Summary
Aquí, presentamos un protocolo para la preparación y la administración estereotáxicas de linfocitos humanos alogénicos en ratones inmunodeficientes con los tumores cerebrales primarios humanos ortotópico. Este estudio proporciona una prueba de concepto para la viabilidad y la eficacia antitumoral de inmunoterapias celulares entregados intrabrain.
Abstract
Glioblastoma multiforme (GBM), el cáncer cerebral primario más frecuente y agresiva en los adultos, se asocia generalmente a un pronóstico pobre, y escasas terapias eficaces se han propuesto en la última década. Entre los candidatos prometedores para el diseño de estrategias terapéuticas novedosas, han sido objeto de inmunoterapias celulares para eliminar altamente invasiva y radiorresistente quimioterapia las células del tumor, probablemente involucrados en una recaída rápida y fatal de este cáncer. Así, administraciones de allogeneic efectores GBM-reactivo de células inmunitarias, como humanos Vϒ9Vδ2 los linfocitos T, en las proximidades del tumor representa una oportunidad única para ofrecer eficiente y altamente concentrado de agentes terapéuticos directamente en el sitio de tumores malignos de cerebro. Aquí, presentamos un protocolo para la preparación y la administración estereotáxicas de linfocitos humanos alogénicos en ratones inmunodeficientes con los tumores cerebrales primarios humanos ortotópico. Este estudio proporciona una prueba de concepto preclínica para la viabilidad y la eficacia antitumoral de estas inmunoterapias celulares que dependen de inyecciones de stereotactic de linfocitos alogénicos humanos en camas de tumor intrabrain.
Introduction
GBM (que grado astrocitoma IV), es el más frecuente y agresivo cáncer cerebral primario en adultos. A pesar de tratamientos agresivos que combinan cirugía y radio-quimioterapia, GBM permanece asociado con un pronóstico extremadamente pobre (supervivencia media de 14,6 meses y una mortalidad de 2 años > 73%)1. Esto pone en evidencia que algunos avances terapéuticos eficientes han sido validados en la última década2. Entre los candidatos para el diseño de estrategias terapéuticas más eficaces3,de4,5, inmunoterapias6 se exploran actualmente para rastrear y eliminar altamente invasivo y radio/quimioterapia-resistente del tumor células, sospechadas por su contribución clave a la rápida y fatal tumor recidiva7. Varios potenciales dianas inmunológicas fueron identificadas y propuestas para inmunoterapias, participación natural o αβ modificado o linfocitos de T ϒδ como GBM-antígenos específicos de tumor o moléculas inducidas por el estrés8,9, 10. La posibilidad de administrar efectores de células inmunitarias GBM-reactivo seleccionados representa una oportunidad única para entregar cantidades elevadas de linfocitos effector directamente en el sitio de la neoplasia residual. Para apoyar esta estrategia, hemos demostrado recientemente que los modelos basados en ratones inmunodeficientes con xenoinjertos GBM humanos primarios orthotopic fielmente recapitulan el desarrollo de tumores cerebrales en GBM pacientes9,11. Por otra parte, estos modelos fueron utilizados para demostrar la fuerte eficacia antitumoral de eventualmente transferidos linfocitos allogeneic de Vϒ9Vδ2T humanos.
Este protocolo describe los pasos experimentales críticos para el logro de las inmunoterapias estereotáxicas de tumores cerebrales, como el GBM, basado en la transferencia adoptiva de linfocitos T trasplante allogeneic. Se muestra en el artículo: (i) la amplificación de linfocitos efector inmune alogénico terapéutico T, como los linfocitos Vϒ9Vδ2T humanos; (ii) la preparación de estos linfocitos efectores T para inyección; (iii) el procedimiento para la administración estereotáxica en el cerebro, cerca del tumor. Este artículo también proporciona la penetración en el comportamiento de estos efectores celulares después de la inyección estereotáctica.
El enfoque terapéutico presentado aquí se basa en la inyección de 20 x 106 efectoras células por dosis para cada ratón inmunodeficiente de con tumores de cerebro. Un paso inicial en vitro expansión es necesaria para producir grandes cantidades de células inmunitarias. Por lo tanto, no específica de la célula expansiones se realizan con fitohemaglutinina (PHA-L) e irradiado células allogeneic alimentador: células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de donantes sanos y de células linfoblastoides de B transformada Epstein Barr Virus EBV líneas (BLCLs), derivadas de PBMCs en vitro infección con EBV contiene cultivo sobrenadante de la línea celular de Tití B95-8, en presencia de 1 μg/mL de ciclosporina-A.
Las células inmunes efectoras GBM-reactivo se comparan y seleccionadas en vitro ensayos9. Estas células efectoras se activan y amplificaron utilizando protocolos estándar, según su naturaleza (por ejemplo, humano de los linfocitos T Vγ9Vδ29 o virus humano del herpes αβ T linfocitos12) con una pureza mínima de > 80%, como habitualmente comprobado por análisis cytometric. El procedimiento de expansión celular detallado a continuación se aplica a varios subconjuntos de linfocitos humanos.
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Protocol
Los siguientes temas animales que procedimiento se realizó según las directrices (acuerdo #00186.02, Comité de ética regional de Pays de la Loire (Francia)). PBMCs humanos se aislaron de la sangre de donantes sanos informados (Etablissement Français du Sang Nantes, Francia). Todas las medidas se realizan bajo condiciones estériles.
1. expansión de inespecífica de los linfocitos citotóxicos efectores T
- Preparar e irradiar células de alimentador en 35 Gy. Para la estimulación de 2 x 105 - 4 x 105 células efectoras preparar PBMCs6 de 10 x 10 y 1 x 106 BLCLs de tres donantes distintos y saludables.
- Resuspender las células de alimentador y células efectoras en 15 mL de RPMI suplementado con 10% FCS inactivado con calor, 2 mM L-glutamina, penicilina (100 UI/mL) y estreptomicina (0.1 μg/mL) y 300 UI/mL IL-2 recombinante.
- Añadir PHA-L a una concentración final de 1 μg/mL, mezclar cuidadosamente y distribuir 150 μL de la suspensión de células por pocillo en placas de 96 pocillos fondo en U.
- Incubar a 37 ° C y con 5% CO2 en un ambiente humidificado.
- Comprobar diariamente la placa hasta células grandes agrupaciones se forman en los pozos de la cultura (~ día 7).
- Transferencia de las células en un frasco de cultivo 1 x 106 células/ml en medio de cultivo fresco.
- Determinar el número total de células por contar (2 x semana) y mantener en el 1 x 106 células/mL en medio de cultivo fresco.
Nota: Las células inmunes efectoras deben estar listas para la administración terapéutica en un estado de reposo (generalmente 3 semanas después del estímulo de amplificación inicial). La pureza y la reactividad de estas células efectoras deben comprobarse antes en vivo las inyecciones (por ejemplo, con ensayos en vitro ).
2. preparación de las células efectoras preoperatorio
- Después de comprobar el recuento de células efectoras, recoger las células efectoras en un tubo de 50 mL por centrifugación (300 x g durante 5 min).
Nota: Para compensar las pérdidas, prepararse un exceso de células (p. ej., 50 x 106). - Cuidadosamente Quite el sobrenadante y resuspender las células en 15 mL de PBS estéril y centrifugar durante 5 min a 300 x g para realizar el lavado.
- Cuidadosamente Quite el sobrenadante y luego Resuspender el precipitado de células en 1 mL de PBS estéril.
- La transferencia de las células resuspendidas en un microtubo de 1,5 mL para centrifugación a 300 x g durante 5 minutos.
- Cuidadosamente Quite el sobrenadante mediante pipeteo lentamente.
- Resuspender el precipitado de células en 8 μl de PBS estéril por ratón.
Nota: Este es un paso crítico. - Miden el volumen de la suspensión celular con una micropipeta. Si es necesario, añadir PBS estéril (20 x 106 células en 15 μl de PBS por dosis) y mezclar cuidadosamente.
- Comprobar, mediante una micropipeta, que el volumen final por ratón es entre 15 y 20 μL (obligatoriamente < 20 μl).
- Mantener las células en hielo hasta inyección estereotáctica.
Nota: los puntos de tiempo más de 3 h no fueron probados.
3. stereotactic inyección
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Equipo
- Montar y calibrar un pequeño marco estereotáctico animal según las instrucciones del fabricante para asegurar la exactitud de las inyecciones intracraneales (p. ej., jeringa tamaño, volumen y tasa de inyección).
Nota: Una tasa de infusión lenta se recomienda (es decir, 2-3 μl/min). - Instale el material debajo de un gabinete de la seguridad microbiana (MSC) para mantener la esterilidad de los instrumentos y protegen a los ratones contra infecciones.
Nota: lugar "bloques isotérmicos" en un baño de agua a 37 ° C. Este sistema limita la hipotermia de los ratones durante la cirugía. Cojines, que son necesarios para el cuidado posterior al procedimiento, la calefacción se debe utilizar durante el monitoreo continuo de la temperatura.
- Montar y calibrar un pequeño marco estereotáctico animal según las instrucciones del fabricante para asegurar la exactitud de las inyecciones intracraneales (p. ej., jeringa tamaño, volumen y tasa de inyección).
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Preparación preoperatoria de animales
- Anestesiar un ratón con una inyección intraperitoneal de ketamina (10 mg/mL) y xilacina (0,1 mg/mL) a 10 μl/g de peso corporal del ratón.
- Realizar una prueba del pellizco del dedo del pie para asegurar la completa anestesia y analgesia del animal.
Nota: Cualquier movimiento es una indicación de analgesia no profundo, y si eso ocurre, se requieren unos minutos más antes de repetir la operación. - Una vez que el ratón correctamente está anestesiado, use tijeras para quitar la piel del sitio quirúrgico (entre las dos orejas hasta la nariz).
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Preparación preoperatoria de la célula
- Con cuidado resuspender las células con una pipeta (varias veces) antes de cada inyección para evitar que cualquier célula aglutinación.
- Sacar cuidadosamente el volumen de suspensión celular requiere (15-20 μl) en la microjeringa de 22-G para evitar la aspiración de burbujas.
Nota: Este paso de la célula de carga en la microjeringa es importante para minimizar las variaciones en los volúmenes inyectados. Recarga las células para cada inyección individual entre los procedimientos para evitar que cualquier célula agrupar y para un número par de administración de las células efectoras en la cohorte. - Luego, coloque la jeringa en la bomba de jeringa adaptada.
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Atención procesal
- Desinfectar el sitio quirúrgico con torunda empapada en solución de povidona-yodo 5% por lo menos 3 x.
- Coloque un ungüento oftálmico lubricante en los ojos del ratón para prevenir cualquier sequedad de la córnea.
- Posición del ratón anestesiado en el marco estereotáctico, en un bloque isotérmico caliente cubierto con una envoltura de plástico estéril para mantener la temperatura del ratón durante la cirugía y limitar la mortalidad.
Nota: Nariz y los dientes del ratón deben estar apropiadamente colocados encima de la barra de dientes, para asegurar un flujo respiratorio adecuado durante el procedimiento. - Una vez que el ratón se coloca encima de la barra de dientes, apretar las barras oído firmemente debajo de orejas de ratón para inmovilizar la cabeza.
Nota: Tenga cuidado de no dañar los tímpanos o comprometer la respiración. - Hacer una incisión de piel sagital de línea media de 1-2 cm con las tijeras estériles a lo largo de la parte superior del cráneo de anterior a posterior para exponer el cráneo.
- Identificar la intersección de las suturas sagitales y coronales (Bregma) para servir como puntos de referencia para la localización estereotáctica antes de la inyección (se muestra en la figura 1).
- Lugar la microjeringa sobre este punto.
- Mueva la microjeringa 2 lateral derecha y anterior de la Bregma 0,5 mm.
- Usando una microperforadora, haga un pequeño agujero en el cráneo con una broca de taladro estéril en las coordenadas predeterminadas. Tenga cuidado de seguir siendo superficial para evitar cualquier lesión traumática del cerebro.
Nota: En este protocolo, se inyectaron células inmunes dentro de un tumor establecido (una semana después de la inyección de células de tumor). La piel debe ser reabierta (cicatriz) y la inyección se realiza en las mismas coordenadas que se utiliza para la implantación de células tumorales (el orificio es generalmente persiste hasta 2 semanas después de la inyección). Coordenadas fueron seleccionados para la inyección de células tumorales y efectoras en el parénquima cerebral13,14.
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Inyección de las células efectoras inmunes
- Introducir cuidadosamente la microjeringa en el orificio taladrado y, moviéndose lentamente, hacia adelante la aguja 3 mm abajo de la duramadre y luego hacia atrás 0.5 mm a una profundidad final de 2,5 mm antes de la inyección de las células efectoras.
- La inyección de células efectoras a 2-3 μl/min y vigilar los ratones a lo largo del tiempo de inyección.
- Una vez completada la inyección, retire la aguja de sólo 1 mm y mantenga la microjeringa en lugar por un minuto adicional antes de lentamente retirar completamente la microjeringa, para evitar cualquier fuga en el sitio de infusión.
Nota: Después de la eliminación de los animales desde el dispositivo estereotáctico, limpie inmediatamente el equipo de inyección para próximos experimentos.
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Cuidados postoperatorios y el seguimiento del ratón
- Quitar el animal del marco estereotáctico e inmediatamente aplicar solución de povidona-yodo al 5% en el sitio de incisión y cierre la piel con una sutura quirúrgica apropiada.
- Aplique el gel de lidocaína 2% directamente sobre la herida y administrar 0.15 μg/g de la buprenorfina por una inyección subcutánea para analgesia posterior al procedimiento.
- Lugar nuevo el ratón anestesiado a la jaula encima de un cojín de calefacción situado a 37 ° C para mantener la temperatura corporal de un ratón apropiado y evitar cualquier hipotermia.
Nota: No es necesario una carcasa separada. - Controlar el ratón hasta que es recuperado de la anestesia y traslado a una habitación de la vivienda.
Nota: Hasta la fecha, este protocolo es bien soportado como pocas complicaciones imprevistas han ocurrido (< 5% de los ratones inyectados). - Diario controlar los ratones y les eutanasia cuando se observan signos de salud decreciente (p. ej., postura jorobada, movilidad reducida, postración y pérdida de peso significativa [≥ 15%]).
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Representative Results
Este estudio describe la estrategia de transferencia adoptiva de células efectoras inmunes celulares en el cerebro de ratones portadores de tumor, basado en inyecciones estereotácticas realizadas directamente en la cama del tumor.
Para minimizar cualquier riesgo de lesión cerebral asociada a un volumen de inyección grande, la suspensión de células efectoras debe ser concentrada (20 x 106 células en 15-20 μl de PBS). Para comprobar si este paso de concentración celular podría afectar la viabilidad de las células efectoras, estas células fueron preparadas según el protocolo descrito y cargadas en la microjeringa. Las células efectoras se recogieron inmediatamente, o 10 minutos después de cargar en la microjeringa. Las células fueron teñidas con ioduro de propidio (PI), un agente intercalante fluorescente de ADN que no es florescente para vivir células y analizadas por citometría de flujo en diferentes puntos de tiempo (0, 24 y 72 horas). Los resultados muestran que la preparación y la carga en la microjeringa no afectan significativamente la viabilidad de las células efectoras durante al menos 24 horas (figura 2A y 2B). A las 72 horas, se observó un aumento leve pero no significativo, de las célulaspositivas de PI (14% frente al 11% para células de descargadas). De manera similar, se analizó la reactividad antitumoral de células efectoras que fueron preparados y mantenidos en hielo por 3 horas. Células efectoras se morfología con las células del tumor de cerebro durante 4 horas en presencia de un mAb anti-CD107a. La regulación al alza del marcador de activación CD107a, similar al valor obtenido en las condiciones de control, indica que la reactividad de las células efectoras no es afectada por la preparación y la carga en la microjeringa (figura 2).
Para evaluar si las células efectoras sobreviven y moverse dentro de la parenquimia del cerebro después de su implantación intra tumoral, efectoras de 20 x 106 células fueron inyectadas en el sitio del tumor de ratones portando un tumor cerebral (GBM 111). Una semana después, el cerebro se recolectaron, fijo, seccionado y manchados para la coloración de hematoxilina eosina y safran (HES) y anti-humano CD3 mAb (IHC). Coloración es identifica la estructura de los tumores cerebrales (figura 3, panel de la izquierda). La tinción de CD3 identificados y localizados los linfocitos de T inmunes efectoras (aquí, humanas células de T de Vϒ9Vδ2) (figura 3, panel derecho). Curiosamente, los linfocitos T efectores fueron detectados alrededor del tumor (figura 3, panel superior derecho), en la base del tumor (figura 3, panel central derecho), sino también en el hemisferio contralateral (figura 3, panel derecho inferior). Por otra parte, se analizó la función de linfocitos T humanos aislados del cerebro de ratón 48 horas después de su inyección (células de T del αβ de 4 x 106 ), que representan el 2% de las células del cerebro. Los resultados indican que recogidos efector cerebro inyectado allogeneic αβ T células ampliaran y proliferan con una activación de las células no específicas PHA-alimentador realizada en presencia de IL-2 (figura 4).
Juntos, estos resultados demuestran que las células efectoras T preparado y administrado bajo estos procedimientos sobreviven por horas en el cerebro y pueden patrullar dentro del tumor y los tejidos de cerebro sano. Estos procedimientos se han utilizado para evaluar la eficacia antitumoral de las administraciones stereotactic terapéuticas alogénicas humanas descansa Vϒ9Vδ2 de células de T para controlar el desarrollo de tumores cerebro humano GBM9,,11. Estas evidencias de estudios que inyecciones de linfocitos alogénicos humanos efectoras T en la cama del tumor mejoran significativamente la supervivencia de ratones con tumores cerebrales. Curiosamente, sobrevivir ratones no llevó las células tumorales detectables, lo que indica un rechazo de la completa del tumor.
Figura 1 : Foto de referencia anatómico en el cráneo de ratón. Esto incluye sagital (línea roja) y suturas coronales (línea azul) y su intersección (Bregma) utilizado para orientar el sitio de inyección. La barra de escala se indica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Supervivencia y la activación de los linfocitos efectores T preparan. Células efectoras (reposo, las células Vϒ9Vδ2 T periféricas humanas) fueron amplificados y elaborada según el procedimiento descrito. Tinción de linfocitos con yoduro de propidio (PI), realizaron un ADN intercalando compuesto fluorescente que no permeant a vivir las células y la activación funcional. (A) este panel muestra una parcela representativa de adelante (FSC-H) versus lateral (SSC-H) dispersión gating de linfocitos effector (panel de la izquierda). El histograma muestra tinción PI de linfocitos de control cerrada (panel derecho). Se indica el porcentaje de linfocitospositivos PI. (B) este panel muestra el porcentaje de linfocitos muertos (PIpositivas) recogido inmediatamente (linea azul) o después de 10 minutos (línea azul oscuro) en la microjeringa, medido en los horarios indicados. Como control, se utilizaron células preparadas descargadas (línea gris). (n = 3; media ± SD; ns = no significativo.) (C) CD107a movilización superficial fue medida por citometría de flujo en cualquier Vδ2 control las célulaspositivas (preparadas) o linfocitos mantenidos en hielo (preparado + 3 h) después de un cocultivo con células de tumor de cerebro primario humano objetivo. Se indica el porcentaje de linfocitos en cada cuadrante de citometría. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Detección y localización de los linfocitos efectores T dentro del cerebro de ratones con tumores de. Una semana después de glioblastoma cerebral implantación del tumor, las células inmunes efectoras (reposo, las células Vϒ9Vδ2 T periféricas humanas) fueron inyectadas en el cerebro de los ratones. Una semana después del tratamiento inmunoterapéutico, los cerebros fueron recogidos fijados y seccionados. Secciones del cerebro fueron coloreadas por análisis inmunohistoquímica (hematoxilina eosina y coloración de safran [HES]) (panel izquierdo) o teñidas con anti-CD3 anticuerpo (panel derecho). Los resultados mostrados son representativos de tres experimentos independientes. La barra de escala se indica.
Figura 4 : Activación de los linfocitos efectores T recogidos desde el cerebro de los ratones tratados. Descanso humano los linfocitos T (aquí, los linfocitos αβ humano T 4 x 106 ) fueron inyectados en el cerebro de los ratones de la NSG. Después de 48 horas, los cerebros fueron recogidos y disociados. El porcentaje de linfocitos T infiltrantes de cerebro humanos fue medido por citometría de flujo utilizando un anticuerpo anti-humana CD3 (panel inferior). Las células recogidas fueron sembradas (10 células/pocillo) en placas de 96 pocillos fondo en U y estimulada (PHA-alimentador células y IL-2) durante 20 días (16 ciclos de duplicación). Nota, el día 10, 13.3 x 106 de linfocitos T humanos se obtuvieron (panel derecho).
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Discussion
Una transferencia adoptiva de seleccionado nativa o las células efectoras inmunes ingeniería representa un enfoque prometedor para tratar eficazmente los tumores, como los cánceres de cerebro infiltrativa, teniendo cuidado de limitar reactividades contra las células no transformadas15, 16,17,18. Sin embargo, el sistema nervioso central, que comprende el cerebro, tiene un particular estado inmune, en particular debido a la existencia de la barrera hemato - encefálica y la falta de un sistema de drenaje linfático clásica19,20. Estas características fisiológicas afectan tejido tráfico y pudieran comprometer la inyección sistémica de células inmunes. Para superar estos obstáculos, intraparenchymal inyecciones han sido exploradas en el principio de que las células antitumorales se entregan algo localmente, cerca al sitio del tumor, en cuanto a microesferas que contienen compuestos farmacológicos21, 22. por un lado, la dilución limitada de linfocitos dentro del órgano puede mejorar su eficacia antitumoral, pero también pueden amplificar mecánico o tumor adaptación efectos deletéreos, como la compresión tisular, que se desarrolla a lo largo de cerebro crecimiento del tumor. Esto implica que este procedimiento requiere pequeños volúmenes de las inyecciones de inmunoterapia. Este problema es aún más crítico en modelos experimentales animales, en que cerebro tumores no pueden ser suprimidos quirúrgico. Este artículo describe un enfoque terapéutico para la preparación y la entrega local de efectores celulares tumorales de cerebro, basado en injection(s) estereotáctica de linfocitos T humanos alogénicos.
Este estudio muestra la preparación y la entrega estereotáxicas de linfocitos alogénicos de Vϒ9Vδ2 T humanos en ratones inmunodeficientes NSG llevar humanos xenoinjertos GBM. La primera etapa de este protocolo describe un sencillo procedimiento para amplificar allogeneic linfocitos T de PBMCs de donantes sanos, utilizando un estímulo de PHA-alimentadores-IL2 estándar que produce grandes cantidades de linfocitos efectores puro T, permitiendo su utilización terapéutica23,24. La segunda etapa de este artículo se centra en la preparación de suspensiones de linfocitos T en reposo en el día de la administración estereotáxicas. Especial atención se puso en este paso tan importante que requiere una alta densidad celular que no debe afectar la viabilidad y la función de los linfocitos efectores seleccionados T. Finalmente, con respecto a experimentos en vivo , la preparación de los linfocitos efectores T y su inyección dentro de la base del tumor se asocia con su difusión, no sólo dentro del tumor sino también en los tejidos circundantes del cerebro, destacando su capacidad particular para patrullar y para rastrear las células del tumor invasivo. Lo importante, estos métodos de preparación e inyección conservan la capacidad de estos linfocitos T activado dentro del cerebro a un reconocimiento específico de células del tumor de cerebro. En conjunto, estas características convincentes aseguran específicamente la capacidad de los linfocitos T a y eficiente apuntan y eliminan las células tumorales de cerebro profunda infiltrante que son un sello de GBM25. De nota, especial cuidado debe tenerse durante la inyección y la extracción de la microjeringa para reducir al mínimo cualquier lesión del cerebro o célula efectora tiene fugas.
En conclusión, este artículo describe un procedimiento eficiente para la entrega de grandes cantidades de linfocitos humanos allogeneic del antitumorales, como descanso los linfocitos Vϒ9Vδ2T humanos, en las proximidades de los tumores cerebrales. Lo importante, este procedimiento terapéutico no es acompañado con efectos adversos en los linfocitos de T transferidos (p. ej., viabilidad, reactividad) o en los tejidos del cerebro. Estudios recientes, basados en modelos Murino ortotópico de GBM humana primaria, han demostrado que los linfocitos Vϒ9Vδ2T objetivo eficientemente células GBM, incluyendo las células tumorales que han infiltrado profundamente en el cerebro parénquima9,11. Estos elementos abren oportunidades para el desarrollo de la novela adoptivos T linfocitos procedimientos de transferencia que se podría aplicar en primera instancia en ratones con tumores cerebrales de orthotopic y, luego, en los estudios clínicos en pacientes GBM.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen al personal del Hospital de la Universidad animal (UTE) de Nantes para la cría de animales y cuidado, celular y tisular de instalaciones centrales de la Universidad de Nantes (MicroPICell) de la proyección de imagen para la proyección de imagen y la citometría (Cytocell) de Nantes por su asistencia técnica experta. Este trabajo fue financiado por el INSERM, CNRS, Université de Nantes, Institut National du Cancer (INCa #PLBio2014-155), Ligue Nationale contre le cáncer (AO 2017 InterRegional) y el consorcio europeo ERA-Net Transcan2 (Immunoglio). El equipo está financiado por la Fundación pour la Recherche Medicale (DEQ20170839118). Este trabajo fue realizado en el contexto de la empresa LabEX IGO y los programas de IHU-Cesti, apoyado por la nacional investigación Agencia Investissements Avenir a través de los programas de ANR-11-LABX-0016-01 y ANR-10-IBHU-005, respectivamente. El proyecto IHU-Cesti es apoyado también por Nantes Metropole y la región de Pays de la Loire. Los autores agradecen Chirine Rafia para proporcionar ayuda en la corrección del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBMCs | from 3 different healthy donors | ||
| BLCLs | from 3 different donors | ||
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Dutscher | S1810-500 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| IL-2 | Novartis | proleukin | |
| PHA-L | Sigma | L4144 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51600 | |
| Mouse adaptator for stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51624 | |
| microsyringe pump injector | WPI | UMP3-4 | |
| NanoFil Syringe | WPI | NF34BV-2 | |
| NSG mice | Charles River | NSGSSFE07S | |
| Ketamine | Merial | Imalgène 1000 | |
| Xylazine | Bayer | Rompur 2% | |
| Scissors | WPI | 201758 | |
| Forceps | WPI | 501215 | |
| OmniDrill 115/230V | WPI | 503598 | |
| Vicryl 4-0 | Ethicon | VCP397H | |
| Xylocaine | Astrazeneca | 3634461 |
References
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