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Environment

In Vitro Élevage des abeilles solitaires : un outil pour évaluer les facteurs de risque larvaire

doi: 10.3791/57876 Published: July 16, 2018

Summary

Pulvérisations sur les plantes à fleurs peuvent vous exposer à de fortes concentrations de résidus de fongicide transmissibles par le pollen des abeilles solitaires. À l’aide d’expériences en laboratoire in vitro-larves d’abeilles élevés, cette étude examine les effets interactifs de consommer le pollen traitées par des fongicides dérivé de plantes hôte et non hôte.

Abstract

Bien que les abeilles solitaires offrent des services de pollinisation crucial pour les cultures sauvages et gérés, ce groupe riche en espèces a été largement négligé dans les études de réglementation des pesticides. Le risque d’exposition à des résidus de fongicide est susceptible d’être particulièrement élevé si le jet se produit sur ou à proximité des plantes hôtes tandis que les abeilles recueillent pollen pour provisionner leurs nids. Pour les espèces de Osmia qui consomment le pollen d’un groupe restreint de plantes (oligolecty), l’impossibilité d’utiliser le pollen provenant de plantes non hôtes peut augmenter leur facteur de risque de toxicité liée à fongicide. Ce manuscrit décrit les protocoles utilisés pour élever avec succès oligolectiques mason bees, Osmia ribifloris sensu lato, de l’oeuf au stade prénymphal au plaques de culture cellulaire dans des conditions de laboratoire normalisées. L' in vitro-élevage d’abeilles sont ensuite utilisés pour étudier les effets de la source de l’exposition et le pollen fongicide sur l’aptitude de l’abeille. Selon un plan factoriel 2 x 2 entièrement traversé, l’expérience examine les effets principaux et interactives de la source de l’exposition et le pollen fongicide sur la forme larvaire, quantifiée par la biomasse prénymphale, durée du développement larvaire et survie. Un avantage majeur de cette technique est que l’utilisation en vitro-élevage d’abeilles réduit la variabilité de fond naturel et permet la manipulation simultanée de multiples paramètres expérimentaux. Le protocole décrit présente un outil polyvalent pour hypothèses essais portant sur la suite des facteurs affectant la santé des abeilles. Pour les efforts de conservation à respecter avec des succès significatifs et durables, ces connaissances sur l’interaction complexe de facteurs physiologiques et environnementales à l’origine des déclins de l’abeille seront révélera pour être critique.

Introduction

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Compte tenu de leur rôle comme le groupe dominant des insectes pollinisateurs1, la perte globale dans les populations d’abeilles constitue une menace pour la sécurité alimentaire et l’écosystème stabilité2,3,4,5,6 ,,7. Les tendances à la baisse dans les deux populations d’abeilles sauvages et non managées ont été attribués à plusieurs facteurs de risque partagés, y compris la fragmentation de l’habitat, émergeant des parasites et pathogènes, perte de diversité génétique et l’introduction d’espèces envahissantes3 ,4,7,8,9,10,11,12. En particulier, l’augmentation spectaculaire de l’utilisation des pesticides, (p. ex., les néonicotinoïdes) a été directement liée à des effets néfastes chez les abeilles13,14,15. Plusieurs études ont montré que la synergie entre les néonicotinoïdes et ergostérol-inhibiteur de la biosynthèse des fongicides (EBI) peut entraîner une mortalité élevée à travers plusieurs abeilles espèces16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22. Néanmoins, fongicides, longtemps considéré comme « bee-safe », continuent à être pulvérisés sur les cultures en fleurs sans beaucoup d’examen minutieux23. Abeilles butineuses ont été documentés pour ramener systématiquement les masses polliniques contaminés par des résidus de fongicide24,25,26. La consommation de ce fongicides-ladenpollen peut provoquer une mortalité élevée chez les larves d’abeilles27,28,29,30et une suite d’effets sublétaux chez les abeilles adultes16 , 31 , 32 , 33 , 34. une étude récente suggère que fongicides peuvent provoquer des pertes d’abeilles en altérant la communauté microbienne au sein de la ruche-stockée pollen, perturbant ainsi les symbioses critiques entre les abeilles et les microbes transmis par pollen35.

Bien que les abeilles solitaires sont indispensables à la pollinisation de plusieurs plantes sauvages et agricoles36,37,38, ce groupe diversifié des pollinisateurs a reçu beaucoup moins d’attention dans les études de surveillance des pesticides. Le nid d’une femelle adulte solitaire contient 5-10 chambres de couvée scellées, chacun agrémentés d’une masse finie de maternellement Collector pollen et nectar et un seul oeuf39. Après l’éclosion, les larves s’appuient sur la fourniture de pollen allouée et la microflore transmises par pollen associée afin d’obtenir une nutrition adéquate40,41. Parce qu’ils n’ont pas les avantages d’un mode de vie sociale, abeilles solitaires peuvent être plus vulnérables aux pesticides exposition42. Par exemple, tandis que des déficits sociaux abeilles après une pulvérisation peut être compensée à certains étendent en travailleurs et nouvelles couvées, la mort d’une seule femelle solitaire adulte termine toute activité reproductrice43. Ces différences de sensibilité mettent en évidence la nécessité d’incorporer des taxons divers abeille en études écotoxicologiques pour assurer une protection adéquate pour les abeilles sauvages et non managée comme. Toutefois, mis à part une poignée d’études, enquêtes sur les effets de l’exposition de fongicide a surtout à abeilles sociales18,23,32,44,45 ,46,47,48,49.

Les abeilles solitaires appartenant au genre Osmia (Figure 1) ont été utilisés dans le monde entier comme des pollinisateurs efficaces de plusieurs importants fruits et noix cultures39,50,51,53, 53. comme avec les autres pollinisateurs managé regroupe24,,du5455,56,57,58, abeilles Osmia adultes sont systématiquement exposés aux fongicides pulvérisés sur les cultures en fleurs44. Femelles adultes nourrissent les cultures récemment pulvérisées peuvent recueillir et stocker leurs chambres de couvée avec du pollen de fongicide-laden, qui constitue plus tard le régime unique pour les larves en développement. Consommer les dispositions du pollen contaminé peut exposer ensuite les larves à des résidus de fongicide42. Le risque d’exposition peut être plus élevé chez les espèces d’oligolectiques qui s’alimentent uniquement sur quelques proches hôte plantes59,60,61. Certaines abeilles mégachiles, par exemple, semblent préférentiellement recherchent le pollen de faible qualité des Astéracées, comme un moyen de réduire le parasitisme62. Toutefois, l’étendue des auquel fongicides répercussions de remise en forme larvaire chez les abeilles solitaires oligolectiques n’a pas été empiriquement quantifiée. L’objectif de cette étude est d’élaborer un protocole pour tester les principaux et des effets interactifs de la source de l’exposition et le pollen fongicide sur l’aptitude de in vitro élevés des abeilles solitaires. Pour étudier, oeufs de ribifloris o. sensu lato (s.l.) peuvent être obtenus sur le marché (Table des matières). Cette population est idéale en raison de son importance comme un pollinisateur natif et sa forte prédilection pour les riches en nectar Mahonia aquifolium (Mahonia nervé) trouvés dans la région53,63,64 (Figure 2).

Figure 1
Figure 1. Une photo à haute résolution d’un adulte Osmia ribifloris. Crédit photographique Dr Jim Cane, recherche entomologiste, USDA-ARS s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Phragmite nidification roseaux de Osmia ribifloris (s.l.) avec une femelle de nidification à l’avant-plan. Partitions de chambre et prises terminales pour les anches sont construits à partir des feuilles mastiquées. Photo crédit M. Kimball Clark, NativeBees.com s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Le premier objectif de cette étude est d’évaluer l’effet de la consommation de pollen traitées par des fongicides sur la remise en forme larvaire (mesurée en termes de temps de développement et de la biomasse prénymphale). Alors que l’exposition à la propiconazole fongicide couramment appliquée a été associée à une mortalité accrue chez les abeilles adultes à travers plusieurs espèces 23,24,32,44,45, 54,55,56,57,58,65,66,67, son impact sur les abeilles larvaires est inférieur connu. Le deuxième objectif de cette étude est d’évaluer les effets de la consommation de pollen non hôte sur la forme larvaire. Des études antérieures indiquent que les larves d’abeilles oligolectiques ne parviennent pas à se développer lorsque obligés de consommer le pollen non hôtes68. Ces résultats peuvent être attribuées aux variations de l’abeille physiologie69, pollen biochimie70et le microbiome bénéfique associé à pollen naturel dispositions71. Le troisième objectif de cette étude est d’évaluer les effets interactifs de traitement fongicide et diététique pollen sur la remise en forme larvaire.

Nombreux traits biologiques, y compris la taille du corps maternel, provisionnement taux, stratégie de recherche de nourriture et quantité de pollen72,73,74,75 sont connus pour affecter une remise en forme larvaire chez les abeilles solitaires. Ces facteurs peuvent introduire une variation importante entre les roseaux, qui pose un problème dans le développement de modèles expérimentaux défendables lors de l’évaluation de santé larvaire. En outre, étant donné que le développement larvaire se produit à l’intérieur de roseaux de nidification scellé, les effets de cette variabilité sur la descendance sont difficiles à visualiser et quantifiés sans utiliser des techniques non létales (Figure 3). Pour relever ce défi, toutes les hypothèses dans cette étude sont testés à l’aide de larves élevées en dehors de leur nidification roseaux. Le protocole expérimental représente un entièrement croisées 2 × 2 factorielle tables de travail, avec chaque facteur composé de 2 niveaux ; Facteur 1 : Exposition fongicide (fongicide ; Aucun fongicide) ; Facteur 2 : Source de Pollen (hôte pollen, pollen Non-hôte). Abeilles sont déclenchés de le œuf au stade prénymphal dans les plaques de culture cellulaire multipuits stérile dans des conditions contrôlées en laboratoire. Chaque bien est approvisionné individuellement avec une quantité standardisée de provision de pollen et un seul oeuf. Après l’éclosion, la larve se nourrit du pollen alloué dans le puits, remplit le développement larvaire et initie la pupaison. Des études antérieures ont montré que la mortalité inexpliquée est plus faible chez les abeilles soulevées au sein de ce milieu d’élevage artificiel que celle rencontrée dans le sauvage49,76. L’utilisation du in vitro-élevage d’abeilles a plusieurs avantages par rapport aux études sur le terrain : 1) elle minimise les effets confondants de variabilité naturelle et incontrôlée des facteurs généralement associés aux études sur le terrain ; 2) il permet plusieurs niveaux de manipulation pour chaque facteur (s) d’intérêt à être testées simultanément dans l’ensemble des groupes de traitement ; 3) le nombre de répétitions peut être prédéterminé, et facteurs expérimentaux pour chaque répétition peuvent être manipulés individuellement ; 4) variables de réponse larves peuvent être facilement visualisés et enregistrés de façon autonome sans inquiétantes larves adjacents ; 5) le protocole peut être modifié pour tenir compte des conceptions expérimentales plus complexes impliquant de multiples facteurs et variables de réponse.

Figure 3
Figure 3. Contenu dans un roseau de nidification naturel de Osmia ribifloris (s.l.). Près (A) un roseau disséqué montrant des chambres individuelles, dispositions de pollen et des partitions et (B) fraîchement récoltés dispositions de pollen et les œufs associés (indiqués par un cercle noir). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Protocol

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1. Préparez expériences d’exposition fongicide Propiconazole Solutions

  1. Préparer 0,1 x solution fongicide en dissolvant les volumes appropriés de propiconazole achetés dans le commerce 14,3 % dans de l’eau stérile le jour de l’expérience. Veiller à ce que la seule solution fongicide fraîchement préparé est utilisée pour tous les traitements.
  2. Ajouter 23 µL de 0,1 x solution fongicide par gramme de provision de pollen pour obtenir la concentration maximale du propiconazole rapportée du pollen d’abeille Collector24 (0,361 PPM ou µg d’ingrédient actif g-1 de pollen).

2. récolte des oeufs et dispositions Pollen hôte Osmia roseaux

  1. À l’aide d’un scalpel stérilisé, disséquer fraîchement branché nidification roseaux de Osmia, diviser en deux parties sur la longueur de l’anche pour exposer les chambres individuelles.
    NOTE : Chaque nid peut contenir entre 8 et 14 chambres et un seul oeuf dans une chambre.
  2. Inspecter les roseaux visuellement afin d’identifier les chambres contenant des œufs mâles issus des directives publiées antérieurement77. Utiliser une aiguille tordue stérilisée pour supprimer chaque disposition de pollen ainsi que le œuf associée de l’anche de nidification et placer dans un endroit propre peser bateau.
  3. Doucement séparer le œuf de la disposition à l’aide d’un pinceau propre fine et enregistrer le poids frais de la fourniture de pollen et d’oeufs à l’aide d’une balance de laboratoire standard. Calculer le poids moyen des dispositions pollen mâle.
  4. Effectuez les opérations suivantes avec un délai minimal pour réduire les risques de dommages à l’oeuf d’une exposition à l’échauffement et la déshydratation.

3. préparer l’hôte plante Pollen dispositions

  1. Inspecter visuellement le pollen de plantes-hôtes maternellement recueillies exhumé dans les chambres de nidification pour s’assurer qu’aucun parasite n’est présent78. Afin de réduire tout biais potentiels maternelle, combiner les dispositions de pollen en une masse unique dans une boîte de petri stérile et mélanger bien à l’aide d’une aiguille stérilisée.
  2. Divisons la masse combinée des nouvelles dispositions de pollen, s’assurer que le poids de chaque disposition reconstitué est approximativement égal au poids moyen d’une disposition des mâle naturellement attribué (moyenne ± écart-type, 0,35 ± 0,01 g, N = 42).
    Remarque : Étant donné que Osmia sp. alloue plus petites dispositions de pollen à la descendance mâle, il en résulte un poids plus faible des larves mâles par rapport à celle des femelles,77. Pour éviter une telle partialité résultant des différences de sexe, utilisez uniquement les oeufs mâles dans les expériences.

4. préparer la fourniture de Pollen de plantes Non hôtes

  1. Pulvériser le miel acheté dans le commerce Collector bee pollen en poudre fine à l’aide d’un broyeur à billes standard de laboratoire.
  2. Basé sur la teneur des dispositions de pollen hôte maternellement Collector (~ 20 %), l’hydrate la poudre de pollen à l’aide des volumes appropriés de sucre 40 % stérilisés solution79 et mélanger soigneusement pour former une pâte consistance.
  3. Diviser en masses de pollen individuels, chacun pesant environ le même que le poids moyen d’une disposition des mâle naturellement attribué.
    NOTE : Taux d’humidité de pollen hôte maternellement recueillies dispositions peuvent être normalisées en avant en comparant le poids frais et sec des dispositions de pollen de 30 chambres hommes choisis au hasard,80. Pour obtenir le poids sec, les dispositions de pollen doivent être lyophilisées dans un lyophilisateur (1,5 Pa pendant 72 h).

5. Préparez les plaques de Culture cellulaire multipuits

  1. La ligne des puits individuels de stérile 48 puits culture avec tasses étain autoclavés (5 × 9 cm). En utilisant une pince stérile, doucement flair sur la bordure supérieure de la capsule afin qu’il peut accueillir la provision de pollen.
  2. Placez une seule masse d’hôte ou non disposition de pollen à l’intérieur de la coupe d’étain à l’aide des outils stériles basées sur le groupe de traitement.
    Remarque : Pour éviter la contamination croisée, utilisez plaques séparées pour le traitement et les groupes témoins.

6. ajouter les fongicides

  1. Faire une dépression position centrale au sein de la masse de pollen à l’aide d’un bâton en bois stérile. Utilisez un nouveau bâton pour chaque disposition de pollen.
  2. Ajouter des volumes appropriés de solution fongicide (pour traitement) ou d’eau stérile (pour les contrôles) dans la dépression. Pincez l’ouverture de la dépression à l’aide d’une pince stérile afin de minimiser la surface de contact entre le fongicide / stérile l’eau et l’oeuf.
  3. Assurez-vous que la factorielle mise en place du plan expérimental s’aligne avec celui représenté dans la représentation schématique (Figure 4).

Figure 4
Figure 4. Représentation schématique de l’installation expérimentale. L’expérience représente un entièrement traversé 2 × 2 factorielle des configurations. Facteur 1 représente l’exposition fongicide et se compose de 2 niveaux : (i) Aucun fongicide (N = 10) et (ii) fongicide (N = 10). Facteur 2 représente la source de Pollen et se compose de 2 niveaux : pollen hôte (i) (N = 8) et (ii) Non-hôte pollen (N = 8). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

7. arrière et observer les larves

  1. Placer un œuf homme choisi au hasard sur la surface supérieure de la provision de pollen à l’aide d’un pinceau propre fine. Une fois que les oeufs ont été placés sur toutes les dispositions, replacez le couvercle de la plaque de culture cellulaire, fixant avec marquage du ruban sur les coins.
  2. Placer les plaques bien sur un plateau propre et couvrez-la avec un linge foncé pour obstruer le contact avec la lumière directe. Place un puits 6 plaque contenant 30 mL d’eau stérile dans la barre d’État pour éviter la dessiccation. Laisser les bacs d’incubation à l’intérieur d’un incubateur à température ambiante.
  3. Observer des plaques bien tous les jours sous un microscope à dissection sans enlever le couvercle des plaques bien. Veiller à ce que les larves sont vivants en recherchant les mouvements. Si aucun mouvement n’est détecté, jeter la coupe étain contenant les larves mortes et la fourniture de pollen restants. Permettre à toutes les larves survivantes de développer non perturbée dans les plaques bien jusqu'à ce qu’ils atteignent le stade prénymphal.
  4. Retirez la larve de la coupe d’étain lorsqu’elle atteint le stade prénymphal41. Utilisez une brosse pour le lavage des déféquer partir du cocon de soie. Soigneusement couper à travers le cocon de soie à l’aide d’un microscope à dissection et extraire le prépupale avec une pince en caoutchouc.
  5. Gérer le prépupale doucement pour s’assurer que les outils ne pas percent le corps mou. Noter le poids frais de la prépupale (prénymphale biomasse) et la durée du développement de l’oeuf au stade prénymphal (durée du développement larvaire).
    Remarque : Toute larve morte doit être jetée immédiatement pour empêcher la croissance microbienne indésirable sur le cadavre et la fourniture de restes de pollen. Cela réduit le risque d’infection pour les larves saines restantes.

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Representative Results

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Remise en forme larvaire a été quantifiée à l’aide de trois temps du développement (i) larvaire métriques, biomasse (ii) prénymphale et (iii) le pourcentage de survie. Une ANOVA bidirectionnelle a été réalisée en utilisant une exposition de fongicide (deux niveaux : aucun fongicide, fongicide) et source de Pollen (deux niveaux : le pollen de l’hôte, pollen Non-hôte) comme les variables indépendantes et la durée du développement larvaire comme variable dépendante. L’effet principal d’exposition de fongicide (F1,28 = 1.24, P = 0,28) était non significative entre le traitées par des fongicides (moyenne ± et) (28.14 ±1.98 d, N = 14) et non traités (25.39 ± 1,65 d, N = 18) groupes. L’effet principal de la source de pollen a cependant indiqué une différence significative entre la durée du développement des larves élevées sur le pollen de l’hôte (20.00 ± 0,50 d, N = 16) et non hôtes pollen (33.19 ±0.81 d, N = 16) (F1,28 = 179.83, P < 0,001). Bonferroni corrigée posteriori comparaisons indiquent que la durée du développement larvaire ne varie pas significativement entre les deux traitées par des fongicides et non traitée soulevées sur l’accueil des groupes (P = 0,57) et non-hôtes (P = 0,32) pollen. Toutefois, la durée du développement larvaire a été significativement plus courte pour les larves élevées sur pollen hôte contre non-hôtes pollen pour toutes deux traitées par des fongicides (P < 0,001) et non traités (P < 0,001) pollen. L’effet d’interaction (source de Pollen de × d’exposition de fongicide) n’était pas significative (F1,28 = 0,09, P = 0,77). L’analyse a été répétée en utilisant la biomasse prénymphale comme variable dépendante. L’effet principal d’exposition fongicide ont indiqué une différence significative (F1,28 = 4,66, P = 0,04) entre le traitées par des fongicides (0,123 ±0, 01 g, N = 14) et non traités (0,149 ± 0,01 g, N = 18) groupes. L’effet principal de la source de Pollen (F1,28 = 56.30, P < 0,001) ont indiqué une différence significative entre les larves élevées sur le pollen de l’hôte (0.170 ± 0,01 g, N = 16) et non hôtes pollen (0,105 ± 0,01 g, N = 16) . Bonferroni corrigée posteriori comparaisons indiquent que la biomasse prénymphale ne varie pas significativement entre les deux traitées par des fongicides et non traitée soulevées sur l’accueil des groupes (P = 0,22) et non-hôtes (P = 0,08) pollen. Cependant, la biomasse prénymphale était significativement plus élevée chez les larves élevées sur pollen hôte contre non-hôtes pollen pour toutes deux traitées par des fongicides (P < 0,001) et non traités (P < 0,001) pollen. L’effet d’interaction (source de Pollen de × d’exposition de fongicide) n’était pas significative (F1,28 = 0,132, P = 0,72). Figure 5 et Figure 6 sont des représentations graphiques des résultats tirés de l’analyse susmentionnée. Indépendant des échantillons t-test indique un effet significatif de la source de pollen sur la survie des larve (N = 18, t9 =-2.45, P =0,04).

Figure 5
Figure 5. Diagramme à barres indiquant les mesures de remise en forme larvaire basé sur la durée du développement larvaire et la biomasse prénymphale. Les mesures de remise en forme larvaire sont groupées basé sur (A) et (B) source de Pollen ; et (C) et fongicide (D) l’exposition. (Moyenne ± 1 SE). P < 0,001 s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6. Terrain d’interaction pour les mesures de remise en forme larvaire. Des effets interactifs de l’exposition de fongicide et source de Pollen sur la durée du développement larvaire (A) et (B) la biomasse prénymphale. (Moyenne ± 1 SE). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Corrélation de Pearson a été utilisée pour étudier la relation entre la durée du développement larvaire et la biomasse prénymphale (Figure 7). Une corrélation négative significative a été notée dans tous les groupes de traitement (r =-0.83, P < 0,001, N = 32) et à travers les traitements fongicides (aucun fongicide : r = -0,76, P < 0,001, N = 18 ; Fongicide : r = rapport à -0,92, P < 0,001, N = 14). Même s’il existait une corrélation négative significative pour les larves élevées sur pollen non hôte (r = -0.64, P < 0,01, N = 16), pas de telle relation a été observée pour les larves élevées sur hôte-pollen (r =-0,01], P = 0,98, N = 16).

Figure 7
Figure 7. Relation entre la durée du développement larvaire et la biomasse prénymphale. Corrélation de Pearson entre durée du développement et de la biomasse prénymphale dans (A) tous les groupes de traitement (P < 0,001) source de Pollen (B) (hôte de pollen : P = 0,98, pollen Non-hôte : P < 0,01) ; (C) exposition de fongicide (aucun fongicide : P < 0,001, fongicide : P < 0,001). Pour les panneaux (B) et (C), courbes de tendance sont de couleur assortie avec les symboles dans la légende de la figure. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Video 1
Animation Figure 1. Cinquième stade larvaire stade d’o. ribifloris au sein d’un seul puits d’une plaque multipuit. La larve est reconnue pour avoir commencé à tourner un cocon de soie en préparation pour la nymphose. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

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Discussion

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Élevage d’abeilles à l’extérieur de leurs roseaux nidification naturelle, dans des conditions de laboratoire, permet l’essai de plusieurs hypothèses relatives à la remise en forme larvaire. Dans la mesure où les facteurs non identifiés continuent à causer la mortalité des abeilles, des études d’évaluation des risques à l’aide de in vitro expériences peuvent aider à identifier les menaces potentielles et informer des pratiques de gestion pour ce groupe riche en espèces de pollinisateurs sauvages 12 ,38,49,76,81,82.

En général, les temps de développement plus courts et une plus grande biomasse prénymphale est associé à remise en forme larvaire plus élevé. Dans l’ensemble de tous les traitements, durée du développement larvaire était corrélée négativement avec la biomasse prénymphale. Cependant, il y avait des différences significatives entre la durée du développement larvaire et la biomasse prénymphale tous les quatre groupes. Les larves qui n’ont pas reçu des fongicides et ont été autorisés à consommer le pollen de l’hôte avaient la plus courte durée du développement larvaire et biomasse plus élevée de prénymphale. En revanche, ces larves qui a consumé traitées par des fongicides non hôtes pollen, a eu la plus longue de développement larvaire complet et avait la plus faible biomasse prénymphale. Toutefois, les tendances pour la survie larvaire étaient moins clairs, avec mortalité étant notée que pour le groupe traitées par des fongicides soulevé sur le pollen de l’hôte. Déconstruire les effets principaux et l’interaction de l’exposition de fongicide et source de Pollen a révélé que : (i) le principal effet de la consommation de pollen traitées par des fongicides avait une incidence négative sur la biomasse prénymphale, mais la durée du développement larvaire pas. Alors qu’une étude précédente a démontré la toxicité orale aiguë chez l’adulte Osmia à des concentrations supérieures,, ces résultats suggèrent que l’exposition orale à propiconazole à concentration beaucoup plus faible peut affecter fitness en réduisant la biomasse prénymphale23 . (ii) le principal effet de la consommation de pollen non hôte a un effet négatif sur l’aptitude de larve. Ces résultats concordent avec les études déjà publiées qui suggèrent qualité de pollen (c'est-à-dire, la présence de toxines, composés protecteurs, le manque de nutriments essentiels), et des différences dans la physiologie de l’abeille peuvent restreindre l’abeilles utilisant non-hôtes pollen68 . Il est également probable que l’absence de microflore bénéfique généralement acquis d’hôte-pollen et/ou abeille récolte peut exacerber cet effet. (iii) il n’y a aucune interaction significative entre l’exposition de fongicide et source de Pollen sur la remise en forme larvaire. Inter-groupe traitées par des fongicides et non traitées, larves consommant non-hôtes pollen était significativement plus faible biomasse prépupe et plue larvaire durée du développement par rapport aux larves élevées sur le pollen de l’hôte. Quelle que soit la source de pollen, les larves consomment des dispositions traitées par des fongicides avaient significativement plus faible biomasse prénymphale par rapport aux larves élevées sur pollen non traitée. Mis à part les principaux effets importants, l’effet interactif de ces deux facteurs étaient conformes au modèle additif, c'est-à-dire, les effets négatifs de type exposition et pollen de fongicide sur la remise en forme larvaire n’étaient pas synergiques. Les incertitudes découlant de l’interaction entre les différents déterminants de la santé des abeilles (comme détaillé ici), limitent l’efficacité des stratégies de gestion des pollinisateurs. En aidant à prédire les effets interactifs de multiples facteurs de risque, les résultats des expériences de laboratoire semblables peuvent aider à contourner ce défi de longue date dans les efforts de conservation d’abeille.

Il y a plusieurs étapes critiques au sein de ce protocole qui peuvent influencer le résultat de l’expérience. La mesure du possible, il est conseillé d’utiliser bio pollen qui est exempte de résidus de pesticides. À l’aide de pollen provenant de sources inconnues augmente le risque de contamination par divers produits agrochimiques, qui peut confondre les résultats expérimentaux. Il est important d’obtenir fraîchement bouchés Osmia roseaux de nidification afin que seulement les œufs non éclos ou les très jeunes larves sont utilisées dans l’étude. Cela garantit que les larves sont posent presque entièrement sur le type de traitement envisagé pollen. Le roseau de nidification doit être disséqué en appliquant une incision peu profonde, faute de quoi le pollen et les œufs peuvent être endommagés pendant la récolte. Après ont retiré les oeufs doivent être manipulés délicatement pour éviter d’endommager et conservés dans les bateaux de peser dans un environnement hygiénique foncé frais (p. ex., prévention des risques biotechnologiques armoire) jusqu'à ce qu’ils soient transférés. Ce temps de retenue devrait être réduit au minimum (< 30 min) pour s’assurer que la qualité de l’oeuf n’est pas compromise. Toutes les procédures doivent être effectuées dans une armoire pour assurer un nettoyage biosafety milieu de travail et réduire les risques de contamination. Afin d’assurer leur efficacité, n’utilisez des solutions fraîchement préparées fongicide pour les traitements. Étant donné que le pollen est hydrophobe, la solution fongicide / eau stérile doit être introduit dans la dépression dans les dispositions de pollen. Cela maximise le volume de liquide imprégnant grâce à la prestation. Cependant, il est important que la dépression ne pas percer toute la profondeur de la disposition, tel qu’il se traduirait par la perte de volume de la solution adhère à la capsule parole. Les soins individuels et les contrôles se fasse dans des plaques bien distinctes afin de réduire les risques de contamination croisée des composés volatils et/ou transmises par pollen microbiote. Morceaux de ruban plié doivent être fixés sur les bords de la plaque pour permettre à entrefer suffisant une fois que les couvercles sont en place. Au cours des observations quotidiennes, les plaques doivent être manipulés délicatement pour minimiser la perturbation les larves. Observations doivent être effectuées sous le microscope avec une intensité lumineuse minimale, et les couvercles ne doivent pas être supprimés, à moins que d’écarter les larves mortes. En cas de mortalité généralisée inattendue, les larves et leurs dispositions de pollen doivent être inspectées visuellement pour rechercher les signes de l’infection et infestation. Les plats contenant les réplicats compromis doivent être immédiatement mis au rebut, l’espace de travail désinfectée et outils stérilisé pour empêcher la propagation de l’infection.

Sans préjudice de son application large, il y a certaines limites à cette méthode. Par exemple, il est recommandé d’utiliser le pollen bio dès que disponible, élever des plantes dans un décor à effet de serre pour produire des quantités suffisantes de pur pollen non contaminé est logistiquement prohibitif. Dans ce cas, pollen prélevés peut-être servir, autant qu’il est projeté pour la présence de résidus de pesticides. Une autre stratégie pour réduire le risque de contamination lors de l’utilisation de pollen prélevés est d’obtenir le pollen provenant d’une source qui est moins susceptible d’avoir été pulvérisé (p. ex., zones non perturbées vierges situés loin des exploitations agricoles). Le pollen de l’hôte utilisé dans cette étude proviennent de nidification de roseaux qui ont été placés dans des forêts naturelles et les Prairies qui entourent les contreforts de la chaîne de Wasatch près de Kaysville, Utah. Étant donné que cette région est dominée par des forêts naturelles sauvages, non managés loin des zones agricoles commerciales et que ces abeilles ne volent pas autant que les abeilles lorsque se nourrir83,84,85, il est extrêmement peu probable que le pollen qu’ils recueillies ont été pulvérisé. Ainsi, les résidus de pesticides dans le pollen recueillis ici sont susceptibles d’être trivial. Recherche de nourriture dans ces paysages sauvages, la femelle adulte est moins susceptible de rencontrer des pollens contaminés, réduisant les risques d’exposition chez les larves. Le pollen d’abeille achetée dans le commerce utilisé dans cette étude est récolté dans des zones boisées naturelles dans le nord du Wisconsin et du Michigan. Commercialisées pour la consommation humaine, les renseignements accessibles au public et communication personnelle avec le fournisseur indique que les ruches ne sont pas traités chimiquement, et le pollen est vendu sous sa forme naturelle, brut sans aucune modification86. Par conséquent, il est raisonnable de supposer que la charge de contaminants dans le pollen d’abeille achetée dans le commerce serait minime. Pour les études qui n’obtiennent pas de pollen des zones non managés avec végétation naturelle sauvage, il est conseillé d’avoir directe preuve empirique de l’analyse pollinique chimie pour que le pollen utilisé pour des tests de risque soit contaminant gratuit. Une autre limitation implique la ruse introduit par le milieu d’élevage artificiel. Malgré tous les efforts, il n’est pas logistiquement faisable de reproduire le microenvironnement exact dans un roseau de nidification naturel (p. ex.., l’humidité, la concentration en oxygène, la structure tridimensionnelle des chambres individuelles), qui peuvent avoir une incidence larvaire remise en forme à degrés inconnus. Pour défendable simuler les caractéristiques de l’alimentation naturelle, les données préliminaires de roseaux de nidification doivent être obtenues avant des études manipulation in vitro diète. Bien que le pollen non hôte utilisé dans cette étude est obtenu à partir des zones où le mahonia est absent ou rare87, il peut y avoir des traces de pollen hôte mélangé dans le pollen acheté dans le commerce, susceptibles d’influer sur les résultats. Un autre inconvénient de cette technique est que le stress au cours de la période expérimentale de manipulation peut provoquer des effets néfastes sur les abeilles. Enfin, alors qu’il est fréquent de rencontrer des oeufs non éclos en nature63, dans des conditions de laboratoire il est difficile de déterminer si l’omission d’éclore était due à la manipulation des stress, traitement expérimental ou le résultat de causes naturelles. Étant donné que ces facteurs peuvent introduire inconnus degrés de partialité dans l’étude, il faut utiliser attention tout en interprétant les résultats obtenus.

En tenant compte de facteurs qui peuvent biaiser les résultats expérimentaux (par exemple, de l’efficacité alimentaire maternelle75, sexe variations77et diététique pollen68,72), manifestement le protocole décrit fournit des améliorations substantielles plus précédemment publié techniques76et offre un cadre plus rigoureux pour tester des hypothèses. Par exemple, en utilisant en vitro-élevage d’abeilles permet une enquête sexe réponses au traitement xénobiotique, qui serait autrement difficile à étudier parmi les populations sauvages de cavernicoles abeilles49,,88. Le potentiel pour manipuler et tester plusieurs facteurs qui interagissent (p. ex., qualité du régime et quantité, microbiote liés à l’alimentation, l’exposition aux pesticides synergiques), peut fournir des renseignements précieux sur les principaux déterminants d’aptitude de l’abeille. La souplesse du protocole permet facilement de modifications (p. ex., en utilisant différentes dimension des plaques bien pour accueillir des larves de différentes tailles, en changeant le type et la quantité de nourriture), ce qui en fait se prêtent pour une utilisation avec plusieurs autres espèces de guêpes et les abeilles solitaires 76. alors que cette étude a évalué remise en forme basée sur le développement et la survie à la phase d’alimentation, insectes peuvent être incubés jusqu'à apparition d’obtenir des données supplémentaires sur le taux d’émergence, conversion de la nourriture à la carrosserie et la longévité de postlevée 49. ces informations peuvent aider à évaluer les effets sublétaux des traitements dans les épreuves de toxicité. Un intérêt croissant pour la fonction du pollen-microbiome, études en laboratoire peuvent s’identifier sensible par rapport aux espèces d’abeilles résistantes basés sur leur pollen microbiote71. Différences dans la susceptibilité de fongicide inter-groupe d’abeilles peuvent être explorées en séquençant le microbiote dans pollen stocké à la ruche. Cela peut aider à déterminer le rôle du microbiome pollen lorsqu’il a conféré des degrés de résistance à des stress xénobiotiques. Les études à venir peuvent aussi aider à identifier les différences entre la microflore naturelle du pollen hôte et non hôte, peut-être constituer un facteur sous-jacent oligolectiques comportement au sein des espèces d’abeilles select au volant.

L’élevage in vitro des abeilles solitaires larvaires peut aider à contrôler pour la variabilité naturelle, connue dans la nature, délimitant ainsi le rôle des facteurs individuels et qui interagissent en affectant l’aptitude de l’abeille. Cette technique peu coûteuse et accessible dilate toolkit des entomologistes en tenant compte de la manipulation des paramètres multiples, qui peuvent être facilement modifiés aux objectifs spécifiques de recherche adresse. Si les preuves provenant des expériences in vitro peut aider à identifier les populations à risque, l’impact sur les stratégies de conservation abeille seront considérable.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs remercient Kimball Clark et Tim Krogh pour fournir des roseaux nidification Osmia , Meredith Nesbitt et Molly Bidwell d’assistance dans le laboratoire, les Drs Cameron Currie, Christelle Guédot, Terry Griswold, Michael Branstetter et trois évaluateurs anonymes pour leurs commentaires utiles qui ont amélioré le manuscrit. Ce travail a été soutenu par des fonds de la USDA-Agricultural Research Service ouvert (Current Research Information System #3655-21220-001), Wisconsin Department of Agriculture, le commerce et la Protection des consommateurs (#197199), National Science Foundation (sous Grant no DEB-1442148), le centre de recherche de bioénergie DOE Great Lakes (DOE Office of Science, DE BER-FC02-07ER64494).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
eggs of O. ribifloris sensu lato (s.l.) Kaysville, Davis County, Utah, USA
Osmia reeds Nativebees.com NA Freshly plugged reeds
Dissection set VWR 89259-964 Sterilize before use
Long Nose Pliers Husky 1006
6 well culture plates VWR 10062-892 Sterile sealed
48 well culture plates VWR 10062-898 Sterile sealed
Petri dishes VWR 25373100 Sterile sealed
Square Weighing Boats VWR 10770-448
Camel Hair Brush Bioquip 1153A
Tin capsules EA Consumables D1021 Sterilize before use
Sucrose VWR 470302-808
Propiconazole 14.3 Quali-Ppro 60207-90-1 Propiconazole 14.3%
Honey bee pollen Bee energised 897098001244 Untreated, natural, raw pollen
Microbalance VWR 10204-990
Pulverisette LAB SYNERGY INC. 30334913
Wooden sticks VWR 470146908 Sterilize before use
Sealing tape VWR 89097-912
Microscope VWR 89403-384
Planting tray VWR 470150-632
Ethanol VWR BDH1158-4LP
Centrifuge tube VWR 21008936
Microsyringe Cole-Palmer UX-07940-07
Rubber tweezer Amazon B0135HWPN4
Syringe needles VWR 89219-334
Freeze drier Labcono LFZ-1L
Statistical software SPSS Version 21.0

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<em>In Vitro</em> Élevage des abeilles solitaires : un outil pour évaluer les facteurs de risque larvaire
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Dharampal, P. S., Carlson, C. M., Diaz-Garcia, L., Steffan, S. A. In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors. J. Vis. Exp. (137), e57876, doi:10.3791/57876 (2018).More

Dharampal, P. S., Carlson, C. M., Diaz-Garcia, L., Steffan, S. A. In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors. J. Vis. Exp. (137), e57876, doi:10.3791/57876 (2018).

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