה: המידע הזה ניתן גם יהיה לאחזר מקטלוג.
        11. שליטה של המטריקס פיצוי.
          1. מערבבים את שפופרת אחת כל הצינור מוכתם יחיד (APCH7 של הבחירה).
          2. ליצור התנסות חדשה בשם 'תאריך אימות פיצוי', להוסיף הדגימה חדש, לחץ על מימין ' הגדרות Cytometer' של הניסוי הזה ולבחור ' קישור | בטל קישור | הגדרת יישום ' הציל את שלב 1.1.3.10. רוכשים אירועים 50,000 מהצינור הזה עם ההגדרות החדשות.
          3. להחיל גליון עבודה גלובלי חדש. ליצור נקודה 1 מגרש FSC-A/האס-A וצייר שער להמחיש לימפוציטים ו n x (n-1) / 2 מגרשים אחרים התמקדו השער לימפוציטים להמחיש פרמטרים-שתיים.
  2. התקנת מכשיר יומי
    1. הפעל את cytometer. להבטיח כי כל רמות הנוזלים הדיווה המתאים ופתוח 6.1.3. לבצע אתחול פלואידיקה: שורת התפריט, בחר ' Cytometer | פלואידיקה אתחול '. לחץ על 'אישור' כאשר תתבקש לעשות זאת. אפשר cytometer את לחמם במשך לפחות 30 דקות.
    2. בדיקת הביצועים - החרוזים CST: לחזור 1.1.2.1–1.1.2.5 השלבים.
    3. בדיקת ביצועים - אישור של PMT ערכים עם חרוזים הקשת.
      1. תווית צינור פוליסטירן כמו ' הקשת חרוזים ' וסמנו שהמספר רבים הוא זה שנמצא בשימוש. מערבבים ביסודיות את המבחנה הקשת חרוז. הכנת חרוזים הקשת, להוסיף טיפה 1 של הקשת חרוזים 1 מ"ל מים מזוקקים או יונים. להגן מפני אור.
        הערה: המשך רכישה או לאחסן את הצינור ב- 2-8 הלעפה תרוטרפמט עד הרכישה.
      2. ליצור התנסות חדשה: ' קשת חרוזים תאריך '.
      3. לקשר את הפיצויים: קליק ימני על ' הגדרות Cytometer', בחרו ' קישור התקנה ', בחר המטריקס שכר הולם שנוצר בשלב 1.1.5.9.9 ובחר 'החלף'.
      4. בטל קישור פיצוי: קליק ימני על ' Cytometer הגדרות ', בחר 'נתק קישור מן ההגדרה שכבר קושרו' ולחץ על 'אישור'.
      5. החלת ' הגדרות יישום ': קליק ימני על ' Cytometer הגדרות ', בחר ' הגדרות יישום ', החלת ההגדרה שנוצר בשלב 1.1.3.10 במהלך הגדרת חודשי ובחר 'לשמור את הערך פיצוי '.
      6. בטלו את הבחירה באפשרות "אפשר פיצוי".
      7. ליצור טיפוס חדש הניסוי עם תבנית גליון העבודה עבור קשת חרוזים. רוכשים את הצינור ברכישת 'נמוך' .
      8. במהלך רכישת חרוזים, להתאים את השער P1 כדי לכלול רק את האוכלוסייה חרוז גופיה. התאם את השער P2 על המגרש נקודה FITC-A / PE-A כדי לכלול רק את האוכלוסייה חרוז גופיה. שיא אירועים 10,000.
      9. בדוק כי MFI את הערכים CV שהתקבלו לאוכלוסיה P2 הם המטרות שהוגדרו מראש של הפרוטוקול. אחרת, לשטוף את cytometer ולהתחיל את הפעולה שוב. לשמור את הדוח בפורמט PDF.

2. הכנת הדוגמא מוניטור

הערה: בצע את התא שטיפה פרוטוקול פשוט לפני ההליך מכתימים.

  1. פיפטה µL 600 מדגם ראשוני לתוך שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל.
  2. להוסיף 10 מ ל לרחוץ את מאגר (PBS + 0.5% BSA [> BSA טהור 98%] + 0.09% נאן3 מסונן פתרון, pH 7.4). מערבבים התליה תא היטב באמצעות פיפטה.
  3. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 540 x g (שטיפת 1). למחוק את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר התא.
  4. חזור על שלבים 2.2 – 2.3 (לשטוף 2).
  5. להשעות בגדר תא ב- 400 µL לרחוץ את המאגר.
  6. צביעת סמני את עמוד השדרה. להעביר את כל נפח הנוגדנים עמוד השדרה צינור פוליפרופילן לניתוח FACS, המזוהה עם הנתונים החולה, את "עמוד השדרה". להוסיף 350 µL מדגם שטף (היקף המדגם שטף נדרש למלא כל הקברים על הלוח). מערבבים היטב בעזרת פיפטה.
    הערה: לחשב את הנפח הכולל של עמוד השדרה נוגדנים על פני הממברנה מכתים (כפי שמוצג בטבלה מס ' 2).
  7. פיפטה כמויות שוות של המיקס מדגם-השדרה לתוך צינורות פוליפרופילן 3 עבור ניתוח FACS, המזוהה עם נתוני המטופל ואת "טורפדו מס ' 1" כדי "צינור מספר 3". אם יש צורך, להשתמש מאגר כביסה כדי להגיע נפח סופי של µL 200 למחזור.
    זהירות: היזהרו לא משאיר עקבות של המדגם על דפנות הצינורות; אחרת, התאים האלה לא להיות מוכתם. במידת הצורך, מערבולת התאים ואת צנטריפוגה הצינור.
  8. כל שפופרת, להוסיף נפח מתאים של נוגדנים בכתבות סמני פני שטח התא (למעט הסימנים עמוד השדרה), כמפורט בטבלה 2. מערבבים היטב בעזרת פיפטה. תקופת דגירה של 30 דקות ב- RT מוגן מפני אור.
  9. להוסיף 2 מ של lysing פתרון. מערבבים היטב בעזרת פיפטה. תקופת דגירה של 10 דקות ב RT מוגן מפני אור.
  10. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב x 540 גרם. למחוק את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר תא, משאיר כ נפח שיורית 50 µL כל שפופרת. מערבבים היטב בעזרת פיפטה.
  11. להוסיף 2 מ"ל לרחוץ את המאגר כדי בגדר התא. מערבבים היטב בעזרת פיפטה.
  12. חזור על שלבים 2.10 – 2.11 (לשטוף 2).
  13. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב x 540 גרם. למחוק את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר תא, מחדש להשעות בגדר תא ב- µL 200 ל- PBS. מערבבים היטב בעזרת פיפטה.
  14. לרכוש את התאים, רצוי, מיד לאחר צביעת או לאחסן ב 4 ° C, מוגן מפני אור, עבור לא יותר מ 1 h עד נמדד cytometer הזרימה.

3. חדרי קירור והקפאה

  1. לפתוח התנסות חדשה ב- Diva תוכנה ולשנות לפי שם, סוג הדגימה ותאריך.
  2. ליצור טיפוס חדש המכיל 3 צינורות. לציין הפריסה ניסוי הנוגדנים בשימוש כל שפופרת.
  3. לחץ על מימין ' Cytometer הגדרות ', בחר ' הגדרות יישום ' ולהחיל הערכים שהתקבלו בהגדרת חודשי (שלב 1.1.3.10).
  4. פתח גליון עבודה גלובלי חדש וליצור החלקות נקודה: האס-A / FSC-A, האס-A / CD45-HV500-A, האס-A / FITC-A, האס-A / PE-A, האס-A / CD34-PerCP-Cy5.5, האס-A / CD117-PECy7-A, האס-A / APC-A, האס-A / APCH7-A, האס-A / הלע-ד ר-HV450-א העלילה נקודה האס-FSC-הנ"מ, ליצור שער כדי לבחור את התאים גופיה. העלילה נקודה האס-A/CD45-BV500-A, ליצור שערים כדי לבחור אוכלוסיות 4: גרנולוציטים ומונוציטים, תקיעות, לימפוציטים. פרוייקט אוכלוסיות אלה בהחלקות נקודה שיצרת קודם לכן.
  5. ליצור גליון עבודה גלובלי חדש לבקרת פיצויים כפי שמתואר בשלב 1.1.5.9.11.3.
  6. רוכשים את הצינור רכישה 'בינוני' , שיא 500,000 אירועים/צינור. לאחר אימות טכני (הערכה של פיצוי, ההכתמה נכונה), לייצא את הנתונים כקבצים FCS3.0.

4. ניתוח נתונים

הערה: כדי לבנות את מסדי הנתונים הרגיל של מוניטור היו קבצים בהם נעשה שימוש מתורמים מאוד בריאים, מאנשים ללא ראיות למחלת hematopoietic כדלקמן 11 מ 18 קבצים עבור Neutrophils_NM מסד נתונים, 10 מ 18 קבצים עבור מסד Monocytes_NM ו 14 מ-18 קבצים עבור מסד הנתונים NRC_NM. הקבצים שנמחקו הראתה בעיות טכניות שונות, כפי שהוצג בסעיף נציג תוצאות. הקבצים באופן אינדיבידואלי נותחו באמצעות התוכנה Infinicyt (טבלה של חומרים), העומדות אסטרטגיות שונות מצטיירת דמות 1A(1-3) על שושלת היוחסין נויטרופילים (פרופיל Neutrophils_Maturation.inp), איור 2 A מונוציט השושלת (פרופיל Monocytes_Maturation.inp), איור 3A(1-2) על שושלת היוחסין של תאי erythroid (פרופיל NRC_Maturation.inp).

  1. האסטרטגיה של ניתוח של נויטרופילים -בניית מסד נתונים Neutrophils_NM 
    1. לזהות CD34 + ביצע נויטרופילים תקיעות באמצעות חיתוך של שבעה שערים, המאפשר בחירת CD34 + CD117 + HLADR + נמוך CD10 - CD13 + CD11b-אירועים (איור 1A.1). להקצות אירועים אלה אל הכרטיסיה 'נויטרופילים' בעץ ההירארכיה האוכלוסייה ובטל לאחר מכן בכרטיסיה זו כדי להסיר תאים אלה (מתואר בכחול) מתוך התצוגה של האירועים הנותרים (אפור).
    2. לבודד את CD117 + CD34 - CD13 + CD11b-HLADR + מבשרי נויטרופילים נמוכה באמצעות חיתוך של שישה שערים, כפי שהיא מתוארת באיור 1A(2) ולהקצות אותם אל הכרטיסיה 'נויטרופילים' .
    3. לזהות נויטרופילים בוגרים יותר באמצעות חיתוך של ארבעה שערים, המאפשר את האפליה של CD45dim SSCint היי CD117-HLADR-תאים וההקצאות שלהם אל הכרטיסיה 'נויטרופילים' .
    4. בטל את הסימון של האירועים הנותרים, שומר רק נויטרופילים גלויים, ואז לייצא אוכלוסייה זו על ידי לחיצה על ' קובץ | ייצוא ' ווידוא כי כל הפרמטרים הדרושים נבדקים ולשמור את הנתונים כקבצים FCS.
    5. בקובץ הממוזג בהיקף של כל הקבצים מיוצא FCS, לבצע בדיקת איכות על ידי הערכת עוצמת הביטוי של סמנים עבור כל subpopulation. באמצעות APS חלקות עם medians עבור כל קובץ ועיקולים SD עבור כל subpopulation שמוצג, להסיר את המקרים מחוץ העקומות 2SD (ראה פירוט בסעיף התוצאות נציג) (איור 1B).
    6. בקובץ מורכב שנוצר עם "נויטרופילים" גלוי, לצייר מסלול התבגרות על דיאגרמה APS (איור 1C משמאל) ולשמור כקובץ .cyt.
      הערה: השוואה ההבשלה תרשים מאפשר את החזיית כל הפרמטרים מכל הקבצים הנכללים במסד הנתונים Neutrophils_NM ייצג מול מסד הנתונים מנורמל. התרשים המוצג באיור 2C, בצד ימין, מציג את כל הקבצים הנכללים במסד הנתונים Neutrophils_NM (n = 11) משתלב 2 SD לעומת החציון של הקבוצה.
  2. מהאסטרטגיה ןועברל monocytes - הבניה מסד Monocytes_NM
    1. לזהות את התאים השושלת monocytic (CD117 + /-CD64 + שלום HLADR + שלום) באמצעות חיתוך של ארבעה שערים (איור 2א). להקצות אירועים אלה אל הכרטיסיה 'Monocytic' בעץ ההירארכיה האוכלוסייה.
    2. בטל את הסימון של האירועים הנותרים, להשאיר רק את התאים monocytic גלויים, ואז לייצא אוכלוסייה זו על ידי לחיצה על ' קובץ | ייצוא ' ווידוא כי כל הפרמטרים הדרושים נבדקים ולשמור את הנתונים כקבצים FCS.
    3. בקובץ הממוזג בהיקף של כל הקבצים מיוצא FCS, לבצע בדיקת איכות על-ידי הערכת עוצמת הביטוי של סמנים עבור כל subpopulation ולאחר מכן תסיר את המקרים מחוץ העקומות 2SD (פירוט בפרק התוצאות נציג) (איור 2 B).
    4. בקובץ שנוצר עם "Monocytic" תאים גלויים, לצייר מסלול התבגרות על הדיאגרמה APS (איור 2C משמאל) ושמור זה כקובץ .cyt.
      הערה: השוואה ההבשלה תרשים מאפשר את החזיית כל הפרמטרים מכל הקבצים הנכללים במסד הנתונים Monocytes_NM ייצג מול מסד הנתונים מנורמל. התרשים המוצג באיור 2C, בצד ימין, מציג את כל הקבצים הנכללים במסד הנתונים Monocytes_NM (n = 10) משתלב 2 SD לעומת החציון של הקבוצה.
  3. האסטרטגיה של ניתוח של כדוריות אדומות nucleated (NRCs) - בניית מסד נתונים NRC_NM
    1. לזהות CD34 + תקיעות erythroid שבוצעו באמצעות חיתוך של שבעה שערים לאפשר את מבחר CD34 + CD117 + HLADR + נמוך CD105 + CD33 - CD36 + CD71 + אירועים (איור 3A(1)). להקצות אירועים אלה ללשונית "NRC" בעץ ההירארכיה האוכלוסייה ובטל ואז בכרטיסיה זו כדי להסיר תאים אלה (מתואר באדום) מתוך התצוגה של האירועים הנותרים (אפור).
    2. לזהות NRCs בוגרים יותר באמצעות חיתוך של ארבעה שערים לאפשר את האפליה של CD45-/ + עמום SSClow CD36 + שלום CD71 + שלום CD105 + /-תאים. להקצות אירועים אלה ללשונית "NRC" (איור 3A(2)). טסיות הדם (CD36 + שלום תאים SSClow) יש להסיר מן האוכלוסייה NRC (איור 3A(2)).
    3. בטל את הסימון של האירועים הנותרים, להשאיר רק את התאים NRC גלויים, ואז לייצא אוכלוסייה זו על ידי לחיצה על ' קובץ | ייצוא ' ווידוא כי כל הפרמטרים הדרושים נבדקים ולשמור את הנתונים כקבצים FCS.
    4. בקובץ הממוזג בהיקף של כל הקבצים מיוצא FCS, מבצעת בדיקת איכות על-ידי הערכת עוצמת הביטוי של סמנים עבור כל subpopulation, ואחריו הסרת של המקרים בחוץ 2SD עקומות (ראה פירוט בסעיף התוצאות נציג) ( איור 3 B).
    5. בקובץ שנוצר עם "NRC" תאים גלויים, לצייר מסלול התבגרות על הדיאגרמה APS (איור 3C, משמאל) ושמור זה כקובץ .cyt.
      הערה: השוואה ההבשלה תרשים מאפשר את החזיית כל הפרמטרים מכל הקבצים הנכללים במסד הנתונים NRC_NM ייצג מול מסד הנתונים מנורמל. התרשים המוצג באיור 3C, בצד ימין, מציג את כל הקבצים הנכללים במסד הנתונים NRC_NM (n = 14) משתלב 2 SD לעומת החציון של הקבוצה.
  4. הערכה של התבגרות בתאים מיאלואידית מוניטור בשימוש במאגרי המידע ההבשלה
    1. פתח את הקובץ .cyt המייצגים שושלת היוחסין של עניין (כלומר., Neutrophils_NM_GMFF.cyt על שושלת היוחסין נויטרופילים, Monocytes_NM_GMFF.cyt של השושלת monocytic, ו NRCs_NM_GMFF.cyt עבור erythroid היוחסין).
    2. לחץ לחיצה ימנית על לשונית "התבגרות" מתחת לכרטיסיה התואם שושלת היוחסין של הריבית (' נויטרופילים | Monocytic | NRC') ולשמור את מסד הנתונים של התבגרות כדי התבגרות.
    3. לפתוח קובץ חדש FCS ולבצע ניתוח כפי שהוסבר קודם לכן (שלב 4.1.1–4.1.3 עבור נויטרופילים, שלב 4.2.1 עבור תאים Monocytic, וצעד 4.3.1–4.3.2 עבור NRC).
    4. לצייר מסלול התבגרות עבור האוכלוסייה עניין.
    5. פתח את מסד הנתונים המתאימים בכרטיסיה 'כלים' (ניתוח מסד נתונים) והשווה האוכלוסייה כדי להיות מנותח עם מסד הנתונים המתאימים של התבגרות. בדוק את הנתונים עבור תאימות עם מסד הנתונים הזמינים: להשלים את תאימות (משולש ירוק); תאימות חלקית, בברוב המקרים אי-התאמות בשם הפרמטרים (משולש צהוב); של אי-תאימות (משולש אדום).
    6. אם הנתונים הם compatibles או compatibles חלקית, התוכנה יוצר דיאגרמה ' מנורמל ההבדלים ההבשלה ' . כדי להמחיש ' פרמטר הלהקה ההבשלה ההבדלים ', פתיחת דיאגרמה חדשה בכרטיסיה 'דיאגרמה' , לחץ על 'ההבשלה' ולבחור כמה פרמטרים כדי להיות מוצגים, לחץ על 'אישור' , הדיאגרמה מופיעים. עם לחץ לחיצה ימנית בדיאגרמה; ניתן לבצע שינויים ויזואליזציה של נתונים, ויזואליזציה של מסד נתונים, ויזואליזציה דיאגרמה ההבשלה.
    7. כדי להמחיש את משמעות ההבדלים בין הקובץ החדש ואת הנתונים הנכללים במסד הנתונים, הגדר זום (לחץ לחיצה ימנית על ' מנורמל ההבדלים ההבשלה ' ולהחיל 'זום').

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הדגימות מוניטור 54 האיסוף-K-EDTA קרישה נכללו במחקר. MFC הנתונים נותחו, בהעדר כל מידע על המטופלים. מחקר רטרוספקטיבי הראה כי הדגימות מוניטור היו מתורמים בריאים 7 (5 זכרים ו 2 נקבות עם עידן החציוני של 47.4 [35-48], 11 אנשים עם הוכחות של מחלה hematopoietic (8 זכרים ונקבות 3 עם עידן החציוני של 57.9 [35-72]) ובמקרים 36 עם שונים מצבים פתולוגיים: מקרה 1 עם אנמיה ורמת קריאטינין נמוך, 3 מקרים עם אנמיה ורמת קריאטינין גבוה, 8 מקרים עם אנמיה של דלקת, במקרה 1 עם אנמיה הנגרמת על ידי ויטמין B12 deficiency, 4 במקרים עם אנמיה ± cytopenias אחרים שנגרמו על ידי נזק לכבד, 3 מקרים עם אנמיה המוליטית אוטואימונית, 5 מקרים עם אידיופטית היווצרות קרישי דם, במקרה 1 עם תסמונת הפעלה macrophage, 3 מקרים עם הפוגה מלאה לאחר טיפול לימפומה (מחלה שיורית מינימלית < 0.01%) ו 7 מקרים . נושא הפרעות hematological (MDS 4, 1 לוקמיה מיאלואידית חריפה, לוקמיה myelomonocytic כרונית 1 ותסמונת myeloproliferative 1 JAK2 חיוביים)... זו הקטגוריה האחרונה כללה 18 זכרים ונקבות 18 עם ממוצע של גיל 60.3 [17-100]. כל הדגימות היו מאנשים יוצאי קווקז. בניית מאגרי המידע מותר זיהוי ותיקון מספר נושאים הקשורים הכנת הדוגמא ורכישה. במקרה שלנו, מסדי הנתונים הסופי של כלל 11/18 קבצים עבור ההבשלה נויטרופילים, 10/18 קבצים עבור מונוציט ההבשלה של 14/18 קבצים עבור NRC ההבשלה. הקבצים שלא נכללו במסדי נתונים היוותה בבעיות טכניות שונות. צביעת הנושאים הנפוצים ביותר נצפתה עבור CD11b ו- CD13 נויטרופילים, CD300e ו HLADR ב ומונוציטים, ו CD71 ו- HLADR NRCs. ייצוא נתונים יכולים להיות מקור של שגיאות; השכיח ביותר ב- dataset שלנו היה היעדר FSC-H בקבצים שיוצאו, היפוכים של FSC-W עם FSC-H שלפעמים מתרחשים בייצוא קבצים הדיווה8. האבחון של מקרים חדשים של cytopenias החשודות MDS כנגד התבגרות רגיל מיאלואידית מסדי הנתונים מאפשרים זיהוי ביטוי לא תקין של התבגרות אנטיגנים של השושלת נויטרופילים (איור 4), ומונוציטים (איור 5 ), ו- NRC (איור 6) גם במקרים ללא חריגות cytological או cytogenetic (איור 7). אחרת, באמצעות תוכנה רכישה שגרתית, כמו דיווה, אלה יהיה קשה או בלתי אפשרי לממש.

Figure 4
איור 4 : ניתוח cytometry זרימה נציג של נויטרופילים במקרה MDS del(7). (א) ב ה מנורמל ההבשלה ההבדלים דיאגרמה, האזור האפור מתייחס הביטוי הרגיל של אנטיגנים המתבררת מניתוח של הקבצים נורמלי 11 הנכללים במסד הנתונים נויטרופילים (median± 2SD). הביטוי חריגה של מספר אנטיגנים נצפתה בהשוואה del(7) MDS בנרתיק Neutrophils_NM מסד נתונים (n = 1 לעומת n = 11 דגימות פקדים רגילים). (B) פרמטר הלהקה ההבשלה דיאגרמות לאפשר ההשוואות בין עוצמת ביטוי של כל סמן בשלבים שונים של התבגרות (קווים מלאים רציפה) החציוני ועיקולים 2SD מחושב עבור המקרים מוניטור 11 נורמלי הנכללים במסד הנתונים (קווים מקווקווים רציפה). ליקויים פנוטיפי של נויטרופילים שנצפתה תיק MDS del(7) לעומת הנתונים נויטרופילים של התבגרות רגיל הם כדלקמן: הכולל ביטוי מוגבר של CD34, עלייה קלה של ביטוי CD11b על ילדותי נויטרופילים (שלבים 2), פחתה הביטוי של CD13 על ילדותי נויטרופילים (שלבים 1-3), עלייה קלה של ביטוי CD16 על שני השלבים הראשונים של נויטרופילים ההבשלה ואחריו עליות מתונות CD16 הביטוי על נויטרופילים בוגרת (שלבים 4-5). (ג) מציג את שהנקודה התואמת חלקות כמו מטמיעים בתוכנה דיווה. הערכה תמונה באמצעות תוכנה הדיווה מאפשר זיהוי של מספר קטן של ליקויים פנוטיפי במקרה זה MDS: אחוז מוגברת CD34 + CD13 + סימנים מקדימים, את downregulation CD13 הביטוי. הביטוי לא נורמלי של CD16 קשה להתבונן בסוג זה של ייצוג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 : ניתוח cytometry זרימה נציג של monocytes במקרה MDS del(7). () ההבדלים Normalized ההבשלה דיאגרמה הצעות הכוללת הצגת אנטיגן הביטוי בשלבים שונים של התבגרות שושלת monocytic התא. האזור האפור מקביל הביטוי הרגיל של אנטיגנים המתבררת מניתוח של 10 קבצים רגילה הנכללים במסד הנתונים monocytic (± החציוני 2SD). הביטוי חריגה של מספר אנטיגנים חורג 2SD, אבל עבור כמה סמנים, כגון CD35 ו- HLADR, שהוא חורג 4SD. (B) ב- פרמטר הלהקה ההבשלה דיאגרמות, העיוותים פנוטיפי של תאים monocytic הנהוגות של del(7) SMD במקרה מתי לעומת מונוציט רגיל ההבשלה מסד נתונים (n = 1 לעומת n = 10 דוגמאות פקדים רגילים) הם כדלקמן: פחתה הביטוי של CD45 בשלבים 1-4 של תאים monocytic, של CD117 בשלבים 1-2 של סימנים מקדימים monocytic ושל ד ר הלע בסך הכל. ביטוי מוגבר של CD35 בשלבים הראשונים של ההבשלה של תאי monocytic היה חריגות המשמעותי ביותר עבור השושלת הזאת. (C) הדיווה נקודה חלקות לאפשר הערכה של monocytic תאים נקודה הדיווה BM. (D) נורמלי יחיד חלקות לאפשר הערכה של תאים monocytic במקרה MDS del(7). הערכה תמונה באמצעות תוכנה הדיווה מאפשרת זיהוי ליקויים פנוטיפי שני במקרה זה MDS: הביטוי מופחתת של ד ר הלע, ביטוי מוגבר של CD35 בחלק של סימנים מקדימים monocytic (אדום אוכלוסייה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6 : ניתוח cytometry זרימה נציג של כדוריות אדומות nucleated במקרה MDS del(7). () ההבדלים Normalized ההבשלה דיאגרמה הצעות הכוללת הצגת אנטיגן הביטוי בשלבים שונים של התבגרות שושלת היוחסין NRC. האזור האפור מקביל הביטוי הרגיל של אנטיגנים המתבררת מניתוח מהקבצים רגילה 14 הכלולים במסד הנתונים התבגרות רגיל NRC (± החציוני 2SD). הביטוי חריגה של מספר אנטיגנים חורג 2SD, אבל עבור כמה סמנים, כגון CD34, CD117, CD71, CD105, שהוא חורג 4SD. (B) ב- פרמטר הלהקה ההבשלה דיאגרמות, העיוותים פנוטיפי שנצפתה תיק del(7) SMD בהשוואה עם הנתונים של התבגרות רגיל NRC (n = 1 לעומת n = 14 דגימות פקדים רגילים) הם כדלקמן: פחתה ביטוי CD34 בשלבים הראשונים של ההבשלה, CD117, CD105, CD71, ד ר הלע על שלב 1 של סימנים מקדימים של השושלת erythroid. הערכה תמונה באמצעות תוכנה הדיווה מאפשר זיהוי של CD71 ביטוי חריג על תאים erythroid במקרה זה MDS, אך שינויים אחרים אינם לזיהוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7 : ניתוח cytometry זרימה נציג של נויטרופילים ומונוציטים, NRCs בשלב מוקדם MDS התיק ללא דיספלזיה מורפולוגי, ולא cytogenetic aberrancies. (א) חלוקת התאים לא בשלה ובוגרת בתוך שלבי ההבשלה שונים עבור שלוש שושלות תאים מיאלואידים: נויטרופילים ומונוציטים, NRCs. נצפתה עלייה במספר ומונוציטים בוגרת (שלב 5) ו מעט הצטמצמות של תאים לא בשלה monocytic (שלב 2 של ההבשלה). (B) ה ההבדלים ההבשלה מנורמל דיאגרמה מראה כי העיוותים פנוטיפי לחרוג 2SD, אבל CD34, CD117, CD11b, CD16, HLADR, הם גבוהים יותר ב- 4SD. ליקויים פנוטיפי נצפתה נויטרופילים הם כדלקמן: מעט האס מוגברת ערכים סימנים מקדימים ילדותי נויטרופילים (שלב 1), הצטמצמות הביטוי של CD34 (שלב 1), של CD117 (שלב 1), של CD16 (שלב 1 - 2) ושל HLADR (שלבים 1-3 של ההבשלה). ביטוי מוגבר של CD11b נצפתה על סימנים מקדימים ילדותי נויטרופילים (שלב 1). (ג) ה מנורמל ההבשלה ההבדלים מראה הדיאגרמה שתצפית ליקויים פנוטיפי החשוב ביותר של השושלת monocytic (מעבר 10SD) הם עלה הביטוי של CD35 ורכישה מוקדמת של CD300e על ילדותי monocytic סימנים מקדימים. מומים אחרים פנוטיפי מובחנים השושלת monocytic הן כדלקמן: הצטמצמות FSC ואת האס על ומונוציטים בוגרת יותר (שלבים 3-5) הצטמצמות קלה הביטוי של CD14 על שלבים 2-3 של תאים monocytic. דיאגרמה (D) ההבדלים ההבשלה Normalized ודיאגרמות של פרמטר הלהקה ההבשלה מראה כי העיוותים פנוטיפי החשוב ביותר שנצפו עבור ה-NRC הם: ביטוי מוגבר של CD117 (מעבר 10SD) על שלבים 2-3 של NRC ההבשלה, גדל ביטוי של CD34 (מעבר 5SD) במהלך השלב השני של ההבשלה של NRC, ירד ביטוי CD36 על סימנים מקדימים erythroid מוקדם (שלבים 1-3). בנוסף, האס-NRC ילדותי היא נמוכה יותר מאשר עמיתיהם נורמלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

יתר על כן, הפירוש של משמעות ההבדלים ביטוי אנטיגן על הגדרות פתולוגי לבין עמיתיהם נורמלי מאפשר "כימות" של ליקויים אלה, עם הזיהוי של אלה דיסקרימיננטה עבור קבוצה של מקרים. זה עשוי גם מאפשרים לדרג אותם בהתבסס על חשיבות לצורך מעקב. במחקר זה, כל 7 מקרים של הפרעות hematological עם דיספלסיה מיאלואידית תכונות (4 MDS, AML 1, לוקמיה myelomonocytic כרונית 1 ותסמונת myeloproliferative 1 JAK2 חיובי) סווגו בתור חריג בהשוואה מסדי הנתונים NBM. בנוסף, ההערכה מול מסד הנתונים Neutrophils_NM חיסלה את חשדו של דיספלזיה מיאלואידית 7 ארגזים. עם אנמיה המוליטית רעילים, דלקתיות, מחלה אוטו-אימונית ואנמיה ממחלת כליות כרונית. ההערכה מול מסד הנתונים Monocytes_NM חיסלה את חשדו של דיספלזיה מיאלואידית בארבעה ארגזים. עם אידיופטית היווצרות קרישי דם (ITP), בעת הערכת נגד NRC_NM המותר עבור בידול במקרים 3, 2 של אנמיה דלקתיות ו-1 של ITP. ויטביע aspirates מן המטופלים בהפוגה מלאה לאחר לימפומה או גידולים מוצקים טיפולים היו בתוך 2 SD של החציון של מסדי הנתונים הרגיל עבור כל שלוש שושלות, ובכך דגימות אלה עשויים להיות חלופות בריא התורם מוניטור דגימות.

Figure 1
איור 1 : ניתוח אסטרטגיות של שושלת היוחסין של תאי נויטרופילים. () מבחר CD34 + CD117 + HLADR + אבות CD10 - CD13 + CD11b-נויטרופילים נמוכה התממש על ידי הצטלבות שבעה שערים כפי שהיא מתוארת A1. השלב הבא של התבגרות, CD117 + CD34 - CD13 + CD11b-HLADR + מבשרי נויטרופילים נמוכה נבחר באמצעות חיתוך של שישה שערים, כפי שהיא מתוארת A2. נויטרופילים בוגרים יותר בסופו של דבר ניתן לזהות באמצעות חיתוך של ארבעה שערים לאפשר אפליה של CD45dim SSCint היי CD117-HLADR-תאים (A3). סמני דיסקרימיננטה רוב על שושלת היוחסין נויטרופילים היו CD34, CD117, CD11b ו- CD16. יחד עם CD13, פרמטרים אלה מאפשרים זיהוי של חמישה subpopulations: CD34 + אבות (CD34 + CD117 + CD13 +נמוך CD11b - CD16-) (כחול כהה); CD34 - CD117 + CD13 +שלום CD11b-CD16-נויטרופילים מבשרי (כחול); CD34 - CD117 - CD13 +נמוך CD11b-CD16-נויטרופילים (שלב 3rd של התבגרות; תכלת); CD34 - CD117 - CD13 +נמוך CD11b + CD16 +נמוך נויטרופילים (שלבה 4 של התבגרות; ורוד); נויטרופילים בוגרת (CD34 - CD117 - CD13 +שלום CD11b +שלום CD16 +שלום; סגול). כל עיגול צבעוני מייצגת את החציון של subpopulation עבור דה מרקר עניין דוגמא אחת (B). (ג) מציג את התפלגות הומוגנית של הפרמטרים שנבדקו במהלך ההבשלה תא נויטרופילים בהשוואה 2 SD של מסד הנתונים התבגרות רגילה (n = 11). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : ניתוח אסטרטגיה עבור ומונוציטים. זיהוי של השושלת monocytic תאים (CD117 + /-CD64 + שלום HLADR + שלום) מתבצעת באמצעות חיתוך של ארבעה שערים (A). הכי דיסקרימיננטה סמנים עבור השושלת monocytic היו CD14, CD300e (IREM2), CD35, ולאורך הלע-ד ר עם CD117, פרמטרים אלה מאפשרים זיהוי של subpopulations שלושה: CD34 - CD117 +נמוך/ - HLADR +שלום CD35 - CD14 - CD300e - (אדום); CD34 - CD117 - HLADR +מד CD35 +מד CD14 +מד CD300e - (כתום); בוגר ומונוציטים CD34 - CD117 - HLADR +מד CD35 +שלום CD14 +שלום CD300e + (ירוק) (B). (ג) מציג את התפלגות הומוגנית של הפרמטרים שנבדקו במהלך ההבשלה תא monocytic בהשוואה 2 SD של מסד הנתונים התבגרות רגילה (n = 10). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : ניתוח אסטרטגיות עבור NRCs. (א) זיהוי CD34 + erythroid ביצע תקיעות מומש באמצעות חיתוך של שבעה שערים המאפשרות מבחר CD34 + CD117 + erythroid אבות (A1). יותר בוגרת NRCs מזוהים באמצעות חיתוך של חמישה שערים (A2). אי-הכללה של טסיות הדם (CD36 + שלום תאים SSClow) מ NRC האוכלוסייה נדרש (A2). סמני דיסקרימיננטה רוב שושלת היוחסין של תאי erythroid היו CD34, CD117, CD71 ו- CD105. יחד עם CD33, פרמטרים אלה מאפשרים זיהוי של subpopulations שלושה: CD45 +נמוך CD34 + CD117 + HLADR +מד CD71 +מד CD36 +מד CD105 +שלום (אדום); CD34 - CD117 + HLADR +נמוך CD71 +שלום CD36 +שלום CD105 +שלום NRCs (2nd שלב של התבגרות; ורוד); CD34-CD117-HLADR-/ +נמוך CD71 +שלום CD36 +מד CD105 +נמוך/-NRCs (בוגרת יותר NRCs; ורוד סלמון) (B). (ג) מציג את התפלגות הומוגנית של הפרמטרים שנבדקו במהלך ההבשלה NRC בהשוואה 2 SD של מסד הנתונים התבגרות רגילה (n = 14). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Table 1
טבלה 1: רשימת ריאגנטים נוגדן fluorochrome מצומדת המשמש להגדרת מטריצות פיצוי זריחה עם אוכלוסיות ההתייחסות שלהם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של השולחן הזה.

Table 2
טבלה 2: שילוב עם כמויות של נוגדנים המשמש להערכה של ההבשלה של תאי נויטרופילים ומונוציטים, erythroid BM.   אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של השולחן הזה.

קובץ משלים 1: Monocytes_Maturation.inp אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

קובץ משלים 2: Monocytes_NM_GMFF.cyt   אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

קובץ משלים 3: Neutrophils_Maturation.inp   אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

הקבצים המשלימים 4: Neutrophils_NM_GMFF.cyt   אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

הקבצים המשלימים 5: NRC_Maturation.inp   אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

הקבצים המשלימים 6: NRC_NM_GMFF.cyt   אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

האיכות של מוניטור וביופסיה יכול להשפיע על התוצאות הסופיות. Hemodilution של וביופסיה מוניטור יכול לעוות את חלוקת תאים בשלבים שונים של ההבשלה בשל היעדרם של אבות או תאים סימנים מקדימים. כנראה העסקת בכמויות גדולות lysing שיטת עשוי לעזור בנורמליזציה של מוניטור aspirates עבור hemodilution זרם cytometric בניתוח. בנוסף, לשלבים הקריטיים עבור הערכת דיספלזיה מיאלואידית מוניטור מאת cytometry זרימה הם דגימת ועיבוד מכתים, חדרי קירור והקפאה, פרשנות2,3. המדגם ועיבוד מכתים צריכה להתבצע עד 72 שעות לאחר מוניטור קציר. הנתונים צריכים לרכוש, רצוי, מיד לאחר צביעת או לאחסן את הדגימות ב 4 ° C, מוגן מפני אור, עבור לא יותר מ 1 h עד מדידה ב cytometer הזרימה. הפירוש מונחה מסד הנתונים מונע את ההערכה הסובייקטיבית של מוניטור התאים מיאלואידית ההבשלה.

את השילובים נוגדן והכנת המדגם היו בהרחבה תאמו את ההליכים EuroFlow9,10. ההבדל לעומת לוח EuroFlow היה כי נוגדנים כל פרט CD300e נמסרו על-ידי BD Bioscience. סטנדרטיזציה cytometry זרימה זה ניתן לקבל נתונים עם רמות גבוהות של הפארמצבטית11, אך זה כרוך להצטרף לקבוצת עובדים על סטנדרטיזציה הלוחות המדובר. בקבוצה שלנו, האחדה של האס נותר שטח כדי להשתפר. הסוגיה לגבי MFC מסדי נתונים הבניין הוא ההליך מוכתמים. התפלגות הראשונית של הנוגדנים ללא עמוד שדרה ב FACS צינורות לפני הוספת כמויות שוות המיקס מדגם-backbone מונע חוזר על עמוד השדרה מכתים במקרה של שגיאות בסופו של דבר בתחום ההפצה של נוגדנים אחרים שאינם את עמוד-השדרה. בנוסף, כדי להתגבר על ההכתמה בעיות שם הן שתי אפשרויות: או להאריך את זמן הדגירה של נוגדנים בין 15 עד 30 דקות, או להשתמש נוגדנים רקומביננטי, המספקים הפארמצבטית רבתי, על פי היצרן מפרט12. הניתוח בוצע בציות נתונים שפורסמו לאחרונה13,14,15. לגבי ניתוח ומונוציטים, לעתים קרובות הבחנו העדר CD34 + CD117 - monocytic-סימנים מקדימים, כפי שדווח בעבר על ידי שן. et al. 16. מסיבה זו, אנו לסלק מן האסטרטגיה ניתוח שער משלים עבור בידוד של אוכלוסייה מסוימת זו. החיתוך של גייטס ומאפשר בידוד של CD64 + F HLADR + F/int ו CD117 + /-כולל את מבשרי ילדותי (CD117 + CD34 + נמוך /-) ומונוציטים בוגרת יותר.

הערכת קבצים FCS חדשים בהשוואה מסד נתונים תורמת מטרה יותר סטנדרטית פרשנות ניתוח ונתונים, מונע misinterpretations של ההכרה דפוסי כביכול, אשר קשה לתקנן את3. כימות של משרעת של ליקויים פנוטיפי by comparison with מסדי נתונים רגיל מאפשר לדרג ליקויים אלה, אשר עשוי לסייע לשפר את ציוני MFC לאבחון MDS. יתר על כן, שיטה זו מאפשרת זיהוי מדויק של ליקויים פנוטיפי ילדותי CD34 + ו/או CD117 + סימנים מקדימים, תאים בוגרים יותר, אשר אינם ניכר בעת שימוש אסטרטגיות ניתוח הנוכחי רכישת תוכנה. שיטה זו היא רלוונטית באבחון של MDS מקרים זה לעשות או שאין מומים מורפולוגיות ניכר, או זה או אינם נושאים cytogenetic aberrancies חוזרים ונשנים.

צורך בשיפור של נוגדן מכתים, התוספת של נתונים חדשים מוניטור נורמלי במסדי נתונים נדרש על מנת להגביר את החוסן, אמינות וצריכת רגישות של הניתוח. בשיטה זו יכול להיות מיושם, עם חקירה נוספת, cytopenias מגורמים אחרים, או hematopoiesis המשובטים בפוטנציאל אינדטרמיננטיים (צ'יפ), על מנת לזהות את השינויים פנוטיפי אמינה הקשורים לתהליכים dysplastic.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים. מחלקת Cytometry זרימה, המעבדה להמטולוגיה בבית החולים באוניברסיטה של Saint-Etienne הוא חבר של קונסורציום EuroFlow.

Acknowledgments

נוגדנים השתמשו במחקר זה נמסרו בידי החיים BD. המחברים רוצה להודות שלהם עמית, ד ר פסקל Flandrin-Gresta, מ המחלקה לביולוגיה מולקולרית, המעבדה להמטולוגיה, אוניברסיטת בית החולים של Saint-Etienne, צרפת, שסיפק מומחיות לפרשנויות של נתונים המיתרים השנייה במקרה של MDS. המחברים מודים ההמטולוגים המטפל שלהם עניין ומעורבות במחקר זה, על המטופלים ועל בריא לתורמים את הסכמתם להשתתף במחקר זה. המחברים רוצה גם להודות הקרן "Les אמיס דה Rémi" תמיכה כספית עבור פרסום.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD FACSCanto II flow-cytometer BD Biosciences, CA, USA SN: V33896301336 3-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf
Awel C48-R Centrifuge AWEL Industries, FR SN: 910120016; Model No: 320002001 low speed centrifuges; capacity 60 FACS tubes
Pipetts of 10µL and 200µL
Pasteur pipettes
15 mL Falcon tubes
polypropylene tube for FACS
Mouse Anti-Human HLA-DR BD Biosciences, CA, USA 655874 clone L243
Mouse BALB/c IgG2a, κ
Fluorochrome Horizon V450
(Ex max 404 nm/
Em max 448 nm)
Mouse Anti-Human CD45 BD Biosciences, CA, USA 560777 clone HI30
Mouse IgG1, κ
Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/
Em max 500 nm)
Mouse Anti-Human CD16 BD Biosciences, CA, USA 656146 clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, κ
Fluorochrome FITC
(Ex max 494 nm/
Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD13 BD Biosciences, CA, USA 347406 clone L138
Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ
Fluorochrome PE
(Ex max 496 nm/
Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD34 BD Biosciences, CA, USA 347222 clone 8G12
Mouse BALB/c IgG1, κ
Fluorochrome PerCP-Cy5.5
(Ex max 482 nm/
Em max 678 nm)
Mouse Anti-Human CD117 BD Biosciences, CA, USA 339217 clone 104D2
Mouse BALB/c IgG1
Fluorochrome PE-Cy7
(Ex max 496 nm/
Em max 785 nm)
Mouse Anti-Human CD11b BD Biosciences, CA, USA 333143 clone D12
Mouse BALB/c IgG2a, κ
D12, Fluorochrome APC
(Ex max 650 nm/
Em max 660nm
Mouse Anti-Human CD10 BD Biosciences, CA, USA 646783 clone HI10A
Mouse BALB/c IgG1, κ
Fluorochrome APC-H7
(Ex max 496 nm/
Em max 785nm)
Mouse Anti-Human CD35 BD Biosciences, CA, USA 555452 clone E11
Mouse IgG1, κ
Fluorochrome FITC
(Ex max 494 nm/
Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD64 BD Biosciences, CA, USA 644385 clone 10.1
Mouse BALB/c IgG1, κ
Fluorochrome PE
(Ex max 496 nm/
Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD300e Immunostep IREM2A-T100 clone UP-H2
Mouse BALB/c IgG1, k
Fluorochrome APC
(Ex max 496 nm/
Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD14 BD Biosciences, CA, USA 641394 clone MoP9
Mouse BALB/c IgG2b, κ
Fluorochrome APC-H7
(Ex max 496 nm/
Em max 785nm)
Mouse Anti-Human CD36 BD Biosciences, CA, USA 656151 clone CLB-IVC7
Mouse IgG1, κ
Fluorochrome FITC
(Ex max 494 nm/
Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD105 BD Biosciences, CA, USA 560839 clone 266
Mouse BALB/c IgG1, κ
Fluorochrome PE
(Ex max 496 nm/
Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD33 345800 clone P67.6
Mouse BALB/c IgG1, κ
Fluorochrome APC
(Ex max 496 nm/
Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD71 BD Biosciences, CA, USA 655408 clone M-A712
Mouse BALB/c IgG2a, κ
Fluorochrome APC-H7
(Ex max 496 nm/
Em max 785nm)
Lysing Solution 10x Concentrate (IVD) BD Biosciences, CA, USA 349202
FACSFlow Sheath Fluid BD Biosciences, CA, USA 342003
FACSDiva CS&T IVD beads BD Biosciences, CA, USA 656046
RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS Cytognos, Salamanca, Spain SPH-RCP-30-5A lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01
Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD) BD Biosciences, CA, USA ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291
Diva software versions 6.1.2 and 6.1.3 BD Biosciences, CA, USA
Phosphate buffered saline tablets R&D Systems, Minneapolis, USA 5564
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich, France A9647
Sodium azide 99% Sigma-Aldrich, France 199931
Infinicyt software version 1.8.0.e Cytognos, Salamanca, Spain

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Orfao, A., Ortuño, F., de Santiago, M., Lopez, A., San Miguel, J. Immunophenotyping of Acute Leukemias and Myelodysplastic Syndromes. Cytometry Part A. 58, 62-71 (2004).
  2. Porwit, A., et al. Revisiting guidelines for integration of flow cytometry results in the WHO classification of Myelodysplastic Syndromes - proposal from the International/European LeukemiaNet Working Group for Flow Cytometry in MDS (IMDSFlow). Leukemia. 28 (9), 1793-1798 (2014).
  3. Westers, M. T., et al. Implementation of flow cytometry in the diagnostic work-up of myelodysplastic syndromes in a multicenter approach: Report from the Dutch Working Party on Flow Cytometry in MDS. Leukemia Research. 36, 422-430 (2012).
  4. Meehan, S., et al. AutoGate: automating analysis of flow cytometry data. Immunologic Research. 58, 218-223 (2014).
  5. Greenberg, P. L., et al. NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology: myelodysplastic syndromes. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 9, 30-56 (2011).
  6. Greenberg, P. L., et al. Myelodysplastic Syndromes, Version 2.2017, Clinical Practice Guidelines in Oncology. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 15, (2017).
  7. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Revised 4th Edition. Swerdlow, S. H., et al. (2), IARC Press. Lyon, France. 86-128 (2017).
  8. https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html. , Available from: https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html (2018).
  9. Composition of EuroFlow panels and technical information on reagents Version 1.5. , (2017).
  10. EuroFlow Standard Operating Procedure (SOP) for sample preparation and staining Version 1.2.1. , (2015).
  11. Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26, 1986-2010 (2012).
  12. http;//www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-flow-cytometry/reagents/antibodies-and-dyes/recombinant-antibodies.aspx. , Available from: http;//www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-flow-cytometry/reagents/antibodies-and-dyes/recombinant-antibodies.aspx (2018).
  13. van Dongen, J. J. M., et al. EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. Leukemia. 26, 1908-1975 (2012).
  14. Matarraz, S. Introduction to the Diagnosis and Classification of Monocytic-Lineage Leukemias by Flow Cytometry. Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 92 (3), 218-227 (2015).
  15. Westers, M. T. Immunophenotypic analysis of erythroid dysplasia in myelodysplastic syndromes. A report from the IMDSFlow working group). Haematologica. 102, 308-319 (2017).
  16. Shen, Q., et al. Flow cytometry immunophenotypic findings in chronic myelomonocytic leukemia and its utility in monitoring treatment response. European Journal of Haematology. 95, 168-176 (2015).

Tags

רפואה גיליון 141 Multiparameter לזרום cytometry MFC myelodysplastic תסמונות MDS מיאלואידית דיספלזיה ההבשלה מסד נתונים התאים מיאלואידית מח עצם מונחה מסד הנתונים לניתוח ב- MFC
Cytometry זרימה מונחה מסד הנתונים להערכה של התבגרות התא מיאלואידית מח עצם
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aanei, C. M., Jacob, M. C.,… More

Aanei, C. M., Jacob, M. C., Veyrat-Masson, R., Picot, T., Rosenthal-Allieri, M. A., Lhoumeau, A. C., Ticchioni, M., Dumezy, F., Campos Catafal, L. Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation. J. Vis. Exp. (141), e57867, doi:10.3791/57867 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter