Summary
Здесь мы представляем протокол для подготовки и администрация стереотаксического аллогенной лимфоцитах человека иммунодефицитных мышей, перевозящих ортотопическая человека первичных опухолей головного мозга. Это исследование предоставляет доказательства в концепция как возможности, так и противоопухолевая эффективность intrabrain доставлены сотовой immunotherapies.
Abstract
Глиобластомы мультиформной (GBM), наиболее частые и агрессивной первичного мозга рак в взрослых, обычно ассоциируется с плохой прогноз, и скудные эффективной терапии были предложены за последнее десятилетие. Среди перспективных кандидатов для проектирования роман терапевтических стратегий сотовой immunotherapies были направлены для ликвидации весьма инвазивных и химио радиационно опухолевых клеток, вероятно, участвующих в быстрое и роковой рецидив этой рака. Таким образом, сменит аллогенной GBM-реактивной эффекторов иммунных клеток, таких как человека Vϒ9Vδ2 Т-лимфоцитов, вблизи опухоли будет представляет собой уникальную возможность предоставлять эффективные и высококонцентрированный терапевтических агентов непосредственно в сайт о злокачественных опухолей мозга. Здесь мы представляем протокол для подготовки и администрация стереотаксического аллогенной лимфоцитах человека иммунодефицитных мышей, перевозящих ортотопическая человека первичных опухолей головного мозга. Это исследование предусматривает доклинических доказательства в концепция как возможности, так и противоопухолевая эффективность этих клеточных immunotherapies, которые полагаются на стереотаксической инъекции аллогенной лимфоцитах человека в intrabrain опухоли кровати.
Introduction
GBM (который класс IV астроцитома), является наиболее частым и агрессивной первичного мозга рак в взрослых. Несмотря на агрессивные методы лечения, которые сочетают хирургии и радио химиотерапии GBM остается связанной с очень плохим прогнозом (медиана выживаемости 14,6 месяца и 2-год смертности > 73%)1. Это свидетельствует, что были проверены несколько эффективных терапевтических достижений за последние десятилетия2. Среди кандидатов для разработки более эффективных терапевтических стратегий3,4,5immunotherapies6 в настоящее время изучаются для отслеживания и ликвидации очень инвазивных и радио/химио устойчивые опухоли клетки, предположительно для их ключевой вклад в быстрое и роковой опухоли рецидив7. Различные потенциальные иммунологические цели были выявлены и предложены для immunotherapies, связанных с естественной или модифицированных αβ или ϒδ Т-лимфоцитов как GBM-специфические антигены опухоли или стресс индуцированного молекул8,9, 10. Возможность администрировать выбранных GBM-реактивной иммунных клеток-эффекторов представляет собой уникальную возможность предоставлять повышенные количества эффекторные лимфоциты непосредственно на сайт остаточного злокачественности. Для поддержки этой стратегии, мы недавно показали, что модели, основанные на иммунодефицитных мышей, перевозящих ортотопическая первичной человека GBM ксенотрасплантатов добросовестно итог развития опухолей головного мозга в GBM больных9,11. Кроме того эти модели были использованы для демонстрации сильное противоопухолевое эффективность восприимчивую передаваемых аллогенной лимфоцитах человека Vϒ9Vδ2T.
Этот протокол описывает критических экспериментальные шаги для достижения Стереотаксическая immunotherapies опухолей головного мозга, например GBM, основанный на приемных передачи аллогенной Т-лимфоцитов. В статье показано: (i) усиление терапевтического аллогенной иммунной эффекторных T лимфоциты, например лимфоцитах человека Vϒ9Vδ2T; (ii подготовка этих эффекторных T-лимфоцитов для инъекций; (iii) процедура стереотаксической администрации в головном мозге, вблизи опухоли. Эта статья также обеспечивает понимание поведения этих клеточных эффекторов после стереотаксической инъекции.
Представленный здесь терапевтический подход основан на инъекции 20 x 106 эффекторные клетки за дозу для каждого мозга опухоль подшипник иммунодефицитных мыши. Первоначальный в vitro расширения необходимо производить большое количество иммунных клеток. Таким образом, неспецифичный клеток разложения выполняются с использованием фитогемагглютинина (ФГА-L) и облученных клеток аллогенной фидер: мононуклеаров периферической крови (получения) от здоровых доноров и EBV вирус Эпштейна Барр-трансформированных B-лимфобластоидных клеток линии (BLCLs), полученные от получения в vitro заражение EBV-содержащих культуры супернатанта от линии клеток игрунка B95-8, в присутствии 1 мкг/мл циклоспорина A.
GBM-реактивной эффекторные клетки иммунной системы сопоставляются и отобраны в vitro анализов9. Эти эффекторные клетки активируются и усиливаются с помощью стандартных протоколов, согласно их характера (например, человеческие Vγ9Vδ2 T лимфоциты9 или человека анти вирус αβ T лимфоциты12) с минимальной чистотой > 80%, как обычно проверены гранулярных анализа. Процедура расширения клеток, подробно ниже относится к различных лимфоцитов человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Процедура с участием животных предметам была выполнена согласно институциональных руководящих принципов (соглашение #00186.02; региональные Этический Комитет Луары [Франция]). Человека получения были изолированы от крови, собранные из информированных здоровых доноров (пели du Français Etablissement Нант, Франция). Все действия выполняются в стерильных условиях.
1. неспецифические расширение эффекторных цитотоксических Т-лимфоцитов
- Подготовить и излучают клетки фидера на 35 гр. Для стимуляции 2 x 105 - 4 x 105 эффекторных клеток, подготовьте 10 х 106 репликацию и 1 x 10-6 BLCLs из трех отдельных, здоровых доноров.
- Ресуспензируйте как фидер и эффекторные клетки в 15 мл RPMI, дополненная 10% тепло инактивированная FCS, 2 мм L-глютамином, пенициллин (100 МЕ/мл) и стрептомицин (0,1 мкг/мл) и 300 МЕ/мл рекомбинантного ИЛ-2.
- Добавить PHA-L в конечной концентрации 1 мкг/мл, тщательно перемешивают и распространять 150 мкл суспензии клеток в скважину в 96-Ну U-дном пластины.
- Инкубируйте при 37 ° C и с 5% CO2 в атмосфере увлажненной.
- Ежедневно проверять пластины до тех пор, пока крупноклеточный сгустки формы в скважинах культуры (~ 7 день).
- Перенесите клетки в культуре колбу в 1 x 106 клеток/мл в свежей питательной среды.
- Определение числа общей ячейки путем подсчета (2 недели) и поддерживать их на 1 х 106 клеток/мл в свежей питательной среды.
Примечание: Эффекторные клетки иммунной системы должны быть готовы к терапевтической администрации в состоянии покоя (обычно 3 недели после первоначального усиления стимулов). Чистота и реакционная способность этих клеток-эффекторов должны быть проверены до в vivo инъекции (например, с в vitro анализов).
2. предоперационная эффекторные клетки подготовка
- После проверки эффекторных клеток граф, собирайте эффекторных клеток в 50-мл пробирку центрифугированием (300 x g 5 мин).
Примечание: Чтобы компенсировать любые потери, подготовьте избыток клеток (например, 50 x 10-6). - Тщательно удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в 15 мл стерильной PBS и центрифуги для 5 мин на 300 x g для выполнения мыть.
- Тщательно и полностью удалить супернатант и затем Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл стерильного PBS.
- Передача ресуспензированы клетки в 1,5 мл микропробирок для центрифугирования в 300 x g за 5 мин.
- Тщательно и полностью удалите супернатант закупорить медленно.
- Ресуспензируйте Пелле клеток в 8 мкл стерильных PBS на мышь.
Примечание: Это важный шаг. - Измерьте объем суспензии клеток с помощью микропипеткой. При необходимости добавьте стерильные PBS (20 x 106 клеток в 15 мкл PBS на дозу) и тщательно перемешать.
- Проверьте, используя микропипеткой, что окончательный объем на мышь между 15 и 20 мкл (императивно < 20 мкл).
- Держите клетки на льду до стереотаксических инъекции.
Примечание: более 3-х timepoints не были проверены.
3. Стереотаксическая инъекций
-
Установка оборудования
- Соберите и калибровки малых животных стереотаксической рамы согласно инструкциям производителя, чтобы обеспечить точность внутричерепных инъекций (например, размер шприца, желаемый объем и скорость впрыска).
Примечание: Скорость медленная инфузия рекомендуется (т.е., 2-3 мкл/мин). - Установка материала под микробной безопасности кабинета (MSC) для сохранения стерильности инструментов и защиты мышей от инфекций.
Примечание: место «изотермический блоков» в водяной бане при температуре 37 ° C. Эта система ограничивает гипотермии мыши во время операции. Электрогрелки, которые необходимы для ухода после процедуры, должны использоваться в ходе мониторинга постоянной температуры.
- Соберите и калибровки малых животных стереотаксической рамы согласно инструкциям производителя, чтобы обеспечить точность внутричерепных инъекций (например, размер шприца, желаемый объем и скорость впрыска).
-
Предоперационная подготовка животных
- Анестезировать мышь с внутрибрюшинного введения кетамин (10 мг/мл) и ксилазина (0,1 мг/мл) на 10 мкл/г веса тела мыши.
- Выполните тест мыс щепотка для обеспечения полной анестезии и обезболивании животного.
Примечание: Любое движение является свидетельством анальгезии-глубокие, и, если это происходит, прежде чем повторять операцию требуется несколько минут. - После того, как мышь должным образом под наркозом, используйте ножницы, чтобы удалить мех с хирургической сайта (между двумя ушами, до носа).
-
Подготовка предоперационное клетки
- Тщательно Ресуспензируйте клетки с пипеткой (несколько раз) перед каждой инъекцией, чтобы предотвратить любую ячейку слипания.
- Аккуратно нарисуйте подвеска объем необходимых клеток (15-20 мкл) в 22-G microsyringe избежание аспирации пузырей.
Примечание: Этот шаг ячейки загрузки в microsyringe имеет важное значение для сведения к минимуму расхождения вводили томов. Перезагрузите ячейки для каждого индивидуального инъекций между процедурами, чтобы предотвратить любую ячейку слипания и обеспечить четное количество эффекторных клеток администрации в когорте. - Затем поместите шприц в адаптированных шприцевой насос.
-
Процедурные Уход
- Лечить хирургическим сайт с тампоны, пропитанные повидон йода 5% раствор по крайней мере 3 x.
- Место смазочное глазные мази в глаза мыши для предотвращения любого сушки роговицы.
- Положение наркотизированных мыши на стереотаксической рамы, на теплых изотермический блок покрыта стерильной полиэтиленовой пленкой для поддержания температуры мыши во время операции и ограничить уровень смертности.
Примечание: Нос мыши и зубы должны быть надлежащим образом расположены над панелью зуб, чтобы обеспечить адекватный поток дыхания во время процедуры. - Когда мышь находится над панелью зуб, затяните баров уха твердо под мышь уши обездвижить головы.
Примечание: Будьте осторожны, чтобы не повредить барабанные перепонки, или для нарушения дыхания. - Сделайте 1-2 см срединной Сагиттальный разрез стерильными ножницами вдоль верхней части черепа от впереди задней подвергать черепа.
- Определите пересечения сагиттальной и коронарного шва (Bregma) в качестве ориентиров для стереотаксической локализации до инъекции (показано на рис. 1).
- Место microsyringe выше этой точки.
- Переместите microsyringe правой боковой 2 и 0,5 мм передней Bregma.
- С помощью microdrill, сделайте небольшое отверстие в черепе с стерильных сверло в заданных координатах. Будьте осторожны, чтобы оставаться поверхностным во избежание любого травматического повреждения мозга.
Примечание: В настоящем Протоколе, иммунные клетки были введены в рамках установленных опухоли (одной недели после инъекции клеток опухоли). Кожа должна быть вновь (СКАР) и инъекции проводится в те же координаты, используемые для имплантации клеток опухоли (отверстие обычно все еще присутствует до 2 недель после инъекции). Для инъекций опухоли и эффекторных клеток в13,паренхимы мозга14были отобраны координаты.
-
Инъекции иммунных эффекторных клеток
- Осторожно вставьте microsyringe в просверленное отверстие и, медленно, вперед игла 3 мм в Дура вниз и затем обратно 0,5 мм до окончательного глубиной 2,5 мм до инъекционных эффекторных клеток.
- Инъекции эффекторных клеток на 2-3 мкл/мин и отслеживать мышей вдоль время впрыска.
- После инъекции, снять иглу для всего 1 мм и держать microsyringe на месте за дополнительную минуту перед медленно снятия полностью microsyringe, для предотвращения любой утечки из сайта инфузии.
Примечание: После удаления животного от стереотаксической устройства, немедленно очистите инъекционное оборудование для предстоящих экспериментов.
-
Послеоперационный уход и последующие мыши
- Удаление животное от стереотаксической рамы и немедленно применить повидон йода 5% раствора на сайте разрез и закрыть кожи с соответствующей шовного.
- Применять гель 2% лидокаин непосредственно на рану и администрировать 0,15 мкг/г бупренорфина подкожно после процедуры анальгезии.
- Место обратно наркотизированных мыши к своей клетке выше грелку набор до 37 ° C для поддержания температуры тела соответствующие мышь и избежать любых гипотермии.
Примечание: Отдельные жилье не является необходимым. - Контролировать мыши до тех пор, пока он полностью оправился от наркоза и передать его на помещение для жилья.
Примечание: На сегодняшний день этот протокол хорошо поддерживается несколько непредвиденные осложнения имели место (< 5% от введенного мышей). - Ежедневно контролировать мышей и усыпить их, когда наблюдаются признаки снижения здоровья (например, Сгорбленная осанка, ограниченной подвижностью, прострация или значительное Потеря веса [≥ 15%]).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Это исследование описывает стратегию передачи приемным клеточных иммунных эффекторных клеток в головном мозге опухоли нося мышей, основанный на стереотаксической инъекции непосредственно в опухоль кровати.
Чтобы свести к минимуму любой риск ушиба мозга, связанные с Томом большой инъекции, подвеска эффекторных клеток необходимо быть сосредоточены (20 x 106 клеток в 15-20 мкл PBS). Чтобы проверить, является ли этот шаг концентрации клеток может повлиять на жизнеспособность клеток-эффекторов, эти клетки были подготовлены согласно описанной протокол и загружаются в microsyringe. Эффекторных клеток были собраны сразу, или 10 мин после загрузки их в microsyringe. Клетки окрашивали пропидий йодидом (PI), флуоресцентный ДНК интеркалирующего агента, который не permeant жить клетки и анализирует проточной цитометрии в разных timepoints (0, 24 и 72 часа). Результаты показывают, что подготовка и загрузка в microsyringe не затрагивают существенно жизнеспособность клеток-эффекторов для по крайней мере за 24 часа (рисунок 2A и 2B). На 72 часа небольшие, но значительные, увеличение PIпозитивных клеток наблюдалось (14% по сравнению с 11% для выгрузки клетки). Аналогичным образом было проанализировано противоопухолевой реактивности эффекторных клеток, которые были подготовлены и сохранены на льду на 3 часа. Эффекторных клеток были cocultured с клетки опухоли мозга для 4 часов в присутствии МАБ анти CD107a. Upregulation маркер активации CD107a, аналогичное значению, полученных в условиях контроля, указывает, что реактивности эффекторных клеток не зависит от подготовки и загрузки в microsyringe (рис. 2 c).
Чтобы оценить ли эффекторных клеток выживать и перемещаться в пределах паренхимы мозга после их внутри опухолевой имплантацией эффектор 20 x 106 клеток вводили в опухоли мышей, перевозящих опухоли головного мозга (11GBM-1). Неделю спустя, мозги были собраны, фиксированные, секционных и окрашенных окраской гематоксилином и эозином, safran (ГЭС) и антигуманной CD3 МАБ (IHC). HES окраске определили структуру опухоли головного мозга (рис. 3, Левая панель). Пятнать CD3 выявлены и локализованные эффекторных иммунных Т-лимфоцитов (здесь, человеческие клетки Vϒ9Vδ2 T) (рис. 3, правая панель). Интересно, что эффекторных Т-лимфоцитов были обнаружены вокруг опухоли (рис. 3, верхней правой панели), в ядре опухоли (рис. 3, средний правой панели), но и в контралатеральной полушарии (рис. 3, Нижняя правая). Кроме того функция человека Т-лимфоцитов, изолированные от мозга мыши 48 часов после их введения (4 x 10-6 αβ Т-клетки), которые представляют 2% клеток мозга, был проанализирован. Результаты показывают, что собранные мозга вводят эффекторных клеток аллогенной αβ T расширить и размножаться на неспецифические PHA-фидер клетки активации выполняется в присутствии Ил-2 (рис. 4).
Вместе эти результаты показывают, что клеток-эффекторов Т подготовленного и управляются в соответствии с этими процедурами выжить для часов в мозге и могут патрулировать внутри опухоли и тканях здорового мозга. Эти процедуры используются для оценки эффективности противоопухолевой терапевтического стереотаксической администраций аллогенных клеток человека упокоения Vϒ9Vδ2 T для управления развития человеческого мозга опухоли GBM9,11. Эти исследования доказательств, что инъекции аллогенной человека эффекторных Т лимфоцитов в постели опухоли значительно улучшить выживаемость мышей проведение мозговых опухолей. Интересно, что выжившие мышей не имеют обнаружению опухолевых клеток, показывая тем самым, неприятие полное опухоли.
Рисунок 1 : Представление о главных анатомических ориентиров на мыши черепа. Это включает в себя Сагиттальная (красная линия) и швы корональный (синяя линия) и их пересечения (Bregma) используется для ориентации на месте инъекции. Указывается, шкалы бар. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Выживание и активация подготовленного эффекторных T лимфоциты. Эффекторные клетки (здесь отдыхает человека периферийные клетки Vϒ9Vδ2 T) были усилены и подготовлен в соответствии с описанной процедурой. Окрашивание лимфоцитов с пропидий йодидом (PI), ДНК, интеркалирующие флуоресцентные соединение, которое не permeant жить клетки и функциональной активации были исполнены. (A) Эта панель показывает представительный участок вперед (FSC-H) против стороны (SSC-H) блуждающий стробирования эффекторные лимфоциты (Левая панель). Гистограмма показывает, окрашивание PI закрытого управления лимфоцитов (правая панель). Указывается число Пиположительные лимфоциты. (B) Эта группа показывает процент мертвых лимфоцитов (PIположительные) собраны сразу (светло синяя линия) или после 10 мин (темно-синяя линия) в microsyringe, измеренные на указанных timepoints. Как управления, были использованы выгружен подготовленных клетки (серая линия). (n = 3; означает ± SD; НС = не значительные.) (C) CD107a поверхности мобилизации измерялась проточной цитометрии на клетки по управления либо Vδ2положительные (неподготовленного) или подготовленных лимфоцитов, поддерживается на льду (подготовленные + 3 h) после coculture с целевой первичного мозга человека опухолевых клеток. В каждом квадранте гранулярных указывается процент лимфоцитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Обнаружение и локализация эффекторных T-лимфоцитов в мозг опухоль подшипник мышей. Через одну неделю после глиобластома мозга опухоли имплантация, эффекторные клетки иммунной системы (здесь отдыхает человека периферийные клетки Vϒ9Vδ2 T) были введены в мозг мышей. Через одну неделю после иммунотерапевтических лечения, мозги были собраны, фиксированной и секционного. Мозг разделы были цветные для иммуногистохимии анализа (гематоксилином эозином и окраска safran [ГЭС]), (Левая панель) или окрашенных с антинародным антитела CD3 (правая панель). Результаты показали, представитель трех независимых экспериментов. Указывается, шкалы бар.
Рисунок 4 : Активация эффекторных T-лимфоцитов собранные от мозга обработанных мышей. Покоя человеческий Т-лимфоцитов (здесь, 4 x 10-6 человека αβ T лимфоциты) вводили в мозг мышей ГЯП. После 48 часов мозги были собраны и отделить. Процент человека Т-лимфоцитов, проникают в мозг был измерен проточной цитометрии, используя Антитело CD3 анти человека (нанижней панели). Собранные клетки были посеяны (10 клеток/а) в 96-Ну U-дном пластины и стимулировали (PHA-фидер клетки и IL-2) за 20 дней (16 удвоение циклов). Обратите внимание, на день 10, 13,3 x 106 человека Т-лимфоцитов были получены (правая панель).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Приемных передача выбранных родной или инженерных иммунной эффекторных клеток представляет собой перспективный подход для эффективного лечения опухолей, таких как инфильтративный мозга рак, заботясь о ограничения определено против-трансформированных клеток15, 16,17,18. Однако центральной нервной системы, которая включает мозга, имеет особое иммунный статус, особенно ввиду существования blood - brain барьер и отсутствие классических лимфодренаж системы19,20. Эти физиологические особенности влияют на ткани людьми и может нарушить системные инъекции иммунных клеток. Чтобы преодолеть эти препятствия, intraparenchymal инъекции были изучены на том принципе, что противоопухолевые клетки скорее локально доставляются, близко к опухоли, что касается микросферы, которые содержат фармакологических соединений21, 22. с одной стороны, ограниченные разрежения лимфоцитов в пределах органа может улучшить их противоопухолевая эффективность, но он может также усиливать вредных механических или опухоль адаптации эффекты, такие как тканевой сжатия, который разрабатывает вдоль мозга рост опухоли. Это означает, что эта процедура требует небольших объемов иммунотерапевтических инъекции. Эта проблема является еще более критической, в экспериментальных моделях животных, в котором мозга опухоли не вырезан хирургическим путем. Эта статья описывает терапевтический подход для подготовки и локальная доставка мозга опухоль – специфичные сотовой эффекторы, основанный на Стереотаксическая injection(s) аллогенной человеческий Т-лимфоцитов.
Это исследование показывает подготовки и стереотаксического доставки аллогенной человека Vϒ9Vδ2 Т-лимфоцитов в иммунодефицитных мышей ГЯП, перевозящих людей GBM ксенотрасплантатов. На первом этапе этот протокол описывает простой процедуры для усиления аллогенной Т-лимфоциты от получения здоровых доноров, используя стандартный неспецифических PHA-питатели IL2 стимуляции, который производит большое количество чистого эффекторных T лимфоциты, позволяя 23,их терапевтического использования24. Второй этап этой статьи направлен на подготовку покоящихся лимфоцитов T суспензий в день стереотаксического администрации. Особое внимание было уделено этот важный шаг, который требует высокой плотности клеточных, которое не должно затрагивать жизнеспособность и функция выбранного эффекторных T-лимфоцитов. Наконец, относительно в естественных условиях экспериментов, подготовка эффекторных T-лимфоцитов и их инъекции в ядре опухоли связано с их распространения, не только в пределах опухоли, но и в окружающих тканях мозга, подчеркнув их особую способность для патрулирования и отслеживать инвазивных опухолевых клеток. Важно отметить, что эти методы подготовки и инъекций сохраняют способность этих Т-лимфоцитов активируется в головном мозге после определенного признания опухолевых клеток мозга. В целом эти привлекательные характеристики конкретно обеспечить способность лимфоцитов T и эффективно целевых и ликвидации глубоко инфильтративный мозга опухолевых клеток, которые являются отличительной чертой GBM25. Следует отметить особое внимание должно быть принято во время инъекций и удаления microsyringe для сведения к минимуму любых поражения мозга или утечки эффекторных клеток.
В заключение эта статья описывает эффективная процедура для доставки больших объемов аллогенной человека противоопухолевых лимфоцитов, как отдыхает лимфоцитах человека Vϒ9Vδ2T, в непосредственной близости опухолей головного мозга. Важно отметить, что эта терапевтические процедуры не сопровождается неблагоприятные последствия перенесенных Т-лимфоцитов (например, жизнеспособность, реактивность) или на тканях мозга. Недавние исследования, основанные на моделях мышиных ортотопическая первичных человеческих GBM, продемонстрировали, что лимфоциты Vϒ9Vδ2T эффективно целевой GBM клеток, включая клетки опухоли, которые глубоко проникли паренхимы мозга9,11. Эти элементы открывают возможности для развития новых приемных T лимфоциты процедур передачи которые могут применяться в первую очередь в мышей, перевозящих ортотопическая опухоли головного мозга, а затем в клинических исследованиях в GBM больных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы благодарят сотрудников больницы университета животных фонда (ют) Нант для животноводства и ухода, клеточной и тканевой визуализации объекта ядра Нант университета (MicroPICell) для обработки изображений, и цитометрии фонда (Cytocell) от Нанта для их экспертной технической помощи. Эта работа финансировалась INSERM, CNRS, Université de Nantes, институт, Национальный du рака (Инка #PLBio2014-155), Национальная лига против le рака (AO межрегиональных 2017) и Европейский консорциум Transcan2 ERA-Net (Immunoglio). Команда финансируется фонд pour la Recherche Пущинский (DEQ20170839118). Эта работа осуществлялась в контексте LabEX МПО и IHU-Сести программ, поддержке национальных исследований агентства Investissements будущее через программы НРУ-11-LABX-0016-01 и АНР-10-IBHU-005, соответственно. IHU-Сести проект поддерживается также Нант Metropole и региона Луары. Авторы благодарят Рафия Chirine за помощь в исправлении рукопись.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBMCs | from 3 different healthy donors | ||
| BLCLs | from 3 different donors | ||
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Dutscher | S1810-500 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| IL-2 | Novartis | proleukin | |
| PHA-L | Sigma | L4144 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51600 | |
| Mouse adaptator for stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51624 | |
| microsyringe pump injector | WPI | UMP3-4 | |
| NanoFil Syringe | WPI | NF34BV-2 | |
| NSG mice | Charles River | NSGSSFE07S | |
| Ketamine | Merial | Imalgène 1000 | |
| Xylazine | Bayer | Rompur 2% | |
| Scissors | WPI | 201758 | |
| Forceps | WPI | 501215 | |
| OmniDrill 115/230V | WPI | 503598 | |
| Vicryl 4-0 | Ethicon | VCP397H | |
| Xylocaine | Astrazeneca | 3634461 |
References
- Stupp, R., Roila, F. Malignant glioma: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up. Annals of Oncology. 20 Suppl 4, 126-128 (2009).
- Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma--are we there yet? Neuro-Oncology. 15 (1), 4-27 (2013).
- Chen, S. H., Shine, H. D., Goodman, J. C., Grossman, R. G., Woo, S. L. Gene therapy for brain tumors: regression of experimental gliomas by adenovirus-mediated gene transfer in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (8), 3054-3057 (1994).
- Choi, P. J., Tubbs, R. S., Oskouian, R. J. Emerging Cellular Therapies for Glioblastoma Multiforme. Cureus. 10 (3), e2305 (2018).
- Zhu, L., et al. Targeting and Therapy of Glioblastoma in a Mouse Model Using Exosomes Derived From Natural Killer Cells. Frontiers in Immunology. 9, 824 (2018).
- Chung, D. S., Shin, H. J., Hong, Y. K. A new hope in immunotherapy for malignant gliomas: adoptive T cell transfer therapy. Journal of Immunology Research. 2014, 326545 (2014).
- Vauleon, E., Avril, T., Collet, B., Mosser, J., Quillien, V. Overview of cellular immunotherapy for patients with glioblastoma. Clinical and Developmental Immunology. 2010, (2010).
- Brown, C. E., et al. Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy. The New England of Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).
- Jarry, U., et al. Stereotaxic administrations of allogeneic human Vgamma9Vdelta2 T cells efficiently control the development of human glioblastoma brain tumors. Oncoimmunology. 5 (6), e1168554 (2016).
- Dutoit, V., et al. Exploiting the glioblastoma peptidome to discover novel tumour-associated antigens for immunotherapy. Brain. 135 (Pt 4), 1042-1054 (2012).
- Joalland, N., et al. IL-21 Increases the Reactivity of Allogeneic Human Vgamma9Vdelta2 T Cells Against Primary Glioblastoma Tumors. Journal of Immunotherapy. 41 (5), 224-231 (2018).
- Clemenceau, B., et al. Effector memory alphabeta T lymphocytes can express FcgammaRIIIa and mediate antibody-dependent cellular cytotoxicity. The Journal of Immunology. 180 (8), 5327-5334 (2008).
- Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. Journal of Visualized Experiments. (57), e3403 (2011).
- Jarry, U., et al. Treg depletion followed by intracerebral CpG-ODN injection induce brain tumor rejection. Journal of Neuroimmunology. 267 (1-2), 35-42 (2014).
- June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
- Baruch, E. N., Berg, A. L., Besser, M. J., Schachter, J., Markel, G. Adoptive T cell therapy: An overview of obstacles and opportunities. Cancer. 123 (S11), 2154-2162 (2017).
- Bryant, N. L., et al. Characterization and immunotherapeutic potential of gammadelta T-cells in patients with glioblastoma. Neuro-Oncology. 11 (4), 357-367 (2009).
- Pereboeva, L., Harkins, L., Wong, S., Lamb, L. S. The safety of allogeneic innate lymphocyte therapy for glioma patients with prior cranial irradiation. Cancer Immunology, Immunotherapy. 64 (5), 551-562 (2015).
- Bailey, S. L., Carpentier, P. A., McMahon, E. J., Begolka, W. S., Miller, S. D. Innate and adaptive immune responses of the central nervous system. Critical Reviews in Immunology. 26 (2), 149-188 (2006).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
- Menei, P., et al. Local and sustained delivery of 5-fluorouracil from biodegradable microspheres for the radiosensitization of glioblastoma: a pilot study. Cancer. 86 (2), 325-330 (1999).
- Menei, P., et al. Stereotaxic implantation of 5-fluorouracil-releasing microspheres in malignant glioma. Cancer. 100 (2), 405-410 (2004).
- Salot, S., et al. Large scale expansion of gamma 9 delta 2 T lymphocytes: Innacell gamma delta cell therapy product. Journal of Immunological Methods. 326 (1-2), 63-75 (2007).
- Bennouna, J., et al. Phase-I study of Innacell gammadelta, an autologous cell-therapy product highly enriched in gamma9delta2 T lymphocytes, in combination with IL-2, in patients with metastatic renal cell carcinoma. Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (11), 1599-1609 (2008).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
