Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

В пробирке Воспитание одиночных пчёл: инструмент для оценки личиночной факторов риска

doi: 10.3791/57876 Published: July 16, 2018

Summary

Противогрибковые аэрозоли на цветущих растений может подвергнуть одиночных пчёл высокой концентрации пыльцы нести фунгицидом. С помощью лабораторных экспериментов с участием в vitro-выращенной пчелиные личинки, это исследование расследует интерактивные эффекты употребления лечить противогрибковыми пыльцы, полученных из растений, хоста и не хост.

Abstract

Хотя одиночные пчёлы обеспечивают важную опыления для диких и управляемых культур, этот вид-богатые люди группы во многом игнорировались в исследования регулирования пестицидов. Риск заражения остатков фунгицид может быть особенно высока, если спрей происходит на или вблизи растений-хозяев, в то время как пчелы собирают пыльцу подготовить свои гнезда. Для видов Osmia , которые потребляют пыльцы из выберите группу растений (oligolecty) невозможность использования пыльцы растений-хост может увеличить их фактором риска для связанных с фунгицидом токсичности. Эта рукопись описывает протоколы, используемые для успешно задние пчёл Мейсон пчелы, lato sensu Osmia ribifloris , от яйца до prepupal этап в ячейку культуры пластин стандартизированных лабораторных условиях. В vitro-выращенной пчел впоследствии используются для изучения последствий воздействия и пыльцы источника фунгицида пчела фитнес. Основываясь на 2 × 2 полностью пересек факторного дизайна, эксперимент рассматриваются основные и интерактивные эффекты облучения и пыльцы источника фунгицида на личиночной фитнес, количественно prepupal биомассы, личинок время развития и выживания. Основным преимуществом этого метода является то, что использование в vitro-выращенной пчел уменьшает естественный фон изменчивость и позволяет одновременной манипуляции нескольких экспериментальных параметров. Описывается протокол представляет универсальный инструмент для тестирования с участием набор факторов, влияющих на здоровье пчел гипотезы. Для сохранения усилия встретился с значительным, прочного успеха такое понимание сложного физиологических и экологических факторов пчелы снижение будет оказаться критической.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Учитывая их роль в качестве доминирующей группой насекомых опылителей1, глобальные потери в пчела населения создает угрозу для продовольственной безопасности и экосистемы стабильности2,3,4,5,6 ,7. Тенденции к снижению в обоих управляемых и дикая пчела населения отнесены несколько общих факторов риска, включая фрагментация среды обитания, новых паразитов и патогенов, потери генетического разнообразия и привнесение инвазивных видов3 ,4,,78,9,10,,1112. В частности резкое увеличение использования пестицидов, (например, neonicotinoids) непосредственно связано с пагубные последствия среди пчел13,14,15. Несколько исследований показали, что синергизм между neonicotinoids и ингибирующих биосинтеза эргостерина фунгицидами (ЕИБ) может привести к высокой смертности через несколько пчел видов16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22. Тем не менее, фунгициды, давно считается «пчела Сейф», по-прежнему быть распылен по культурам в цвету без много внимания23. Фуражиры документально вернуть регулярно пыльцы нагрузок, загрязненных с фунгицидом остатков24,25,26. Потребление такой фунгицидом ladenpollen может привести к высокой смертности среди личинок пчел27,28,29,30и набор югу смертоносных последствий среди взрослых пчел16 , 31 , 32 , 33 , 34. Недавно проведенное исследование свидетельствует о том, что Фунгициды могут вызвать пчелы потери путем изменения микробной сообщества внутри улья хранить пыльцу, тем самым нарушая критических симбиоз между пчел и35пыльца нести микробов.

Хотя одиночные пчёлы имеют жизненно важное значение для опыления несколько диких и сельскохозяйственных растений36,37,38, этой разнообразной группы опылителей получил гораздо меньше внимания в пестицидов, мониторинг исследований. Гнездо взрослой самки одиночные содержит 5-10 Герметичные выводок камеры, каждый заполненный с конечной массой матерински собранной пыльцы и нектара и одно яйцо39. После вылупления личинки полагаются на предоставление выделенных пыльцы и связанные пыльцы нести микробиоты для получения адекватного питания40,41. Потому что они не имеют преимущества социального образа жизни, одиночные пчёлы могут быть более уязвимы для воздействия пестицидов42. Например, во время дефицита в социальной пчелы после спрей может быть возмещен на некоторые расширения рабочих и вновь возникающих расплода, смерть одной взрослой самки одиночные заканчивается все репродуктивной активности43. Такие различия в чувствительности подчеркивают необходимость учета различных пчела таксонов в экотоксикологических исследований для обеспечения надлежащей защиты для управляемых и диких пчел так. Однако помимо нескольких исследований, расследования последствий воздействия фунгицида в первую очередь на социальной пчел18,23,,3244,45 ,-46,-47,-48,-49.

Одиночные пчёлы, принадлежащие к роду Osmia (рис. 1) были использованы во всем мире как эффективный опылителей нескольких важных фруктовых и ореховых культур39,50,51,53, 53. как с другие управляемые опылителей групп24,54,55,,5657,58, Osmia пчел, регулярно подвергается фунгициды, наносится на урожай в Блум44. Взрослые самки нагула на недавно распыляется культур могут собирать и сток их выводок камеры с фунгицидом Ладена пыльцы, которая позднее является единственным диета для развивающихся личинок. Потребления загрязненных пыльцы положения впоследствии можно предоставлять личинки фунгицид остатков42. Риск воздействия может быть среди видов пчёл, что корм только на несколько тесно связанных разместить растения59,60,61выше. Некоторые megachilid пчел, например, представляется преференциально комбикорма для низкого качества Сложноцветные пыльцы, как средства уменьшения паразитизм62. Однако степень которой фунгициды воздействие личиночной фитнесу среди одиночных пчёл пчёл не были количественно эмпирически. Цель этого исследования заключается в разработке протокол для тестирования основных и интерактивные эффекты облучения и пыльцы источника фунгицида на фитнес в vitro воспитал одиночных пчёл. Расследовать, яйца O. ribifloris sensu lato (s.l.) могут быть получены коммерчески (таблица материалов). Это население является идеальным ввиду ее важности как родной опылителей и ее сильное пристрастие к нектар богатые магонии aquifolium (Орегон винограда) найдены в пределах региона53,63,64 (Рис. 2).

Figure 1
Рисунок 1. Высоким разрешением фото взрослых Osmia ribifloris. Фото кредит д-р Джим тростника, исследования энтомолог, USDA-ARS пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2. Вложенности язычков Osmia ribifloris (s.l.) с женщиной гнездящихся на переднем плане. Phragmite Палата разделов и терминала вилки для язычков построены из пережевывается листья. Фото г-н Кларк Kimball, NativeBees.com пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Первая цель этого исследования заключается в том, оценить влияние потребления лечить противогрибковыми пыльцы на личиночной Фитнес (измеряется время разработки и prepupal биомассы). В то время как воздействия обычно применяемые фунгициды пропиконазол был связан с повышением смертности среди взрослых пчел через несколько видов 23,24,,3244,45, 54,55,56,,5758,65,66,67, ее влияние на личинок пчел меньше известны. Вторая цель этого исследования заключается в том, для оценки последствий потребления-хост пыльцы на личиночной фитнес. Предыдущие исследования показывают, что личинки пчёл пчел не развивать, когда вынуждены потреблять68-хост пыльцы. Такие результаты могут объясняться различия в пчела физиологии69, пыльца биохимии70и выгодно микрофлора, связанные с естественным пыльцы положения71. Третья цель настоящего исследования заключается в оценить интерактивные эффекты лечения противогрибковыми и диетических пыльцы на личиночной фитнес.

Многочисленные биологические черты, включая размер материнского тела, подготовки курса, нагула стратегии, пыльца количество72,,7374,75 известно и влияют на личиночной фитнесу среди одиночных пчёл. Эти факторы могут внести существенные различия между язычки, которые ставит задачу в развитии обоснованные экспериментальные проекты, при оценке личиночной здоровья. Кроме того учитывая, что развития личинок происходит внутри герметичных вложенности язычков, последствия такой изменчивости потомства трудно визуализировать и количественных без использования нелетальных методов (рис. 3). Чтобы преодолеть этот вызов, все гипотезы в рамках этого исследования проверена с помощью личинки, воспитал вне их вложенности язычков. Экспериментальный дизайн представляет полностью перешли 2 × 2 факториал структурах, с каждым фактором, состоящий из 2 уровней; Фактор 1: Фунгицид воздействия (фунгицида; Не фунгицид); Фактор 2: Пыльцы источник (хост пыльцы, Non хост пыльцы). Пчелы возникают от яйца до стадии prepupal в стерильные multiwell клетки культуры пластин контролируемых лабораторных условиях. Каждый хорошо индивидуально укомплектована стандартизированный количество пыльцы положение и одно яйцо. После вылупления, личинка каналы на выделенных пыльцы в колодец, завершает развития личинок и инициирует окукливание. Последние исследования показали, что необъяснимые смертности среди пчел, поднятые в рамках этой искусственного выращивания среды чем возникшего в диких49,-76ниже. Использование в vitro-выращенной пчел имеет ряд преимуществ над на основе полевых исследований: 1) она минимизирует смешанные эффекты естественной изменчивости и неконтролируемых факторов, обычно связанных с на основе полевых исследований; 2) она позволяет несколько уровней манипуляции для каждого factor(s) интерес для испытываться одновременно в группах лечения; 3 количество повторных измерений может быть заранее, и экспериментальные факторы для каждой репликации могут управляться индивидуально; 4) личинок ответ переменные можно легко визуализировать и самостоятельно записан без тревожных соседние личинки; 5) протокол могут быть изменены для размещения более сложные экспериментальные проекты с участием многочисленных факторов и ответ переменных.

Figure 3
Рисунок 3. Содержимое в пределах естественной вложенности Рид о Osmia ribifloris (s.l.). Крупным планом (A) расчлененных Рид, показаны отдельные камеры, пыльцы положения и разделы и (B) свеже собранного пыльцы положения и связанные яйца (обозначается черным кружком). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Подготовьте пропиконазол решения для фунгицида экспозиции экспериментов

  1. Подготовьте 0.1 x противогрибковые решения путем растворения соответствующие объемы коммерчески приобретенных пропиконазол 14,3% в стерильной воде день эксперимента. Убедитесь, что только свежеприготовленные фунгицидом решение используется для всех процедур.
  2. 23 мкл 0.1 x фунгицидом решение на грамм пыльцы положения для получения максимальной концентрации пропиконазол сообщалось ранее собрали пчелы пыльца24 (0.361 PPM или мкг активного ингредиента g-1 пыльцы).

2. урожай яиц и принимающих пыльцы положений из Osmia язычки

  1. С помощью Стерилизованный скальпель, вскрыть свежезаваренным подключен вложения камышовые заросли Osmia, разделения его на две части по длине тростника подвергать отдельных камер.
    Примечание: Каждое гнездо может содержать между 8 до 14 камер и одно яйцо в камере.
  2. Осмотрите язычков визуально выявить камер, содержащие Мужские яйца, основанный на ранее опубликованные рекомендации77. Использование стерилизованные изогнутой иглы для удаления каждого пыльцы положения наряду с связанные яйцо от гнездования Рид и место в чистой вес лодки.
  3. Аккуратно отделить яйцо от положения с помощью чистой тонкой кистью и записывать свежие вес положения пыльцы и яйцо, используя стандартный лабораторный баланс. Рассчитайте средний вес мужского пыльцы положений.
  4. Выполните последующие шаги с минимальной задержкой, чтобы уменьшить вероятность повреждения на яйцо от воздействия избыточной температуры и обезвоживания.

3. подготовить положения пыльцы растений хост

  1. Осмотрите пыльцы матерински собранные растения хозяина, извлечены из вложенности камер для обеспечения настоящей78не паразитов. Для того, чтобы уменьшить любые потенциальные материнской предвзятости, объединить положения пыльцы в одном массу в стерильных Петри и перемешать хорошо с использованием стерилизованные иглы.
  2. Разделить общую массу новых положений пыльцы, обеспечивая, что вес каждого восстановленного положения приблизительно равен средний вес естественно выделенные мужской положения (средний ± SE, 0,35 ± 0,01 г, N = 42).
    Примечание: Потому что Osmia sp. выделяет меньше пыльцы положения мужского потомства, это приводит к нижней веса личинок мужчин, по сравнению с77женщин. Чтобы избежать любой такой смещения в результате различий пола, используйте только мужские яйца в экспериментах.

4. Подготовьте положение пыльцы растений-Host

  1. Распылить коммерчески приобрели мед пчелы собранной пыльцы в мелкий порошок, используя стандартный лабораторный мяч мельница.
  2. Основываясь на содержание влаги матерински собранные хост пыльцы положений (~ 20%), гидрата порошок пыльцы, используя соответствующие объемы сахара 40% стерилизации решение79 и перемешать тщательно сформировать консистенции тесто как.
  3. Разделите на отдельные пыльцы масс, каждый весом примерно так же, как средний вес естественно выделенные мужской положения.
    Примечание: Содержание влаги матерински собранного узла пыльцы, которую положений может быть стандартизирована в предыдущие, сравнивая свежий и сухой вес положений пыльцы из 30 случайно выбранных мужчины камеры80. Для получения сухого веса, пыльца положения должны быть сублимированный в лиофилизатор (1.5 Па за 72 ч).

5. подготовить Multiwell клетки культуры пластин

  1. Линия отдельных скважин стерильных 48-ну культуры плиты с газобетона оловянные кубки (5 × 9 см). Использование стерильный пинцет, нежно чутье из верхнего края капсулы, так что он может вместить положение пыльцы.
  2. Поместите один массы пыльцы положения принимающих или не принимающих оловянный Кубок, с использованием стерильных инструментов, основанных на группе лечения.
    Примечание: Чтобы избежать перекрестного загрязнения, используйте отдельные пластины для лечения и управления группами.

6. Добавить фунгициды

  1. Сделайте централизованно размещены депрессии в массы пыльцы с помощью стерильных деревянной палочкой. Используйте новый палку для каждого положения пыльцы.
  2. Добавьте соответствующие тома фунгицидом раствора (для лечения), или стерильная вода (для контроля) в депрессию. Щепотка открытие депрессии с помощью стерильный пинцет, чтобы свести к минимуму поверхности контакта между фунгицидом / стерильную воду и яйцо.
  3. Убедитесь, что факториал set-up экспериментальный дизайн выравнивает с этим изображен схематически (рис. 4).

Figure 4
Рисунок 4. Схематическое представление экспериментальной установки. Этот эксперимент представляет полностью перешли 2 × 2 факториал установок. Фактор 1 представляет фунгицид экспозиции и состоит из 2 уровней: (i) не фунгицидом (N = 10) и (ii) фунгицидом (N = 10). Фактор 2 представляет источник пыльцы и состоит из 2 уровней: (i) хост пыльцы (N = 8) и (ii) номера хост пыльцы (N = 8). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

7. задний и наблюдать личинки

  1. Место случайно выбранных мужчины яйцо на верхней поверхности положения пыльцы, с использованием чистой тонкой кистью. После того, как яйца были размещены на всех положений, замените крышку пластину культуры клеток, закрепив его с маркировки ленты на углах.
  2. Место хорошо пластины на чистый лоток и накрыть темной тканью препятствовать контакт с прямого света. Место 6 хорошо пластины содержащие 30 мл стерильной воды в поддоне, для предотвращения высыхания. Оставьте в покое внутри инкубатор лотки инкубации при комнатной температуре.
  3. Соблюдайте также пластины ежедневно под микроскопом рассечения без снятия крышки хорошо плит. Убедитесь, что личинки живы, установив для движения. При обнаружении движения, отбросить олова Кубок, содержащий погибших личинок и оставшиеся положения пыльцы. Разрешить все живых личинок развивать спокойно в хорошо пластины, пока они достигают стадии prepupal.
  4. Удаление личинка из олова Кубка после того, как он достигает стадии prepupal41. Используйте щетку для очистки любого испражняются из шелкового кокона. Тщательно прорваться через Шелковый кокон, под микроскопом рассечения и извлекать prepupa пинцетом резины.
  5. Ручка prepupa осторожно, чтобы обеспечить, что инструменты не проколоть мягкое тело. Запись свежего веса prepupa (prepupal биомассы) и время развития от яйца до стадии prepupal (личинок развития время).
    Примечание: Любые погибших личинок должен быть уничтожен немедленно для предотвращения нежелательного роста микробов на труп и остатки пыльцы положение. Это уменьшает риск заражения для оставшихся здоровых личинки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Личинок фитнес был количественно с помощью три метрики (i) личинок развития время, (ii) prepupal биомассы и (iii) процент выживания. Двусторонний ANOVA был проведен с использованием фунгицид экспозиции (два уровня: без фунгицидов, фунгицид) и пыльцы источник (два уровня: хост пыльцы, Non-host пыльцы) как независимые переменные и личинок развития время как зависимой переменной. Основной эффект воздействия фунгицидом (F1,28 = 1,24, P = 0,28) был незначительным между фунгицидом лечение (среднее ± SE) (28.14 ±1.98 d, N = 14) и неочищенные (25.39 ± 1,65 d, N = 18) групп. Основной эффект для пыльцы источника, однако указали существенное различие между развития время для личинок, поднятые на хост пыльцы (20.00 ± 0,50 d, N = 16) и пыльца-хост (33,19 ±0.81 d, N = 16) (1,28 F= 179.83, P < 0,001). Бонферрони, исправленные пост hoc сравнения указывается, что личиночной развития время не менялась значительно между лечить противогрибковыми и лечить группы подняли на хосте (P = 0,57) и не хост (P = 0,32) пыльцы. Однако, личинок развития время было значительно короче для личинок, поднятые на хост пыльцы, по сравнению с пыльцы-хост для обоих фунгицидом лечение (P < 0,001) и без лечения (P < 0,001) пыльцы. Эффект взаимодействия (фунгицид экспозиции × пыльцы источник) не был значительным (1,28 F= 0,09, P = 0,77). Анализ был повторен, используя prepupal биомассы в качестве зависимой переменной. Основной эффект воздействия фунгицид отметил существенное различие (F1,28 = 4.66, P = 0,04) между фунгицидом лечение (0,123 ±0, 01 g, N = 14) и неочищенные (0.149 ± 0,01 г, N = 18) групп. Основной эффект для источника пыльцы (F1,28 56,30, P = < 0,001) отметил существенное различие между личинок, поднятые на хост пыльцы (0.170 ± 0,01 г, N = 16) и пыльца-хост (0,105 ±0, 01 g, N = 16) . Бонферрони, исправленные пост hoc сравнения указывается, что prepupal биомасса не менялась значительно между лечить противогрибковыми и лечить группы подняли на хосте (P = 0,22) и не хост (P = 0,08) пыльцы. Однако, был значительно выше среди личинок, поднятые на хост пыльцы, по сравнению с пыльцы-хост для обоих фунгицидом лечение prepupal биомассы (P < 0,001) и без лечения (P < 0,001) пыльцы. Эффект взаимодействия (фунгицид экспозиции × пыльцы источник) не был значительным (1,28 F= 0,132, P = 0,72). Рисунок 5 и Рисунок 6 являются графические представления результатов, полученных из вышеупомянутого анализа. Независимые образцы t-теста указывается значительное влияние пыльцы источника на личиночной выживания (N = 18, т9 =-2.45, P =0,04).

Figure 5
Рисунок 5. Бар график, показывающий метрики для личинок Фитнес на основе развития личинок времени и prepupal биомассы. Личинок фитнес метрики являются кластеризованными основаны на (A) и (B) пыльцы источника; и (C) и (D) фунгицида экспозиции. (Среднее ± 1 SE). P < 0,001 пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6. Взаимодействие участок для личинок фитнес метрик. Интерактивные эффекты воздействия фунгицидом и пыльцы источника на личиночной развития времени (A) и (B) prepupal биомассы. (Среднее ± 1 SE). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Пирсонс корреляции был использован для изучения взаимосвязи между личинок развития время и prepupal биомассы (рис. 7). О значительном отрицательном соотношении было отмечено во всех группах лечения (r = -0.83, P < 0,001, N = 32) и через противогрибковые лечения (без фунгицидов: r =-0.76, P < 0,001, N = 18; Фунгицид: r = -0,92, P < 0,001, N = 14). Хотя о значительном отрицательном соотношении для личинок, поднял на пыльцу-хост (r = -0.64, P < 0.01, N = 16), такие отношения было отмечено для личинок, поднятые на хост пыльца (r = -0.01, P = 0,98, N = 16).

Figure 7
Рисунок 7. Отношения между личинок развития время и prepupal биомассы. Корреляции Пирсона между развития время и prepupal биомассы через (A) все группы лечения (P < 0,001) пыльцы (B) источник (принимающей пыльцы: P = 0,98, Non хост пыльцы: P < 0.01); (C) фунгицид воздействия (не фунгицид: P < 0,001, фунгицид: P < 0,001). Для панелей (B) и (C), линии тренда, цвета совпадают с символами в рисунке легенда. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Video 1
Анимированный рисунок 1. Пятый этап личиночной instar O. ribifloris в пределах одного хорошо multiwell плиты. Личинка отмечается начали спиннинг шелковые кокон в рамках подготовки к окукливание. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Разведение пчел вне их естественной вложенности язычков, в лабораторных условиях, позволяет тестировать несколько гипотез, касающихся личиночной фитнес. В той степени, в какой неизвестные факторы по-прежнему вызывают Би смертности, исследования по оценке риска использование в vitro экспериментов может помочь выявить потенциальные угрозы и информировать практики управления для этой группы богатые видами диких опылителей 12 ,,3849,76,,8182.

В общем короче развития раз и выше prepupal биомассы связано с выше личиночной фитнес. Во всех методов лечения продолжительность развития личинок был негативно коррелируется с prepupal биомассы. Однако существуют значительные различия между продолжительность развития личинок и prepupal биомассы в четырех группах. Личинки, которые не получили каких-либо фунгицидами и разрешалось потреблять пыльцы хост был кратчайший личиночной развития время и высоким prepupal биомассы. Напротив эти личинки, которые потребляются фунгицидом лечение не принимающих пыльцы, взял длинный для полного развития личинок и имел низкий prepupal биомассы. Однако тенденции для личинок выживания были менее ясно, с смертности отмечается только для лечить противогрибковыми группы подняли на хост пыльцы. Разбирая основной и взаимодействия эффекты воздействия фунгицидом и пыльцы источник показал, что: (i) основной эффект потребления лечить противогрибковыми пыльцы было значительное негативное воздействие на prepupal биомассы, но не личиночной развития продолжительность. Хотя предыдущее исследование продемонстрировало острой пероральной токсичности в взрослых Osmia в более высоких концентрациях,, эти результаты показывают, что воздействие пропиконазол в гораздо меньшей концентрации может повлиять на фитнес путем сокращения биомассы prepupal23 . (ii) основной эффект потребления пыльцы-хост имеет неблагоприятное воздействие на личиночной фитнес. Эти результаты согласуются с ранее опубликованных исследований, которые показывают качество пыльцы (то есть, наличие токсинов, защитными составами, отсутствие необходимых питательных веществ), и различия в физиологии пчела может ограничить пчел с использованием не хост пыльцы68 . Это также вероятно, что отсутствие выгодно микробиоты, обычно приобрел от хост пыльцы и/или пчела культур может усилить этот эффект. (iii) было не существенного взаимодействия между воздействием фунгицидом и пыльцы источник на личиночной фитнес. Лечить противогрибковыми и необработанных групп личинки, потребляя-host пыльцы было значительно ниже prepupal биомассы и больше личинок развития времени по сравнению с личинки, поднятые на хост пыльцы. Независимо от источника пыльцы личинки, потребляя лечить противогрибковыми положения были значительно ниже prepupal биомассы по сравнению с личинки, поднятые на необработанных пыльцы. Помимо значительных основные эффекты интерактивный эффект обоих факторов соответствует аддитивные модели, т.е., негативные последствия фунгицид экспозиции и пыльцы типа на личиночной фитнес не были синергизма. Неопределенностей, возникающих в результате взаимодействия различных факторов здоровья пчел (как подробно здесь), ограничивают эффективность стратегий управления опылителей. Помогая предсказать интерактивные эффекты множественных факторов риска, результаты от аналогичных на основе лабораторных экспериментов могут помочь обойти эту давнюю проблему в усилиях по сохранению пчелы.

Есть несколько важных шагов в этот протокол, который может повлиять на результат эксперимента. Всякий раз, когда это возможно, желательно использовать органические пыльцы, которая свободна от остатков пестицидов. С помощью пыльцы из неизвестных источников увеличивает риск загрязнения с различными агрохимикатов, которые можно смешивать экспериментальных результатов. Важно получить свежую подключен Osmia вложения язычков, так, что в исследовании используются только Невыведенные яйца или личинки очень молодых. Это гарантирует, что личинки выращиваются почти полностью на предполагаемой пыльца лечения типа. Вложенности Рид следует расчлененный с помощью неглубоких надреза, при отсутствии которых положения пыльцы и яйца могут быть повреждены во время сбора урожая. После того, как были удалены яйца они должны аккуратно обрабатывается для предотвращения повреждения и сохранены в лодки весят в прохладно темно гигиенической среде (например, биобезопасности кабинета), пока они передаются. Это время проведения должны быть сведены к минимума (< 30 мин) для обеспечения, что качество яйца не нарушается. Все процедуры должны выполняться в области биобезопасности, кабинета для обеспечения чистой рабочей среды и уменьшить шансы заражения. Для обеспечения их эффективности, используйте только свежеприготовленные противогрибковые решения для лечения. Учитывая, что пыльца гидрофобный, противогрибковые решения / стерильной воды должны быть включены в депрессии, в рамках положений пыльцы. Это увеличивает объем жидкости, проникая через предоставление. Однако важно, что депрессия не пронизывают всю глубину этого положения, поскольку это приведет к потере объема из раствора, придерживаясь капсула пол. Индивидуальное лечение и контроль должны проводиться в отдельной хорошо пластины, чтобы уменьшить шансы перекрестного заражения от летучих соединений и/или передаваемых через пыльцу микробиоты. Кусочки сложенном ленты прикрепляется к краям плиты позволяет достаточно воздуха разрыв после крышки на месте. Во время ежедневных наблюдений пластины должны обрабатываться нежно к минимуму помехи для личинок. Замечания должны быть сделаны под микроскопом с минимальной интенсивности света, и крышки не должны быть удалены, если отбросить погибших личинок. В случае неожиданных широко распространенной смертности личинок и их пыльца положения должны быть визуально проверены на наличие признаков инфекции и заражения. Хорошо пластины, содержащие угрозу реплицирует должна быть немедленно отбрасывается, вылечен рабочей области, и стерилизации инструментов для предотвращения распространения инфекции.

Несмотря на его широкого применения существуют определенные ограничения в этот метод. Например хотя это рекомендуется использовать органические пыльцы, по возможности, повышение растений в течение парниковых параметр приносить достаточное количество чистой нетронутой пыльцы технически непомерно высокой. В таких случаях может использоваться дикий сбор пыльцы, при том условии, что он проверяется на наличие остатков пестицидов. Еще одна стратегия для снижения риска заражения при использовании дикий собранной пыльцы заключается в получении пыльцы из источника, менее склонны были распыляется (например, нетронутые ненарушенных районы, расположенные далеко от сельскохозяйственных фермах). Хост пыльцы, используемые в данном исследовании был получен от вложенности язычки, которые были помещены в естественных лесов и лугов, окружающие предгорьях хребта Wasatch вблизи Кайсвилле, Юта. Учитывая, что этот регион преобладают дикая, неуправляемые естественные леса вдали от любых коммерческих сельскохозяйственных районов и что эти пчелы не летать как далеко, как пчелы когда взятка83,,8485, это крайне маловероятно что бы распылять пыльцы, которые они собрали. Таким образом остатков пестицидов в пыльцы, собранные здесь, вероятно, будет тривиальным. Нагула в таких диких ландшафтов, взрослая самка меньше шансов столкнуться загрязненных пыльцы, уменьшая риск заражения среди личинок. Коммерчески приобретенных пчелы пыльца, используемые в данном исследовании собраны из естественных лесных районов в северной части штата Висконсин и Мичиган. На рынке для потребления человеком, публично доступной информации и личного общения с поставщиком указывает, что сыпь не обрабатываются химически и пыльцы продается в виде природных, необработанные, без каких-либо модификаций86. Таким образом это разумно предположить, что нагрузки загрязнения в коммерчески приобретенных пчелы пыльца будет минимальным. Для исследований, которые не получают пыльцы из неуправляемых районов с дикой естественной растительности желательно иметь прямой эмпирические данные от пыльцы химии анализ, чтобы убедиться, что пыльца, используемых в анализов риска является загрязнителем бесплатно. Другое ограничение связано приспособление, представленный искусственного выращивания окружающей среды. Несмотря на все усилия, это не технически целесообразно воспроизвести точный микроокружения в пределах естественной вложенности Рид (например., влажность, концентрации кислорода, трехмерной структуры отдельных камер), которые могут повлиять на личинок Фитнес для неизвестных градусов. Для defensibly моделирования характеристики природных диеты, предварительные данные от гнездования язычков должно быть получено до в vitro диета манипуляции исследований. Хотя пыльца-хост, используемые в данном исследовании получается из районов, где отсутствует или редкие87Орегон винограда, возможно, следы пребывания пыльцы, смешанной в коммерчески приобретенных пыльцы, потенциально затрагивающих результаты. Еще одним недостатком этого метода является, что обработка стресс во время экспериментального периода может оказывать неблагоприятное воздействие на пчел. Наконец хотя это часто сталкиваются Невыведенные яйца в природе63, в лабораторных условиях трудно выяснить ли неспособность Люк был из-за стресса, экспериментальное лечение, или в результате естественных причин. Так как эти факторы могут ввести неизвестной степени предвзятости в исследовании, необходимо использовать осторожно при интерпретации полученных результатов.

Контролируя факторы, которые могут явно смещения экспериментальный результат (например, материнской нагула эффективность75, секс специфические вариации77и диетических пыльцы68,72), описывается протокол обеспечивает более существенные улучшения ранее опубликованные методы76и предлагает более четкие рамки для тестирования гипотез. Например, использование в vitro-выращенной пчел позволяет в секс конкретные ответы на ксенобиотиков лечения, которые в противном случае было бы сложно исследование среди диких популяций полости гнездования пчел49,88расследования. Потенциал для манипулирования и тестирования нескольких взаимодействующих факторов (например, диетические качества и количества, диета связанные микробиоты, синергетический пестицидов), может обеспечить ценную информацию о ключевых факторов, определяющих пчела фитнес. Гибкости протокола легко позволяет изменения (например, с использованием различных размеров хорошо пластины для размещения личинками различных размеров, изменив тип и количество диета), что делает его подходит для использования с несколькими другие виды одиночных пчёл и ОС 76. во время этой фитнес исследования оценивается на основе развития и выживания на стадии подачи, насекомые могут инкубировали до появления для получения дополнительных данных о появление ставка, еда для тела преобразования и после появления долголетия 49. Эта информация может помочь оценить югу смертоносных эффекты лечения в анализов токсичности. С ростом интереса к функции пыльцы микрофлора, на основе лабораторных исследований можно определить чувствительными по сравнению с устойчивостью пчела видов на основе их пыльцы микробиоты71. Различия в фунгицид восприимчивости Би групп может быть изучена по виртуализации микробиоты внутри улья хранить пыльцу. Это может помочь определить роль пыльцы микрофлора в присвоении различной степени сопротивления ксенобиотиков раздражители. Будущие исследования также могут помочь выявить различия между естественным микробиоты хоста и не принимающих пыльцы, который может служить базовым фактором поведения пчёл в пределах вида выберите пчела.

В vitro воспитание личиночной одиночных пчёл может помочь управления для естественной изменчивости, опытных в дикой природе, таким образом определяющие роль индивидуальных и взаимодействующих факторов в затрагивающих пчела фитнес. Этот доступной и недорогой метод расширяет Инструментарий энтомологов, позволяя для манипуляции нескольких параметров, которые могут быть легко изменены в адрес конкретных научно-исследовательских целей. Если доказательства от экспериментов в пробирке может помочь идентифицировать уязвимого населения, влияние на стратегии сохранения пчела будет существенным.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Авторы благодарят Kimball Кларк и Тим Крог для обеспечения Osmia вложенности язычков, Мередит Несбитт и Молли Bidwell для помощи в лаборатории, Drs. Cameron карри, Кристель Guédot, Терри Griswold, Майкл Branstetter и три анонимных рецензентов для их полезные комментарии, которые улучшили рукопись. Эта работа была поддержана USDA-сельскохозяйственная исследовательская служба ассигнованных средств (текущие исследования информационной системы #3655-21220-001), Висконсин Департамент сельского хозяйства, торговли и защиты прав потребителей (#197199), Национальный научный фонд (под Грант № DEB-1442148), Доу Великих озер биоэнергетики исследовательский центр (DOE Канцелярии науки BER де РС02 07ER64494).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
eggs of O. ribifloris sensu lato (s.l.) Kaysville, Davis County, Utah, USA
Osmia reeds Nativebees.com NA Freshly plugged reeds
Dissection set VWR 89259-964 Sterilize before use
Long Nose Pliers Husky 1006
6 well culture plates VWR 10062-892 Sterile sealed
48 well culture plates VWR 10062-898 Sterile sealed
Petri dishes VWR 25373100 Sterile sealed
Square Weighing Boats VWR 10770-448
Camel Hair Brush Bioquip 1153A
Tin capsules EA Consumables D1021 Sterilize before use
Sucrose VWR 470302-808
Propiconazole 14.3 Quali-Ppro 60207-90-1 Propiconazole 14.3%
Honey bee pollen Bee energised 897098001244 Untreated, natural, raw pollen
Microbalance VWR 10204-990
Pulverisette LAB SYNERGY INC. 30334913
Wooden sticks VWR 470146908 Sterilize before use
Sealing tape VWR 89097-912
Microscope VWR 89403-384
Planting tray VWR 470150-632
Ethanol VWR BDH1158-4LP
Centrifuge tube VWR 21008936
Microsyringe Cole-Palmer UX-07940-07
Rubber tweezer Amazon B0135HWPN4
Syringe needles VWR 89219-334
Freeze drier Labcono LFZ-1L
Statistical software SPSS Version 21.0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Klein, A. -M., et al. Importance of pollinators in changing landscapes for world crops. P Roy Soc Lond B Bio. 274, (1608), 303-313 (2007).
  2. Biesmeijer, J. C. J., et al. Parallel declines in pollinators and insect-pollinated plants in Britain and the Netherlands. Science. 313, (5785), 351-354 (2006).
  3. Potts, S. G., Biesmeijer, J. C., Kremen, C., Neumann, P., Schweiger, O., Kunin, W. E. Global pollinator declines: Trends, impacts and drivers. Trends Ecol Evol. 25, (6), 345-353 (2010).
  4. Cameron, S. A., et al. Patterns of widespread decline in North American bumble bees. P Natl Acad Sci USA. 108, (2), 662-667 (2011).
  5. Gallai, N., Salles, J. M., Settele, J., Vaissière, B. E. Economic valuation of the vunerability of world agriculture confronted with pollinator decline. Ecol Econ. 68, (3), 810-821 (2009).
  6. Fontaine, C., Dajoz, I., Meriguet, J., Loreau, M. Functional diversity of plant-pollinator interaction webs enhances the persistence of plant communities. Plos Biol. 4, (1), 0129-0135 (2006).
  7. Kluser, S., Peduzzi, P. Global pollinator decline: a literature review. UNEP/GRID Europe. (2007).
  8. Brown, M. J. F., Paxton, R. J. The conservation of bees: a global perspective. Apidologie. 40, (3), (2009).
  9. Lebuhn, G., et al. Detecting insect pollinator declines on regional and global scales. Conserv Biol. 27, (1), (2013).
  10. Vanengelsdorp, D., Meixner, M. D. A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. J Invertebr Pathol. Suppl 103. S80-S95 (2010).
  11. Pettis, J. S., Delaplane, K. S. Coordinated responses to honey bee decline in the USA. Apidologie. 41, (3), 256-263 (2010).
  12. Sandrock, C., Tanadini, L. G., Pettis, J. S., Biesmeijer, J. C., Potts, S. G., Neumann, P. Sublethal neonicotinoid insecticide exposure reduces solitary bee reproductive success. Agr Forest Entomol. 16, (2), (2014).
  13. Van der Sluijs, J. P., Simon-Delso, N., Goulson, D., Maxim, L., Bonmatin, J. M., Belzunces, L. P. Neonicotinoids, bee disorders and the sustainability of pollinator services. Curr Opin Env Sust. 5, (3), (2013).
  14. Goulson, D., Nicholls, E., Botías, C., Rotheray, E. L. Bee declines driven by combined stress from parasites, pesticides, and lack of flowers. Science. 347, (6229), (2015).
  15. Johnson, R. M., Ellis, M. D., Mullin, C. A., Frazier, M. Pesticides and honey bee toxicity - USA. Apidologie. 41, (3), (2010).
  16. Iwasa, T., Motoyama, N., Ambrose, J. T., Roe, R. M. Mechanism for the differential toxicity of neonicotinoid insecticides in the honey bee, Apis mellifera. Crop Protection. 23, (5), 371-378 (2004).
  17. Glavan, G., Bozic, J. The synergy of xenobiotics in honey bee Apis mellifera: mechanisms and effects. Acta Biol. Slov. 56, 11-27 (2013).
  18. Biddinger, D. J., et al. Comparative toxicities and synergism of apple orchard pesticides to Apis mellifera (L.) and Osmia cornifrons (Radoszkowski). PLoS ONE. 8, (9), e72587 (2013).
  19. Thompson, H. M., Fryday, S. L., Harkin, S., Milner, S. Potential impacts of synergism in honeybees (Apis mellifera) of exposure to neonicotinoids and sprayed fungicides in crops. Apidologie. 45, (5), 545-553 (2014).
  20. Jansen, J. -P., Lauvaux, S., Gruntowy, J., Denayer, J. Possible synergistic effects of fungicide-insecticide mixtures on beneficial arthropods. IOBC-WPRS Bulletin. 125, 28-35 (2017).
  21. Robinson, A., Hesketh, H., et al. Comparing bee species responses to chemical mixtures: Common response patterns? PLoS ONE. 12, (6), (2017).
  22. Sgolastra, F., Medrzycki, P., et al. Synergistic mortality between a neonicotinoid insecticide and an ergosterol-biosynthesis-inhibiting fungicide in three bee species. Pest Management Science. 73, (6), 1236-1243 (2017).
  23. Ladurner, E., Bosch, J., Kemp, W. P., Maini, S. Assessing delayed and acute toxicity of five formulated fungicides to Osmia lignaria and Apis mellifera. Apidologie. 36, (3), 449-460 (2005).
  24. Mullin, C. A., et al. High levels of miticides and agrochemicals in North American apiaries: implications for honey bee health. PloS one. 5, (3), e9754 (2010).
  25. Pettis, J. S., Lichtenberg, E. M., Andree, M., Stitzinger, J., Rose, R., Vanengelsdorp, D. Crop pollination exposes honey bees to pesticides which alters their susceptibility to the gut pathogen Nosema ceranae. PloS one. 8, (7), e70182 (2013).
  26. David, A., et al. Widespread contamination of wildflower and bee-collected pollen with complex mixtures of neonicotinoids and fungicides commonly applied to crops. Environ Int. 88, 169-178 (2016).
  27. Zhu, W., Schmehl, D. R., Mullin, C. A., Frazier, J. L. Four common pesticides, their mixtures and a formulation solvent in the hive environment have high oral toxicity to honey bee larvae. PloS one. 9, (1), e77547 (2014).
  28. Simon-Delso, N., Martin, G. S., Bruneau, E., Minsart, L. A., Mouret, C., Hautier, L. Honeybee colony disorder in crop areas: The role of pesticides and viruses. PLoS ONE. 9, (7), (2014).
  29. Park, M. G., Blitzer, E. J., Gibbs, J., Losey, J. E., Danforth, B. N. Negative effects of pesticides on wild bee communities can be buffered by landscape context. P Roy Soc B-Biol Sci. 282, (1809), 20150299-20150299 (2015).
  30. Bernauer, O. M., Gaines-Day, H. R., Steffan, S. A. Colonies of bumble bees (Bombus impatiens) produce fewer workers, less bee biomass, and have smaller mother queens following fungicide exposure. Insects. 6, (2), 478-488 (2015).
  31. Williamson, S. M., Wright, G. A. Exposure to multiple cholinergic pesticides impairs olfactory learning and memory in honeybees. J Exp Biol. 216, (10), 1799-1807 (2013).
  32. Artz, D. R., Pitts-Singer, T. L. Effects of fungicide and adjuvant sprays on nesting behavior in two managed solitary bees, Osmia lignaria and Megachile rotundata. PLoS ONE. 10, (8), e0135688 (2015).
  33. Pilling, E. D., Bromleychallenor, K. A. C., Walker, C. H., Jepson, P. C. Mechanism of synergism between the pyrethroid insecticide lambda-cyhalothrin and the imidazole fungicide prochloraz, in the honeybee (Apis mellifera L). Pestic Biochem Phys. 51, (1), 1-11 (1995).
  34. Johnson, R. M., Wen, Z., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. Mediation of pyrethroid insecticide toxicity to honey bees (Hymenoptera: Apidae) by cytochrome P450 monooxygenases. J. Econ. Entomol. 99, (4), 1046-1050 (2006).
  35. Steffan, S. A., Dharampal, P. S., Diaz-Garcia, L. A., Currie, C. R., Zalapa, J. E., Hittinger, C. T. Empirical, metagenomic, and computational techniques illuminate the mechanisms by which fungicides compromise bee health. JoVE. (128), e54631 (2017).
  36. Batra, S. W. T. Solitary bees. Sci Am. 250, (2), 120-127 (1984).
  37. Linsley, E. G. The ecology of solitary bees. Hilgardia. 27, (19), 543-599 (1958).
  38. Garibaldi, L. A., et al. Wild Pollinators Enhance Fruit Set of Crops Regardless of Honey Bee Abundance. Science. 339, (6127), 1608-1611 (2013).
  39. Bosch, J., Kemp, W. P. How to manage the blue orchard bee. Sustainable Agriculture Network. Washington, DC. (2001).
  40. Keller, A., Grimmer, G., Steffan-Dewenter, I. Diverse microbiota identified in whole intact nest chambers of the red mason bee Osmia bicornis (Linnaeus 1758). PLoS ONE. 8, (10), e78296 (2013).
  41. Bosch, J., Kemp, W. P. Development and Emergence of the Orchard Pollinator Osmia lignaria (Hymenoptera: Megachilidae). Environmental Entomology. 29, (1), 8-13 (2000).
  42. Brittain, C., Potts, S. G. The potential impacts of insecticides on the life-history traits of bees and the consequences for pollination. Basic and Applied Ecology. 12, (4), 321-331 (2011).
  43. Arena, M., Sgolastra, F. A meta-analysis comparing the sensitivity of bees to pesticides. Ecotoxicology. 23, (3), 324-334 (2014).
  44. Ladurner, E., Bosch, J., Kemp, W. P., Maini, S. Foraging and nesting behavior of Osmia lignaria (Hymenoptera: Megachilidae) in the presence of fungicides: cage studies. J Econ Entomol. 101, (3), 647-653 (2008).
  45. Huntzinger, A. C. I., James, R. R., Bosch, J., Kemp, W. P. Fungicide tests on adult alfalfa leafcutting bees (Hymenoptera: Megachilidae). J Econ Entomol. 101, (4), 1088-1094 (2008).
  46. Tsvetkov, N., et al. Chronic exposure to neonicotinoids reduces honey bee health near corn crops. Science. 356, (6345), 1395-1397 (2017).
  47. Mao, W., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. Disruption of quercetin metabolism by fungicide affects energy production in honey bees (Apis mellifera). P Natl Acad Sci. 114, (10), 2538-2543 (2017).
  48. Blacquière, T., Smagghe, G., Van Gestel, C. A. M., Mommaerts, V. Neonicotinoids in bees: A review on concentrations, side-effects and risk assessment. Ecotoxicology. 21, (4), 973-992 (2012).
  49. Sgolastra, F., Tosi, S., Medrzycki, P., Porrini, C., Burgio, G. Toxicity of spirotetramat on solitary bee larvae, Osmia cornuta (Hymenoptera: Megachilidae), in laboratory conditions. Journal of Apicultural Science. 59, (2), 73-83 (2015).
  50. Mader, E., Spivak, M., Evans, E. Managing Alternative Pollinators. Sustainable Agriculture Research and Education (SARE), US Dept. of Agriculture. (2010).
  51. Bosch, J., Kemp, W. P. Developing and establishing bee species as crop pollinators: the example of Osmia spp.(Hymenoptera: Megachilidae) and fruit trees. B Entomol Res. 92, (1), 3-16 (2002).
  52. Sampson, B. J., Rinehart, T. A., Kirker, G. T., Stringer, S. J., Werle, C. T. Phenotypic variation in fitness traits of a managed solitary bee, Osmia ribifloris (Hymenoptera: Megachilidae). J Econ Entomol. 108, (6), 2589-2598 (2015).
  53. Sampson, B. J., Cane, J. H., Kirker, G. T., Stringer, S. J., Spiers, J. M. Biology and management potential for three orchard bee species (Hymenoptera: Megachilidae): Osmia ribifloris Cockerell, O. lignaria (Say) and O.chalybea Smith with emphasis on the former. Acta Hort. 810, 549-555 (2009).
  54. Hladik, M. L., Vandever, M., Smalling, K. L. Exposure of native bees foraging in an agricultural landscape to current-use pesticides. Sci Total Environ. 542, 469-477 (2016).
  55. Long, E. Y., Krupke, C. H. Non-cultivated plants present a season-long route of pesticide exposure for honey bees. Nat Commun. 7, (2016).
  56. Krupke, C. H., Hunt, G. J., Eitzer, B. D., Andino, G., Given, K. Multiple routes of pesticide exposure for honey bees living near agricultural fields. PLoS ONE. 7, (1), e29268 (2012).
  57. Stoner, K. A., Eitzer, B. D. Using a hazard quotient to evaluate pesticide residues detected in pollen trapped from honey bees (Apis mellifera) in Connecticut. PLoS ONE. 8, (10), e77550 (2013).
  58. Sánchez-Bayo, F., Goulson, D., Pennacchio, F., Nazzi, F., Goka, K., Desneux, N. Are bee diseases linked to pesticides? - A brief review. Environ Int. 89, 7-11 (2016).
  59. Steffan-Dewenter, I., Klein, A. -M., Gaebele, V., Alfert, T., Tscharntke, T. Bee diversity and plant-pollinator interactions in fragmented landscapes. Specialization and generalization in plant-pollinator interactions. 387-410 (2006).
  60. Kremen, C., Ricketts, T. Global perspectives on pollination disruptions. Conserv Biol. 14, (5), 1226-1228 (2000).
  61. Memmott, J., Waser, N. M., Price, M. V. Tolerance of pollination networks to species extinctions. P Roy Soc B-Biol Sci. 271, (1557), 2605-2611 (2004).
  62. Spear, D. M., Silverman, S., Forrest, J. R. K. Asteraceae pollen provisions protect Osmia mason bees (Hymenoptera: Megachilidae) from brood parasitism. The American Naturalist. 187, (6), 797-803 (2016).
  63. Rust, R. W. Biology of Osmia (Osmia) ribifloris Cockerell (Hymenoptera: Megachilidae). J Kansas Entomol Soc. 59, 89-94 (1986).
  64. Torchio, P. F. Osmia ribifloris, a native bee species developed as a commercially managed pollinator of highbush blueberry (Hymenoptera: Megachilidae). J Kansas Entomol Soc. 63, (633), 427-436 (1990).
  65. Sanchez-Bayo, F., Goka, K. Pesticide residues and bees - A risk assessment. PLoS ONE. 9, (4), e94482 (2014).
  66. Kasiotis, K. M., Anagnostopoulos, C., Anastasiadou, P., Machera, K. Pesticide residues in honeybees, honey and bee pollen by LC-MS/MS screening: Reported death incidents in honeybees. Sci Total Environ. 485, (1), 633-642 (2014).
  67. Stanley, J., Sah, K., Jain, S. K., Bhatt, J. C., Sushil, S. N. Evaluation of pesticide toxicity at their field recommended doses to honeybees, Apis cerana and A. mellifera through laboratory, semi-field and field studies. Chemosphere. 119, 668-674 (2015).
  68. Praz, C. J., Müller, A., Dorn, S. Specialized bees fail to develop on non-host pollen: Do plants chemically protect their pollen? Ecology. 89, (3), 795-804 (2008).
  69. Sedivy, C., Müller, A., Dorn, S. Closely related pollen generalist bees differ in their ability to develop on the same pollen diet: Evidence for physiological adaptations to digest pollen. Funct Ecol. 25, (3), 718-725 (2011).
  70. Williams, N. M. Use of novel pollen species by specialist and generalist solitary bees (Hymenoptera: Megachilidae). Oecologia. 134, (2003).
  71. Graystock, P., Rehan, S. M., McFrederick, Q. S. Hunting for healthy microbiomes: determining the core microbiomes of Ceratina, Megalopta, and Apis bees and how they associate with microbes in bee collected pollen. Conserv Genet. 18, (3), 1-11 (2017).
  72. Bosch, J., Vicens, N. Relationship between body size, provisioning rate, longevity and reproductive success in females of the solitary bee Osmia cornuta. Behav Ecol Sociobiol. 60, (1), 26-33 (2006).
  73. Bosch, J., Vicens, N. Body size as an estimator of production costs in a solitary bee. Ecol Entomol. 27, (2), 129-137 (2002).
  74. Radmacher, S., Strohm, E. Factors affecting offspring body size in the solitary bee Osmia bicornis (Hymenoptera, Megachilidae). Apidologie. 41, (2), 169-177 (2010).
  75. Seidelmann, K. Open-cell parasitism shapes maternal investment patterns in the Red Mason bee Osmia rufa. Behav Ecol. 17, (5), (2006).
  76. Becker, M. C., Keller, A. Laboratory rearing of solitary bees and wasps. Insect Science. 23, (6), 918-923 (2016).
  77. Bosch, J. The nesting behaviour of the mason bee Osmia cornuta (Latr) with special reference to its pollinating potential (Hymenoptera, Megachilidae). Apidologie. 25, 84-93 (1994).
  78. Krunić, M., Stanisavljević, L., Pinzauti, M., Felicioli, A. The accompanying fauna of Osmia cornuta and Osmia rufa and effective measures of protection. B Insectol. 58, (2), 141-152 (2005).
  79. Elliott, S. E., Irwin, R. E., Adler, L. S., Williams, N. M. The nectar alkaloid, gelsemine, does not affect offspring performance of a native solitary bee, Osmia lignaria (Megachilidae). Ecol Entomol. 33, (2), 298-304 (2008).
  80. Toby Mordkoff, J. The Assumption(s) of Normality. Available from: http://www2.psychology.uiowa.edu/faculty/mordkoff/GradStats/part 1/I.07 normal.pdf (2016).
  81. Hendriksma, H. P., Härtel, S., Steffan-Dewenter, I. Honey bee risk assessment: New approaches for in vitro larvae rearing and data analyses. Methods Ecol and Evol. 2, (5), 509-517 (2011).
  82. Aupinel, P., et al. Improvement of artificial feeding in a standard in vitro method for rearing Apis mellifera larvae. B Insectol. 58, (2), 107-111 (2005).
  83. Beekman, M., Ratnieks, F. L. W. Long-range foraging by the honey-bee, Apis mellifera L. Funct Ecol. 14, (4), 490-496 (2000).
  84. Gathmann, A., Tscharntke, T. Foraging ranges of solitary bees. J Anim Ecol. 71, (5), 757-764 (2002).
  85. Greenleaf, S. S., Williams, N. M., Winfree, R., Kremen, C. Bee foraging ranges and their relationship to body size. Oecologia. 153, (3), 589-596 (2007).
  86. Bee Pollen Supplement - Bee Rescued. Available from: https://beerescued.com/product/bee-rescued-bee-pollen-supplement/ (2018).
  87. Holly-Leaf Oregon-Grape (Mahonia aquifolium) Species Details and Allergy Info, Teton county, Wyoming. Available from: http://www.pollenlibrary.com/Local/Specie/Mahonia+aquifolium/in/Teton County/WY/ (2018).
  88. Cane, J. H., Griswold, T., Parker, F. D. Substrates and Materials Used for Nesting by North American Osmia Bees (Hymenoptera: Apiformes: Megachilidae). Annals of the Entomological Society of America. 100, (3), 350-358 (2007).
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dharampal, P. S., Carlson, C. M., Diaz-Garcia, L., Steffan, S. A. In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors. J. Vis. Exp. (137), e57876, doi:10.3791/57876 (2018).More

Dharampal, P. S., Carlson, C. M., Diaz-Garcia, L., Steffan, S. A. In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors. J. Vis. Exp. (137), e57876, doi:10.3791/57876 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter