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In-vitro- Aufzucht von Solitärbienen: ein Werkzeug für die Beurteilung der Larven Risikofaktoren

Published: July 16, 2018 doi: 10.3791/57876
Automatic Translation
1, 2, 3,4, 1,5
1Department of Entomology, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Bacteriology, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Horticulture, University of Wisconsin-Madison, 4Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agricolas y Pecuarias, 5USDA-ARS, Vegetable Crop Research Unit

Summary

Fungizid-Sprays auf Blütenpflanzen können solitäre Bienen gegenüber hohen Konzentrationen von Pollen getragen Fungizid Rückstände aussetzen. Mit Labor-basierten Experimente mit in-Vitro-gezüchteten Bienenlarven, diese Studie untersucht die Wechselwirkungen des Verzehrs von Fungizid behandelt Pollen aus Host und nicht-Host Pflanzen gewonnen.

Abstract

Obwohl Solitärbienen entscheidend Bestäubung wild und verwalteten Kulturen erbringen, hat dieser artenreichen Gruppe weitgehend in Schädlingsbekämpfungsmitteln Verordnung Studien übersehen worden. Das Risiko einer Exposition gegenüber Fungizid Rückstände ist wahrscheinlich zu hoch sein, insbesondere wenn das Spray auf oder in der Nähe von Wirtspflanzen auftritt, während die Bienen sammeln Pollen ihre Nester bereitstellen. Arten von Osmia , die Pollen von einer ausgewählten Gruppe von Pflanzen (Oligolecty) zu konsumieren, kann die Unfähigkeit zur Nutzung der Pollen von nicht-Wirtspflanzen ihre Risikofaktor für Fungizid-bezogene Toxizität erhöhen. Dieses Manuskript beschreibt Protokolle verwendet, monophyletische Mauerbienen, Osmia Ribifloris Sensu Lato, vom Ei bis zum prepupal Stadium in Kultur Zellplatten unter standardisierten Laborbedingungen erfolgreich aufzuziehen. Die in-Vitro-gezüchteten Bienen werden anschließend verwendet, um Belichtung und Pollen Quelle Fungizid auf Biene Fitness auswirkt. Basierend auf einem 2 × 2 vollständig gekreuzt faktoriellen Design, untersucht das Experiment die Haupt- und interaktive Auswirkungen von Fungizid Exposition und Pollen Quelle an Larven Fitness, durch prepupal Biomasse, Larvale Entwicklungszeit und Survivorship quantifiziert. Ein großer Vorteil dieser Technik ist, die Verwendung von in-Vitro-gezüchteten Bienen natürlichen Hintergrund Variabilität reduziert und ermöglicht die gleichzeitige Manipulation von mehreren experimentellen Parameter. Das beschriebene Protokoll präsentiert ein vielseitiges Werkzeug für Hypothesen Tests, an denen die Suite von Faktoren, die Gesundheit der Bienen. Für Erhaltung Bemühungen mit erheblichen und dauerhaften Erfolg erfüllt werden werden solche Einblicke in das komplexe Zusammenspiel von physiologischen und ökologischen Faktoren, die Biene Rückgänge erweisen sich als kritisch.

Introduction

Angesichts ihrer Rolle als die dominierende Gruppe von Bestäubern1, stellt der weltweite Rückgang der Bienenvölker eine Bedrohung für Ernährungssicherheit und Ökosystem Stabilität2,3,4,5,6 ,7. Die rückläufigen Trends in beiden verwaltet und wilde Bienenvölker werden mehrere gemeinsame Risikofaktoren einschließlich Habitatfragmentierung, neue Parasiten und Krankheitserreger, Verlust der genetischen Vielfalt und die Einführung invasiver Arten3 zugeschrieben ,4,7,8,9,10,11,12. Insbesondere ist der dramatische Anstieg der Verwendung von Pestiziden, (z. B. Neonicotinoide) direkt zu negativen Auswirkungen bei den Bienen13,14,15verbunden. Mehrere Studien haben gezeigt, dass der Synergismus zwischen Neonicotinoide und Ergosterol-Biosynthese-Hemmung (EBI) Fungizide über mehrere Biene Arten16,17,18 , hohe Mortalität führen kann , 19 , 20 , 21 , 22. dennoch Fungizide, lange Zeit als "Biene-Safe", weiterhin auf-Blüte ernten ohne viel Kontrolle23gesprüht werden. Sammlerbienen sind dokumentiert worden, um routinemäßig wieder Pollen Lasten mit Fungizid Rückstände24,25,26kontaminiert. Der Verzehr von solchen Fungizid-Ladenpollen kann dazu führen, dass hohe Mortalität unter larval Bienen27,28,29,30und eine Palette subletale Effekte unter Erwachsenen Bienen16 , 31 , 32 , 33 , 34. eine aktuelle Studie legt nahe, dass Fungizide Biene Verluste verursachen, durch die Veränderung der mikrobiellen Gemeinschaft im Bienenstock gespeichert Pollen, dabei stören die kritische Symbiosen zwischen Bienen und Pollen-borne Mikroben35.

Obwohl solitäre Bienen für die Bestäubung von mehreren wild und landwirtschaftliche Pflanzen36,37,von entscheidender Bedeutung sind hat38, diese heterogene Gruppe der Bestäuber in Pestizid Überwachung Studien viel weniger Aufmerksamkeit erhalten. Das Nest einer erwachsenfrau einsame enthält ca. 5-10 versiegelte Brut Kammern, jeweils bestückt mit einer endlichen Masse von mütterlich gesammelten Pollen und Nektar und ein einzelnes Ei-39. Nach dem Schlüpfen verlassen die Larven auf die zugewiesenen Pollen-Bereitstellung und die zugeordneten Pollen getragen Mikrobiota, angemessene Ernährung40,41zu erhalten. Weil sie die Vorteile eines sozialen Lebensstils fehlt, möglicherweise solitäre Bienen anfälliger für Pestizid Exposition42. Zum Beispiel während der Defizite im sozialen Bienen nach einem Spray kompensiert werden kann einige verlängern von Arbeitern und neu entstehende Brut, der Tod eines einzigen einsamen erwachsenfrau endet alle Vermehrungstätigkeit43. Solche Unterschiede in der Empfindlichkeit unterstreichen die Notwendigkeit, diverse Biene Taxa in Ökotoxikologische Untersuchungen ausreichend Schutz für verwaltete und wilde Bienen gleichermaßen zu integrieren. Aber abgesehen von einer Handvoll Studien, Untersuchungen über die Auswirkungen der Fungizid-Exposition in erster Linie konzentriert sich auf soziale Bienen18,23,32,44,45 ,46,47,48,49.

Solitäre Bienen gehören zur Gattung Osmia (Abbildung 1) sind weltweit als effiziente Bestäuber mehrere wichtige Obst-und Nuss Pflanzen39,50,51,53, benutzt worden 53. Gruppen mit anderen verwalteten Bestäuber24,54,55,56,57,58, Osmia Bienen sind routinemäßig Fungizide in voller Blüte ernten44aufgesprüht ausgesetzt. Adulte Weibchen auf Nahrungssuche auf vor kurzem gespritzten Pflanzen sammeln und lagern ihre Brut Kammern mit Fungizid-beladenen Pollen, die später die alleinige Ernährung für die entwickelnden Larven bildet. Verzehr von kontaminierten Pollen Bestimmungen kann anschließend die Larven zu Fungizid Rückstände42verfügbar. Das Risiko eines möglicherweise höhere unter monophyletische Arten, die nur auf wenige eng verwandte Host Pflanzen59,60,61Futter. Zum Beispiel scheinen bestimmte Megachilid Bienen, bevorzugt für minderwertige Asteraceae Pollen, als ein Mittel zur Verringerung von Parasitismus62Futter. Jedoch wurde das Ausmaß auf dem Fungizide Larven Fitness unter monophyletische solitäre Bienen auswirken empirisch nicht quantifiziert. Das Ziel dieser Studie ist es, ein Protokoll, um die wichtigsten test entwickeln und interaktive Effekte von Fungizid Exposition und Pollen Quelle auf die Fitness der in-vitro- aufgezogen Solitärbienen. Um zu untersuchen, können Eier von O. Ribifloris Sensu Lato (s.l.) im Handel bezogen werden (Table of Materials). Diese Population eignet sich wegen seiner Bedeutung als eine native Bestäuber und seine starke Vorliebe für die nektarreichen Mahonia Aquifolium (Mahonie) gefunden in der Region53,63,64 (Abbildung 2).

Figure 1
Abbildung 1: Ein hochauflösendes Foto von einem Erwachsenen Osmia Ribifloris. Photo credit Dr. Jim Cane, Forschung Entomologe, USDA-ARS Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Phragmite nisten Schilf von Osmia Ribifloris (s.l.) mit einem brütenden Weibchen im Vordergrund. Kammer-Partitionen und Klemme Stecker für die Stimmzungen sind aus vorgekaute Blättern gefertigt. Bildnachweis: Herr Kimball Clark, NativeBees.com Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Das erste Ziel dieser Studie ist die Wirkung des Verzehrs von Fungizid behandelt Pollen auf Larven Fitness (gemessen an der Entwicklungszeit und prepupal Biomasse) bewerten. Während der Exposition gegenüber der allgemein angewandten Fungizid-propiconazolhaltige mit erhöhter Mortalität unter Erwachsenen Bienen über mehrere Arten 23,24,32,44,45, verbunden worden ist 54,55,56,57,58,65,66,67, ihre Auswirkungen auf die larval Bienen ist weniger bekannt. Das zweite Ziel dieser Studie ist die Bewertung der Auswirkungen des Konsums von nicht-Host Pollen auf Larven Fitness. Bisherige Studien zeigen, dass Larven der monophyletische Bienen nicht weiterentwickeln, wenn gezwungen, nicht-Host Pollen68verbrauchen. Solche Ergebnisse können Schwankungen der Biene Physiologie69, Pollen Biochemie70und die wohltuende Microbiome verbunden mit natürlichen Pollen Bestimmungen71zugeschrieben werden. Das dritte Ziel dieser Studie ist es, die interaktiven Effekte der Fungizidbehandlung und diätetische Pollen auf Larven Fitness zu bewerten.

Zahlreiche biologische Merkmale, einschließlich mütterlichen Körpergröße, sind Bereitstellung Rate, Futtersuche Strategie und Pollen Menge72,73,74,75 bekannt, larval Fitness unter solitäre Bienen beeinflussen. Diese Faktoren können erhebliche Variabilität zwischen Schilf, die eine Herausforderung vertretbar experimentellen Designs zu entwickeln, bei der Beurteilung der Larven Gesundheit darstellt einführen. Darüber hinaus da die Larvalentwicklung in versiegelten Verschachtelung Schilf auftritt, sind der Auswirkungen von solchen Variabilität auf die Nachkommen schwierig zu visualisieren und quantifizierte ohne Verwendung von nicht-tödlichen Techniken (Abbildung 3). Um diese Herausforderung zu meistern, sind alle Hypothesen im Rahmen dieser Studie mit Larven aufgezogen außerhalb ihre Verschachtelung Schilf getestet. Das experimentelle Design stellt eine vollständig gekreuzte 2 × 2 Faktorielle Set-ups, mit jeder Faktor bestehend aus 2 Ebenen; Faktor 1: Fungizid Exposition (Fungizid; Kein Fungizid); Faktor 2: Pollen Quelle (Host Pollen, Non-Host Pollen). Bienen werden aus dem Ei in die prepupal Phase im sterilen multiwell Kultur Zellplatten unter kontrollierten Laborbedingungen ausgelöst. Jeder ist gut individuell bestückt mit einer standardisierten Menge Blütenstaub und ein einziges Ei. Nach dem Schlupf der Larve ernährt sich von den zugewiesenen Pollen in den Brunnen, vervollständigt Larvalentwicklung und Verpuppung initiiert. Frühere Studien haben gezeigt, dass unerklärliche Sterblichkeit bei den Bienen innerhalb dieser künstliche Aufzucht Umgebung als in die wilde49,76aufgetretenen geringer ist. Die Verwendung von in-Vitro-gezüchteten Bienen hat mehrere Vorteile gegenüber feldbasierte Untersuchungen: 1) es minimiert die verwirrende Wirkung der natürlichen Variabilität und unkontrollierte Faktoren, die in der Regel mit Feld-Studien; (2) Es kann mehrere Ebenen von Manipulation für jedes Risiko von Interesse über Behandlungsgruppen gleichzeitig getestet werden; (3) die Anzahl der Wiederholungen kann vorgegeben werden, und experimentelle Faktoren für jede replizieren können individuell bearbeitet werden; (4) Larven Antwortvariablen problemlos visualisiert und unabhängig ohne störende neben Larven aufgenommen; (5) das Protokoll kann geändert werden, um komplexere experimentellen Designs mit mehreren Faktoren und Zielgrößen zu berücksichtigen.

Figure 3
Abbildung 3. Inhalte in eine natürliche Nistplätze Schilf von Osmia Ribifloris (s.l.). Nahaufnahme von (A) ein seziert Schilfrohr mit einzelnen Kammern, Pollen Bestimmungen und Partitionen, und (B) frisch Pollen Bestimmungen und die damit verbundenen Eier (gekennzeichnet mit einem schwarzen Kreis) geerntet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Protocol

1. bereiten Sie Propiconazolhaltige Lösungen für Fungizid Belichtung Experimente

  1. Bereiten Sie 0,1 x Fungizid-Lösung durch entsprechende Mengen von im Handel erworbenen propiconazolhaltige 14,3 % in sterilem Wasser am Tag des Experiments auflösen. Stellen Sie sicher, dass nur frisch zubereitete Fungizid-Lösung für alle Anwendungen verwendet wird.
  2. Fügen Sie 23 µL 0.1 x Fungizid-Lösung pro Gramm Pollen Bestimmung, die maximale Konzentration des propiconazolhaltige bereits berichtet von Bienen gesammelte Pollen24 (0,361 PPM oder µg Wirkstoff g-1 von Pollen) zu erhalten.

2. ernten Sie Eier und Host-Pollen-Bestimmungen von Osmia Schilf

  1. Mit einem sterilen Skalpell, sezieren Sie, frisch angeschlossen nisten Schilf von Osmia, Aufteilung in zwei Teile entlang der Länge des Blattes, die einzelnen Kammern verfügbar zu machen.
    Hinweis: Jedes Nest kann zwischen 8 bis 14 Kammern und ein einziges Ei innerhalb einer Kammer enthalten.
  2. Inspizieren Sie Schilf visuell um die Kammern männliche Eier anhand der bisher veröffentlichten Richtlinien77zu identifizieren. Verwendung einer sterilisierten gebogene Nadel entfernen jede Pollen Bestimmung zusammen mit dem zugehörigen Ei aus der Verschachtelung Schilf, und in einem sauberen wiegen Boot.
  3. Sanft die Bereitstellung mit einem sauberen feinen Pinsel das Ei trennen und das Frischgewicht der Pollen Bestimmung aufzunehmen und Ei mit einer standard-Labor-Waage. Das durchschnittliche Gewicht der männlichen Pollen Bestimmungen zu berechnen.
  4. Führen Sie die nachfolgenden Schritte mit einer minimalen Verzögerung die Gefahr eines Schadens zum Ei vor Übertemperatur und Austrocknung zu reduzieren.

3. bereiten Sie Host Pflanze Pollen Bestimmungen

  1. Sichtkontrolle des mütterlich gesammelten Wirtspflanze Pollens aus der Verschachtelung Kammern um sicherzustellen, dass keine Parasiten vorhanden78ausgegraben. Um jede mögliche mütterliche Bias zu reduzieren, kombinieren Sie die Pollen-Bestimmungen zu einer einheitlichen Masse in eine sterile Petrischale und mischen Sie gut mit einer sterilisierten Nadel.
  2. Teilen Sie die kombinierte Masse in Pollen Neuregelungen, um sicherzustellen, dass das Gewicht jedes rekonstituierte Bestimmung etwa gleich auf das durchschnittliche Gewicht einer natürlich zugewiesenen männlichen Bestimmung ist (meine ± SE, 0,35 ± 0,01 g, N = 42).
    Hinweis: Da Osmia sp. weist kleinere Pollen Bestimmungen an die männlichen Nachkommen, dies führt zu geringeren Körpergewicht der männlichen Larven im Vergleich zu Frauen77. Um eine solche Voreingenommenheit durch geschlechtsspezifische Unterschiede zu vermeiden, verwenden Sie nur männliche Eier in den Experimenten.

4. bereiten Sie-Wirtspflanze Pollen Bestimmung vor

  1. Pulverisieren Sie kommerziell gekauften Honig Bienen gesammelte Pollen zu einem feinen Pulver mit einer standard-Labor-Kugelmühle.
  2. Basierend auf den Feuchtigkeitsgehalt der mütterlich gesammelt Host Pollen Bestimmungen (~ 20 %), Hydrat der Pollen Pulver mit entsprechenden Volumes von 40 % sterilisiert Zucker Lösung79 und Mischung gründlich um zu eine Teig-Konsistenz zu bilden.
  3. Teilen Sie in einzelnen Pollen Massen, jeweils mit einem Gewicht von ungefähr das gleiche wie das durchschnittliche Gewicht einer natürlich zugewiesenen männlichen Bestimmung.
    Hinweis: Feuchtigkeitsgehalt der mütterlich gesammelten Host Pollen, die Bestimmungen in vor standardisiert werden können, durch den Vergleich der frischen und trockenen Gewichts Pollen Bestimmungen von 30 zufällig ausgewählten männlichen Kammern80. Um das Trockengewicht zu erhalten, sollten Pollen Bestimmungen werden gefriergetrocknet in ein Gefriertrockner (1,5 Pa 72 h).

5. bereiten Sie Multiwell Zellplatten Kultur

  1. Linie individuelle Vertiefungen der sterilen 48-Well Kultur Teller mit autoklaviert Zinn Tassen (5 × 9 cm). Verwenden sterile Pinzetten, sanft Flair aus dem oberen Rand der Kapsel, so dass es die Pollen Bereitstellung unterbringen kann.
  2. Legen Sie eine einzelne Masse der Host oder nicht-Host Pollen Bestimmung in die blechtasse mit sterilen Werkzeugen basierend auf der behandelten Gruppe.
    Hinweis: Zur Vermeidung von Kreuzkontamination verwenden Sie separate Platten für Behandlungs- und Kontrollgruppen.

6. Fügen Sie Fungizide

  1. Machen Sie eine zentral platzierte Depression innerhalb der Pollen-Masse mit einem sterilen Holzstab. Verwenden Sie einen neuen Stick für jede Erbringung von Pollen.
  2. Fügen Sie entsprechende Mengen Fungizid-Lösung (zur Behandlung) oder sterilem Wasser (für Steuerelemente) in die Depression. Klemmen Sie die Eröffnung der Depression mit sterilen Pinzette zur Minimierung der Kontaktfläche zwischen das Fungizid / sterile Wasser und das Ei.
  3. Sicherzustellen, dass der Faktorielle Aufbau des experimentellen Designs, die ausgerichtet in der schematischen Darstellung (Abb. 4) dargestellt.

Figure 4
Abbildung 4. Schematische Darstellung des experimentellen Aufbaus. Das Experiment ist ein vollständig gekreuzt 2 × 2 Faktorielle Setups. Faktor 1 stellt Fungizid Exposition und besteht aus 2 Ebenen: (i) kein Fungizid (N = 10), und (Ii) Fungizid (N = 10). Faktor 2 Pollen als Finanzierungsquelle und besteht aus 2 Ebenen: (i) Host Pollen (N = 8), und (Ii) nicht-Host Pollen (N = 8). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

(7) hinten und Larven zu beobachten

  1. Legen Sie eine zufällig gewählte männliche Ei auf der Oberseite der Pollen Bestimmung mit einem sauberen feinen Pinsel. Sobald Eier auf alle Bestimmungen gestellt worden sind, setzen Sie den Deckel der Kultur Zellplatte, befestigen Sie es mit Klebeband an den Ecken beschriften.
  2. Legen Sie die well-Platten auf einem sauberen Tablett und bedecken Sie es mit einem dunklen Tuch, Kontakt mit direktem Licht zu behindern. Platz 6 Brunnen Platte mit 30 mL steriles Wasser in das Fach, um Austrocknung zu verhindern. Lassen Sie Inkubation Tabletts ungestört in einem Inkubator bei Raumtemperatur.
  3. Beobachten Sie well-Platten täglich unter dem sezierenden Mikroskop ohne Abnehmen des Deckels von der well-Platten. Stellen Sie sicher, dass die Larven lebendig sind, indem für die Bewegung. Wenn keine Bewegung erkannt wird, verwerfen Sie die blechtasse, die Toten Larven und die restlichen Blütenstaub-Bereitstellung enthalten. Lassen Sie alle Überlebende Larven innerhalb der well-Platten ungestört entwickeln, bis sie die prepupal Stadium zu erreichen.
  4. Entfernen Sie die Larve aus der blechtasse, sobald es die prepupal Stufe41erreicht. Verwendung einer Bürste zu reinigen Stuhldrang aus dem Silk Kokon. Sorgfältig die Silk Cocoon sezierenden Mikroskop durchtrennt und Extrahieren der Prepupa mit Kautschuk-Zangen.
  5. Behandeln Sie die Prepupa vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Tools nicht den weichen Körper durchbohren zu tun. Notieren Sie das Frischgewicht des Prepupa (prepupal Biomasse) und die Entwicklungszeit vom Ei in die prepupal Phase (Larvale Entwicklungszeit).
    Hinweis: Jeder Tote Larve sollte sofort verworfen, um unerwünschten mikrobiellen Wachstums auf den Kadaver und übrig gebliebene Pollen zu verhindern. Dies reduziert das Risiko einer Infektion für die verbleibenden gesunden Larven.

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Representative Results

Larval Fitness wurde mit drei Metriken (i) Larvale Entwicklungszeit, (Ii) prepupal Biomasse und (Iii) Prozent Survivorship quantifiziert. Eine zwei-Wege-ANOVA wurde mit Fungizid Exposition durchgeführt (zwei Ebenen: kein Fungizid, Fungizid) und Pollen Quelle (zwei Ebenen: Host Pollen, Non-Host Pollen) als die unabhängigen Variablen und Larvale Entwicklungszeit als abhängige Variable. Der Haupteffekt für Fungizid Exposition (F1,28 = 1.24, P = 0,28) war nicht signifikant zwischen den Fungizid behandelt (Mittelwert ± SE) (28.14 ±1.98 d, N = 14), und unbehandelt (25.39 ± 1,65 d, N = 18) Gruppen. Der Haupteffekt für Pollen Quelle zeigte jedoch einen signifikanten Unterschied zwischen Entwicklungszeit für Larven Host Pollen ausgelöst (20.00 ± 0,50 d, N = 16) und nicht-Host Pollen (33.19 ±0.81 d, N = 16) (F1,28 = 179.83, P < 0,001). Bonferroni-korrigierte Post Hoc Vergleiche zeigten, dass Larvale Entwicklungszeit nicht deutlich zwischen variiert Fungizid behandelt und unbehandelt Gruppen angehoben auf Host (P = 0,57) und nicht-Host (P = 0,32) Pollen. Larvale Entwicklungszeit war jedoch wesentlich kürzer für Larven am Host Pollen im Vergleich zu nicht-Host Pollen für beide Fungizid behandelt (P < 0,001) und unbehandelt (P < 0,001) Pollen. Die Wirkung der Interaktion (Fungizid Exposition × Pollen Quelle) war nicht signifikant (F1,28 = 0,09, P = 0,77). Die Analyse wurde wiederholt mit prepupal Biomasse als abhängige Variable. Der Haupteffekt für Fungizid Exposition angegeben einen signifikanten Unterschied (F1,28 = 4,66, P = 0,04) zwischen der Fungizid behandelt (0.123 ±0.01 g, N = 14), und unbehandelt (0.149 ± 0,01 g, N = 18) Gruppen. Der Haupteffekt für Pollen Quelle (F1,28 = 56.30, P < 0,001) angegeben einen signifikanten Unterschied zwischen den Larven Host Pollen ausgelöst (0.170 ± 0,01 g, N = 16) und nicht-Host Pollen (0.105 ±0.01 g, N = 16) . Bonferroni-korrigierte Post Hoc Vergleiche angegeben, dass prepupal Biomasse variiert nicht deutlich zwischen Fungizid behandelt und unbehandelt Gruppen angehoben auf Host (P = 0,22) und nicht-Host (P = 0,08) Pollen. Prepupal Biomasse lag jedoch deutlich unter Larven am Host Pollen im Vergleich zu nicht-Host Pollen für beide Fungizid behandelt (P < 0,001) und unbehandelt (P < 0,001) Pollen. Die Wirkung der Interaktion (Fungizid Exposition × Pollen Quelle) war nicht signifikant (F1,28 = 0.132, P = 0,72). Abbildung 5 und Abbildung 6 sind grafische Darstellungen der Ergebnisse aus der vorstehenden Analyse. Unabhängige Proben t-Test angegeben einen signifikanten Effekt der Pollen Quelle auf Larven überleben (N = 18 t9 =-2.45, P =0,04).

Figure 5
Abbildung 5. Balkendiagramm zeigt Metriken für Larven Fitness basierend auf Larvale Entwicklungszeit und prepupal Biomasse. Larval Fitness Metriken sind basierend auf (A) und (B) Pollen Quelle gruppiert; und (C) und (D) Fungizid Exposition. (Mittelwert ± 1 SE). P < 0,001 Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6. Wechselwirkungsdiagramm für Larven Fitness Metriken. Interaktive Effekte der Fungizid-Exposition und Pollen Quelle auf Larvale Entwicklungszeit (A) und (B) prepupal Biomasse. (Mittelwert ± 1 SE). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Pearsons Korrelation wurde verwendet, um die Beziehung zwischen Larvale Entwicklungszeit und prepupal Biomasse (Abbildung 7). Eine signifikante negative Korrelation wurde in allen Behandlungsgruppen (R =-0.83, P < 0,001, N = 32), und über Fungizid-Behandlungen (kein Fungizid: R =-0.76, P < 0,001, N = 18; Fungizid: R =-0.92, P < 0,001, N = 14). Zwar gab es eine signifikante negative Korrelation für Larven nicht Host Pollen ausgelöst (R =-0.64, P < 0,01, N = 16), keine solche Beziehung wurde für Larven am Host-Pollen beobachtet (R = -0,01, P = 0.98, N = 16).

Figure 7
Abbildung 7. Beziehung zwischen Larvale Entwicklungszeit und prepupal Biomasse. Pearson-Korrelation zwischen Entwicklungszeit und prepupal Biomasse über (A) allen Behandlungsgruppen (P < 0,001) (B) Pollen Quelle (Host-Pollen: P = 0,98, Non-Host Pollen: P < 0,01); (C) Fungizid Exposition (kein Fungizid: P < 0,001, Fungizid: P < 0,001). Für Platten sind (B) und (C), Trendlinien farblich abgestimmt mit Symbolen in der Bild-Legende. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Video 1
Animierte Abbildung 1. Fünfte Etappe larvalen Instar von O. Ribifloris in einem einzigen Brunnen einer multiwell Platte. Die Larve wird darauf hingewiesen, einen seidenen Kokon in Vorbereitung auf die Verpuppung Spinnen begonnen haben. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)

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Discussion

Aufzucht von Bienen außerhalb ihrer natürlichen Verschachtelung Schilf unter Laborbedingungen ermöglicht die Prüfung von mehreren Hypothesen, die im Zusammenhang mit Larven Fitness. In dem Maße, in dem nicht identifizierte Faktoren weiterhin Bienensterben führen, riskieren Studien können in-vitro- Experimente mit Hilfe identifizieren möglicher Bedrohungen und Management-Praktiken zu informieren, für diese artenreichen Gruppe der wilden Bestäuber 12 ,38,49,76,81,82.

In der Regel ist kürzere Entwicklungs-Zeiten und höhere prepupal Biomasse mit höheren Larven Fitness verbunden. Über alle Behandlungen war Dauer der Larvalentwicklung negativ korreliert mit prepupal Biomasse. Allerdings gab es erhebliche Unterschiede zwischen der Dauer der Larvalentwicklung und prepupal Biomasse in den vier Gruppen. Larven, die nicht erhalten Fungizide und Host Pollen verzehren durften hatten die kürzeste Larvale Entwicklungszeit und höchste prepupal Biomasse. Im Gegensatz dazu die Larven, die Fungizid behandelt nicht Host Pollen, verbraucht dauerte die längste, komplette Larvalentwicklung und hatte die niedrigsten prepupal Biomasse. Allerdings verlief die Entwicklung für Larven Survivorship weniger klar, mit einer Sterblichkeit wird nur für das Fungizid behandelten Gruppe hob Host Pollen festgestellt. Dekonstruktion der Haupt- und Interaktion Effekte der Fungizid-Exposition und Pollen Quelle ergab, dass: (i) der Haupteffekt des Verzehrs von Fungizid behandelt Pollen hatte erhebliche negative Auswirkungen auf prepupal Biomasse, aber keine Larven Entwicklungsstörungen Dauer. Während eine frühere Studie akute orale Toxizität bei Erwachsenen Osmia bei höheren Konzentrationen, nachgewiesen deuten diese Ergebnisse, dass orale Exposition gegenüber propiconazolhaltige in weit geringerer Konzentration Fitness beeinflussen kann, durch die Reduzierung prepupal Biomasse23 . (Ii) der Haupteffekt des Konsums von nicht-Host Pollen hat negative Auswirkungen auf Larven Fitness. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit den bisher veröffentlichten Studien, die Pollen Qualität (z.B. Vorhandensein von Toxinen, schützende Verbindungen, Mangel an essentiellen Nährstoffen) vorschlagen, und Unterschiede in der Physiologie der Biene können verhindern, dass Bienen nutzen nicht Host Pollen68 . Es ist auch wahrscheinlich, dass das Fehlen von Vorteil Mikrobiota erworben in der Regel aus Host-Pollen und/oder Biene Ernte diesbezügliche verschlimmern kann. (Iii) gab es keine signifikante Wechselwirkung zwischen Fungizid-Exposition und Pollen Quelle auf Larven Fitness. Fungizid-behandelten und unbehandelten gruppenübergreifende hatte Larven verbrauchen nicht Host Pollen deutlich niedriger prepupal Biomasse und mehr Larven Entwicklungszeit im Vergleich zu Larven Host Pollen ausgelöst. Unabhängig von Pollen Quelle hatte Larven verbrauchen Fungizid behandelt Bestimmungen deutlich niedriger prepupal Biomasse im Vergleich zu Larven unbehandelte Pollen ausgelöst. Neben der signifikanten Haupteffekte der interaktiven Wirkung beider Faktoren entsprach das additive Modell, d. h., die negativen Auswirkungen der Exposition und Pollen Art Fungizid auf Larven Fitness waren nicht synergistisch. Unsicherheiten, die aus dem Zusammenspiel der verschiedenen Determinanten der Gesundheit der Bienen (wie detaillierte hier), schränken Sie die Wirksamkeit der Bestäuber-Management-Strategien. Indem wir helfen, vorherzusagen, die interaktiven Effekte von mehreren Risikofaktoren, können Ergebnisse aus ähnlichen Labor Experimente helfen diese langjährige Herausforderung in Biene Erhaltungsbemühungen zu umgehen.

Es gibt mehrere wichtige Schritte in diesem Protokoll, das das Ergebnis des Experiments beeinflussen können. Wann immer möglich, ist es ratsam, Bio Pollen zu verwenden, die frei von Pestizidrückständen ist. Mit Pollen aus unbekannten Quellen, erhöht das Risiko einer Kontamination mit verschiedenen Agrochemikalien, die experimentelle Befunde verwirren können. Es ist wichtig, erhalten frisch gesteckten Osmia Schilf nisten, so dass nur ungeschlüpfte Eier oder sehr jungen Larven in der Studie verwendet werden. Dadurch wird sichergestellt, dass die Larven fast ausschließlich auf die Art der beabsichtigten Pollen-Behandlung ausgelöst werden. Die Verschachtelung Reed seziert werden sollte mit einem flachen Schnitt, widrigenfalls die Pollen-Bestimmungen und Eier beschädigt werden, während der Ernte. Sobald Eier entfernt wurden müssen sie schonend behandelt, um Schäden zu vermeiden und in die wiegen Boote in einem kühlen dunklen hygienischen Umfeld (z.B. biologische Kabinett) beibehalten, bis sie übertragen werden. Diese Haltezeit sollte gehalten werden, auf ein Minimum (< 30 min) um sicherzustellen, dass die Qualität der Eizelle nicht beeinträchtigt wird. Alle Verfahren durchgeführt werden, in eine biologische Kabinett zu gewährleisten ein sauberes Arbeitsumfeld und Chancen der Verunreinigung verringern. Um ihre Wirksamkeit zu gewährleisten, verwenden Sie nur frisch zubereitete Fungizid Lösungen für Behandlungen. Angesichts der Tatsache, dass Pollen hydrophob ist, Fungizid-Lösung / steriles Wasser in die Vertiefung innerhalb von Pollen Bestimmungen eingeführt werden. Dies maximiert das Volumen der Flüssigkeit durchdringt durch die Bereitstellung. Jedoch ist es wichtig, dass die Depression nicht die gesamte Tiefe der Bestimmung, durchbohren, da es zu Volumenverlust von der Einhaltung der Kapsel Boden Lösung führen würde. Die einzelnen Behandlungen und Kontrollen sollten in separaten well-Platten zur Chancen von Cross-Kontamination von flüchtigen Verbindungen und/oder Pollen getragen Mikrobiota durchgeführt werden. Gefaltete Klebestreifen sollte angebracht werden, an den Rändern der Platte um genügend Luftspalt zu ermöglichen, sobald der Deckel vorhanden sind. Während der täglichen Beobachtungen sollten die Platten sanft behandelt werden, um Störungen für die Larven zu minimieren. Erfassungen sollten unter dem Mikroskop mit minimale Lichtintensität und die Deckel sollten nicht entfernt werden, es sei denn, um tote Larven zu verwerfen. Im Falle eines unerwarteten weit verbreitete Sterblichkeit müssen sowohl Larven als auch ihre Pollen Bestimmungen visuell überprüft werden, um auf Anzeichen einer Infektion und Befall überprüfen. Die well-Platten mit der kompromittierten Wiederholungen sollte sofort verworfen, der Arbeitsbereich desinfiziert und Werkzeuge sterilisiert, um die Ausbreitung der Infektion zu verhindern.

Trotz seiner weit reichenden Anwendung gibt es gewisse Einschränkungen auf diese Methode. Während es bewährte Methode, Bio Pollen soweit verfügbar zu verwenden ist, ist zum Beispiel Erhöhung der Pflanzen in einem Gewächshaus, ausreichende Mengen von reinem unbelasteten Pollen liefern logistisch unerschwinglich. In solchen Fällen kann Wild gesammelten Pollen verwendet werden, vorausgesetzt, dass es auf das Vorhandensein von Rückständen von Schädlingsbekämpfungsmitteln abgeschirmt ist. Eine weitere Strategie zur Verringerung des Risikos einer Kontamination bei der Verwendung von Wild-gesammelten Pollen ist Pollen aus einer Quelle zu erhalten, die weniger besprüht (z.B., unberührten ungestörte Gebiete befindet sich weit von landwirtschaftlichen Betrieben) gewesen sein dürfte. In dieser Studie verwendeten Host Pollen aus Verschachtelung Schilf ermittelt, die in natürlichen Wäldern und Wiesen umgeben am Fuße der Wasatch Range in der Nähe von Kaysville, Utah platziert wurden. Da dieser Region von wilden, nicht verwalteten natürlichen Wäldern weit von jeder kommerziellen landwirtschaftlichen Gebieten dominiert wird, und dass diese Bienen fliegen nicht so weit wie Honigbienen bei der Nahrungssuche83,84,85, ist es äußerst unwahrscheinlich dass der Pollen, die, den Sie gesammelt, besprüht worden wäre. Pestizidrückstände in den hier gesammelten Pollen dürften so trivial sein. Nahrungssuche in solche wilden Landschaften, ist die erwachsenfrau weniger wahrscheinlich, verunreinigte Pollen, auftreten Verringerung des Risikos der Exposition unter Larven. In dieser Studie verwendeten kommerziell gekauften Honigbiene Pollen wird von natürlichen Waldgebieten im Norden von Wisconsin und Michigan gesammelt. Für den menschlichen Verzehr in Verkehr gebracht, zeigt öffentlich verfügbaren Informationen und persönliche Kommunikation mit dem Lieferanten, dass die Nesselsucht sind nicht chemisch behandelt, und der Pollen wird in seiner natürlichen, rohen Form ohne irgendwelche Modifikationen86verkauft. Daher ist es vernünftig anzunehmen, dass die Verunreinigung Last im kommerziell gekauften Honigbiene Pollen minimal wäre. Für Studien, die keine Pollen von nicht verwalteten Gebieten mit wilden natürlichen Vegetation erhalten, empfiehlt es sich, direkte empirische Beweise von Chemie Pollenanalyse um sicherzustellen, dass Pollen in Gefahr-Assays verwendet Verunreinigung frei ist. Eine weitere Einschränkung betrifft die Erfindung durch die künstliche Aufzucht Umwelt eingeführt. Trotz aller Bemühungen, es ist nicht logistisch möglich, die genaue Mikroumgebung innerhalb einer natürlichen Verschachtelung Reed zu replizieren (zB., Feuchtigkeit, Sauerstoff-Konzentration, die dreidimensionale Struktur der einzelnen Kammern), die Larven auswirken kann Fitness auf unbekannten Grad. Um die Eigenschaften der natürlichen Ernährung dazustehen zu simulieren, sind vorläufige Daten aus Schilf nisten vor dem in-vitro- Diät Manipulation Studien einzuholen. Obwohl in dieser Studie verwendeten nicht-Host Pollen aus Bereichen wo die Mahonie fehlend oder seltene87ist gewonnen wird, möglicherweise Spuren von Host Pollen vermischt innerhalb der kommerziell gekauften Pollen, die möglicherweise Auswirkungen auf die Ergebnisse. Ein weiterer Nachteil dieser Technik ist, dass Umgang mit Stress während der Probezeit kann negative Auswirkungen auf die Bienen. Schließlich, während es üblich ungeschlüpfte Eier Natur63zu begegnen ist, ist unter Laborbedingungen es schwierig zu prüfen, ob das Scheitern zu schlüpfen war wegen Umgang mit Stress, experimentelle Behandlung oder ein Ergebnis eines natürlichen Todes. Da diese Faktoren unbekannten Grad der Verzerrung in der Studie vorstellen können, muss eine Vorsicht verwenden, beim Interpretieren der Ergebnisse.

Durch die Steuerung für Faktoren, die nachweislich experimentelle Ergebnisse (z. B. mütterlichen Futtersuche Effizienz75, geschlechtsspezifische Variationen77und diätetische Pollen68,72), bias können die beschriebenen Protokoll bietet wesentliche Verbesserungen über zuvor veröffentlichte Techniken76und bietet einen strengeren Rahmen für Hypothesen testen. Zum Beispiel mittels in-Vitro-gezüchteten Bienen ermöglicht Untersuchungen über geschlechtsspezifische Reaktionen auf XENOBIOTIKA-Behandlung, die sonst schwierig sein würde, um wilde Populationen von Hohlraum-Verschachtelung Bienen49,88zu studieren. Das Potenzial für Manipulation und Tests mehrerer interagierende Faktoren (z.B., Diät Qualität und Quantität, Diät-assoziierten Mikrobiota, Exposition gegenüber Pestiziden synergistische), bieten wertvolle Einblicke in die wichtigsten Determinanten der Biene Fitness. Die Flexibilität des Protokolls können leicht Änderungen (z. B. mit unterschiedlichen Größe well-Platten um Larven von unterschiedlicher Größe, ändern die Art und Menge der Nahrung aufnehmen), macht es zugänglich für den Einsatz mit mehreren anderen Arten von solitäre Bienen und Wespen 76. während dieser Studie ausgewertet-Fitness, basierend auf der Entwicklung und Hinterbliebene bei der Fütterung, können Insekten bis entstehen, zusätzliche Daten über Entstehung Rate, Lebensmittel-to-Body-Konvertierung und Post-Entstehung Langlebigkeit inkubiert werden 49. anhand dieser Informationen können die subletale Wirkungen von Behandlungen in Giftigkeit Tests zu beurteilen. Mit zunehmendes Interesse in der Funktion des Pollen-Mikrobiom, können Labor-basierten Studien empfindlich gegenüber resistent Bienenarten basierend auf deren Pollen Mikrobiota71identifizieren. Unterschiede in der Fungizid-Anfälligkeit gruppenübergreifende Biene können durch Sequenzierung der Mikrobiota im Bienenstock gespeichert Pollen untersucht werden. Dies kann helfen, festzustellen, die Rolle der Pollen Microbiome in unterschiedlichem Widerstand gegen XENOBIOTIKA Stressoren zu verleihen. Zukünftige Studien können auch helfen, Unterschiede zwischen der natürlichen Mikrobiota von Host und nicht-Host Pollen zu identifizieren, die als ein grundlegender Faktor monophyletische Fahrverhalten in ausgewählten Bienenarten dienen kann.

Die in-vitro- Aufzucht von Larven Solitärbienen kann Kontrolle für die natürliche Variabilität erlebt in freier Wildbahn, so beschreiben die Rolle des einzelnen und interagierenden Faktoren Auswirkungen auf Bienen Fitness helfen. Diese zugänglich und kostengünstige Technik erweitert die Entomologen Toolkit ermöglicht die Manipulation von mehreren Parametern, die leicht zu spezifischen Forschungsziele Adresse geändert werden können. Wenn Beweise von in-vitro- Experimente Risikogruppen zu identifizieren helfen kann, werden die Auswirkungen auf die Strategien zur Erhaltung der Bienen erheblich sein.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Autoren danken Kimball Clark und Tim Krogh für die Bereitstellung von Osmia Verschachtelung Schilf, Meredith Nesbitt und Molly Bidwell für Hilfe im Labor, DRS. Cameron Currie, Christelle Guédot, Terry Griswold, Michael Branstetter und drei anonymen Gutachtern für Ihre nützliche Kommentare, die das Manuskript verbessert. Diese Arbeit wurde von USDA-Agricultural Research Service angeeignet Mittel (aktuelle Research Information System #3655-21220-001), Wisconsin Ministerium für Landwirtschaft, Handel und Verbraucherschutz (#197199), National Science Foundation (unter unterstützt. Grant Nr. DEB-1442148), DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (DOE Office of Science BER DE-FC02-07ER64494).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
eggs of O. ribifloris sensu lato (s.l.) Kaysville, Davis County, Utah, USA
Osmia reeds Nativebees.com NA Freshly plugged reeds
Dissection set VWR 89259-964 Sterilize before use
Long Nose Pliers Husky 1006
6 well culture plates VWR 10062-892 Sterile sealed
48 well culture plates VWR 10062-898 Sterile sealed
Petri dishes VWR 25373100 Sterile sealed
Square Weighing Boats VWR 10770-448
Camel Hair Brush Bioquip 1153A
Tin capsules EA Consumables D1021 Sterilize before use
Sucrose VWR 470302-808
Propiconazole 14.3 Quali-Ppro 60207-90-1 Propiconazole 14.3%
Honey bee pollen Bee energised 897098001244 Untreated, natural, raw pollen
Microbalance VWR 10204-990
Pulverisette LAB SYNERGY INC. 30334913
Wooden sticks VWR 470146908 Sterilize before use
Sealing tape VWR 89097-912
Microscope VWR 89403-384
Planting tray VWR 470150-632
Ethanol VWR BDH1158-4LP
Centrifuge tube VWR 21008936
Microsyringe Cole-Palmer UX-07940-07
Rubber tweezer Amazon B0135HWPN4
Syringe needles VWR 89219-334
Freeze drier Labcono LFZ-1L
Statistical software SPSS Version 21.0

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<em>In-vitro-</em> Aufzucht von Solitärbienen: ein Werkzeug für die Beurteilung der Larven Risikofaktoren
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Dharampal, P. S., Carlson, C. M.,… More

Dharampal, P. S., Carlson, C. M., Diaz-Garcia, L., Steffan, S. A. In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors. J. Vis. Exp. (137), e57876, doi:10.3791/57876 (2018).

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