Summary
La diagnosis MDS es difícil en ausencia de criterios morfológicos o citogenética no informativo. MFC podría ayudar a perfeccionar el proceso de diagnóstico de MDS. Para ser de utilidad para la práctica clínica, el análisis MFC debe basarse en parámetros con suficiente especificidad y sensibilidad, y resultados deben ser reproducibles entre diferentes operadores.
Abstract
Un grupo de trabajo iniciado dentro de la asociación francesa de citometría (AFC) fue desarrollado con el fin de armonizar la aplicación de la citometría de flujo multiparamétrico (MFC) para el diagnóstico de enfermedad mieloide en Francia. El protocolo presentado aquí fue acordada y aplicada entre septiembre de 2013 y noviembre de 2015 en seis laboratorios de diagnóstico francés (hospitales universitarios de Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Niza y Lille e Instituto Paoli-Calmettes en Marsella) y permite la estandarización de la médula ósea muestra preparación y adquisición de datos. Tres bases de datos de maduración fueron desarrollados para neutrófilos, monocítica y linajes eritroides con la médula ósea de individuos "sanos" donantes (personas sin ninguna evidencia de una enfermedad hematopoyética). Un método robusto de análisis para cada linaje mieloide debe ser aplicable para el uso rutinario de diagnóstico. Nuevos casos pueden ser analizados de la misma manera y con respecto a las bases de datos generalmente. Por lo tanto, cuantitativas y cualitativas las anormalidades fenotípicas pueden ser identificadas y aquellos por encima de 2SD en comparación con los datos de las muestras de médula ósea normal puede considerarse indicativas de patología. La principal limitación es la mayor variabilidad entre los datos que se consigue utilizando los anticuerpos monoclonales obtenidos con los métodos basados en hibridomas tecnologías y actualmente se utiliza en diagnóstico clínico. Establecimiento de criterios para la validación técnica de los datos adquiridos puede ayudar a mejorar la utilidad de MFC para el diagnóstico MDS. El establecimiento de estos criterios requiere un análisis contra una base de datos. La reducción de la subjetividad del investigador en análisis de datos es una ventaja importante de este método.
Introduction
En la ausencia de marcadores fenotípicos específicos a los que ocurren en las células mieloides durante la MDS iniciación y progresión de los cambios displásticos, ha propuesto un nuevo enfoque en los últimos años basadas en la evaluación de las vías de maduración (expresión alterada de antígenos mieloides durante la producción de células mieloides maduras) o de la distribución anormal de los diferentes tipos de células en la médula (BM) la célula compartimientos1,2.
Este artículo presenta un nuevo método para el uso estandarizado de MFC para detectar cambios displásticos en BM compartimentos de células mieloides relacionadas con síndromes mielodisplásicos (MDS) u otras enfermedades hematológicas mieloides. Este estudio también demuestra la utilidad del uso de bases de datos de maduración para el análisis de datos MFC.
Estandarización del procedimiento de preparación de muestras, adquisición de datos y análisis con las bases de datos permitiría la identificación de las anormalidades fenotípicas más relevantes relacionados con los cambios displásicos en células mieloides BM. Por lo tanto, son necesarios para el desarrollo de una estrategia de análisis que se puede utilizar en análisis posteriores subconjuntos estadísticamente seleccionados basados en formatos bien marcados y reconocidos (separador de población automático (APS) diagramas, histogramas y diagramas de punto) rondas. El descubrimiento de anormalidades fenotípicas robustos en MDS facilitaría el diagnóstico en casos con o sin displasia morfológica mínima y sin aberrancies citogenéticas. Identificación de parámetros discriminatorios lo que permite la reducción de paneles de immunophenotypic puede simplificar el actual puntuaciones2, permitiendo su aplicación en laboratorios de patología clínica.
Este método limita las interpretaciones subjetivas de datos de citometría, como se ha senalado en MDS diagnóstico3. Este paso es un requisito previo para el desarrollo de herramientas automáticas para el procesamiento y análisis de flujo de datos4.
MDS comprende un grupo heterogéneo de trastornos clonales de células madre hematopoyéticas (HSC) en el que las mutaciones del espliceosoma cooperan con modificadores epigenéticos específicos para producir el fenotipo MDS. Ahora se sabe que, junto con las mutaciones de la HSC, otros mecanismos están implicados en la fisiopatología MDS, como inflamación mediada inmune aberrante e interacciones entre HSCs malignas y el microambiente estromal del BM. Sin embargo, estos mecanismos siguen siendo mal entendidos. La heterogeneidad amplia clínica y biológica de los MDS hace el diagnóstico y la selección de la terapia óptima un desafío. En la última década, varios estudios han demostrado que MFC es a menudo más sensible en la detección de displasia2 de morfología, pero las limitaciones técnicas y económicas dificultan esta técnica estandarizar, con resultados a menudo depende de la experiencia del intérprete3. Además, no está claro cómo MFC puede inclinar la balanza hacia MDS en casos con o sin displasia morfológica mínima y en ausencia de anomalías citogenéticas o en casos extremos como hypocellular MDS, con una cuenta baja blast, de otros no clonal BM trastornos como la insuficiencia de la médula ósea (ej., anemia aplásica). También sigue siendo difícil de distinguir casos dudosos de MDS con un exceso de blastos de la leucemia mieloide aguda (AML). Por todas estas razones, las directrices clínicas integran no MFC de prueba en el diagnóstico final de MDS. En 2011, red nacional de cáncer integral de Estados Unidos (NCCN) recomendó MFC para la estimación del porcentaje de células CD34 +, detección de clones de la hemoglobinuria paroxística nocturna y la presencia de clones de células T citotóxicas en hypocellular MDS5. Estas dos últimas situaciones implican también un objetivo terapéutico porque los datos clínicos han demostrado una buena respuesta de estos pacientes a la terapia inmunosupresiva6. Las guías NCCN de 2017, citando las recomendaciones del grupo de trabajo internacional (GTI), la lista aberrante immunophenotyping detección MFC entre los co criterios para el diagnóstico de la MDS, pero sin realizar ninguna Especificaciones6. Además, la recientemente publicada clasificación de la OMS estipula que resultados MFC solamente no son suficientes para establecer un diagnóstico primario de MDS en ausencia de datos concluyentes de la morfológica y citogenética7. Sin embargo, MFC puede utilizarse como una prueba adicional que el dysregulation de células mieloides patrones de maduración y cuantificar la "distancia de normal" para un paciente en un momento específico en el curso de la enfermedad.
Este método es aplicable a los laboratorios clínicos interesados en la evaluación de la displasia de las células mieloides BM usando MFC immunophenotyping, para afinar el diagnóstico en MDS u otros desordenes mieloides con anormalidades displásticas.
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Protocol
El protocolo a continuación ha sido aprobado por el "Comité de protección des Personnes" (Comité de ética independiente) 1 Sud-Est de la Universidad Hospital de Saint-Etienne, Francia.
1. citometría ajustes
Nota: La configuración de citómetro se realizaron según recomendaciones de flujo de Francia, según procedimiento EuroFlow "EuroFlow operativo protocolo de estándar (SOP) para la configuración del instrumento y compensación (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php).
- Configuración instrumento mensual
- Gire en el citómetro. Asegurar que todos los niveles de fluido adecuado y abierto Diva 6.1.3. Realizar inicio de fluidos: en la barra de menús, seleccione ' citómetro | Inicio de fluidos '. Haga clic en 'OK' cuando se le solicite. Permiten el citómetro calentar durante al menos 30 minutos.
- Verificación de rendimiento - cuentas de CST
Nota: Para este paso, preparar 12 tubo poliestireno de 75 mm, perlas de CST y vaina líquido (véase Tabla de materiales).- Etiquetar un tubo poliestireno 12 x 75 mm2 'CST'. Mezclar la ampolleta de grano suministrado por inversión suave o muy suave Vortex. Añadir al tubo etiquetado: 0,35 mL de líquido de la envoltura y 1 gota de granos de la CST. Vórtice el tubo suavemente y proceder a la adquisición. Guarde el tubo para un máximo de 8 h a 2-25 ° C en la oscuridad si no adquirir inmediatamente.
- Realizar la verificación de rendimiento: en la barra de menús, seleccione ' citómetro | CST'.
- En la pestaña 'Configuración' del módulo CST: confirmar el Canto II como en la configuración por defecto de 4-2 H-2V y también confirmar que existe una base creada con el lote actual de granos de la CST para esta configuración. Si no existe una línea de base, consulte la instrucciones de uso de cuentas de CST. Confirmar que la instantánea no ha caducado: bajo ' Control Setup', seleccione ' ver resultados ' en el menú desplegable.
- Verifique 'Cargar manualmente el tubo' y haga clic en 'Ejecutar'. Confirme que aparece el número de lote. Suavemente vórtice los granos diluidos prepararon por encima y cuando se le solicite, cargue los granos diluidos y haga clic en 'Aceptar'.
- Cuando finalice la comprobación de funcionamiento, verificar que citómetro rendimiento pasado. Haga clic en 'Ver informe'. Vuelva a ejecutar la comprobación de funcionamiento si los resultados no pasaron. Guardar el informe en formato PDF con la fecha de informe de seguimiento de rendimiento.
- Ajustar 'Voltajes fluorescentes PMT' con perlas de arco iris (Tabla de materiales).
Nota: Los valores objetivo se establecen en Euroflow procedimiento operativo estándar (SOP) titulado "20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads". Esta compensación está disponible en sitio de Euroflow (www.euroflow.org; en el área pública; Ficha de protocolos).- Crear un nuevo experimento a través de ' fecha de configuración instrumento mensual | Muestra '.
- ', elija los parámetros ópticos y fluorocromos correspondiente a los tubos afectados (FITC, PE, PerCPCy5.5, PE-Cy7, APC, APC-H7, V450, V500) y comprobar los parámetros de adquisición deseada (registro de, A, H y / o W). Aplicar configuración actual CST (haga clic derecho sobre ' configuración de citómetro ' del experimento). Establecer el umbral para el parámetro FSC en 10.000.
- En el citómetro, apague la compensación mientras se ajusta la fluorescencia voltajes PMT para el ajuste de blanco MFI; para ello, ir en el 'Inspector', vaya a la ficha de 'Compensación' desactivar compensación por opción de ' permitir compensación ' desactivando.
- Crear una hoja de cálculo ' blanco MFI' con todas las parcelas necesarias dot (n = 2; FSC y SSC, FITC y PE), histogramas (n = 8; un histograma para cada detector de fluorescencia) y estadísticas que indiquen la referencia valores máximos (MFI y CV) para cada canal de fluorescencia.
- Diluya 1 gota de partículas de calibración de cuentas 8-pico arco iris en 1 mL de agua destilada y agitar antes de usar. Adquirir sin la solución de cuentas 8-pico arco iris caudal 'Bajo' de grabación. Guarde el tubo para un máximo de 8 h a 2-25 ° c en la oscuridad si no adquirir inmediatamente.
- Camiseta de puerta de perlas ' población P1' en el FSC versus trama de punto bivariada la SSC y el pico 8 o 7 en el FITC versus trama de punto bivariada la PE (el pico más brillante o el siguiente hacia abajo, como se estipula en el documento de Euroflow titulado "20180302_7th_ Peak_Target_Values_Rainbow_Beads") y el nombre de esta puerta P2 de la población.
- Continuar con la adquisición de la suspensión de grano de arco iris de 8 picos y ajustar tensiones PMT en todos los canales de fluorescencia para alcanzar valores de MFI de destino según el documento de Euroflow "20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads".
- Una vez que se alcanzan valores de destino MFI para el pico de 8 o 7, registrar la IMF objetivo logrado y los correspondientes valores PMT finales. Adquirir 5.000 eventos y registro de datos.
Nota: Que valores de PMT debe utilizarse debajo de paso 1.2.3 (rendimiento Compruebe - confirmación de valores de PMT con perlas de arco iris). - Registrar estos valores haciendo una impresión de la pantalla con ajustes de ' destino MFI' e instrumento de hoja de cálculo y guardar como imagen jpg.
Nota: Cuando se crea un tubo de "Nuevo", a veces los valores PMT varían inesperadamente. Para ello, una doble comprobación de PMT es esencial. ¡Comparar cada vez los valores PMT a sus notas, compruebe que ' destino MFI' valores y PMT son correctos! - Guardar la 'configuración de la aplicación del '. En el explorador, haga clic en ' configuración de citómetro '. En el menú desplegable, seleccione ' configuración de la aplicación 'y guardar. Haga clic en 'Aceptar'. Si se le pida, haga clic en sí para mantener los valores de umbral.
Nota: Guarde la configuración de la aplicación utilizando el nombre por defecto. NO cambiar el nombre de la configuración.
- Ajustar el 'FCS' y 'Tensiones SSC' con sangre lavada sometidas a lisis (LWB).
Nota: Para este paso, se necesitan 50 μl de una muestra de sangre periférica (PB) de una solución voluntaria, lisis saludable (Tabla de materiales) y tampón de lavado.- Mide con una pipeta 50 μl de PB en un tubo. Añadir 2 mL de solución de lisis recién diluida. Mezclar suavemente e incubar 10 min a TA.
- Centrifugar 5 min a 540 x g.
- Aspirar el sobrenadante sin perturbar el pellet celular, dejar aproximadamente 50 μl volumen residual en el tubo. Mezclar suavemente y añadir 2 mL de solución de lavado filtrada.
- Centrifugar 5 min a 540 x g.
- Repetir una vez más el 1.1.4.3–1.1.4.4 pasos.
- Añadir 250 μl de tampón de lavado filtrada y mezclar suavemente.
- En el experimento destinado a adquisición de perlas de arco iris, crear una nueva ' muestra | Nueva hoja de cálculo ': dibujar un gráfico bi-paramétrica A SSC / FSC-A.
- Adquirir las células, los linfocitos en un FSC versus trama de punto bivariada la SSC de la puerta y ajustar voltajes FSC y SSC para alcanzar los siguientes valores de target media para la población de linfocitos cerrada: FSC: 55.000 (rango de 50.000 – 60.000) y SSC: 13.000 (gama 11.000 –15,000).
- Adquirir y registrar los datos con unos 10.000 eventos. Verifique que los valores medios de objetivo FSC y SSC para linfocitos cerrados. Reajuste la tensión de FSC y SSC si es necesario.
- Imprimir pantalla y guardar la impresión de los valores de canal de destino que se obtienen.
- Ajustes de compensación de fluorescencia.
Nota: Los controles de compensación solo manchado deben establecerse después de la configuración de MFI de destino y se han establecido parámetros FSC/SSC. Para este paso, un PB de un voluntario sano, partículas de compensación (Tabla de materiales), solución de lisis y lavado tampón son necesarios. La lista de reactivos de anticuerpos conjugados con fluorocromo utilizado para instalar las matrices de remuneración de fluorescencia y sus poblaciones de referencia se enumeran en la tabla 1.- Etiquetar un tubo por reactivo para ser utilizado en configuración de compensación de la fluorescencia (FITC, PE, PerCPCy5.5, APC, V450, V500, PECy7 - CD117, APC-H7 - CD10, APC-H7 - CD14 y APC-H7 - CD71) y un tubo "blanco/sin mancha".
- Extraiga con pipeta 50 μl de PB en cada tubo o 1 gota de "negativo" de las partículas de compensación + 1 gota de "positivo" compensación de partículas en los tubos de control de la compensación indicadas en la tabla 1.
- Añada la cantidad apropiada del reactivo de anticuerpo al tubo. Añadir el tampón de lavado filtrada para alcanzar un volumen final de 100 μl por tubo y mezcle suavemente. Incubar por 15 min a temperatura ambiente, protegido de la luz.
- Añadir 2 mL de solución de lisis recién diluida en los tubos con las células y mezclar suavemente. Incubar por 10 min a temperatura ambiente, protegido de la luz.
- Centrifugar 5 min a 540 x g.
- Aspirar el sobrenadante sin perturbar el pellet celular dejando aproximadamente volumen residual de 50 μL en cada tubo. Mezclar suavemente. Añadir 2 mL de tampón de lavado filtrada.
- Centrifugar 5 min a 540 x g.
- Aspirar el sobrenadante sin perturbar el pellet celular dejando aproximadamente volumen residual de 50 μL en cada tubo. Añadir el tampón de lavado filtrada para alcanzar un volumen final de 250 μl por tubo y mezcle suavemente.
- Crear controles de compensación.
- En la barra de menús, seleccione experimento creado para la adquisición de granos del arco iris. Crear una nueva ' muestra | Configuración de compensación | Crear los controles de compensación.
- En el cuadro de diálogo resultante, seleccione la opción ' control sin manchas separadas incluyen tubo/bien ' . Crear controles de compensación (no específica de etiqueta) genérico para FITC, PE, PerCPCy5.5, APC, HV450, HV500. Crear controles de etiqueta específica compensación para PE-Cy7-CD117, APC-H7 - CD10, APC-H7 - CD14 y APC-H7 - CD71. Haga clic en 'Aceptar'.
- En una nueva hoja de cálculo, crear un gráfico A SSC / FSC-A bi-paramétricas y dibujar una puerta en linfocitos (P1) y el histograma correspondiente al fluorocromo que se detectan en cada tubo y dibuja una puerta P2 para el pico positivo. Mostrar la jerarquía (clic derecho en un gráfico y seleccione ' Mostrar jerarquía de población ') para visualizar el número de eventos en P2, excepto el tubo de Control sin manchas.
- En el navegador, ampliar a la muestra de controles de compensación.
- Vórtice las células sin manchas, preparado anteriormente, para instalar s. 3 – 5 las células sin manchas preparadas en el citómetro. Ajustar el flujo a 'medio ' y haga clic en ' obtener datos '. En la parcela de FSC-A vs SSC-A punto, ajuste la puerta P1 para abarcar completamente la población de linfocitos. Haga clic en la puerta de P1. Seleccione 'Aplicar a todo el control de compensación'.
- En el panel de 'Adquisición' , haga clic en 'datos de registro ' para adquirir 5.000 eventos. Para todas las celdas de control teñida del solo-color, compruebe que la puerta P2 del intervalo abarca a la población positiva.
- Para el PE-Cy7 y tubos de APCH7, añadir una puerta de intervalo de P3 al histograma y asegúrese de que comprende a la población negativa, y que la P2 abarca a la población positiva.
- Calcular indemnización. En la barra de menús, seleccione ' experimento | Configuración de compensación | Calcular indemnización '. Nombre de la matriz de compensación: «Fecha de compensaciones». Seleccione 'Link y guardar'.
- Guardar la matriz de compensación en la configuración de la aplicación Catálogo: haga clic en 'citómetro de configuración | Configuración de la aplicación | Guardar ', nombre de la matriz de compensación 'Fecha de compensación' y haga clic en 'Aceptar'.
- En el explorador, haga clic en ' configuración de citómetro '. En el Inspector, desplácese a la ficha de 'Compensación' , haga clic en imprimir en la esquina inferior derecha.
Nota: Esta información también puede ser obtenida del catálogo. - Control de la matriz de compensación.
- Mezclar en un tubo del solo tubo manchado (APCH7 de elección).
- Crear un nuevo experimento llamado 'Fecha de verificación de compensación', agregar nueva muestra, haga clic derecho en la ' configuración de citómetro ' de este experimento y elija ' enlace | Desenlazar | Configuración de aplicación ' guardó en el paso 1.1.3.10. Adquirir 50.000 eventos de este tubo con la nueva configuración.
- Aplicar una nueva hoja de cálculo Global. Crear trama de puntos 1 FSC-SSC-A/A y dibuja una puerta para visualizar los linfocitos y n x (n-1) / 2 otras parcelas se centró en la puerta de los linfocitos para visualizar parámetros de dos en dos.
- Configuración instrumento diario
- Gire en el citómetro. Asegurar que todos los niveles de fluido adecuado y abierto Diva 6.1.3. Realizar inicio de fluidos: en la barra de menús, seleccione ' citómetro | Inicio de fluidos '. Haga clic en 'OK' cuando se le solicite. Permiten el citómetro calentar durante al menos 30 minutos.
- Verificación de rendimiento - cuentas de CST: Repita los pasos 1.1.2.1–1.1.2.5.
- Control de rendimiento - confirmación de los valores PMT con perlas de arco iris.
- Etiquetar un tubo de poliestireno como ' perlas de arco iris ' y compruebe que el número de lote es el que está en uso. Mezclar bien el frasco de arco iris del grano. Preparar las perlas de arco iris, añadir 1 gota de perlas de arco iris 1 mL de agua destilada o desionizada. Proteger de la luz.
Nota: Proceder a la adquisición o almacenar el tubo a 2-8 ° c hasta la adquisición. - Crear un nuevo experimento: ' fecha de perlas arco iris '.
- Vincular las compensaciones: haga clic en ' configuración de citómetro ', seleccione ' configuración de enlace ', seleccione la matriz de compensación adecuada creada en el paso 1.1.5.9.9 y seleccione "Sobrescribir".
- Desvinculación de compensación: haga clic en ' configuración de citómetro ', seleccione 'Desvincular desde la configuración previamente vinculada' y pulse 'Aceptar'.
- Aplicar ' Configuración de la aplicación: haga clic en ' configuración de citómetro ', seleccione ' Configuración de la aplicación, aplicar la configuración que creó en el paso 1.1.3.10 durante la instalación mensual y 'mantener el valor de compensación '.
- Deseleccione la opción 'Activar compensación'.
- Crear a una nueva muestra en el experimento con la plantilla de hoja de cálculo para perlas de arco iris. Adquirir el tubo en la adquisición de 'Baja' .
- Durante la adquisición de granos, ajuste la puerta P1 para incluir sólo la población de tira de camiseta. Ajustar la puerta P2 en la trama de la FITC-A / PE-A punto para incluir sólo la población de tira de camiseta. Registrar eventos de 10.000.
- Compruebe que la IMF y los valores de CV obtenidos para la población de P2 en los objetivos previamente definidos del protocolo. Lo contrario, lave el citómetro y empezar la operación. Guarde el informe como formato PDF.
- Etiquetar un tubo de poliestireno como ' perlas de arco iris ' y compruebe que el número de lote es el que está en uso. Mezclar bien el frasco de arco iris del grano. Preparar las perlas de arco iris, añadir 1 gota de perlas de arco iris 1 mL de agua destilada o desionizada. Proteger de la luz.
2. preparación de la muestra BM
Nota: Realice la célula lavado protocolo justo antes del procedimiento de tinción.
- Pipetear 600 μl de la muestra principal en un tubo de centrífuga de 15 mL.
- Añadir 10 mL de tampón de lavado (PBS + 0,5% BSA [> 98% puro BSA] + 0,09% NaN3 filtrado de solución, pH 7.4). Mezclar la suspensión de células con una pipeta.
- Centrifugar 5 min a 540 x g (lavado 1). Deseche el sobrenadante sin perturbar el sedimento celulares.
- Repita los pasos 2.2 – 2.3 (programa 2).
- Suspender el sedimento celular en 400 μL de tampón de lavado.
- La coloración de los marcadores de columna vertebral. Transferir todo el volumen de los anticuerpos de la espina dorsal a un tubo de polipropileno para el análisis FACS, identificado con los datos del paciente y la "columna vertebral". Añadir 350 μl de la muestra lavada (el volumen de la muestra lavada que llenan todos los tubos del panel). Mezclar con una pipeta.
Nota: Calcular el volumen total de anticuerpos de la columna vertebral para la membrana superficial de tinción (como se muestra en la tabla 2). - Pipetear cantidades iguales de la mezcla de muestra-columna vertebral en 3 tubos de polipropileno para el análisis FACS, identificado con los datos del paciente y "número 1 del tubo" a "número de tubo de 3". Si es necesario, uso de tampón de lavado para llegar a un volumen final de 200 μL por tubo.
PRECAUCIÓN: Tenga cuidado de no dejar ningún rastro de la muestra en las paredes de los tubos; de lo contrario, estas células no se mancharon. Si es necesario, vórtice de las células y el tubo de la centrifugadora. - En cada tubo, agregue el volumen adecuado de anticuerpos dirigidos contra marcadores de superficie celular (a excepción de los marcadores de columna vertebral), como especificado en la tabla 2. Mezclar con una pipeta. Incubar durante 30 min a TA protegido de la luz.
- Añadir 2 mL de solución de lisis. Mezclar con una pipeta. Incubar por 10 min a TA protegido de la luz.
- Centrifugar 5 min a 540 x g. Deseche el sobrenadante sin perturbar el pellet celular, dejando aproximadamente volumen residual de 50 μL en cada tubo. Mezclar con una pipeta.
- Añadir 2 mL de buffer para el precipitado de células que se lavan. Mezclar con una pipeta.
- Repita los pasos 2.10-2.11 (programa 2).
- Centrifugar 5 min a 540 x g. Deseche el sobrenadante sin perturbar el sedimento celulares y Resuspenda el precipitado de células en 200 μL de PBS. Mezclar con una pipeta.
- Adquirir preferentemente las células, inmediatamente después de la tinción o almacenar a 4 ° C, protegido de la luz, para no más de 1 h hasta medido en el citómetro de flujo.
3. adquisición de datos
- Abra un nuevo experimento en software Diva y cámbiele el nombre según el nombre, tipo de muestra y fecha.
- Crear a una nueva muestra que contienen 3 tubos. Especificar en el diseño de experimento los anticuerpos utilizados en cada tubo.
- Haga clic derecho en la ' configuración de citómetro ', seleccione ' configuración de la aplicación ' y aplicar los valores obtenidos en configuración mensual (paso 1.1.3.10).
- Abra una nueva hoja de cálculo Global y crear los diagramas de punto: A SSC / FSC-A, SSC-A / CD45-HV500-A, SSC-A / FITC-A, SSC-A / PE-A, SSC-A / CD34-PerCP-Cy5.5, SSC-A / CD117-PECy7-A, SSC-A / APC-A, SSC-A / APCH7-A, SSC-A / HLA-DR-HV450-A. En la trama de punto SSC-FSC-A/A, crear una puerta para seleccionar las células de la camiseta. En la trama de punto SSC-CD45-BV500-A/a, crear puertas para seleccionar 4 poblaciones: granulocitos, monocitos, blastos y linfocitos. Proyecto de estas poblaciones en las parcelas de punto creadas anteriormente.
- Crear una nueva hoja de cálculo Global para el control de compensación como se describe en el paso 1.1.5.9.11.3.
- Adquirir el tubo en 'Medio' adquisición y registro 500.000 eventos/tubo. Después de validación técnica (evaluación de la compensación y la tinción adecuada), exportar los datos como archivos FCS3.0.
4. Análisis de datos
Nota: Para construir las bases de datos de BM normales fueron archivos de donantes sanos y de individuos sin ninguna evidencia de una enfermedad hematopoyética 11 de los 18 archivos para el Neutrophils_NM base de datos, 10 de los 18 archivos de base de datos de Monocytes_NM y 14 de 18 archivos de base de datos de NRC_NM. Los archivos descartan presentaron diversos problemas técnicos, tal como se presenta en la sección de resultados de representante. Los archivos individualmente se analizaron utilizando el software de Infinicyt (Tabla de materiales), conforme a las diversas estrategias que se muestra en la figura 1A(1-3) para linaje neutrófilo (perfil Neutrophils_Maturation.inp), figura 2 A por linaje monocito (perfil Monocytes_Maturation.inp) y figura 3A(1-2) de linaje de células eritroides (perfil NRC_Maturation.inp).
- Estrategia de análisis para los neutrófilos -Construcción de base de datos de Neutrophils_NM
- Identificar CD34 + ráfagas de neutrófilo cometido mediante un cruce de siete puertas, permitiendo la selección de CD34 + CD117 + HLADR + baja CD10 - CD13 + CD11b-eventos (1 de figuraA.1). Asignar estos eventos a la pestaña 'Neutrófilo' en el árbol de jerarquía de población y después desmarque esta pestaña para quitar estas células (mostradas en azul) de la pantalla de los eventos restantes (gris).
- Aislar el CD117 + CD34 - CD13 + CD11b-HLADR + precursores de neutrófilos baja mediante una intersección de seis puertas como se muestra en la figura 1A(2) y asignarlos a la pestaña 'Neutrófilo' .
- Identificar los neutrófilos más maduros con una intersección de cuatro puertas, lo que permite la discriminación de CD45dim SSCint-Hola CD117-HLADR-las células y su asignación a la pestaña 'Neutrófilo' .
- Desmarque los eventos restantes, manteniendo sólo los neutrófilos visible, luego exportación esta población haciendo clic en ' archivo | Exportación de ' y verificar que todos los parámetros requeridos son verificados y guardar los datos como archivos de FCS.
- En un archivo combinado de todos los archivos exportados de FCS, realizar una verificación de calidad mediante la evaluación de la intensidad de la expresión de marcadores de cada subpoblación. Con APS parcelas con medias para cada archivo y las curvas de SD para cada subpoblación se muestra, quite los casos fuera de las curvas de 2SD (ver detalles en la sección de resultados de representante) (figura 1B).
- En el archivo resultante compuesto con "Neutrófilos" visibles, dibujar el camino de maduración en un diagrama APS (a la izquierdafigura 1C ) y guardar como un archivo de .cyt.
Nota: Una comparación de esquema de maduración permite la visualización de todos los parámetros de todos los archivos incluidos en la base de datos de Neutrophils_NM representada la base de datos normalizada. El diagrama presentado en la figura 2C, lado derecho, muestra que todos los archivos incluyen en la base de datos de Neutrophils_NM (n = 11) en 2 SD en comparación con la mediana del grupo.
- Estrategia de análisis para los monocitos - Monocytes_NM construcción de base de datos
- Identificar las células de estirpe monocítica (CD117 +-CD64 + Hola HLADR + hi) mediante una intersección de cuatro puertas (figura 2A). Asignar estos eventos a la pestaña 'Monocítica' en el árbol de jerarquía de población.
- Desmarque los eventos restantes, manteniendo sólo las células monocytic visible, luego exportación esta población haciendo clic en ' archivo | Exportación de ' y verificar que todos los parámetros requeridos son verificados y guardar los datos como archivos de FCS.
- En un archivo combinado de todos los archivos exportados de FCS, realizar una verificación de calidad mediante la evaluación de la intensidad de la expresión de marcadores para cada subpoblación y, a continuación, quite los casos fuera de las curvas de 2SD (detalles en sección resultados representante) (figura 2 B).
- En el archivo resultante con las células "Monocítica" visibles, dibujar el camino de maduración en el diagrama de la APS (a la izquierdafigura 2C ) y guardar como un archivo de .cyt.
Nota: Una comparación de esquema de maduración permite la visualización de todos los parámetros de todos los archivos incluidos en la base de datos de Monocytes_NM representada la base de datos normalizada. El diagrama presentado en la figura 2C, lado derecho, muestra que todos los archivos incluyen en la base de datos de Monocytes_NM (n = 10) en 2 SD en comparación con la mediana del grupo.
- Estrategia de análisis para eritrocitos nucleados (NRCs) - construcción de base de datos NRC_NM
- Identificar CD34 + blastos eritroides cometidos utilizando un cruce de siete puertas que permiten la selección de CD34 + CD117 + HLADR + baja CD105 + CD33 - CD36 + CD71 + eventos (figura 3a.1). Asignar estos eventos a la pestaña "NRC" en el árbol de jerarquía de población y luego desmarque esta pestaña para quitar estas células (mostradas en rojo) de la pantalla de los eventos restantes (gris).
- Identificar NRCs más maduros con una intersección de cuatro puertas que permiten la discriminación de CD45-/ + dim SSClow CD36 + Hola CD71 + Hola CD105 + /-de las células. Asignar estos eventos a la pestaña de "NRC" (figura 3A(2)). Las plaquetas (CD36 + Hola SSClow células) debe ser retirado de la población de NRC (figura 3A(2)).
- Desmarque los eventos restantes, manteniendo sólo las células de la NRC visible, luego exportación esta población haciendo clic en ' archivo | Exportación de ' y verificar que todos los parámetros requeridos son verificados y guardar los datos como archivos de FCS.
- En un archivo combinado de todos los archivos exportados de FCS, realizar una verificación de calidad mediante la evaluación de la intensidad de la expresión de marcadores para cada subpoblación, seguida de la eliminación de los casos fuera de la (2) (ver detalles en sección resultados representante) curvas Figura 3 B).
- En el archivo resultante con las células "NRC" visibles, dibujar el camino de maduración en el diagrama de la APS (figura 3C, izquierda) y guardar como un archivo de .cyt.
Nota: Una comparación de esquema de maduración permite la visualización de todos los parámetros de todos los archivos incluidos en la base de datos NRC_NM representada la base de datos normalizada. El diagrama presentado en la figura 3C, lado derecho, muestra que todos los archivos incluyen en la base de datos NRC_NM (n = 14) en 2 SD en comparación con la mediana del grupo.
- Evaluación de la maduración en compartimientos mieloides BM utilizando las bases de datos de maduración
- Abra el archivo .cyt correspondiente al linaje de interés (es decir., Neutrophils_NM_GMFF.cyt de linaje neutrófilo, Monocytes_NM_GMFF.cyt de linaje monocytic y NRCs_NM_GMFF.cyt de linaje eritroide).
- Haga clic en la pestaña de 'Maduración' debajo de la ficha correspondiente al linaje de interés (' neutrófilos | Monocítica | NRC') y guardar la base de datos de maduración a maduración.
- Abra un nuevo archivo de FCS y realizar análisis como se explicó anteriormente (paso 4.1.1–4.1.3 para neutrófilos, paso 4.2.1 para las células Monocytic, y de paso 4.3.1–4.3.2 para NRC).
- Dibujar el camino de maduración para la población de interés.
- Abra la base de datos correspondiente en la pestaña 'Herramientas' (análisis de la base de datos) y comparar la población a analizar con la base de datos correspondiente de maduración. Verificar los datos para la compatibilidad con la base de datos disponible: completa compatibilidad (triángulo verde); compatibilidad parcial, en la mayoría de las discrepancias de casos en el nombre de los parámetros (triángulo amarillo); e incompatibilidad (triángulo rojo).
- Si los datos son compatibles o parciales compatibles, el software crea el diagrama ' normalizado de las diferencias de maduración ' . Para visualizar las ' diferencias de maduración parámetro banda ', abrir un nuevo diagrama en pestaña 'Diagrama' , 'Maduración' , haga clic en y elija cuántos parámetros se muestran, haga clic en 'OK' y el diagrama aparecen. Con click derecho en el diagrama; pueden hacer cambios en la visualización de datos, visualización de la base de datos y visualización del esquema de maduración.
- Para visualizar la importancia de las diferencias entre el nuevo archivo y datos incluidos en la base de datos, configurar un zoom (haga click en ' diferencias de maduración normalizado ' y aplicar 'Zoom').
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Representative Results
Las 54 muestras de BM en anticoagulante EDTA K se incluyeron en el estudio. Se analizaron los datos MFC en la ausencia de cualquier información sobre los pacientes. Estudio retrospectivo demostró que las muestras del BM eran de 7 donantes sanos (5 machos y 2 hembras con una edad media de 47.4 [35-48], 11 personas sin evidencia de una enfermedad hematopoyética (8 varones y 3 hembras con una edad promedio de 57.9 [35-72]) y 36 casos con varias condiciones patológicas: 1 caso con anemia y nivel de creatinina bajo, 3 casos con anemia y nivel de creatinina alta, 8 casos con anemia de la inflamación, 1 caso con anemia causada por la vitamina deficiencia de B12 , 4 casos con anemia ± otros cytopenias causada por daños en el hígado, 3 casos con anemia hemolítica autoinmune, 5 casos con púrpura trombocitopénica idiopática, 1 caso con síndrome de la activación de macrófagos, 3 casos con remisión completa después del tratamiento de linfoma (enfermedad residual mínima < 0,01%) y 7 casos llevando los desordenes hematológicos (MDS de 4, 1 LMA, leucemia myelomonocytic crónica 1 y 1 síndrome mieloproliferativo JAK2 positivo). Esta última categoría incluyó 18 machos y 18 hembras con un promedio de edad 60.3 [17-100]. Todas las muestras fueron de individuos caucásicos. Las bases de datos del edificio permitieron identificar y fijar varias cuestiones relacionadas con la adquisición y preparación de la muestra. En nuestro caso, las bases de datos finales incluyen archivos de 11/18 para la maduración de neutrófilo, 10/18 archivos para la maduración de monocitos y 14/18 archivos de maduración de la NRC. Los archivos que no fueron incluidos en las bases de datos que plantea varios problemas técnicos. Los problemas de tinción más comunes fueron observados para CD11b y CD13 en neutrófilos, CD300e y HLADR en monocitos, y CD71 y HLADR en NRCs. exportación de datos pueden ser una fuente de errores; el más frecuente en nuestro conjunto de datos fue la ausencia de FSC-H en archivos exportados y las inversiones de FSC-W con FSC-H que a veces se producen en la exportación de archivos DIVA8. La evaluación de nuevos casos de cytopenias sospechosos de ser MDS contra la mieloide Normal maduración las bases de datos permiten la identificación de la expresión anormal de los antígenos de la maduración del linaje de neutrófilos (figura 4), monocitos (figura 5 ) y NRC (figura 6) incluso en los casos sin anomalías citológicas o citogenéticos (figura 7). De lo contrario, utilizando el software de adquisición rutinaria, como Diva, estos serían difíciles o imposibles de realizar.
Figura 4 : Análisis de citometría de flujo representativo de los neutrófilos en un caso MDS del(7). (A) diagrama en el normalizado maduración las diferencias, la zona gris corresponde a la expresión normal de los antígenos resultantes del análisis de los 11 archivos normales incluido en la base de datos neutrófilo (median± 2). La expresión anormal de varios antígenos fue observada en comparación con el caso MDS del(7) contra Neutrophils_NM la base de datos (n = 1 y n = 11 muestras de controles normales). (B) parámetro de banda maduración diagramas permite las comparaciones entre la intensidad media de expresión de cada marcador en diferentes etapas de maduración (líneas continuas completas) y 2 curvas calculan para los 11 casos de BM normales incluidos en la base de datos (líneas discontinuas continuas). Las anormalidades fenotípicas de neutrófilos observadas en un caso MDS del(7) en comparación con la base de datos de maduración Normal neutrófilos son los siguientes: General aumento de la expresión de CD34, ligero aumento de la expresión de CD11b en neutrófilos inmaduros (etapas 2), disminuye expresión de CD13 en neutrófilos inmaduros (etapas 1-3) y ligero aumento de la expresión de CD16 en las dos primeras etapas de maduración de neutrófila seguida por el moderado aumento de la expresión de CD16 en neutrófilos maduros (etapas 4-5). (C) muestra que el punto correspondiente de parcelas como visualizada en el software de la DIVA. Evaluación de la imagen utilizando el software DIVA permite la identificación de un pequeño número de anormalidades fenotípicas en este caso MDS: un aumento del porcentaje de precursores CD34 + CD13 + y el downregulation de expresión de CD13. La expresión anormal de CD16 es difícil de observar en este tipo de representación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Análisis de citometría de flujo representativo de los monocitos en un caso MDS del(7). (A) las diferencias de maduración normalizado diagrama ofrece opinión un total de expresión del antígeno en las distintas etapas de maduración de linaje de células monocytic. La zona gris corresponde a la expresión normal de los antígenos resultantes del análisis de 10 archivos normales incluido en la base de datos monocítica (media ± 2SD). La expresión anormal de varios antígenos supera los 2, pero para algunos marcadores, tales como CD35 y HLADR, excede 4SD. (B) en el parámetro banda maduración diagramas, las anormalidades fenotípicas de las células monocytic en un del(7) SMD del caso cuando en comparación con la base de datos la maduración Normal de monocitos (n = 1 y n = 10 muestras de controles normales) son los siguientes: disminuyó la expresión de CD45 durante etapas 1-4 de células monocytic, de CD117 en etapas 1-2 de monocytic precursores y de HLA-DR en general. La mayor expresión de CD35 en las 3 primeras etapas de la maduración de las células monocytic fue la anormalidad más importante de este linaje. DIVA (C) punto de parcelas que permiten la evaluación de células monocytic en un solo punto normal de DIVA BM (D) parcelas que permiten la evaluación de células monocytic en caso MDS del(7). Evaluación de imagen utilizando el software DIVA permite la identificación de las anormalidades fenotípicas dos en este caso MDS: la disminuida expresión de HLA-DR y el aumento de la expresión de CD35 en una parte de precursores monocítica (población rojo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 : Análisis de citometría de flujo representativo de eritrocitos nucleados en un caso MDS del(7). (A) las diferencias de maduración normalizado diagrama ofrece opinión un total de expresión de antígeno en las distintas etapas de maduración del linaje de NRC. La zona gris corresponde a la expresión normal de los antígenos resultantes del análisis de los 14 archivos normales incluido en la base de la maduración Normal de NRC (media ± 2SD). La expresión anormal de varios antígenos supera los 2, pero para algunos marcadores, como CD34, CD117, CD71 y CD105, excede 4SD. (B) en el parámetro banda maduración diagramas, las anormalidades fenotípicas observadas en un caso de del(7) SMD en comparación con con la base de la maduración Normal de NRC (n = 1 y n = 14 muestras de controles normales) son los siguientes: disminución de expresión de CD34 en las dos primeras etapas de maduración, de CD117, CD105, CD71 y HLA-DR en la etapa 1 de los precursores eritroides linaje. Evaluación de la imagen utilizando el software DIVA permite identificación de CD71 expresión anormal de las células eritroides en este caso MDS, pero otras modificaciones no son detectables. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7 : Análisis de citometría de flujo representativo de neutrófilos, monocitos y NRCs en una fase temprana caso MDS sin displasia morfológica ni citogenéticas aberrancies. (A) la distribución de células inmaduras y maduras dentro de etapas de maduración diferentes para los tres linajes mieloides: neutrófilos, monocitos y NRCs. Se observó un aumento del número de monocitos maduros (etapa 5) y la disminución de un poco de monocytic células inmaduras (fase 2 de maduración). (B) diferencias de maduración normalizó el diagrama demuestra que las anormalidades fenotípicas superan los 2, pero para CD34, CD117, CD11b, CD16 y HLADR, son más altos en 4SD. anormalidades fenotípicas observadas para neutrófilos son como sigue: un poco SSC mayor valores en precursores neutrófilos inmaduros (etapa 1), disminución de la expresión de CD34 (etapa 1), de CD117 (etapa 1), de CD16 (etapa 1 - 2) y de HLADR (etapas 1-3 de maduración). Se observó un incremento en la expresión de CD11b en precursores neutrófilos inmaduros (etapa 1). (C) el normalizado maduración diferencias diagrama demuestra que las más importantes anormalidades fenotípicas observadas para el linaje monocytic (superior a 10SD) es aumento de la expresión de CD35 y adquisición temprana de CD300e en el inmaduro monocítica precursores. Otras anormalidades fenotípicas observadas en el linaje monocytic son los siguientes: disminución de FSC y SSC en monocitos más maduros (etapas 3-5) y leve disminución de la expresión de CD14 en etapas 2-3 de las células monocytic. (D) las diferencias de maduración normalizado diagrama y los diagramas de maduración de banda de parámetro muestra que las más importantes anormalidades fenotípicas observadas para el NRC son: aumento de la expresión de CD117 (superior a 10SD) en etapas de 2-3 de NRC maduración, aumenta la expresión de CD34 (superior a 5SD) durante la segunda etapa de maduración del NRC y disminuida expresión de CD36 en los precursores eritroides tempranos (etapas 1-3). Además, la SSC en NRC es menor que en las contrapartes normales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Por otra parte, la interpretación de la significación de las diferencias entre la expresión del antígeno en valores patológicos y sus contrapartes normales permite la "cuantificación" de estas anomalías, con la identificación de aquellos que son discriminantes para un grupo de los casos. Esto puede también hacer posible clasificar basado en importancia a los efectos de un seguimiento. En este estudio, todos los 7 casos de trastornos hematológicos con características de displasia mieloide (4 MDS, 1 LMA, leucemia myelomonocytic crónica 1 y 1 síndrome mieloproliferativo JAK2 positivo) fueron clasificados como anormales en comparación con las bases de datos del Banco Nacional de Moldova. Además, la evaluación en la base de datos de Neutrophils_NM eliminado la sospecha de displasia mieloide en 7 casos con anemia hemolítica tóxica, inflamatoria, autoinmune y anemia de enfermedad crónica del riñón. La evaluación contra la base de datos de Monocytes_NM elimina la sospecha de displasia mieloide en 4 casos con púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), mientras que la evaluación contra el NRC_NM permitido para la diferenciación en 3 casos, 2 de la anemia inflamatoria y 1 de la PTI. El BM aspira de los pacientes en remisión completa después de tratamientos de tumor sólido o linfoma dentro de 2 SD de la media de las bases de datos normales para los tres linajes y así estas muestras puede ser alternativas a las muestras de donante sano BM.
Figura 1 : Estrategias de análisis de linaje celular neutrófilos. (A) selección de CD34 + CD117 + HLADR + progenitores CD10 - CD13 + CD11b-neutrófilo baja fue realizada por intersección de siete puertas como se muestra en la A1. El siguiente paso de maduración, CD117 + CD34 - CD13 + CD11b-HLADR + precursores de neutrófilos baja fue elegido mediante una intersección de seis puertas como se muestra en A2. Los neutrófilos más maduros finalmente se identifican mediante una intersección de cuatro puertas que permiten la discriminación de CD45dim SSCint-Hola CD117-HLADR-células (A3). La mayoría de los marcadores discriminante de linaje neutrófilo era CD34, CD117, CD11b y CD16. Junto a CD13, estos parámetros permiten la identificación de cinco subpoblaciones: CD34 + (CD34 +, CD117 + CD13 +baja CD11b - CD16-) progenitores (azul oscuro); CD34 - CD117 + CD13 +Hola CD11b-CD16-neutrófilo precursores (azul); CD34 - CD117 - CD13 +baja CD11b-CD16-neutrófilos (paso 3 delrd de maduración azul claro); CD34 - CD117 - CD13 +baja CD11b + CD16 +baja neutrófilos (4th paso de maduración, color de rosa); neutrófilos maduros (CD34 - CD117 - CD13 +Hola CD11b +Hola CD16 +Hola, violeta). Cada círculo coloreado representa la mediana de una subpoblación para el marcador de interés de una muestra (B). (C) muestra la distribución homogénea de los parámetros muestreados durante la maduración del neutrófilo célula en comparación con 2 SD de la base de la maduración normal (n = 11). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Estrategia de análisis para monocitos. Identificación de células de estirpe monocítica (CD117 +-CD64 + Hola HLADR + hi) se realiza mediante un cruce de cuatro puertas (A). El más discriminante marcadores de linaje monocytic fueron CD14, CD300e (IREM2), CD35 y HLA-DR. junto con CD117, estos parámetros permiten la identificación de tres subpoblaciones: CD34 - CD117 +bajo/ - HLADR +Hola CD35 - CD14 - CD300e - (rojo); CD34 - CD117 - HLADR +med CD35 +med CD14 +med CD300e - (naranja); madura monocitos CD34 - CD117 - HLADR +med CD35 +Hola CD14 +Hola CD300e + (verde) (B). (C) muestra la distribución homogénea de los parámetros muestreados durante la maduración de células monocytic en comparación con 2 SD de la base de la maduración normal (n = 10). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Estrategias de análisis para NRCs. (A) la identificación de CD34 + blastos eritroides comprometidos se realizó utilizando un cruce de siete puertas que permiten la selección de CD34 + CD117 + progenitores eritroides (A1). El NRCs más maduros se identifican mediante una intersección de cinco puertas (A2). Exclusión de las plaquetas (CD36 + Hola SSClow células) de NRC población se requiere (A2). La mayoría de los marcadores de linaje de la célula eritroide discriminante era CD34, CD117, CD71 y CD105. Junto con el CD33, estos parámetros permiten la identificación de tres subpoblaciones: CD45 +baja CD34 +, CD117 + HLADR +med CD71 +med CD36 +med CD105 +alta (rojo); CD34 - CD117 + HLADR +baja CD71 +Hola CD36 +Hola CD105 +Hola NRCs (2nd paso de maduración, color de rosa); CD34-CD117-HLADR-/ +baja CD71 +Hola CD36 +med CD105 +bajo/-NRCs (más maduro NRCs; salmón rosado) (B). (C) muestra la distribución homogénea de los parámetros muestreados durante la maduración de la NRC en comparación con 2 SD de la base de la maduración normal (n = 14). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: lista de reactivos de anticuerpos conjugados con fluorocromo utilizado para instalar las matrices de remuneración de fluorescencia con sus poblaciones de referencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta mesa.
Tabla 2: Combinación y cantidades de anticuerpos que se usan para la evaluación de la maduración de células neutrófilos, monocitos y eritroides en BM Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta mesa.
Archivo adicional 1: Monocytes_Maturation.inp haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo adicional 2: Monocytes_NM_GMFF.CyT Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo complementario 3: Neutrophils_Maturation.INP Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo adicional 4: Neutrophils_NM_GMFF.CyT Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo complementario 5: NRC_Maturation.INP Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo complementario 6: NRC_NM_GMFF.CyT Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
La calidad de aspirado del BM podría impactar en los resultados finales. La hemodilución de la aspirada del BM podría distorsionar la distribución de células en diferentes etapas de maduración debido a la ausencia de progenitores o precursores. Probablemente emplear un bulto lisis método puede ayudar en la normalización de BM aspira por hemodilución en los análisis de citometría de flujo. Además, los pasos críticos para la evaluación de la displasia mieloide BM por citometría de flujo son la muestra procesamiento y tinción, adquisición de datos y la interpretación2,3. La muestra, procesamiento y tinción debe realizarse hasta 72 h después de la cosecha de BM. Los datos deben ser adquiridos, preferentemente, inmediatamente después de la tinción o almacenan las muestras a 4 ° C, protegido de la luz, para no más de 1 h hasta medir en el citómetro de flujo. La interpretación guiada por la base de datos evita la valoración subjetiva de la maduración de células mieloides de BM.
Las combinaciones de anticuerpos y la preparación de la muestra fueron ampliamente conformadas al EuroFlow procedimientos9,10. La diferencia en comparación con el grupo EuroFlow fue que todos los anticuerpos excepto CD300e fueron proporcionados por biociencias de BD. La estandarización de la citometría de flujo ha permitido obtener datos con altos niveles de reproducibilidad11, pero esto exige unirse a un grupo de trabajo sobre la normalización de los paneles en cuestión. En nuestro grupo, la normalización de la SSC sigue siendo un área a mejorar. El principal problema con respecto a las bases de datos MFC de construcción es el procedimiento de tinción. La distribución inicial de los anticuerpos no-backbone en FACS tubos antes de agregar las cantidades iguales de la mezcla de muestra-columna vertebral evita repetir la columna vertebral la coloración en caso de eventuales errores en la distribución de otros anticuerpos no columna vertebral. Además, para superar la tinción problemas son dos posibilidades: aumentar el tiempo de incubación de los anticuerpos de 15 a 30 minutos, o utilizar los anticuerpos recombinantes, que proporcionan una mayor reproducibilidad, según el fabricante Especificaciones12. El análisis se realizó de conformidad con los datos recientemente publicados13,14,15. En cuanto a análisis de monocitos, observamos con frecuencia la ausencia de CD34 + CD117 - monocytic precursores, como se ha divulgado previamente por Shen et al. 16. para ello, eliminamos de la estrategia de análisis una puerta adicional para el aislamiento de esta población en particular. La intersección de puertas que permite aislamiento de CD64 + F HLADR + F/int y CD117 +-incluye los precursores inmaduros (CD117 + CD34 + bajo /-) y los monocitos más maduros.
La evaluación de nuevos archivos de FCS en comparación con una base de datos contribuye a una más objetiva, estandarizada interpretación de datos y análisis y evita interpretaciones erróneas y el reconocimiento de patrones llamado, que es difícil estandarizar3. La cuantificación de la amplitud de las anormalidades fenotípicas por comparación con bases de datos normales hace posible clasificar estas anormalidades, que pueden ayudar a mejorar resultados MFC para el diagnóstico MDS. Además, este método permite la identificación exacta de las anormalidades fenotípicas en inmaduras CD34 + o precursores de CD117 + y en células más maduras, que no son evidentes al usar las estrategias actuales de análisis en software de adquisición. Este método es relevante en el diagnóstico de casos MDS que ni no tienen anormalidades morfológicas evidentes o que o no llevan citogenéticas recurrentes aberrancies.
Mejora de anticuerpos es necesaria, y la adición de nuevos datos de BM normales en bases de datos es necesaria para aumentar la robustez, fiabilidad y sensibilidad de los análisis. Este método podría aplicarse, con más investigación, cytopenias de otras causas, o hematopoyesis clonal de potencial indeterminado (CHIP), con el fin de identificar los cambios fenotípicos confiable relacionada con los procesos displásicos.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten. El Departamento de citometría de flujo, laboratorio de Hematología en el Hospital de la Universidad de Saint-Etienne es un miembro del consorcio EuroFlow.
Acknowledgments
Los anticuerpos utilizados en este estudio fueron proporcionados por BD Biosciences. Los autores desean agradecer a su colega, el Dr. Pascale Flandrin-Gresta, desde el Departamento de Biología Molecular, laboratorio de Hematología, Universidad Hospital de Saint-Etienne, Francia, que proporciona conocimientos para la interpretación de datos NGS para la segunda Caso MDS. Los autores están agradecidos por los hematólogos del clínico para su interés y participación en este estudio y para los pacientes y donantes sanos para su acuerdo para participar en este estudio. Los autores quisieran agradecer a la Fundación "Les Amis de Rémi" apoyo financiero para la publicación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSCanto II flow-cytometer | BD Biosciences, CA, USA | SN: V33896301336 | 3-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf |
| Awel C48-R Centrifuge | AWEL Industries, FR | SN: 910120016; Model No: 320002001 | low speed centrifuges; capacity 60 FACS tubes |
| Pipetts of 10µL and 200µL | |||
| Pasteur pipettes | |||
| 15 mL Falcon tubes | |||
| polypropylene tube for FACS | |||
| Mouse Anti-Human HLA-DR | BD Biosciences, CA, USA | 655874 | clone L243 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm) |
| Mouse Anti-Human CD45 | BD Biosciences, CA, USA | 560777 | clone HI30 Mouse IgG1, κ Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm) |
| Mouse Anti-Human CD16 | BD Biosciences, CA, USA | 656146 | clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD13 | BD Biosciences, CA, USA | 347406 | clone L138 Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD34 | BD Biosciences, CA, USA | 347222 | clone 8G12 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm) |
| Mouse Anti-Human CD117 | BD Biosciences, CA, USA | 339217 | clone 104D2 Mouse BALB/c IgG1 Fluorochrome PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm) |
| Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, CA, USA | 333143 | clone D12 Mouse BALB/c IgG2a, κ D12, Fluorochrome APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm |
| Mouse Anti-Human CD10 | BD Biosciences, CA, USA | 646783 | clone HI10A Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Mouse Anti-Human CD35 | BD Biosciences, CA, USA | 555452 | clone E11 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD64 | BD Biosciences, CA, USA | 644385 | clone 10.1 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD300e | Immunostep | IREM2A-T100 | clone UP-H2 Mouse BALB/c IgG1, k Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, CA, USA | 641394 | clone MoP9 Mouse BALB/c IgG2b, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Mouse Anti-Human CD36 | BD Biosciences, CA, USA | 656151 | clone CLB-IVC7 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD105 | BD Biosciences, CA, USA | 560839 | clone 266 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD33 | 345800 | clone P67.6 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
|
| Mouse Anti-Human CD71 | BD Biosciences, CA, USA | 655408 | clone M-A712 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Lysing Solution 10x Concentrate (IVD) | BD Biosciences, CA, USA | 349202 | |
| FACSFlow Sheath Fluid | BD Biosciences, CA, USA | 342003 | |
| FACSDiva CS&T IVD beads | BD Biosciences, CA, USA | 656046 | |
| RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS | Cytognos, Salamanca, Spain | SPH-RCP-30-5A | lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01 |
| Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD) | BD Biosciences, CA, USA | ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291 | |
| Diva software versions 6.1.2 and 6.1.3 | BD Biosciences, CA, USA | ||
| Phosphate buffered saline tablets | R&D Systems, Minneapolis, USA | 5564 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, France | A9647 | |
| Sodium azide 99% | Sigma-Aldrich, France | 199931 | |
| Infinicyt software version 1.8.0.e | Cytognos, Salamanca, Spain |
References
- Orfao, A., Ortuño, F., de Santiago, M., Lopez, A., San Miguel, J. Immunophenotyping of Acute Leukemias and Myelodysplastic Syndromes. Cytometry Part A. 58, 62-71 (2004).
- Porwit, A., et al. Revisiting guidelines for integration of flow cytometry results in the WHO classification of Myelodysplastic Syndromes - proposal from the International/European LeukemiaNet Working Group for Flow Cytometry in MDS (IMDSFlow). Leukemia. 28 (9), 1793-1798 (2014).
- Westers, M. T., et al. Implementation of flow cytometry in the diagnostic work-up of myelodysplastic syndromes in a multicenter approach: Report from the Dutch Working Party on Flow Cytometry in MDS. Leukemia Research. 36, 422-430 (2012).
- Meehan, S., et al. AutoGate: automating analysis of flow cytometry data. Immunologic Research. 58, 218-223 (2014).
- Greenberg, P. L., et al. NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology: myelodysplastic syndromes. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 9, 30-56 (2011).
- Greenberg, P. L., et al. Myelodysplastic Syndromes, Version 2.2017, Clinical Practice Guidelines in Oncology. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 15, (2017).
- WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Revised 4th Edition. Swerdlow, S. H., et al. (2), IARC Press. Lyon, France. 86-128 (2017).
- https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html. , Available from: https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html (2018).
- Composition of EuroFlow panels and technical information on reagents Version 1.5. , (2017).
- EuroFlow Standard Operating Procedure (SOP) for sample preparation and staining Version 1.2.1. , (2015).
- Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26, 1986-2010 (2012).
- http;//www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-flow-cytometry/reagents/antibodies-and-dyes/recombinant-antibodies.aspx. , Available from: http;//www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-flow-cytometry/reagents/antibodies-and-dyes/recombinant-antibodies.aspx (2018).
- van Dongen, J. J. M., et al. EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. Leukemia. 26, 1908-1975 (2012).
- Matarraz, S. Introduction to the Diagnosis and Classification of Monocytic-Lineage Leukemias by Flow Cytometry. Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 92 (3), 218-227 (2015).
- Westers, M. T. Immunophenotypic analysis of erythroid dysplasia in myelodysplastic syndromes. A report from the IMDSFlow working group). Haematologica. 102, 308-319 (2017).
- Shen, Q., et al. Flow cytometry immunophenotypic findings in chronic myelomonocytic leukemia and its utility in monitoring treatment response. European Journal of Haematology. 95, 168-176 (2015).
