Summary
在这里, 我们提出了一项协议, 以制备和立体定向管理的异基因人淋巴细胞在 immunodeficient 小鼠携带原位人原发性脑肿瘤。本研究为 intrabrain 细胞免疫疗法的可行性和抗肿瘤疗效提供了概念验证。
Abstract
胶质瘤多形性 (肾小球) 是成人中最常见和最有攻击性的原发性脑癌, 通常与预后较差有关, 在过去十年中提出了缺乏有效的治疗方法。在设计新的治疗策略的有希望的候选者中, 细胞免疫疗法已被用来消除高度侵袭性和化疗放射抗拒肿瘤细胞, 可能涉及迅速和致命复发的癌症。因此, 在肿瘤附近的同种异体肾小球-反应性免疫细胞效应剂 (如人 vυ9vδ2 T 淋巴细胞) 的管理, 将是一个独特的机会, 以提供高效和高度集中的治疗药物直接进入脑恶性肿瘤现场。在这里, 我们提出了一项协议, 以制备和立体定向管理的异基因人淋巴细胞在 immunodeficient 小鼠携带原位人原发性脑肿瘤。本研究为这些细胞免疫疗法的可行性和抗肿瘤效果提供了一个临床前的概念证明, 它们依赖于 intrabrain 肿瘤床内的异基因人淋巴细胞的立体定向注射。
Introduction
肾小球 (IV. 型星形细胞瘤) 是成人最常见和最有攻击性的原发性脑癌。尽管有积极的治疗, 结合手术和射频化疗, 肾小球仍然与一个非常糟糕的预后 (中位存活率14.6 月和2年死亡率 > 73%)1。这一证据表明, 在过去十年2中, 没有有效的治疗进展得到证实。在设计更有效的治疗策略3,4,5, 免疫疗法6的候选者中, 目前正在探索追踪和消除高度侵入性和无线电/抗化疗肿瘤细胞, 怀疑他们的关键贡献迅速和致命的肿瘤复发7。对免疫疗法的各种潜在免疫指标进行了鉴定和建议, 涉及天然或改良的αβ或υδ T 淋巴细胞, 如肾小球特异肿瘤抗原或应力诱导分子8,9, 10。管理选定的肾小球活性免疫细胞效应器的可能性代表了一个独特的机会, 提供高数量的效应淋巴细胞直接进入残余恶性肿瘤的部位。为支持这一策略, 我们最近发现, 基于 immunodeficient 小鼠的同种异体肾小球移植的模型忠实地重述了肾小球肿瘤的发展9,11。此外, 这些模型被用来证明过继转输转移异体人 vυ9vδ2t 淋巴细胞的强抗癌功效。
本协议描述了在同种异体 T 淋巴细胞的移植基础上实现脑肿瘤立体定向免疫疗法的关键实验步骤。本文说明: (i) 治疗同种异体免疫效应 T 淋巴细胞 (如人 vυ9vδ2t 淋巴细胞) 的扩增;(ii) 制备注射用的这些效应 T 淋巴细胞;(iii) 大脑内立体定向管理的程序, 靠近肿瘤。本文还介绍了立体定向注射后这些细胞效应的行为。
这里提出的治疗方法是基于每剂量 20 x 106效应细胞为每个脑肿瘤-轴承 immunodeficient 鼠注射。一个初始的体外扩张步骤是需要产生大量的免疫细胞。因此, 非特异细胞扩张是使用 phytohemagglutinin (PHA L) 和辐照异基因饲养细胞: 外周血单个核细胞 (PBMCs) 的健康捐献者和 eb 病毒 (eb) 转换的 B-永生细胞线 (BLCLs), 从 PBMCs 的体外感染, 从狨 B95-8 细胞系的 eb 病毒的培养上清液中提取, 在1µg/毫升环孢素 a 的存在。
从体外测定9中比较和选择了肾小球活性效应免疫细胞。这些效应细胞的激活和放大使用标准协议, 根据其性质 (例如, 人类 Vγ9Vδ2 T 淋巴细胞9或人抗疱疹病毒αβ T 淋巴细胞12) 与最低纯度 > 80%, 例行由细胞分析检查。下面详述的细胞扩张程序适用于各种人类淋巴细胞子集。
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Protocol
下列涉及动物的程序是根据机构指南 (协议 #00186) 执行的. 02; 意大利 (法国) 的区域道德委员会人类 PBMCs 从知情的健康捐献者的血液中分离出来 (景区法国法国南特)。所有步骤都是在无菌条件下进行的。
1. 细胞毒性效应 T 淋巴细胞的非特异扩张
- 准备并照射35的馈线细胞。为刺激 2 x 105 -4 x 105个效应细胞, 准备 10 x 106 PBMCs 和 1 x 106 BLCLs 从三个不同, 健康捐赠者。
- 并用重悬15毫升 RPMI 中的饲养细胞和效应细胞, 辅以10% 热灭活 FCS、2毫米 l-谷氨酰胺、青霉素 (100 毫升/ml)、链霉素 (0.1 µg/毫升) 和300毫升/ml 重组 IL-2。
- 在最终浓度为1µg/毫升, 仔细混合, 并分配150µL 的细胞悬浮每井在96井 U 底板。
- 孵育在37°c 和与 5% CO2在一个湿润的大气。
- 每日检查板材直到大细胞团簇形成在养殖井 (~ 天 7)。
- 在新鲜培养基中将细胞转化为 1 x 106细胞/毫升的培养瓶。
- 通过计数 (每周 2x) 确定细胞总数, 并在新鲜培养基中保持 1 x 106细胞/毫升。
注意: 效应免疫细胞应准备好治疗管理的休息状态 (通常3周后, 最初的放大刺激)。在体内注射前应检查这些效应细胞的纯度和反应性 (如体外测定)。
2. 手术前效应细胞的制备
- 在检查效应细胞计数后, 通过离心 (300 x g 5 分钟) 收集50毫升管中的效应细胞。
注: 为弥补任何损失, 准备过量的细胞 (例如, 50 x 106)。 - 小心取出上清液, 在15毫升的无菌 PBS 和离心机中并用重悬细胞, 在 300 x g 5 分钟进行洗涤。
- 仔细和彻底清除上清, 然后并用重悬细胞颗粒在1毫升的无菌 PBS。
- 将悬浮细胞转移到一个1.5 毫升的微细中, 以 300 x g的离心为5分钟。
- 小心, 完全清除上清吹打缓慢。
- 并用重悬细胞颗粒在8µL 不育 PBS 每只老鼠。
注意: 这是一个关键步骤。 - 使用微测量细胞悬浮液的体积。如果需要, 添加无菌 pbs (20 x 106细胞在每剂量的 PBS 的15µL), 并仔细混合。
- 使用微检查, 每个鼠标的最终音量介于15和 20 ul 之间 (势在必行 < 20 µL)。
- 保持细胞在冰上, 直到立体定向注射。
注: 超过3小时 timepoints 未测试。
3. 立体定向注射
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设备安装
- 根据制造商的指示, 组装和校准小型动物立体定向框架, 以确保颅内注射的准确性 (如注射器大小、所需体积和注射率)。
注: 建议采用慢速输液 (即2-3 µL/分钟)。 - 在微生物安全柜 (MSC) 下安装材料, 以维持器械的不育, 保护小鼠不受感染。
注: 在37摄氏度的水浴中放置 "等温集团"。这个系统限制了小鼠在手术中的体温过低。加热垫, 这是必要的后程序护理, 必须使用在连续的温度监测。
- 根据制造商的指示, 组装和校准小型动物立体定向框架, 以确保颅内注射的准确性 (如注射器大小、所需体积和注射率)。
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手术前动物制剂
- 麻醉小鼠腹腔注射氯胺酮 (10 毫克/毫升) 和甲苯噻嗪 (0.1 毫克/毫升) 在10µL/克体重的鼠标。
- 执行脚趾捏试验, 以确保完全麻醉和镇痛的动物。
注意: 任何运动都是不深镇痛的征兆, 如果出现这种情况, 在重复手术前需要几分钟的时间。 - 一旦鼠标被正确麻醉, 使用剪刀从手术部位 (两个耳朵之间, 由鼻子) 去除皮毛。
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手术前细胞准备
- 在每次注射前用吸管 (几次) 仔细并用重悬细胞, 以防止细胞结块。
- 仔细绘制所需的细胞悬浮量 (15-20 µL) 到22克微量泵, 以避免气泡的渴望。
注意: 这个单元格加载步骤进入微量泵是很重要的, 以尽量减少差异的注入量。在程序之间重新加载每个单独注入的单元格, 以防止细胞聚集, 并确保队列中的效应细胞管理甚至数量。 - 然后, 把注射器放进适应的注射器泵中。
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程序护理
- 使用聚维酮碘5% 溶液浸泡的拭子对手术部位进行消毒, 至少3x。
- 在鼠标的眼睛里放一个润滑的眼膏, 防止角膜的任何干燥。
- 将麻醉的鼠标放在立体定向的框架上, 在一个温暖的等温块上, 覆盖着无菌塑料包装, 以维持在手术中的老鼠的体温, 并限制死亡率。
注: 鼠标的鼻子和牙齿应适当地放置在牙杆上方, 以确保在手术过程中有足够的呼吸流量。 - 一旦鼠标定位在牙杆上方, 将耳棒牢牢地拧紧在鼠标的耳朵下, 以固定头部。
注意: 小心不要破坏耳膜或损害呼吸。 - 用无菌剪刀在颅骨的上半部, 从前到后, 使头骨显露出 1-2 厘米中线矢状皮肤切口。
- 确定矢状和冠状缝线 (Bregma) 的交叉点, 作为注射前立体定向定位的地标 (如图 1所示)。
- 把微量泵放在这一点上。
- 移动微量泵2毫米右侧面和0.5 毫米前的 Bregma。
- 使用 microdrill, 在预定坐标处用无菌钻头在头骨上做一个小孔。小心保持肤浅, 以避免任何外伤的大脑。
注: 在本议定书中, 免疫细胞注射在一个已建立的肿瘤 (肿瘤细胞注射后一周)。皮肤应重新打开 (疤痕) 和注射是执行在同一坐标用于肿瘤细胞植入 (孔通常仍然存在2周后注射)。在脑实质13、14中为注射肿瘤和效应细胞选择了坐标。
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免疫效应细胞的注射
- 小心地将微量泵插入钻孔中, 缓慢移动, 将针3毫米向下的硬脑膜, 然后向后0.5 毫米到最后深度2.5 毫米之前注入效应细胞。
- 在 2-3 µL/分钟内运行效应细胞注射, 并在注射时间内监测小鼠。
- 一旦注射完成, 取出针仅1毫米, 并保持微量泵在一个额外的分钟, 然后慢慢地完全撤回微量泵, 以防止任何渗漏从输液现场。
注: 在将动物从立体定向装置移走后, 立即清洁注射设备进行实验。
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小鼠术后护理及随访
- 将动物从立体定向的框架中取出, 立即在切口部位应用聚维酮碘5% 溶液, 用适当的手术缝合闭合皮肤。
- 在伤口上直接应用2% 利多卡因凝胶, 用皮下注射治疗丁丙诺啡0.15 µg/克, 术后镇痛。
- 将被麻醉的老鼠放回它的笼子上面的加热垫设置为37°c, 以保持适当的老鼠体温和避免任何体温过低。
注: 不需要单独的住房。 - 监视鼠标直到它完全从麻醉中恢复, 并将其转移到一个住房室。
注意: 到目前为止, 该协议得到很好的支持, 因为很少发生意外并发症 (< 5% 的注射小鼠)。 - 每日监测小鼠和弄死, 当任何下降的健康迹象被观察 (例如, 驼背的姿势, 减少流动性, 虚脱, 或重大体重下降 [≥ 15%])。
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Representative Results
这项研究描述了在肿瘤携带的小鼠脑内进行细胞免疫效应细胞转移的策略, 其基础是直接在瘤床内进行的立体定向注射。
为了尽量减少与大注射量相关的脑损伤的风险, 需要将效应细胞悬浮液集中 (20 x 106细胞在 PBS 的 15-20 µL 中)。为了检查这个细胞浓度步骤是否可能影响效应细胞的生存能力, 这些细胞是根据所描述的协议, 并加载到微量泵。效应细胞立即收集, 或10分钟后加载到微量泵。细胞被染色碘碘化物 (PI), 一种荧光 DNA 锂剂, 不 permeant 活细胞和分析的流式细胞术在不同的 timepoints (0, 24, 72 小时)。结果表明, 微量泵的制备和加载对效应细胞的活性影响至少24小时 (图 2A和2B)。在72小时内, 观察到 PI阳性细胞的轻微但非显著增加 (14% 与被卸载细胞相比为 11%)。以类似的方式, 分析了在冰上制备和维持3小时的效应细胞的抗肿瘤活性。在 anti-CD107a 单克隆抗体的存在下, 效应细胞与脑肿瘤细胞共培养4小时。激活标记 CD107a 的上调, 类似于控制条件中获得的值, 表明效应细胞的反应性不受准备和加载到微量泵 (图 2C) 的影响。
为了评估效应细胞在肿瘤内植入后是否存活并在脑实质内移动, 20 x 106效应细胞被注射到携带脑肿瘤的小鼠肿瘤部位 (GBM-111)。一周后, 大脑被收集, 固定, 切片, 并染色的苏木精, 伊红, 和赛峰染色 (他) 和抗人 CD3 单克隆 (IHC)。他的着色确定了脑肿瘤的结构 (图 3,左面板)。CD3 染色识别和本地化的效应免疫 T 淋巴细胞 (这里, 人类 vυ9vδ2 t 细胞) (图 3,右面板)。有趣的是, 在肿瘤的核心 (图3,右上板), 在对侧半球 (图3 中, 观察到的效应 T 淋巴细胞被检测到瘤的周围 (图 3, 右上板),右下角面板)。此外, 还分析了48小时后从小鼠脑中分离出来的人 t 淋巴细胞 (4x106 αβ T 细胞) 的功能, 即2% 的脑细胞。结果表明, 采集的脑注射效应基因αβ T 细胞扩张和增殖后, 非特定的 IL-2 细胞激活的活化在存在的情况下 (图 4)。
这些结果表明, 根据这些程序制备和治疗的效应 T 细胞在大脑中存活数小时, 可以在肿瘤和健康的脑组织内进行巡逻。这些程序已被用于评估治疗的立体定向的人静止 vυ9vδ2 T 细胞的抗肿瘤效果, 以控制人肾小球脑肿瘤的发展9,11。这些研究表明, 在肿瘤床上注射异基因人效应 T 淋巴细胞能显著改善脑肿瘤小鼠的生存率。有趣的是, 幸存的老鼠没有携带可检测到的肿瘤细胞, 从而表明完全的肿瘤排斥。
图 1:在老鼠头骨上的主要解剖地标的图片.这包括矢状 (红线) 和冠状 (蓝线) 缝合和他们的交叉口 (Bregma) 用于定向的地方注射。显示刻度条。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 制备的效应 T 淋巴细胞的存活和活化.效应细胞 (这里, 休息的人外周 vυ9vδ2 T 细胞) 被放大和准备根据描述的过程。用碘碘 (PI) 染色淋巴细胞, 一种不 permeant 活细胞的 DNA 锂荧光化合物, 并进行功能活化。(A) 这个小组显示了一个有代表性的图 (FSC h)与侧面 (SSC h) 散射门的效应淋巴细胞 (左面板)。直方图显示门控控制淋巴细胞 (右面板) 的 PI 染色。显示 PI阳性淋巴细胞的百分比。(B) 本小组显示在微量泵中, 在所示的 timepoints 中, 立即收集的死淋巴细胞 (PI阳性) 百分比 (蓝线) 或10分钟 (深蓝色线)。作为控制, 被卸载的准备的细胞使用了 (灰色线)。(n = 3; 平均值 = 不显著)(C) CD107a 的表面动员是用流式细胞仪测量 Vδ2阳性对照细胞 (未准备好) 或在冰 (准备 + 3 h) 上维持的在共培养与靶向人原发性脑肿瘤细胞后进行的制备的淋巴细胞。每个细胞象限中都显示淋巴细胞的百分比。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 肿瘤小鼠脑内效应 T 淋巴细胞的检测和定位.一周后胶质瘤脑肿瘤植入, 效应免疫细胞 (这里, 休息的人外周 vυ9vδ2 T 细胞) 被注入到老鼠的大脑。免疫治疗治疗一周后, 大脑被收集、固定和切片。脑切片染色的免疫组化分析 (苏木精, 伊红, 和赛峰 [他] 着色) (左面板) 或染色抗人 CD3 抗体 (右面板)。结果表明, 三项独立实验具有代表性。显示刻度条。
图 4: 活化的作用 T 淋巴细胞从大脑中收集的治疗小鼠.静止的人 T 淋巴细胞 (在这里, 4 x 106人αβ T 淋巴细胞) 被注射到脑中的核细胞集团的老鼠。48小时后, 大脑被收集和分离。应用抗人 CD3 抗体 (下板) 测量流式细胞术测定人脑浸润 T 淋巴细胞的百分比。所采集的细胞在96井 U 底板上播种 (10 细胞/井), 并刺激 (IL-2) 20 天 (16 倍周期)。注意, 在10天, 获得了 13.3 x 106的人 T 淋巴细胞 (右面板)。
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Discussion
经选择的本机或工程免疫效应细胞的移植, 是有效治疗肿瘤的一种有希望的方法, 如浸润性脑癌, 注意限制活性对非转化细胞15, 16,17,18。然而, 包括大脑在内的中枢神经系统具有特殊的免疫状态, 特别是由于血脑屏障的存在以及缺乏典型的淋巴引流系统19、20。这些生理特征会影响组织的贩运, 并可能损害免疫细胞的全身注射。为了克服这些障碍, 脑实质注射液已经被探索的原则, 抗肿瘤细胞是相当当地提供, 与肿瘤部位紧密联系, 对于含有药理成分的微球21,22. 一方面, 器官内淋巴细胞的有限稀释可能会提高其抗肿瘤效率, 但也可以放大有害的机械或肿瘤适应效应, 如 tissular 压缩, 这是沿大脑发展的肿瘤生长。这意味着这个过程需要少量的免疫治疗注射。这一问题在动物实验模型中更为重要, 因为脑肿瘤不能手术切除。本文介绍了一种治疗方法, 以制备和局部交付的脑肿瘤特异细胞效应, 基于立体定向注射 (s) 异基因人 T 淋巴细胞。
本研究显示 immunodeficient 核细胞瘤小鼠携带人肾小球移植的异基因人 vυ9vδ2 T 淋巴细胞的制备和立体定向传递。该议定书的第一阶段描述了一个简单的程序, 以扩大来自健康捐赠者 PBMCs 的异基因 T 淋巴细胞, 使用标准非特异性 PHA-feeders-IL2 刺激, 产生大量的纯效应 T 淋巴细胞, 允许他们的治疗利用23,24。本文的第二阶段着重于在立体定向管理的当天准备休息 T 淋巴细胞悬浮液。在这一重要步骤上, 特别关注的是需要高细胞密度, 不应影响所选效应 T 淋巴细胞的生存能力和功能。最后, 对于活体实验, 在肿瘤核内制备效应 T 淋巴细胞及其注射液与它们的传播有关, 不仅在肿瘤内, 而且在周围的脑组织中, 突出其特别有能力巡逻和追踪侵袭性肿瘤细胞。重要的是, 这些制备和注射方法保留了这些 T 淋巴细胞在脑肿瘤细胞特定识别后在大脑中激活的能力。总之, 这些引人注目的特点, 确保 T 淋巴细胞的能力, 明确和有效地靶向和消除深浸润性脑肿瘤细胞, 这是一个标志的肾小球25。值得注意的是, 在注射和去除微量泵时必须特别注意, 以尽量减少任何脑部病变或效应细胞泄漏。
最后, 本文描述了一个有效的程序, 提供大量的同种异体人类抗肿瘤淋巴细胞, 如静止的人 vυ9vδ2t 淋巴细胞, 在脑肿瘤附近。重要的是, 这种治疗程序不伴有不良影响, 无论是对转移 T 淋巴细胞 (例如, 生存能力, 反应性) 或脑组织。最近的研究, 基于小鼠的原始人肾小球的原位模型, 表明 vυ9vδ2t 淋巴细胞有效靶向肾小球细胞, 包括肿瘤细胞已深入渗透脑实质9,11。这些因素为开发新的采用 T 淋巴细胞转移程序开辟了机会, 这一过程可以首次应用于携带原位脑肿瘤的小鼠身上, 然后在肾小球病患者的临床研究中。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢南特大学医院动物设施 (犹特人) 的工作人员畜牧和护理, 南特大学的细胞和 tissular 成像核心设施 (MicroPICell) 的成像, 和从南特的细胞术设施 (Cytocell)他们的专家技术援助。这项工作由 INSERM、CNRS、大学 de 南特、国立杜肿瘤研究所 (INCa#PLBio2014-155)、国家民族反癌症 (AO 区域间 2017) 和欧洲联盟时代网 Transcan2 (Immunoglio) 资助。这支队伍由研究所 Medicale (DEQ20170839118) 资助。这项工作是在 LabEX 监察员办公室和 IHU Cesti 方案的范围内实现的, 该项目分别由艾文莉和 ANR-11-LABX-0016-01 的国家研究机构 Investissements d ' ANR-10-IBHU-005 支助。IHU-Cesti 项目也支持南特都市和支付 la 卢瓦尔地区。作者感谢 Chirine Rafia 为改正手稿提供帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBMCs | from 3 different healthy donors | ||
| BLCLs | from 3 different donors | ||
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Dutscher | S1810-500 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| IL-2 | Novartis | proleukin | |
| PHA-L | Sigma | L4144 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51600 | |
| Mouse adaptator for stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51624 | |
| microsyringe pump injector | WPI | UMP3-4 | |
| NanoFil Syringe | WPI | NF34BV-2 | |
| NSG mice | Charles River | NSGSSFE07S | |
| Ketamine | Merial | Imalgène 1000 | |
| Xylazine | Bayer | Rompur 2% | |
| Scissors | WPI | 201758 | |
| Forceps | WPI | 501215 | |
| OmniDrill 115/230V | WPI | 503598 | |
| Vicryl 4-0 | Ethicon | VCP397H | |
| Xylocaine | Astrazeneca | 3634461 |
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