Fungicid sprays på blomsterplanter kan udsætte ensomme bier for høje koncentrationer af pollen-bårne fungicid restkoncentrationer. Ved hjælp af laboratoriebaserede eksperimenter, der involverer in vitro--opdrættet bee larver, dette studie undersøger de interaktive effekter af forbrugende fungicid behandlet pollen stammer fra vært og ikke-vært planter.
Selv om ensomme bier tjenesteydelser afgørende bestøvning for vilde og administrerede afgrøder, har denne artsrige gruppe i høj grad blevet overset i pesticid forordning undersøgelser. Risikoen for eksponering for fungicid rester forventes at være særlig stor hvis spray opstår på eller i nærheden af værtsplanter mens bierne indsamler pollen til at klargøre deres reder. For arter af Osmia , der forbruger pollen fra en udvalgt gruppe af planter (oligolecty), kan manglende evne til at bruge pollen fra ikke-værtsplanter øge deres risikofaktor for fungicid-relateret toksicitet. Dette manuskript beskriver protokoller, der bruges til med held bageste oligolectic mason bier, Osmia ribifloris sensu lato, fra æg til prepupal fase inden for celle kultur plader under standardiserede laboratorieforhold. Til i vitro-opdrættet bier bruges efterfølgende til at undersøge virkningerne af fungicid eksponering og pollen kilde på bee fitness. Baseret på et 2 × 2 krydsede fuldt faktordesign, undersøger eksperimentet vigtigste og interaktive virkningerne af fungicid eksponering og pollen kilde på larve fitness, kvantificeres ved prepupal biomasse, larve udviklingsmæssige tid og efterladte. En stor fordel ved denne teknik er at bruge in vitro--opdrættet bier reducerer naturlige baggrund variabilitet og tillader den samtidige manipulation af flere eksperimentelle parametre. Den beskrevne protokol præsenterer et alsidigt værktøj til hypoteser test involverer suite af faktorer, der påvirker biers sundhed. For bevarelse bestræbelser på at blive mødt med betydelig, varig succes, sådan indsigt i den komplekse samspil mellem fysiologiske og miljømæssige faktorer køre bee falder vil vise sig for at være kritisk.
I betragtning af deres rolle som den dominerende gruppe af insekt bestøvere1, udgør den globale tab i bibestandene en trussel mod fødevaresikkerheden og økosystem stabilitet2,3,4,5,6 ,7. De faldende tendenser i både administrerede og vilde bibestandene er blevet tilskrevet flere fælles risikofaktorer, herunder habitat fragmentering, nye parasitter og patogener, tab af genetisk mangfoldighed og indførelsen af invasive arter3 ,4,7,8,9,10,11,12. Især den dramatiske stigning i brugen af pesticider, (f.eks. neonicotinoids) har været direkte forbundet med skadelige virkninger blandt bier13,14,15. Flere undersøgelser har vist, at synergi mellem neonicotinoids og ergosterol-biosyntesen-hæmmende (EBI) fungicider kan føre til høj dødelighed på tværs af flere bee arter16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22. dog fungicider, længe anset for at være ‘bi-safe’, fortsat skal sprøjtes på-bloom afgrøder uden megen kontrol23. Fouragering bier har dokumenteret at rutinemæssigt bringe tilbage pollen belastninger forurenet med fungicid restkoncentrationer24,25,26. Forbruget af sådanne fungicid-ladenpollen kan forårsage høj dødelighed blandt larve bier27,28,29,30, og en række subletale virkninger blandt voksne bier16 , 31 , 32 , 33 , 34. en nylig undersøgelse antyder, at fungicider kan forårsage bee tab ved at ændre den mikrobielle samfund inden for hive-gemt pollen, dermed forstyrre de kritiske symbioser mellem bier og pollen-bårne mikrober35.
Selv om ensomme bier er af afgørende betydning for bestøvningen af flere vilde og landbruget planter36,37,har38, denne forskelligartede gruppe af bestøvere fået langt mindre opmærksomhed i pesticid overvågning undersøgelser. Rede af en voksen ensom kvinde indeholder 5-10 forseglet yngel kamre, hver fyldt med en begrænset masse maternally indsamlet pollen og nektar og et enkelt æg39. Efter klækning afhængige larverne af, at den tildelte pollen bestemmelse, og den tilknyttede pollen-bårne mikrobiota at få tilstrækkelig ernæring40,41. Fordi de mangler fordelene ved en social livsstil, kan ensomme bier være mere sårbare over for pesticider eksponering42. For eksempel, mens underskud i sociale bier efter en spray kan udlignes til nogle udvide af arbejdstagere og nyopstået yngel, død af en enkelt voksen ensom kvinde slutter alle reproduktiv aktivitet43. Sådanne forskelle i modtagelighed behovet for at inkorporere forskellige bee taxa i økotoksikologiske undersøgelser for at sikre tilstrækkelig beskyttelse for administrerede og vilde bier ens. Men, bortset fra en håndfuld af undersøgelser, undersøgelser af virkningerne af fungicid eksponering har primært fokuseret på sociale bier18,23,32,44,45 ,46,47,48,49.
Ensomme bier tilhører slægten Osmia (figur 1) er blevet anvendt over hele verden som effektivt bestøvere af flere vigtige frugt og nut afgrøder39,50,51,53, 53. som med andre administrerede bestøver grupper24,54,55,56,57,58, voksen Osmia bier er rutinemæssigt udsat for fungicider, der sprøjtes på i bloom afgrøder44. Voksne hunner fouragering for nylig sprøjtede afgrøder kan indsamle og lagerføre deres yngel kamre med fungicid-laden pollen, som senere danner den eneste kost for udviklingslandene larverne. Forbrugende forurenet pollen bestemmelser kan efterfølgende udsætte larverne til fungicid restkoncentrationer42. Risikoen for eksponering kan blive højere blandt oligolectic arter, at fouragere kun på et par nært beslægtede vært planter59,60,61. Visse megachilid bier, for eksempel vises at fortrinsvis fouragere for lav kvalitet Asteraceae pollen, som et middel til at reducere parasitisme62. Imidlertid har i omfang som fungicider påvirke larve fitness blandt oligolectic ensom bier ikke været empirisk kvantificeret. Målet med denne undersøgelse er at udvikle en protokol for at afprøve hovedsagen og interaktive virkningerne af fungicid eksponering og pollen kilde på fitness af in vitro- opdrættet ensomme bier. For at undersøge, æg af O. ribifloris sensu lato (s.l.) kan være fremstillet kommercielt (tabel af materialer). Denne population er ideelt på grund af dens betydning som en native bestøvere, og dens stærk forkærlighed for nektar-rige Mahonie aquifolium (Oregon grape) fundet i region53,63,64 (Figur 2).
Figur 1. En høj opløsning billede af en voksen Osmia ribifloris. Foto kredit Dr. Jim Cane, forskning entomolog, USDA-ARS venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Phragmite nesting siv af Osmia ribifloris (s.l.) med en rugende kvinde i forgrunden. Salen partitioner og terminal stik for rørene er konstrueret af masticated blade. Foto kredit Mr. Kimball Clark, NativeBees.com venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Det første mål for denne undersøgelse er at evaluere effekten af forbrugende fungicid behandlet pollen på larve fitness (målt i udviklingstid og prepupal biomasse). Mens udsættelse for almindeligt anvendte fungicid propiconazol har været forbundet med øget dødelighed blandt voksne bier på tværs af flere arter 23,24,32,44,45, 54,55,56,57,58,65,66,67, dens indvirkning på larve bier er mindre kendt. Det andet formål med denne undersøgelse er at evaluere virkningerne af forbrugende ikke-vært pollen på larve fitness. Tidligere undersøgelser viser, at larver af oligolectic bier undlader at udvikle når tvunget til at forbruge ikke-vært pollen68. Sådanne resultater kan henføres til variationer i bee fysiologi69, pollen biokemi70og den gavnlige microbiome forbundet med naturlige pollen bestemmelser71. Det tredje mål i denne undersøgelse er at vurdere interaktive virkningerne af fungicidbehandling og kosten pollen på larve fitness.
Mange biologiske træk herunder maternel kropsstørrelse, er tilførselssats, fouragering strategi og pollen mængde72,73,74,75 kendt for at påvirke larve fitness blandt ensomme bier. Disse faktorer kan indføre betydelig variation mellem siv, som udgør en udfordring i at udvikle forsvarligt eksperimentelle design ved vurderingen af larve sundhed. Desuden, eftersom larve udvikling opstår inde i forseglet nesting siv, virkningerne af sådanne udsving på afkommet er svært at visualisere og kvantificerede uden brug af ikke-dødelige teknikker (figur 3). For at overvinde denne udfordring, er alle hypoteser inden for denne undersøgelse testet ved hjælp af larver opdrættes uden for deres nesting siv. Den eksperimentelle design repræsenterer en fuldt krydsede 2 × 2 factorial set-ups, med hver faktor, bestående af 2 niveauer; Faktor 1: Fungicid eksponering (fungicid; Ingen fungicid); Faktor 2: Pollen kilde (vært pollen, Non-vært pollen). Bier er rejst fra ægget den prepupal fase inden for steril multiwell celle kultur plader under kontrollerede laboratorieforhold. Hver er individuelt velforsynet med et standardiseret beløb af pollen bestemmelse og et enkelt æg. Efter klækning, larve feeds på den tildelte pollen i brønden, fuldender larve udvikling og indleder pupation. Tidligere undersøgelser har vist, at uforklarlige dødeligheden er lavere blandt bier rejst i denne kunstige opdræt miljø end den, der opstod i vilde49,76. Brug af in vitro-opdrættet bier har flere fordele sammenlignet med felt-baserede studier: 1) det minimerer de forstyrrende effekter af naturlig variabilitet og ukontrolleret faktorer typisk forbundet med felt-baserede undersøgelser; 2) det giver mulighed for flere niveauer af manipulation for hver faktor(med) af interesse skal testes samtidigt på tværs af behandlingsgrupper; 3) antallet af gentagelser kan være forudbestemt, og eksperimenterende faktorer for hver replikat kan bearbejdes individuelt; 4) larve svar variabler kan nemt visualiseres og registreret selvstændigt uden forstyrrende tilstødende larver; 5) protokollen kan ændres til at rumme mere komplekse eksperimentelle design med flere faktorer og svar variabler.
Figur 3. Indholdet i en naturlig nesting reed af Osmia ribifloris (s.l.). Nærbillede af (A) en dissekeret reed viser individuelle kamre, pollen bestemmelser, og partitioner og (B) frisk høstet pollen bestemmelser, og de tilknyttede æg (angivet med en sort cirkel). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Opdræt bier uden for deres naturlige nesting siv, under laboratorieforhold, giver mulighed for afprøvning af flere hypoteser vedrørende larve fitness. At uidentificerede faktorer fortsat forårsage bidødelighed, risiko vurdering undersøgelser kan ved hjælp af in vitro- eksperimenter hjælpe identificere potentielle trusler og informere forvaltningspraksis for denne artsrige gruppe af vilde bestøvere 12 ,38,49<su…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takke Kimball Clark og Tim Krogh for at levere Osmia nesting siv, Meredith Nesbitt og Molly Bidwell for bistand i laboratoriet, Drs. Cameron Currie, Christelle Guédot, Terry Griswold, Michael Branstetter og tre anonym korrekturlæsere for deres nyttige bemærkninger, at forbedret håndskriftet. Dette arbejde blev støttet af USDA-Agricultural Research Service bevilgede midler (nuværende forskning informationssystem #3655-21220-001), Wisconsin Landbrugsministeriet, handel og forbrugerbeskyttelse (#197199), National Science Foundation (under Grant nr. DEB-1442148), DOE Great Lakes bioenergi Research Center (DOE kontor for videnskab BER DE-FC02-07ER64494).
eggs of O. ribifloris sensu lato (s.l.) | Kaysville, Davis County, Utah, USA | ||
Osmia reeds | Nativebees.com | NA | Freshly plugged reeds |
Dissection set | VWR | 89259-964 | Sterilize before use |
Long Nose Pliers | Husky | 1006 | |
6 well culture plates | VWR | 10062-892 | Sterile sealed |
48 well culture plates | VWR | 10062-898 | Sterile sealed |
Petri dishes | VWR | 25373100 | Sterile sealed |
Square Weighing Boats | VWR | 10770-448 | |
Camel Hair Brush | Bioquip | 1153A | |
Tin capsules | EA Consumables | D1021 | Sterilize before use |
Sucrose | VWR | 470302-808 | |
Propiconazole 14.3 | Quali-Ppro | 60207-90-1 | Propiconazole 14.3% |
Honey bee pollen | Bee energised | 897098001244 | Untreated, natural, raw pollen |
Microbalance | VWR | 10204-990 | |
Pulverisette | LAB SYNERGY INC. | 30334913 | |
Wooden sticks | VWR | 470146908 | Sterilize before use |
Sealing tape | VWR | 89097-912 | |
Microscope | VWR | 89403-384 | |
Planting tray | VWR | 470150-632 | |
Ethanol | VWR | BDH1158-4LP | |
Centrifuge tube | VWR | 21008936 | |
Microsyringe | Cole-Palmer | UX-07940-07 | |
Rubber tweezer | Amazon | B0135HWPN4 | |
Syringe needles | VWR | 89219-334 | |
Freeze drier | Labcono | LFZ-1L | |
Statistical software | SPSS | Version 21.0 |