Fungicid sprayer på blommande växter kan utsätta solitära bin för höga halter av pollen-burna fungicid rester. Med hjälp av laboratoriebaserade experiment med in vitro--uppfödda bee larver, denna studie undersöker de interaktiva effekterna av att konsumera fungicid-behandlade pollen från växter som värd och icke-värd.
Solitära bin ger avgörande pollinering tjänster för vilda och hanterade grödor, har artrika gruppen till stor del förbisetts i bekämpningsmedel förordning studier. Risken för exponering för bekämpningsmedelsrester till fungicid sannolikt särskilt hög om sprayen inträffar på eller nära värdväxter medan Bina samlar pollen för att etablera sina bon. För arter av Osmia som förbrukar pollen från en utvald grupp av växter (oligolecty), kan oförmåga att använda pollen från icke-värdväxter öka deras riskfaktor för fungicid-relaterad toxicitet. Detta manuskript beskriver protokoll som används för att framgångsrikt bakre oligolectic mason bin, Osmia ribifloris sensu lato, från ägg till prepupal skede inom cell kultur plattor under standardiserade laboratorieförhållanden. Den i vitro-uppfödda bin används därefter för att undersöka effekterna av fungicid exponering och pollen källa på bee fitness. Baserat på en 2 × 2 fullt korsade faktoriell design, undersöker experimentet fungicid exponering och pollen källa huvudsakliga och interaktiva effekter på larval fitness, kvantifieras av prepupal biomassa, larval utvecklande tid och efterlevande. En stor fördel med denna teknik är att använda i vitro-uppfödda bina minskar naturlig bakgrund variabilitet och tillåter samtidig manipulering av flera experimentella parametrar. Protokollet beskrivs presenterar ett mångsidigt verktyg för hypoteser testning som rör sviten av faktorer som påverkar binas hälsa. För bevarandeinsatser uppfyllas med betydande, varaktig framgång, kommer att sådana insikter i det komplexa samspelet mellan fysiologiska och miljömässiga faktorer som driver bee nedgångar visa sig vara kritiska.
Den globala förlusten i bisamhällena med tanke på sin roll som den dominerande gruppen av insekter pollinatörer1, och utgör ett hot mot livsmedelssäkerheten och ekosystemens stabilitet2,3,4,5,6 ,7. De minskande trenderna i både hanterade och vilda bisamhällena har tillskrivits flera delade riskfaktorer inklusive livsmiljö fragmentering, framväxande parasiter och patogener, förlust av genetisk mångfald och införandet av invasiva arter3 ,4,7,8,9,10,11,12. I synnerhet har den dramatiska ökningen av användningen av bekämpningsmedel, (t.ex. neonicotinoids) varit direkt knuten till skadliga effekter bland bina13,14,15. Flera studier har visat att synergism mellan neonicotinoids och ergosterol biosyntes-hämmande (EBI) svampmedel kan leda till hög dödlighet över flera bee arter16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22. ändå, fungicider, länge anses vara ‘bee-safe’, fortsätta att sprayas på-bloom grödor utan mycket kontroll23. Födosökande bina har dokumenterats för att rutinmässigt föra tillbaka pollen laster förorenade med fungicid rester24,25,26. Konsumtionen av sådana fungicid-ladenpollen kan orsaka hög dödlighet bland larval bin27,28,29,30, och en svit av subletala effekter bland vuxna bin16 , 31 , 32 , 33 , 34. en nyligen genomförd studie tyder på att fungicider kan orsaka bee förluster genom att ändra mikrobiell gemenskapen inom hive-lagrade pollen, därmed störa de kritiska symbios mellan bin och pollen-burna mikrober35.
Även om solitära bin är mycket viktiga för pollineringen av flera vilda och jordbrukets växter36,37,har38, denna mångskiftande grupp av pollinatörer fått mycket mindre uppmärksamhet i bekämpningsmedel uppföljningsstudier. Boet av en vuxen ensam kvinna innehåller 5-10 förseglade barnaskara chambers, var fylld med en ändlig massa maternellt-samlat pollen och nektar, och ett enda ägg39. Efter kläckningen lita larver på tilldelade pollen tillhandahållandet, och den associerade pollen-burna bakterieflora att erhålla tillräcklig näring40,41. Eftersom de saknar fördelarna med en social livsstil, kan solitära bin vara mer utsatta för bekämpningsmedel exponering42. Till exempel, medan brister i sociala bin efter en spray kan kompenseras till några förlänga med arbetstagare och döden av en enda vuxen ensam hona nya framväxande barnaskara, och slutar alla reproduktiv aktivitet43. Sådana skillnader i känslighet belysa behovet av att införliva olika bee taxa i ekotoxikologiska studier för att säkerställa ett adekvat skydd för hanterade och vilda bin som är likadana. Men bortsett från en handfull studier, undersökningar om effekterna av fungicid exponering har främst fokuserat på sociala bin18,23,32,44,45 ,46,47,48,49.
Solitära bin tillhör släktet Osmia (figur 1) har använts över hela världen som effektiva pollinatörer av flera viktiga frukt och mutter grödor39,50,51,53, 53. som med andra hanterade pollinerare grupper24,54,55,56,57,58, vuxen Osmia bin är rutinmässigt utsatt för fungicider som sprutas på i-bloom grödor44. Vuxna honor födosöka på nyligen besprutade grödor kan samla in och lagerför deras avels chambers med fungicid-lastad pollen, som senare utgör den enda kosten för utveckla larverna. Konsumera förorenade pollen bestämmelserna kan därefter utsätta larverna till fungicid rester42. Risken för exponering kan vara högre bland oligolectic arter som födosöker endast på några närbesläktade värd växter59,60,61. Vissa megachilid bin, tycks till exempel prioriterat fodergrödor för låg kvalitet korgblommiga växter pollen, som ett sätt att minska parasitism62. Dock har i vilken utsträckning som fungicider påverka larval fitness bland oligolectic solitära bin inte empiriskt kvantifierats. Målet med denna studie är att utveckla ett protokoll för att testa huvudsakligen och interaktiva effekter av fungicid exponering och pollen källa på fitness av in vitro- uppfödda solitära bin. För att undersöka, ägg av O. ribifloris sensu lato (s.l.) kan erhållas kommersiellt (tabell av material). Denna population är idealisk på grund av dess betydelse som en infödd pollinerare och dess stark förkärlek för den nektar-rika Mahonia aquifolium (Oregon druva) finns inom den regionen53,63,64 (Figur 2).
Figur 1. Ett högupplöst foto av en vuxen Osmia ribifloris. Foto kredit Dr Jim Cane, forskning entomolog, USDA-ARS vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2. Phragmite häckande vass i Osmia ribifloris (s.l.) med en häckande hona i förgrunden. Kammaren partitioner och terminal pluggar för vassen är tillverkade av masticeras blad. Foto kredit Mr Kimball Clark, NativeBees.com vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Det första syftet med denna studie är att utvärdera effekten av konsumerar fungicid-behandlade pollen på larval fitness (mätt utvecklingstid och prepupal biomassa). Medan exponering för den allmänt tillämpade fungicid propikonazol har kopplats till ökad dödlighet hos vuxna bin över flera arter 23,24,32,44,45, 54,55,56,57,58,65,66,67, dess inverkan på larval bin är mindre känd. Det andra syftet med denna studie är att utvärdera effekterna av konsumera icke-host pollen på larval fitness. Tidigare studier visar att larver av oligolectic bina misslyckas med att utveckla när de tvingas att konsumera icke-host pollen68. Sådana resultat kan tillskrivas variationer i bee fysiologi69, pollen biokemi70och den nyttiga mikrobiomet är associerad med naturliga pollen bestämmelser71. Det tredje målet med denna studie är att utvärdera fungicid behandling och kost pollen interaktiva effekter på larval fitness.
Många biologiska egenskaper inklusive moderns storlek, är etablering takt, födosökande strategi och pollen kvantiteten72,73,74,75 kända att påverka larval fitness hos solitära bin. Dessa faktorer kan införa betydande variabilitet mellan vassen, som utgör en utmaning utveckla försvarbart experimentell design vid bedömningen av larval hälsa. Dessutom, med tanke på att larver utveckling sker inuti slutna häckande vassen, effekterna av sådana variationer på avkomman är svårt att visualisera och kvantifierade utan att använda icke-dödliga metoder (figur 3). För att övervinna denna utmaning, testas alla hypoteser inom denna studie via larver som föds upp utanför deras häckande vassen. Experimentell design representerar en fullt korsade 2 × 2 faktoriell uppställningar, med varje faktor bestående av 2 nivåer; Faktor 1: Fungicid exponering (fungicid; Ingen fungicid); Faktor 2: Pollen källa (värd pollen, icke-host pollen). Bina höjs från ägg till prepupal scenen inom sterila rundbottnade cell kultur plattor under kontrollerade laboratorieförhållanden. Vart är individuellt välfyllda med en standardiserad mängd pollen bestämmelse och ett ägg. Efter kläckningen, larven livnär sig på tilldelade pollen inom brunnen, slutför larval development och initierar förpuppningen. Tidigare studier har visat att oförklarliga dödligheten är lägre bland bina upp inom denna artificiell uppfödning miljö än som uppstått i den vilda49,76. Användning av in vitro-uppfödda bina har flera fördelar över fältet-baserade studier: 1) det minimerar störande effekterna av naturliga variationer och okontrollerad faktorer som vanligtvis förknippas med fält-baserade studier; (2) det tillåter flera nivåer av manipulation för varje faktorer av intresse för provas samtidigt mellan behandlingsgrupperna; (3) antalet replikat kan vara förutbestämd, och experimentella faktorer för varje replikat kan manipuleras individuellt; 4) larval svar variabler kan enkelt visualiseras och inspelade självständigt utan störande intilliggande larver; 5) protokollet kan ändras för att rymma mer komplexa experimentell design som involverar flera faktorer och svar variabler.
Figur 3. Innehållet inom en naturlig häckande reed av Osmia ribifloris (s.l.). Närbild av (A) en dissekerade reed visar enskilda chambers, pollen bestämmelser, och partitioner och (B) nymalen skördas pollen bestämmelser och associerade äggen (märkt med en svart cirkel). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Uppfödning bin utanför deras naturliga häckande vassen, under laboratorieförhållanden, tillåter testning av flera hypoteser som rör larval fitness. I den utsträckning som oidentifierade faktorer fortsätter att orsaka bidödligheten, riskerar bedömning studier kan in vitro- experiment hjälp identifiera potentiella hot och informera förvaltningsmetoder för denna art-rik grupp av vilda pollinatörer 12 ,38,49…
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Kimball Clark och Tim Krogh för att tillhandahålla Osmia häckande vassen, Meredith Nesbitt och Molly Bidwell för stöd i labbet, Drs. Cameron Currie, Christelle Guédot, Terry Griswold, Michael Branstetter och tre anonyma granskare för deras värdefulla synpunkter som förbättrat manuskriptet. Detta arbete stöds av USDA-Agricultural Research Service avsatt medel (nuvarande forskning Information System #3655-21220-001), Wisconsin Department of Agriculture, handel och konsumentskydd (#197199), National Science Foundation (under Bidrag nr. DEB-1442148), DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (DOE Office av vetenskap BER DE-FC02-07ER64494).
eggs of O. ribifloris sensu lato (s.l.) | Kaysville, Davis County, Utah, USA | ||
Osmia reeds | Nativebees.com | NA | Freshly plugged reeds |
Dissection set | VWR | 89259-964 | Sterilize before use |
Long Nose Pliers | Husky | 1006 | |
6 well culture plates | VWR | 10062-892 | Sterile sealed |
48 well culture plates | VWR | 10062-898 | Sterile sealed |
Petri dishes | VWR | 25373100 | Sterile sealed |
Square Weighing Boats | VWR | 10770-448 | |
Camel Hair Brush | Bioquip | 1153A | |
Tin capsules | EA Consumables | D1021 | Sterilize before use |
Sucrose | VWR | 470302-808 | |
Propiconazole 14.3 | Quali-Ppro | 60207-90-1 | Propiconazole 14.3% |
Honey bee pollen | Bee energised | 897098001244 | Untreated, natural, raw pollen |
Microbalance | VWR | 10204-990 | |
Pulverisette | LAB SYNERGY INC. | 30334913 | |
Wooden sticks | VWR | 470146908 | Sterilize before use |
Sealing tape | VWR | 89097-912 | |
Microscope | VWR | 89403-384 | |
Planting tray | VWR | 470150-632 | |
Ethanol | VWR | BDH1158-4LP | |
Centrifuge tube | VWR | 21008936 | |
Microsyringe | Cole-Palmer | UX-07940-07 | |
Rubber tweezer | Amazon | B0135HWPN4 | |
Syringe needles | VWR | 89219-334 | |
Freeze drier | Labcono | LFZ-1L | |
Statistical software | SPSS | Version 21.0 |