Summary
Här presenterar vi ett protokoll för beredning och stereotaxic administrering av allogena humana lymfocyter i nedsatt immunförsvar möss bära ortotop människans primära hjärntumörer. Denna studie ger en proof-of-concept för både genomförbarheten och antitumöreffekt effekten av intrabrain-levererade cellulär immunterapi.
Abstract
Glioblastoma multiforme (GBM), den mest frekventa och aggressiva primär hjärncancer hos vuxna, är vanligtvis associerad med dålig prognos, och knappa effektiva behandlingar har föreslagits under det senaste decenniet. Bland de lovande kandidaterna för att utforma nya terapeutiska strategier, cellulär immunterapi har varit föremål för att eliminera mycket invasiva och kemo-radioresistant tumörceller, sannolikt involverade i snabba och dödliga återfall av denna cancer. Således, organisation av allogena GBM-reaktivt immunceller effektorer, såsom mänskliga Vϒ9Vδ2 T-lymfocyter, i närheten av tumören skulle innebär en unik möjlighet att leverera effektiva och högkoncentrerad terapeutiska medel direkt till de webbplats av hjärnan maligniteter. Här presenterar vi ett protokoll för beredning och stereotaxic administrering av allogena humana lymfocyter i nedsatt immunförsvar möss bära ortotop människans primära hjärntumörer. Denna studie ger ett prekliniskt proof-of-concept för både genomförbarheten och antitumöreffekt effekten av dessa cellulär immunterapi som förlitar sig på stereotaktisk injektioner av allogena humana lymfocyter inom intrabrain tumör sängar.
Introduction
GBM (som grad IV astrocytom), är den mest frekventa och aggressiva primär hjärncancer hos vuxna. Trots aggressiva behandlingar som kombinerar kirurgi och radio-kemoterapi, förblir GBM associerade med en extremt dålig prognos (median överlevnad på 14.6 månader och en 2-år-dödlighet > 73%)1. Detta utvisar att några effektiva terapeutiska framsteg har validerats över det senaste decenniet2. Bland kandidaterna för utformningen av effektivare behandlingsstrategier3,4,5, är immunterapier6 för närvarande utforskas för att spåra och eliminera mycket invasiva och radio/chemo-resistent tumör celler, misstänks för deras viktiga bidrag till snabb och dödlig tumör återfall7. Olika potentiella immunologiska mål var identifierade och föreslagna för immunterapier, med naturlig eller modifierad αβ eller ϒδ T-lymfocyter som GBM-specifik tumör antigener eller stressinducerade molekyler8,9, 10. Möjlighet att administrera valda GBM-reaktivt immunceller effektorer representerar en unik möjlighet att leverera förhöjda mängder ljudeffektläget lymfocyter direkt in platsen för resterande malignitet. För att stödja denna strategi, har vi nyligen visat att modeller baserade på nedsatt immunförsvar möss bära ortotop primära mänskliga GBM xenograft troget sammanfatta utvecklingen av hjärntumörer i GBM patienter9,11. Dessutom användes dessa modeller för att demonstrera adoptively överförda allogen humana Vϒ9Vδ2T lymfocyter stark antitumöreffekt effektivitet.
Det här protokollet beskriver de kritiska experimentella steg för att uppnå stereotaktisk immunterapier av hjärntumörer, såsom GBM, baserat på överföringen av allogena T-lymfocyter. Artikel visar: (i) förstärkning av terapeutiska allogen immun effektor T-lymfocyter, såsom humana Vϒ9Vδ2T lymfocyter; (ii) utarbetande av dessa effektor T-lymfocyter för injektion; (iii) förfarandet för stereotaktisk administration inom hjärnan, nära tumören. Denna artikel ger också inblick i uppförandet av dessa cellulära effektorer efter stereotaktisk injektion.
Den terapeutiska metoden som presenteras här bygger på injektion av 20 x 106 effektor celler per dos för varje hjärnan tumör-bärande nedsatt immunförsvar mus. En inledande in vitro- expansion steg krävs för att producera stora mängder immunceller. Därför icke-specifik cell expansioner utförs med phytohemagglutinin (PHA-L) och bestrålade allogen feeder celler: perifera-mononukleära blodceller (PBMC) från friska donatorer och Epstein Barr Virus EBV-omvandlad B-lymfoblastoida celler linjerna (BLCLs), härstammar från PBMC genom in vitro- infektion med EBV-innehållande kultur supernatant från Goeldisapa B95-8 cell-linjen, i närvaro av 1 µg/mL ciklosporin-A.
GBM-reaktivt effektor immunceller jämförs och utvalda från in vitro- analyser9. Dessa effektor celler aktiveras och förstärks med hjälp av standardprotokoll, enligt sin natur (t.ex., humant Vγ9Vδ2 T lymfocyter9 eller mänskligt anti herpes virus αβ T lymfocyter12) med en lägsta renhetsgrad av > 80%, som rutinmässigt kontrolleras av flödescytometrisk analys. Cell expansion proceduren nedan gäller olika mänskligt lymfocyter delmängder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Följande förfarande som inbegriper animaliska ämnen utfördes enligt institutionella riktlinjer (avtal nr 00186.02; regionala etikkommittén i Pays de la Loire [Frankrike]). Mänskliga PBMC isolerades från blod som samlats in från informerade friska donatorer (Etablissement Français du Sang Nantes, Frankrike). Alla åtgärder utförs under sterila förhållanden.
1. icke-specifik Expansion av cytotoxiska effektor T-lymfocyter
- Förbereda och bestråla feeder celler på 35 Gy. För stimulering av 2 x 105 - 4 x 105 effektor celler, förbereda 10 x 106 PBMC och 1 x 106 BLCLs från tre distinkta, friska donatorer.
- Återsuspendera både feeder och effektor celler i 15 mL RPMI kompletteras med 10% Värmeinaktiverade FCS, 2 mM L-glutamin, penicillin (100 IE/mL), och streptomycin (0.1 µg/mL) och 300 IE/mL rekombinant IL-2.
- Lägg till PHA-L med en slutlig koncentration på 1 µg/mL, blanda omsorgsfullt och fördela 150 µL cellsuspension per brunn i 96 brunnar flerbrunnsplattor.
- Inkubera vid 37 ° C och med 5% CO2 i en fuktad atmosfär.
- Dagligen kontrollera plattan tills stora cell klumpar form i kultur brunnarna (~ dag 7).
- Och över cellerna till en kultur på 1 x 106 celler/mL i färskt odlingssubstrat.
- Bestämma antalet totala cell genom att räkna (2 x per vecka) och underhålla dem på 1 x 106 celler/mL i färskt odlingssubstrat.
Obs: Effektor immunceller bör vara redo för den terapeutiska administrering vid vilotillstånd (vanligen 3 veckor efter första förstärkning stimulans). Renhet och Reaktiviteten hos dessa effektor celler bör kontrolleras före i vivo injektioner (t.ex., med in vitro- analyser).
2. preoperativ effektor celler förberedelse
- Efter kontroll det effektor celltalet, samla effektor cellerna i en 50 mL tub genom centrifugering (300 x g för 5 min).
Obs: För att kompensera för eventuella förluster, förbereda ett överskott av celler (t.ex., 50 x 106). - Försiktigt avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 15 mL steril PBS och Centrifugera under 5 minuter vid 300 x g för att utföra tvätten.
- Noggrant och fullständigt avlägsna supernatanten och återsuspendera sedan cellpelleten i 1 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning.
- Överföra de återsuspenderade cellerna i en 1,5 mL mikrorör för centrifugering vid 300 x g i 5 min.
- Noggrant och helt ta bort supernatanten genom pipettering långsamt.
- Återsuspendera cellpelleten i 8 µL sterilt PBS per mus.
Obs: Detta är ett kritiskt steg. - Mäta volymen av cellsuspensionen med hjälp av en mikropipett. Om det behövs tillsätt steril fosfatbuffrad Koksaltlösning (20 x 106 celler i 15 µL av PBS per dos) och blanda noga.
- Kontrollera med hjälp av en mikropipett, som den slutliga volymen per mus är mellan 15 och 20 μL (ovillkorligen < 20 µL).
- Hålla cellerna på is tills stereotaktisk injektion.
Obs: mer än 3 h tidpunkter testades inte.
3. stereotaktisk injektion
-
Utrustning set-up
- Montera och kalibrera en liten djur stereotaktisk ram enligt tillverkarens instruktioner för att säkerställa riktigheten av intrakraniell injektioner (t.ex., spruta storlek, önskad volym och hastighet av injektion).
Obs: En långsam infusionshastighet rekommenderas (dvs2-3 µL/min). - Installera materialet under en mikrobiell säkerhetsskåp (MSC) att upprätthålla sterilitet av instrumenten och skydda mössen från infektioner.
Obs: plats ”isotermiska block” i ett vattenbad vid 37 ° C. Detta system begränsar hypotermi möss under operationen. Värmedynor, som är nödvändiga för efter ingrepp vård, måste användas under kontinuerlig temperaturövervakning.
- Montera och kalibrera en liten djur stereotaktisk ram enligt tillverkarens instruktioner för att säkerställa riktigheten av intrakraniell injektioner (t.ex., spruta storlek, önskad volym och hastighet av injektion).
-
Preoperativ djur förberedelse
- Söva en mus med en intraperitoneal injektion av ketamin (10 mg/mL) och xylazin (0,1 mg/mL) vid 10 µL/g kroppsvikt av musen.
- Utför en tå nypa test för att säkerställa fullständig anestesi och analgesi av djuret.
Obs: Någon rörelse är en indikation på icke-djupt analgesi och, om det inträffar några minuter krävs innan du upprepar åtgärden. - När musen är ordentligt sövda, använd sax för att ta bort päls från operationssåret (mellan två öron, upp till näsan).
-
Preoperativ cell förberedelse
- Noggrant att resuspendera cellerna med en pipett (flera gånger) före varje injektion för att förhindra att någon cell som klumpar.
- Försiktigt dra volymen krävs cell suspension (15-20 µL) i den 22-G mikrosprutan att undvika aspiration av bubblor.
Obs: Denna cell-lastning steg in i mikrosprutan är viktigt att minimera avvikelser i injicerade volymer. Ladda celler för varje enskild injektion mellan förfaranden för att förhindra att någon cell som klumpar och för att säkerställa ett jämnt antal effektor celler administration i kohorten. - Sedan placera sprutan i anpassade sprutpumpen.
-
Processuella vård
- Desinfektera operationsområdet med kompresser indränkt i povidonjod 5% lösning minst 3 x.
- Placera en smörjande oftalmologiska salva i musens ögon att förhindra eventuella torkning av hornhinna.
- Ställning sövda musen på stereotaktiska ramen, på en varm isotermiska block täckta med en steril plastfolie att upprätthålla musens temperatur under operation och begränsa dödligheten.
Obs: Musens näsa och tänder skall vara lämpligt placerade ovanför baren tand, att säkerställa adekvat respiratoriska flödet under förfarandet. - När musen är placerad ovanför baren tand, skärpa örat staplarna ordentligt under musens öron att immobilisera huvudet.
Obs: Var noga med att inte skada trumhinnor eller att äventyra respirationen. - Gör en 1-2 cm mittlinjen sagittal huden snitt med steril sax längs den övre delen av kraniet från främre till bakre att exponera skallen.
- Identifiera skärningspunkten mellan sagittal och koronalt suturerna (Bregma) att tjäna som landmärken för stereotaktisk lokalisering före injektionen (visas i figur 1).
- Placera mikrosprutan ovanför denna punkt.
- Flytta mikrosprutan 2 mm höger lateral och 0,5 mm främre av Bregma.
- Använder en microdrill, göra ett litet hål i skallen med en steril borr på förutbestämda koordinater. Var försiktig med att förbli ytliga för att undvika någon traumatisk skada i hjärnan.
Obs: I detta protokoll injicerades immunceller inom en etablerad tumör (en vecka efter tumör cell injektionen). Huden ska vara återöppnat (ärr) och injektionen utförs vid samma koordinater används för tumör cell implantation (hålet finns vanligen kvar upp till 2 veckor efter injektionen). Koordinater valdes för att injicera tumör och effektor celler i hjärnparenkymet13,14.
-
Injektion av immun effektor celler
- Noggrant sätt i mikrosprutan i det borrade hålet och, flytta långsamt, vidarebefordra nålen 3 mm ner i dura och sedan bakåt 0,5 mm till ett sista djup av 2,5 mm före injicering effektor cellerna.
- Kör effektor cell injektionen vid 2-3 µL/min och övervaka mössen längs den injektion tid.
- När injektionen är klar, ta ut nålen för endast 1 mm och hålla mikrosprutan på plats för en extra minut innan du långsamt drar helt i mikrosprutan, för att förhindra läckage från infusionsstället.
Obs: Efter avlägsnande av djuret från stereotaktisk enheten, ren omedelbart injektionsutrustning för kommande experiment.
-
Postoperativ vård och uppföljning av mus
- Ta bort djuret från stereotaktiska ramen och omedelbart tillämpa povidonjod 5% lösning på webbplatsen för snitt och Stäng huden med en lämplig kirurgisk suturen.
- Applicera 2% lidokain gel direkt på såret och administrera 0,15 µg/g av buprenorfin som en subkutan efter ingrepp smärtlindring.
- Plats tillbaka sövda musen till sin bur ovan en värmedyna ställa till 37 ° C att upprätthålla en lämplig mus kroppstemperatur och undvika eventuella hypotermi.
Obs: Separat hus är inte nödvändigt. - Övervaka musen tills det är helt återhämtat sig från anestesi och överföra det till ett bostäder rum.
Obs: Hittills har detta protokoll väl stöds eftersom några oförutsedda komplikationer har inträffat (< 5% av injicerad möss). - Dagligen övervaka möss och avliva dem när sjunkande hälsa tecken observeras (t.ex., krökt kroppshållning, nedsatt rörlighet, utmattning eller betydande viktminskning [≥ 15%]).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna studie beskriver strategin adoptiv överföringar av cellulära immunförsvaret effektor celler i hjärnan av tumör-carrying möss, baserat på stereotaktisk injektioner utförs direkt i tumören sängen.
För att minimera risken för hjärnskada som är associerad med en stor injektionsvolym, behöver effektor cellsuspensionen koncentreras (20 x 106 celler i 15-20 µL av PBS). För att kontrollera huruvida denna cell koncentration steg kan påverka lönsamheten för de effektor cellerna, var dessa celler upprättad enligt protokollet beskrivs och laddas in i mikrosprutan. Effektor cellerna samlades omedelbart, eller 10 min efter laddar dem i mikrosprutan. Cellerna var fläckade propidium jodid (PI), en fluorescerande DNA intercalating agent som inte är diffusionskoefficient till levande celler och analyseras med flödescytometri vid olika tidpunkter (0, 24 och 72 timmar). Resultaten visar att preparatet och lastning till mikrosprutan inte påtagligt påverkar lönsamheten för effektor celler i minst 24 timmar (figur 2A och 2B). Vid 72 timmar observerades en liten, men icke-signifikant, ökning av PIpositiva celler (14% jämfört med 11% för lossas celler). På liknande sätt analyserades antitumöreffekt Reaktiviteten hos effektor celler som var förberedd och underhålls på is i 3 timmar. Effektor celler var cocultured med hjärnan tumörceller i 4 timmar i närvaro av en anti-CD107a mAb. Uppreglering av aktiveringen markören CD107a, liknande till det värde som erhålls i villkor som kontroll, anger att Reaktiviteten hos effektor celler inte påverkas av preparatet och lastning till mikrosprutan (figur 2 c).
För att utvärdera huruvida effektor celler överleva och flytta inom hjärnparenkymet efter deras intra-tumoral implantation, 20 x 106 effektor skulle celler injiceras i webbplatsen tumören av möss bära en hjärntumör (GBM-111). En vecka senare samlades hjärnor, fasta, sektionerad och färgade för safran hematoxylin och eosin färgning (HES) och anti-humant CD3 mAb (IHC). HES coloration identifierade strukturen av hjärntumörer (figur 3, till vänster). CD3 färgningen identifieras och lokaliserade effektor immun T lymfocyter (här, mänskliga Vϒ9Vδ2 T celler) (figur 3, högra panelen). Intressant, upptäcktes effektor T-lymfocyter runt tumören (figur 3, övre högra panelen) i tumören kärnan (figur 3, mellersta högra panelen), men också i den kontralaterala hemisfären (figur 3, nedre högra panelen). Dessutom analyserades funktionen av humana T-lymfocyter som isolerade från mus hjärnan 48 timmar efter deras injektion (4 x 106 αβ T-celler), som utgör 2% av hjärnceller. Resultaten indikerar att insamlade hjärnan-injiceras effektor allogen αβ T celler expandera och föröka sig vid en icke-specifik PHA-feeder celler aktivering utföras i närvaro av IL-2 (figur 4).
Tillsammans, visar dessa resultat att effektor T-celler bereds och administreras enligt dessa förfaranden överleva i timmar i hjärnan och kan patrullera inom tumören och friska hjärnans vävnader. Dessa förfaranden har använts för att bedöma den terapeutiska stereotaktiska förvaltningens allogen mänskliga vilande Vϒ9Vδ2 T celler antitumöreffekt effektiviteten för att styra utvecklingen av mänsklig GBM hjärnan tumörer9,11. Dessa studier bevis att injektioner av allogena mänskliga effektor T-lymfocyter i tumör sängen avsevärt förbättra överlevnaden av möss bära hjärntumörer. Intressant nog bedrev överleva möss inte detekterbara tumörceller, vilket indikerar ett komplett tumör avvisande.
Figur 1 : Bild av de viktigaste anatomiska landmärkena på mus skallen. Detta inkluderar sagittal (röda linjen) och koronala (blå linje) suturer och sina skärningspunkter (Bregma) används för att orientera injektionsstället. Skalstapeln indikeras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Överlevnad och aktivering av beredda effektor T lymfocyter. Effektor celler (här vilar människans perifera Vϒ9Vδ2 T-celler) var förstärks och upprättad enligt förfarandet som beskrivs. Färgning av lymfocyter med propidium jodid (PI), en DNA infoga fluorescerande förening som inte är diffusionskoefficient till levande celler, och funktionell aktiveringen utfördes. (A) denna panel visar en representativ tomt framåt (FSC-H) kontra sida (SSC-H) scatter gating ljudeffektläget lymfocyter (vänster panel). Histogrammet visar PI färgningen av gated kontroll lymfocyter (högra panelen). Procentandelen av PIpositiva lymfocyter indikeras. (B) denna panel visar andelen döda lymfocyter (PIpositiva) samlas in omedelbart (ljus blå linje) eller efter 10 min (mörk blå linje) i mikrosprutan, mätt vid den angivna tidpunkter. Som kontroll, lossas beredda celler användes (grå linje). (n = 3; genomsnitt ± SD; ns = inte betydande.) (C) CD107a yta mobilisering mättes genom flödescytometri på antingen Vδ2positiv kontroll celler (oförberedd) eller beredda lymfocyter underhålls på is (beredd + 3 h) efter en coculture med målet primära människohjärnan tumörceller. Procentandelen av lymfocyter indikeras i varje flödescytometrisk kvadrant. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Identifiering och lokalisering av effektor T-lymfocyter i hjärnan av tumör-bärande möss. En vecka efter glioblastoma hjärnan tumören implantation, effektor immunceller (här vilar människans perifera Vϒ9Vδ2 T-celler) skulle injiceras i hjärnan hos möss. En vecka efter immunoterapeutisk behandling, var hjärnor samlat, fast och sektioneras. Hjärnan sektioner var färgade för immunohistokemi analys (hematoxylin eosin och safran [HES] färgning) (till vänster) eller betsad med anti-humant CD3 antikropp (högra panelen). Resultaten är representativa för tre oberoende experiment. Skalstapeln indikeras.
Figur 4 : Aktivering av effektor T-lymfocyter som samlats in från hjärnan av behandlade möss. Vilande humana T-lymfocyter (här, 4 x 106 mänskliga αβ T-lymfocyter) skulle injiceras i hjärnan hos NSG möss. Efter 48 timmar hjärnor samlades in och dissocierade. Procentandelen av mänskliga hjärnan-infiltrera T-lymfocyter mättes av flödescytometri med hjälp av en anti-humant CD3 antikropp (nedre panelen). De insamlade cellerna var seedad (10 celler per brunn) med 96 brunnar flerbrunnsplattor och stimuleras (PHA-feeder celler och IL-2) för 20 dagar (16 fördubbling cykler). Obs, på dag 10, 13,3 x 106 av humana T-lymfocyter erhölls (högra panelen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En överföring av valt infödda eller konstruerade immun effektor celler representerar en lovande strategi för att effektivt behandla tumörer, såsom infiltrativ hjärnan cancer, tar hand om att begränsa reactivities mot icke-omvandlad celler15, 16,17,18. Det centrala nervsystemet, som består av hjärnan, har dock en viss immunstatus, särskilt på grund av förekomsten av den blod - hjärnbarriären och avsaknaden av en klassisk lymfdränage system19,20. Dessa fysiologiska funktioner påverkar vävnad människohandel och kan äventyra systemisk injektioner av immunceller. För att övervinna dessa hinder, har intraparenchymal injektioner utforskats på principen att antitumöreffekt cellerna levereras snarare lokalt, nära till webbplatsen tumören, när det gäller mikrosfärer som innehåller farmakologiska föreningar21, 22. å ena sidan begränsad utspädning av lymfocyter inom organ kan förbättra deras antitumöreffekt effektivitet, men det kan också förstärka skadliga mekaniska eller tumör anpassning effekter, såsom tissular kompression, som utvecklas längs hjärnan tumörtillväxt. Detta innebär att denna procedur kräver små volymer av immunoterapeutisk injektioner. Problemet är ännu mer kritisk i experimentella djurmodeller i som hjärnan tumörer inte kan vara kirurgiskt censurerade. Denna artikel beskriver en terapeutisk metod för beredning och lokal leverans av hjärnan tumör-specifika cellulära effektorer, baserat på stereotaktisk injection(s) av allogena humana T-lymfocyter.
Denna studie visar förberedelserna och stereotaxic leverans av allogena mänskliga Vϒ9Vδ2 T-lymfocyter i nedsatt immunförsvar NSG möss bära mänskliga GBM xenograft. Den första etappen av detta protokoll beskriver en enkel procedur för förstärkande allogen T-lymfocyter från PBMC av friska donatorer, använda en standard ospecifik PHA-matare-IL2 stimulering som producerar stora mängder ren effektor T-lymfocyter, vilket gör att deras terapeutiska användning23,24. Det andra steget i denna artikel fokuserar på utarbetandet av vilande T lymfocyter suspensioner på dagen för stereotaxic administration. Särskilt fokus placerades på detta viktiga steg som kräver en hög cellulära densitet som inte bör påverka lönsamheten och funktionen av de valda effektor T-lymfocyterna. Slutligen, angående i vivo experiment, utarbetandet av effektor T-lymfocyter och deras injektion inom tumör kärnan är associerade med deras spridning, inte bara inom tumören men också i omgivande hjärnan vävnaderna, lyfta fram deras viss förmåga att patrullera och spåra invasiv tumörceller. Ännu viktigare, kvar dessa metoder för beredning och injektion möjligheten av dessa T-lymfocyter aktiveras i hjärnan vid ett särskilt erkännande av hjärnan tumörceller. Sammantaget dessa övertygande egenskaper säkerställa förmågan av T-lymfocyter till specifikt och effektivt identifiera och eliminera djupt infiltrativ hjärnan tumörceller som är ett kännetecken för GBM25. Notera, en särskild omsorg måste tas under injektionen och avlägsnande av mikrosprutan att minimera eventuella hjärnskador eller effektor celler läcker.
Avslutningsvis beskrivs ett effektivt förfarande för att leverera stora mängder allogen mänskliga anti-tumor lymfocyter, såsom vila mänskliga Vϒ9Vδ2T lymfocyter, i närheten av hjärntumörer. Ännu viktigare, åtföljs proceduren terapeutiska inte med negativa effekter på de överförda T-lymfocyterna (t.ex., livskraft, reaktivitet) eller hjärnans vävnader. Nyligen genomförda studier, baserat på murina ortotop modeller av primära mänskliga GBM, har visat att Vϒ9Vδ2T lymfocyter effektivt rikta GBM celler, inklusive tumörceller som djupt har infiltrerat hjärnparenkymet9,11. Dessa element öppna möjligheter för utveckling av romanen adoptiv T lymfocyter överföringsförfaranden som skulle kunna tillämpas i första hand hos möss bära ortotop hjärntumörer och, sedan, i kliniska studier hos GBM patienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tacka Personalen på Universitetssjukhuset djuranläggningen (UTE) av Nantes för djurhållning och skötsel, cellulära och tissular imaging core facilitet av Nantes universitet (MicroPICell) för avbildning, och flödescytometri facility (Cytocell) från Nantes för deras teknisk experthjälp. Detta arbete finansierades av INSERM, CNRS, Université de Nantes, Institut National du Cancer (INCa #PLBio2014-155), Ligue Nationale contre le Cancer (AO interregionala 2017) och det Europeiska konsortiet ERA-Net Transcan2 (Immunoglio). Laget är finansierat av Fondation pour la Recherche médicale (DEQ20170839118). Detta arbete genomfördes i samband med LabEX IGO och IHU-Cesti program, stöds av nationella forskningen byrån Investissements pris via programmen ANR-11-LABX-0016-01 och ANR-10-IBHU-005, respektive. IHU-Cesti projektet stöds även av Nantes Metropole och regionen Pays de la Loire. Författarna vill tacka Chirine Rafia för att ge hjälp i korrigera manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBMCs | from 3 different healthy donors | ||
| BLCLs | from 3 different donors | ||
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Dutscher | S1810-500 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| IL-2 | Novartis | proleukin | |
| PHA-L | Sigma | L4144 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51600 | |
| Mouse adaptator for stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51624 | |
| microsyringe pump injector | WPI | UMP3-4 | |
| NanoFil Syringe | WPI | NF34BV-2 | |
| NSG mice | Charles River | NSGSSFE07S | |
| Ketamine | Merial | Imalgène 1000 | |
| Xylazine | Bayer | Rompur 2% | |
| Scissors | WPI | 201758 | |
| Forceps | WPI | 501215 | |
| OmniDrill 115/230V | WPI | 503598 | |
| Vicryl 4-0 | Ethicon | VCP397H | |
| Xylocaine | Astrazeneca | 3634461 |
References
- Stupp, R., Roila, F. Malignant glioma: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up. Annals of Oncology. 20 Suppl 4, 126-128 (2009).
- Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma--are we there yet? Neuro-Oncology. 15 (1), 4-27 (2013).
- Chen, S. H., Shine, H. D., Goodman, J. C., Grossman, R. G., Woo, S. L. Gene therapy for brain tumors: regression of experimental gliomas by adenovirus-mediated gene transfer in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (8), 3054-3057 (1994).
- Choi, P. J., Tubbs, R. S., Oskouian, R. J. Emerging Cellular Therapies for Glioblastoma Multiforme. Cureus. 10 (3), e2305 (2018).
- Zhu, L., et al. Targeting and Therapy of Glioblastoma in a Mouse Model Using Exosomes Derived From Natural Killer Cells. Frontiers in Immunology. 9, 824 (2018).
- Chung, D. S., Shin, H. J., Hong, Y. K. A new hope in immunotherapy for malignant gliomas: adoptive T cell transfer therapy. Journal of Immunology Research. 2014, 326545 (2014).
- Vauleon, E., Avril, T., Collet, B., Mosser, J., Quillien, V. Overview of cellular immunotherapy for patients with glioblastoma. Clinical and Developmental Immunology. 2010, (2010).
- Brown, C. E., et al. Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy. The New England of Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).
- Jarry, U., et al. Stereotaxic administrations of allogeneic human Vgamma9Vdelta2 T cells efficiently control the development of human glioblastoma brain tumors. Oncoimmunology. 5 (6), e1168554 (2016).
- Dutoit, V., et al. Exploiting the glioblastoma peptidome to discover novel tumour-associated antigens for immunotherapy. Brain. 135 (Pt 4), 1042-1054 (2012).
- Joalland, N., et al. IL-21 Increases the Reactivity of Allogeneic Human Vgamma9Vdelta2 T Cells Against Primary Glioblastoma Tumors. Journal of Immunotherapy. 41 (5), 224-231 (2018).
- Clemenceau, B., et al. Effector memory alphabeta T lymphocytes can express FcgammaRIIIa and mediate antibody-dependent cellular cytotoxicity. The Journal of Immunology. 180 (8), 5327-5334 (2008).
- Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. Journal of Visualized Experiments. (57), e3403 (2011).
- Jarry, U., et al. Treg depletion followed by intracerebral CpG-ODN injection induce brain tumor rejection. Journal of Neuroimmunology. 267 (1-2), 35-42 (2014).
- June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
- Baruch, E. N., Berg, A. L., Besser, M. J., Schachter, J., Markel, G. Adoptive T cell therapy: An overview of obstacles and opportunities. Cancer. 123 (S11), 2154-2162 (2017).
- Bryant, N. L., et al. Characterization and immunotherapeutic potential of gammadelta T-cells in patients with glioblastoma. Neuro-Oncology. 11 (4), 357-367 (2009).
- Pereboeva, L., Harkins, L., Wong, S., Lamb, L. S. The safety of allogeneic innate lymphocyte therapy for glioma patients with prior cranial irradiation. Cancer Immunology, Immunotherapy. 64 (5), 551-562 (2015).
- Bailey, S. L., Carpentier, P. A., McMahon, E. J., Begolka, W. S., Miller, S. D. Innate and adaptive immune responses of the central nervous system. Critical Reviews in Immunology. 26 (2), 149-188 (2006).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
- Menei, P., et al. Local and sustained delivery of 5-fluorouracil from biodegradable microspheres for the radiosensitization of glioblastoma: a pilot study. Cancer. 86 (2), 325-330 (1999).
- Menei, P., et al. Stereotaxic implantation of 5-fluorouracil-releasing microspheres in malignant glioma. Cancer. 100 (2), 405-410 (2004).
- Salot, S., et al. Large scale expansion of gamma 9 delta 2 T lymphocytes: Innacell gamma delta cell therapy product. Journal of Immunological Methods. 326 (1-2), 63-75 (2007).
- Bennouna, J., et al. Phase-I study of Innacell gammadelta, an autologous cell-therapy product highly enriched in gamma9delta2 T lymphocytes, in combination with IL-2, in patients with metastatic renal cell carcinoma. Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (11), 1599-1609 (2008).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
