Summary
ここで提示されるプロトコルは、成人雄のダークアグーチラットにおける両方の皮質半球の広範な灰色物質脱髄の再生を可能にする。この方法は、カテーテルの脳内移植、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質に対する非臨床的免疫、および移植されたカテーテルを介した炎症性サイトカイン混合物の脳内注射を含む。
Abstract
多発性硬化症(MS)は、中枢神経系(CNS)の最も一般的な免疫媒介性疾患であり、脊髄および小脳の白質病変によって引き起こされる身体障害および死に、ならびに灰色物質の脱髄によって徐々に起こる。実験的なアレルギー性脳脊髄炎の従来のモデルは、脊髄および小脳白質における細胞介在性炎症の調査に適しているが、それらは灰色物質病理に対処することができない。ここでは、皮質脱髄の新しいラットモデルの実験プロトコルを提示し、皮質病変につながる病理学的および分子的メカニズムの調査を可能にする。この脱髄は、不完全なフロイントアジュバントにおける低用量ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)による免疫化と、続いてカテーテル媒介性の前炎症性サイトカインの脳内送達によって誘発される。さらに、カテーテルは、注射誘発外傷を引き起こすことなく、複数の脱髄を可能にし、また、前臨床試験を受けている潜在的な治療薬の脳内送達を可能にする。この方法は、動物の痛みや苦痛や障害が制御され、比較的最小限であるため、倫理的にも有利です。プロトコル全体の実装に必要な期間は、約 8 ~ 10 週間です。
Introduction
MSは、主にミエリンシートに損傷を与えるCNSの免疫媒介性の炎症性疾患であるが、最終的には軸索喪失および永久的な神経損傷につながる。MSは、全米MSソサエティ1によると、世界中で約230万人の推定有病率を有するCNSの最も一般的な免疫媒介性疾患であり、大きな個人的および社会経済的負担を表している。病気発症の平均年齢は30歳であり、重度の障害を引き起こすことによって生産的な年の損失につながります。MSは現在不治であり、現在の治療モダリティは再発性MSにおける急性再発時の症状を管理し、免疫調節療法2,3によって再発頻度を減少させる疾患の経過を変更することを目的とする。B細胞枯渇療法の最近の臨床試験を除いて、進行性タイプ4に対して有効な治療選択肢はまだ証明されていないが、これは、活発な炎症を有する原発性進行性MS(PPMS)患者のサブグループにおいて有効であることが示された5。しかし、いくつかの潜在的な遺伝的6および環境リスク因子7が同定されているが、MSの病因は不明のままである。
MSは、白斑8,9に大きな炎症性脱髄歯垢、およびびまん性傷害を特徴とする。焦点病変は、広範囲のT細胞媒介性攻撃、オリゴデンドロ血球破壊、反応性アストログリオーシス、および軸索変性に関連しており、運動ニューロンの衰退を招く。灰色物質脱髄および萎縮は、疾患9、10、11の追加の組織病理学的特徴として認識を得ている。後者は、患者12,13の神経機能障害および認知機能低下に寄与することが示唆されている。皮質脱髄の3つのパターン、すなわちi)白質皮質、白色物質病変(34%)、ii)小さく、血管内(16%)、およびiii)下皮(50%)と連続している。焦点白色物病変とは異なり、これらの灰色物質病変はT細胞介在攻撃を欠いていると報告されており、代わりに増強された微小グリア活性化、アポトーシス、および神経喪失12によって特徴付けられる。
現在までに、主に病気の複雑さのために、単一の動物モデルでヒトMSを再現することは不可能であった。様々なMS動物モデルは、それぞれ疾患の病態と進行の異なる側面をシミュレートし、代わりに、14、15を開発した。現在の動物モデルは、3つの異なる疾患プロセスを模倣する:i)焦点炎症性病変、ii)びまん白質傷害、およびiii)びまん性灰色物質病理。
MS白物斑の動物研究は、主にげっ歯類脳脊髄炎(EAE)モデルで行われてきた。試験動物は、ミエリン抗原を含むエマルジョンで積極的に免疫化される[通常ミエリンオリゴデンドロ血糖タンパク質(MOG)16、17、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)18、またはタンパク質脂質タンパク質(PLP)19]、完全なフロイントアジュバント(CFA)20と共に。この疾患はまた、ミエリン特異的T細胞21の養子転移によって受動的に誘発され得る。疾患の経過は、使用される抗原/マウス株の組み合わせに依存します。例えば、C57BL/6のMOG35-55は、単一性慢性疾患22を生じ、スイスジムランバート(SJL)マウスのPLP139-151は性別特異的な方法で再発性転移性疾患コース23に至る24。ラットMOG35-55は、さらに、脳機能性T細胞応答を誘導し、一方、ヒトMOG35−55は、C57BL/6マウス25においてB細胞依存性炎症を誘導する。様々なEAEモデルは、主に脊髄および小脳における細胞媒介性炎症を研究するための優れたツールを提供するが、皮質、脳梁、皮質下構造のような前脳構造は、主に26を免れたままである。拡散白物損傷も灰色物質の脱髄も、さらに、EAEモデル26、27において十分に複製されていない。活性EAE誘導に関連する皮質脱髄は、マーモセット28、29および特定のルイスラットサブ株において報告されており、後者の場合にはMHCクラスIとクラスIIアイソタイプおよび対立遺伝子30の一般的な組み合わせに起因する。
このクプリゾンモデル31は、皮質、皮質下32、海馬33領域、ならびにコーパスカオスム34およびcaudate putamen35の広範な脱髄を有する拡散白物脱髄および灰色物質病理を研究するのに有用なツールである。クプリゾン中毒は、原則として、オリゴデンドロサイトの代謝ストレス誘発アポトーシスをもたらし、ミクログリア活性化、アストログリオーシス、および相対的な末梢免疫細胞の浸潤欠如などのMS脳の皮質脱髄病変のいくつかの特徴を模倣する。しかし、神経性アポトーシスおよび視床萎縮の欠如、ならびに食事中のクプリゾン補充32の停止時に観察された堅牢な再髄鞘形成を伴う脱髄の完全な分解は、前臨床MSモデルとしてのクプリゾン中毒の使用を制限する。毒性脱髄は、白熱管36,37にリゾレシチンまたは臭化エチジウムの焦点注入によって誘発することもできるが、これらの方法はほとんど使用されない。毒性脱髄モデルは、オリゴデンドロサイト前駆細胞およびアストロサイト38,39の要件などの再髄鞘化の複雑なメカニズムの解析に特に適している。EAE と中毒モデルに関する詳細情報は、2 つの最近のレビュー15,40で提供されています。
サイトカイン誘発脱髄は、EAE41において脊髄白質病変を研究するために最初に開発された。その後、MS.ダークアグーティ(DA)またはルイスラットの皮質灰色物質病理を研究するように改変され、不完全なフロイントアジュバント(IFA)でMOG1-12542、43またはMOG1-11644によるサブ臨床予防接種によって最初にプライミングされる。古典的なEAEモデルとは異なり、これらのプライミングされた動物は、脊髄における焦点炎症性病変の臨床症状を示さない。その代わりに、脳内の炎症反応および脱髄は、その後、動物が血液中の抗MOG抗体の安定した力板を達成した後、炎症誘発性サイトカイン混合物[腫瘍壊死因子α(TNFα)およびインターフェロンガンマ(IFNγ))の脳内投与によって達成される。
メルクラーらの研究42とガードナーら44は、サブ臨床MOG免疫および脳内またはくも膜下サイトカイン注射による下皮質脱髄誘導の有効性を証明している。しかし、報告された脱髄の持続時間は、14日以内に完全な髄鞘化が発生しすぎて、薬理学的介入検査の期間を制限した。さらに、両方のモデルは、外傷性注射弾性率を利用し、それ以上に注射外傷および血液脳関門(BBB)の破壊を引き起こし、したがって、実質細胞の制御不能なリクルートにつながる。両方の研究は、さらに、限られた領域、イプシ側皮質、またはサイトカイン注射の部位の近傍に制限される脱髄を実証した。
これらの制限を克服するために、我々は、カテーテル先端が脳梁のすぐ上に位置するDAラットの右頭頂皮質にカテーテルを移植した。BBB完全性の完全な回復を可能にするために、動物はカテーテルの移植後2週間の休息期間を許可した。続いて、ラットをIFAにおいて5μgの組換えMOG1-125 でサブ臨床的に免疫した。約4週間後に安定した抗MOG抗体力素の達成に続いて、2μLのサイトカイン混合物を、プログラム可能な注射器ポンプを用いて10分以内にカテーテル を介して 注入した。この手順は、15日間でipsi-と反側大脳半球の両方の広範囲にわたる皮質脱髄を引き出し、サイトカイン注射後30日前後の部分的な再髄鞘を有する。複数の脱髄相は、さらに、カテーテルを介した炎症性サイトカインの繰り返し投与によって誘導され、かつ、進行性MSサブタイプ45の共通の特徴である世界的な脳萎縮は、第2の脱髄相43の早い時期に誘発され得る。重要なことに、移植されたカテーテルはまた、薬理学的介入をテストするために使用することができる。
以下に説明するプロトコルは、脳内カテーテルを用いたDAラットの両大脳半球における広範囲の皮質脱髄の再現性のある生成のための実験ステップの詳細な説明を提供する。
Protocol
ここに記載されているすべての方法は、地方自治体によって承認されています (ブンデスミニウム・フュル・ウィセンシャフト・ウント・フォルシュン (オーストリア科学研究省);ライセンス番号: 66.010/0132-WF/V/3b/2014)。成人の雄のDAラット(10〜12週齢)は、食物および水への自由なアクセスを伴う12/12時間の明暗サイクルに収容された。
1. 材料の準備
注:手術は無菌状態で行われます。開始する前に、ドリルビットを含むすべての手術器具が適切な消毒剤で洗浄されていることを確認してください。
- フェンタニル0.02mg/mL、ミダゾラム0.4mg/mL、メデトミジン0.2mg/mL(混合物中の最終濃度)の麻酔混合物を調製します。
注: 代替麻酔薬については、それぞれの 説明 セクションを参照してください。 - 解毒剤混合物を調製する:0.07mg/mLのフルマゼニルと0.42mg/mLのアティパメゾール(混合物中の最終濃度)。
- カテーテルとカテーテルキャップを入口とネジで組み立てます。カテーテルをメスで2mmの長さに切ります(図1)。
注:カテーテル先端の円形の断面形状を絞り、歪めるので、これにはハサミを使用しないでください。
2. 外科手術の準備
- 腹腔内投与(すなわち)の麻酔混合物(体重1.5mL/kg)でラットを麻酔します。
- 電気剃毛を使用して、耳の間でラットの頭を剃ります。動物を配置する前に、体性の高いフレームに家庭性毛布を置き、手術中の低体温症を避ける。
- 耳の棒と一口プレートを使用して、立体フレームにラットの頭を固定し、頭が水平かつ安定していることを確認します。指や鉗子で頭蓋骨に圧力をかけ、安定性を確認します。
注: 定位フレーム内の緩い固定と非水平位置は、意図した座標からのずれが生じることがあります。 - 手術中の角膜乾燥を防ぐために潤滑用点眼剤を塗布してください。任意の外科的光暴露を防ぐために不透明な材料で目を覆います。
- 70%エタノールと10%ポビトン-ヨウ素複合体の塗布を交互に行うことによって、剃毛領域をきれいにします。
注:感染を避けるために、手術中のすべての予防措置に従ってください。手術は無菌状態で行われます。もし敗血症が壊れているなら、汚染された物質を取り替えなければいい。
3. カテーテルの注入
- 頭部皮膚の中央に約2cmの長さの切開を行います。ブルドッグクランプを使用して、皮膚を側面に固定します。これらの手順の概要については、図 2を参照してください。
- 綿の先端のアプリケーターを使用して血液を取り除く。
- 頭蓋骨の骨膜を取り除く。綿先端アプリケーターで組織をきれいにし、頭蓋骨を露出させる。頭蓋骨を約1分間乾燥させます。
- 解剖学的ランドマーク、ラムダ、ブレグマ、内側縫合糸を特定します。ドリルを立体フレームに取り付けた後、ブレグマにドリルチップを開始点として配置します。ブレグマから2mm後部を移動し、内側縫合糸に横に〜2.4mm移動します。
- この位置でカテーテルの直径0.5mmの穴を開けます。骨のほこりをやさしくふくらませます。
メモ: 硬膜は掘削中はそのまま残ることが重要です。これを確実にするために、1)定位フレームに設置できるドリルを使用し、2)掘削中に頻繁に穴を検査し、3)小さなステップでドリルダウンする- 頭蓋骨にあまりにも多くの圧力が加えられると、ドリル先端が続き、頭蓋骨が完全に浸透したときに脳を損傷する。 - 第1の穴から数ミリメートル離れたアンカーねじに対して、さらに穴3(直径1.3mm程度)をドリルします。骨のほこりをそっと吹き飛ばします。
注:カテーテルの上(直径が2ミリメートル)とアンカースクリュートップ(約1mm)のための十分なスペースを提供するアンカースクリューの位置を選択します。 - 約1-2 mLの無菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)または注射器を使用した生理食塩水で骨粉を除去します。頭蓋骨をきれいにします。アンカーねじを2~3回完全に締めます。
注:アンカーネジは、歯科用セメントを保持することによってセットアップを安定させるために必要であり、それによってカテーテルを所定の位置に保持します。アンカースクリューを締め付ける間は、鉗子で上にそっと持ち上げて簡単に取り外しができないようにしてください。カテーテル自体の移植は組織外傷を引き起こすので、アンカーネジの掘削中または引き締め中に追加の硬膜損傷は、複数の外傷を引き起こし、グループ内の比較可能性を妨げる可能性があります。最初にアンカーネジを締め、最後にカテーテルを挿入します。 - 頭蓋骨の表面に垂直な最初の穴から2mmの長さのカテーテルを挿入します。カテーテルを保持したまま、少し歯科用セメントを塗布し、カテーテルを安定させるために歯科用硬化光への短時間(〜5s)曝露で重合させ、次のステップで両手の使用を可能にする。
注意:歯科硬化光を使用している間は、この光の高強度が原因で、被用領域から反射されたチップや光を直接見ないようにしてください。適切な保護ゴーグルを使用してください。 - カテーテルの周りにより多くの歯科セメントを適用し、ネジを固定し、歯科用硬化光(〜15〜30s)で歯科セメントを固めます。鉗子の先端でセメントの硬化を確認します。
4. 創傷の閉閉と麻酔の拮抗
- カテーテルに対するリソーブル縫合糸、前部および後部で頭部の皮膚を閉じる。
注:移植の終わりに頭蓋骨の上にでこぼこセットアップがあるので、それに応じて創傷閉鎖を行います。皮膚を持ち上げすぎると、動物に不快感を与えます。 - 26G針の1 mL注射器を使用して、皮下(体重1.5mL/kg)に解毒剤混合物を注入します。
- 予防的抗生物質治療のために皮下注射(7.5mg/kg体重)によってエンロフロキサシン(2.5%)を投与する。皮下注射による痛みの軽減のためにカルプロフェン(1mg/mL;5 mg/kg体重)とブプレノルフィン(1.2mg/kg)を投与する。
5. 術後のケアと投薬
- 動物を改変ケージに戻し、低体温を避けるために赤外線を適用して、1〜3時間観察下に保管します。術後の回復まで、5~10分ごとに動物を常に観察し、再配置します。回復するまで目に一定の光暴露を避けるために特別な注意を払ってください。
- 手術の翌日に皮下注射によるエンロフロキサシン(7.5mg/kg体重)とカルプロフェン(1mg/mL;5mg/kg体重)投与を繰り返す。ブプレノルフィンは、前の治療が72時間有効であるため、リフレッシュする必要はありません。
6. 免疫化混合物の調製 (カテーテルの移植後早い14日)
注: 準備手順中に、注射器を氷の上に置きます。
- 2つの10 mLルアーロックチップガラスの注射器を3ウェイストップコックの短い腕に接続し、3番目の出口を長いアームで閉じます。
- 接続が安全で漏れがないことを確認する:ピストン2を保持したまま、約4mLの無菌PBSをオープンシリンジに加えます。ピストン1を挿入し、両方のピストンを前後に押し出し、漏出を確認します。漏れが発生しない場合は、PBSを廃棄し、ピストン1を再度取り外します。
- ピペット1 mLのIFAと50 μgのrMOG1-125 を合わせて、適切なチューブ内の滅菌PBS(pH 7.4)を用いて、混合物を2 mLの最終体積に調整します。
注:準備中にシリンジの先端や壁にエマルジョンが失われるため、管理のために意図したよりも大きなボリュームを準備してください。一度に1匹以上の動物を準備する方が同様に実用的です。 - 希釈したIFAとrMOG1-125混合物をオープンシリンジに入れます。反対側のピストンに緩い圧力を保ちながら、ピストンを穏やかに挿入します(図3A)。
- ピストンを前後に押し、一方のシリンジから他方のシリンジに駆動し、白く粘性になるまで、接種物を乳化する(図3B)。
- 3方向ストップコックの開いた短い腕に1 mL Luerロックシリンジを固定し、それを接種器で満たす(図3C)。すべての接種を1 mLの注射器に分配する。注射まで氷の上に保管してください。調製日に混合物を投与する。
7. 予防接種
- ラットをチャンバー内のイオブルオラン(〜2分、酸素2 L/分と混合)で麻酔し、マスク(酸素1.5 L/minと混合)を介して麻酔を維持する。
- 21G針を用いて尾部ベースに200μLの接種液を皮下に注入します。
注: 溶液が粘性であるため、注射をゆっくりと行ってください。
8. 抗体タイターの測定
- 抗MOG抗体の抗体を決定するために、免疫後4週間で約200μLの血液を引き出す。
- 96ウェルプレートのウェルにMOG(PBSでは5μg/mL)をコーティングし、37°Cで1時間インキュベートします。
- PBSで1%ウシ血清アルブミン(BSA)でプレートを室温で1時間ブロックします。
- プレートをラット血清(1:50)でインキュベートし、37°Cで2時間標準にします。 プレート3xを200 μLのPBS/ポリソルベート20で洗浄します。
- プレートを西洋ワサビペルオキシダーゼ共役抗ラットIgG二次抗体(1:10,000)でインキュベートします。プレート3xを200 μLのPBS/ポリソルベート20で洗浄します。
- ペルオキシダーゼ基材溶液1ウェルあたり100 μLを加え、室温で暗闇の中で20〜30分間インキュベートします。
- 405 nm波長の光学密度を測定し、標準曲線を用いて光学密度から抗体の抗体を算出します。
9. 脳内サイトカイン注射
- コネクタカニューレの長さを調整します(2mm)。(準備手順については 、図 4 を参照してください。
- サイトカイン混合物(TNF-αの500 ng/μL、無菌PBS中の組換えラットIFN-γの300 U/μL)で1mLシリンジを充填します。注射器をコネクタカニューレに接続します。カニューレにサイトカインの混合物を充填します。泡を避けてください。
- シリンジをプログラム可能なシリンジポンプに取り付け、0.2 μL/minを注入するようにプログラムします(図5A)。ポンプを起動し、カニューレの先端に気泡の形成を避けるために動作し続けます。
注:射出速度は、使用される特定のシリンジの内径を考慮に入れる必要があります。それにより、シリンジ径はポンプの設置中に登録されなければならない。 - ラットをチャンバー内のイオブルラン(〜2分、酸素2 L/分と混合)で麻酔し、マスク(酸素1.5 L/minと混合)を介して麻酔を維持する(図5B および 5C)。動物は少なくとも30分間麻酔下されますので、潤滑点眼薬を塗布してください。
- 入口でカテーテルキャップを取り外します。コネクタカニューレをカテーテルとネジに挿入し、締め付けます(図5Dと5E)。
注意:これはカテーテルの上端を破壊するので、それを締めすぎないでください。 - 10分間(射出の総容積は2μL)に進みます。ポンプを停止します。カテーテル内のカニューレを20分間放置し、注入された容積が完全に拡散するようにします。
- コネクタカニューレを外し、真空効果を避けるためにゆっくりと取り外します。
- カテーテルキャップを入口に取り付け直し、ねじ込みます。ケージ内の麻酔から回復する動物を許可します。
Representative Results
皮質脱髄は、プロテオリピッドタンパク質(PLP)に対する免疫細胞化学によるサイトカイン注射後の異なる時点で評価することができる(図6)。図6Aは、移植されたカテーテルを介してのみ無菌PBSを受けたMOG免疫制御動物における15日目の無傷のPLP免疫反応性を示す。サイトカイン注射の1日目には、カテーテル領域の近傍にあるにもかかわらず、MOGプライミング動物では既に脱髄が検出できた(図6B)。PLP免疫反応性は、1日間のポストサイトカイン注射で非側皮質にそのまま残る。3日目には、周囲皮質(図6C)に広がるPLP免疫反応性の低下が徐々に増加することが観察された。3日目(図6D)でも対側皮質脱髄が検出できたが、アンカースクリュー43によって引き起こされる間質流体の低流量領域に対して、むしろアンカーねじの下の領域に限定されている。PBS注入対照動物における同様の観察の欠如は、アンカースクリューから生じる外傷誘発脱髄の可能性を排除する。
日 9 - 15 の間に、脱髄は両方の半球の皮質の大部分に影響を与える (図 6E、 6F、および6G)。これは、ロタロッド試験43における運動能力の統計的有意な低下なしに、遅い行動の観察と一致する。皮質脱髄は、両方の半球(図6Hおよび6I)のサイトカイン注射後最大30日間持続し、部分的な髄鞘のみの部分を有する。図6Jは、脳内サイトカイン注射後の皮質灰色物質におけるPLP損失の定量を示す。PLP免疫反応性は、30日より長い期間後にまだ評価されていないことに留意すべきです;それによって、再髄鞘化の瞬間的な分解は、もしあるならば、さらなる実験によって評価され続ける。最初の注射の30日後に移植されたカテーテルを通してサイトカイン混合物の第二の投与は、15日目に顕著な脳萎縮をもたらす(図7)。
図1:カテーテルの調製(AおよびB)ガイドカニューレとダミーカニューレ(入口付きカテーテルキャップ)を組み立ててねじ込む。(C)その後、カテーテルはメスの助けを借りて2mmの大きさにカットされます。顕微鏡観察では、その目的のためにはさみの使用がカニューレ先端の円形形状を歪め、それにより避けなければならないことが示された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2: カテーテルの移植( A) 手術は、骨膜の縦切りと除去から始まります。(B, C)このパネルは、ブレグマから2 mm後部、矢状縫合糸から右に2.4mm側面のカテーテルの場所のマーキングを示しています。カテーテルとラムダからの適切な距離を持つ3つのアンカーネジのために意図された穴のための場所と同様。(D)カテーテルの穴(直径0.5mm、丸いドリルチップ付き)とアンカーねじ(ねじれたドリルチップ付きの直径1.3mm)の穴を掘削した後、アンカーネジを締め付けます。(E, F)その後、カテーテルが挿入され、全体のセットアップは、重合歯科セメントで安定しています。(G)創傷は、前に2つか3つの結び目と後部カテーテルで縫い合わせされる。B = ブレグマ;L = ラムダ;C = カテーテル;S1、S2、S3 = 3つのアンカーねじの穴の位置。スケールバー= 1 cm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3: rMOG/IFAエマルジョンの調製( A) rMOG,PBS,IFAの混合物は、ピストンを前後に押し出して、あるシリンジから別のシリンジに接種物を押し付け、白く粘性になるまで乳化する。(C)続いて、接種液は注射用に1mLの注射器に分配される。5 μg の rMOG は、1 つのラットを臨床的に免疫するために PBS/IFA 混合物の 200 μL で使用されます。しかし、準備中に注射器の先端や壁の損失のために、より大きなボリュームを準備する必要があります。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:コネクタカニューレの準備(A - D)これらのパネルは、コネクタと内部が2mmサイズのテンプレートガイドカニューレでどのように組み立てられているかを示しています。(E) 内部はメスの助けを借りてガイドカニューレと同じサイズにカットされ、テンプレートガイドはねじ込まれます。(G)コネクタカニューレのもう一端は、注射ミックスを含む1mLシリンジに20G針を固定する。スケールバー= 3 cm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5: 脳内注射装置(A)プログラム可能なシリンジポンプを2μL/minの注入速度に調整し、サイトカインミックス(またはコントロール用の滅菌PBS)で満たされた1mLシリンジをポンプに取り付けます。(B)動物は、最初に2 L/min酸素流を有する5%のイオブルランを使用してチャンバーで麻酔を行い、次いで(C)麻酔は1.5 L/分酸素流を有する2.5%イオブルランを用いてマスクを通して持続する。(D)入口(ダミーカニューレ)付きカテーテルキャップをねじ込み、注入カニューレを埋め込んだカテーテルを通して挿入する。注入の量は非常に小さいので、研究者はカニューレの先端に気泡を避けるために慎重であるべきである。そのため、ポンプが作動している間、そして先端に液体気泡が成長している場合にのみ挿入を開始することが重要である。余分なボリュームは、挿入前にカテーテルの上に分解するので、とにかく脳に入りません。(E)コネクタカニューレを締め付け、ポンプを10分間作動させる。10分間の注入の後、ポンプは停止し、カニューレは、間質液への注入された容積の拡散を可能にするために15〜20分間内部に残される。縮尺バー = 5 cm (特に指定がない限り)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:コロナ脳切片におけるPLP免疫反応性(A)このパネルは、PBS注射(15日目)を有するコントロール脳(MOGプライミング)を示し、皮質脱髄をもたらさない。(B) 早ければ1日目ポストサイトカイン注射では、カテーテル領域に脱髄が見られる。(C) PLP免疫反応性のより広範な損失は、3日目のipsilateral皮質(D)ならびに対側側で観察される。PLP免疫反応性の広範囲にわたる損失は、15日目に両半球で観察され、(E)このパネルは、このパネルは、周側皮質を示し、(F)このパネルは、対側皮質を示す。(G) 15日目におけるPLPの広範囲にわたる損失を示す上で、両半球の概要が示される。30日目には、このパネルが周辺皮質を示し、(I)このパネルが対側皮質を示すように、まだ顕著な脱髄があるが、いくつかのリ髄化された領域も観察することができる。(J) このパネルは、脱髄の定量化(MM2/半球のPLP損失)を示します。1.5 -2 μmのコロナ脳切片は、希釈因子1:500のMS抗PLPでPLP検出に使用された。この切片は、細胞核に対してヘマトキシリンで対数化した。免疫検査の詳細については、Ucalらを参照してください。43.パネルG及びJは、Ucalらから改変された。43.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:2回目のサイトカイン注射後の脳萎縮(A)このパネルは、PBS注射(15日目)を有するコントロール脳(MOGプライミング)を示す。(B) 最初のサイトカイン注射後15日目に、2回目の注射は15日以内に脳萎縮を引き起こしうる。1.5 -2 μmのコロナ脳切片は、希釈因子1:500のMS抗PLPでPLP検出に使用された。この切片は、細胞核に対してヘマトキシリンで対数化した。免疫検査の詳細については、ブレイクモア37を参照してください。スケールバー = 500 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8:動物によるカテーテル除去を防止するためにケージを修正した。 標準的なケージでは、グリッド上の食品ホルダースペースはケージ底部に近い位置にあり、カテーテルがグリッドと絡む可能性を高め、それによってその除去を引き起こし、危険な狭いスペースを作り出します。これを避けるために、ケージを変更する必要があります。この狭いスペースは透明な平面で塞がれ、動物の観察を可能にした。食べ物は、これらの変更されたケージのケージの中に与えられないです。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
我々の方法は、DAラットを使用しています。マウスへの適応は、おそらくより小さなカテーテルとネジの使用を必要とします。また、病気の経過、炎症反応、および脱髄の程度は、異なる種/株が使用される場合、ここで提示されるものとは異なる可能性があることを念頭に置く必要があります。このような違いは、マウスの異なる株を使用して古典的なEAEモデルで観察されています。例えばラット由来のMOG92-106 は、A.SWマウスにおいて一次進行性または二次進行性EAEをもたらし、一方、SJL/Jマウス46において再発性再放出EAEを誘導した。したがって、同じ株の動物を使用する必要があります。EAEの症状における性差は、様々な以前の研究24でも報告されている。このようなジェンダー効果の発生は、ここで説明するプロトコルで予想されるかもしれませんが、さらなる実験では検証されていません。
フェンタニルの0.02mg/mL、ミダゾラムの0.4mg/mL、および0.2mg/mLのメデトミジンを含む麻酔混合物の腹腔内(IP)投与は、外科的介入のために使用される。270-300 gの雄の雄のラットは、この混合物の約0.4-0.6 mL(すなわち、〜1.5 mL/kg)を必要とし、60〜90分持続する麻酔を誘発する。手術後、麻酔は0.07mg/mLのフルマゼニルと0.42mg/mLのアティパメゾールを生理食塩水(0.9%NaCl)からなる解毒剤の皮下注射によって拮抗する。1 - 1.5 mL/kgの用量は5分以内に麻酔を拮抗する。あるいは、動物は麻酔薬から生理学的な洗浄をすると自発的に目を覚ますことができますが、その場合、動物は完全に意識されるまで観察する必要があります。
ケタミンおよびキシラジン47 またはペントバルビタール48ナトリウムのIP注入、またはイソフルオラン49 およびハロタン50のような揮発性麻酔薬の吸入など、動物の手術に頻繁に使用される他の麻酔オプションも、ここで提示される手術についても考慮することができる。しかし、意図した下流の介入を妨げない麻酔薬を選択することが重要です。
免疫および脳内サイトカイン注射の間、5%のイオブルランが麻酔に使用される。ここで説明するモデルはラットを用いて確立され、そして、記載された実験詳細は、したがって、ラットに特異的に適用可能である。カテーテルの注入座標は、可能な白質変化(コーパスカオスのカテーテル先端)の同時分析を可能にするために選択された。カテーテル挿入部位は後部および横位置に関して変化させることができるが、中央のスルカスの選択は、上座矢の静脈に対する損傷の回避を必要とする。
記載された方法のさらなる特徴は、ipsi-および対側半球の両方の等価的な脱髄であり、皮質領域51からの間質流体の生理的流れによって注入されたサイトカイン混合物をくも膜下腔に運び出した結果である可能性がある。注射モードは、カテーテルの位置ではなく、したがって、大脳皮質全体に脱髄を引き起こし、したがって、右または左頭頂皮質の選択は、したがって、この点で重要ではないべきである。
このプロトコルは、広範な外傷を避けるのに十分小さく、実験の長い経過にわたってカテーテル先端の詰まり率の増加を避けるのに十分な大きさの26 Gカテーテルを使用する。確かに、移植およびカテーテル自体の存在は、カテーテルの移植のみを受ける制御動物においても、星状およびミクログリア活性化を引き起こす。しかし、サイトカイン注入動物と比較すると、これは軽微である。43 その後の解析との干渉を避けるために、ポリエーテル-エーテルケトン(PEEK)で作られたMRI対応カテーテルを使用しました。
同様の脱髄深度は、実際には、提示された方法でipsi-と反側の両方の領域で作成される。これは、カテーテルの深さ/長さが皮質のパターンおよび脱髄の程度において大きな役割を果たさないかもしれないことを意味する。したがって、カテーテルによって誘発される病変サイズを小さくするためにカテーテル長さの修飾が考慮される場合がある。それにもかかわらず、カテーテルの長さが有意に短いと、わずかに顕著でない皮質脱髄を引き起こす可能性があり、決定的な答えはカテーテルの長さを特異的にテストする実験によってのみ得られる。
モデルの1つの利点は、移植されたカテーテルがカテーテルを 介して 皮質に投与される潜在的な治療薬の検査を可能にし、組織学的に検出可能な皮質脱髄のピーク後(15日目以降)に再髄鞘を可能にする一方で、前処理設定では予防接種の後であるが、サイトカインシン注射の前である。したがって、治療が投与される時間枠に関する決定は、特定の研究問題および関心のある薬物に依存する。
カテーテルの移植後、研究の終わりまでカテーテル除去を避けるために、動物を単一の修飾(好ましくは高い上)ケージに収容することが重要である(図8)。動物はまた、入口でカテーテルキャップを緩めるかもしれませんが、これはめったに起こりません。動物は毎日観察され、取り除かれたキャップは、入口の不在時にカテーテル先端の閉塞を避け、脳内注射後のパレンチマへの正確な送達を確実にするために、新鮮なものと交換する必要があります。動物は、血液脳関門の治癒および閉鎖を可能にするために、カテーテル移植後の早い2週間で免疫される。
血清抗MOG抗体の抗体の抗体は、免疫後に測定する必要があります。用量反応実験では、5μgのMOG1-125(IFA) が成人雄DAラットにおいて4週間以内に十分な免疫を提供した。5,000 μg/mL以上の力は十分ですが、MOG調製や動物株を含むいくつかの要因に依存し、したがって個別に決定する必要があります。過剰に高い抗原用量を避けることは、サイトカイン注射の前でさえ、後肢を麻痺させた古典的なEAE表現型をもたらす可能性を避けることが重要である。
各動物は、5 μgの組換えミエリンオリゴデンドロシテ糖タンパク質(rMOG1-125)を200 μLの不完全なフロイントアジュバント(IFA)で乳化して免疫化します。エマルジョンの一部は調製中に注射器内で失われるので、動物ごとにこの量以上を調製することをお勧めします。我々は、エシェリヒア大腸菌で発現した組換えMOG(ラットMOGのN末から1-125)を使用し、次いで、キレートクロマトグラフィーによって均質に精製し、6M尿素に溶解し、PBSに対して透析して生理学的製剤52、53を得た。市販のMOGも使用してもよい。
MOG1-116、MOG35-55またはPLP139-151などの他の抗原調製物は、種々のEAEモデルで使用されており、抗原および動物株の違いは、これらのモデル20において明確な疾患表現型を誘導することが知られている。これらの抗原製剤は、DAラットでは試験されておらず、rMOG1-125に優先して使用される場合、ここで提示されるものとは異なる疾患表現型または細胞学結果を誘発する可能性がある。
カテーテルと同じ長さのコネクタカニューレは、脳内注射の前に用意される。これは、テンプレートカテーテルで組み立て、同じサイズ(長さ2mm)に切断することによって行うことができます(図4)。コネクタカニューレは、サイトカイン注入中に気泡を含まないことが重要です-注入量はわずか2μLであるため、カニューレ先端の小さな気泡でさえ、脳に正常に送達される液体の体積を大幅に減少させます。これはポンプを動かし続け、注入液の増加の低下が先端に存在するときだけカニューレを挿入することによって達成される。カニューレ挿入後、コネクタはカテーテルの上端を損傷しないように締め付けすぎないようにしながらカテーテルにねじ込まれ、射出後の再蓋が困難になります。射出速度0.2 μL/minは、噴射による外傷を避けるために使用されます。さらに、注射の遅い注入は、注入後20分の待ち時間と組み合わせることで、注入された液体を間質液に拡散させ、CSFに効果的に排出することを保証する。カニューレは、真空効果を避けるためにゆっくりと除去されます。
報告された方法は外科的介入を含み、したがって、定位的生存手術を行うことができるスタッフを必要とする。動物と直接接触する人員は、適切な動物実験コースを受講する必要があります。プロトコルの残りの部分は、有能なラボメンバーによって行うことができます。
この方法は、大脳皮質の炎症誘発脱髄を生じさせるものであり、ヒトMSのすべての特徴(例えば、ヒトMSの特徴である炎症性白質病変の発生)を再現しない。
Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らは、医学大学グラーツ生物医学研究所の全ての職員の助けと協力、そして原稿を校正してくれたクリストファー・ジョン・ライトンに感謝したいと考えています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult male Dark Agouti rats (300 ±25 g) | |||
| Fentanyl | Hameln pharma plus, Germany | as Fentanyl-Citrate, 50 µg/ml | |
| Midazolam | ERWO Pharma, Austria | 50039017 | 5 mg/ml |
| Medetomidin | Orion Pharma, Finland | as Medetomidin hydrochloride, 1mg/ml | |
| Flumazenil | Roche, Switzerland | 0.1 mg/ml | |
| Atipamezol | Orion Pharma, Finland | as Atipamezol hydrochloride, 5 mg/ml | |
| 10% povidone-iodine complex | Mundipharma, Austria | ||
| Dental cement | Heraeus Kulzer, Germany | 6603 7633 | |
| Physiological saline solution | Fresenius Kabi, Austria | 0.9% NaCl | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Germany | P3813 | |
| Isofluorane | AbbVie, Austria | ||
| Lubricating eye drops | Thea Pharma, Austria | ||
| 70% EtOH | Merck, Germany | 1070172511 | Absolute ethanol was diluted in ddH2O for preparation of 70% v/v |
| 2.5% enrofloxacin | Bayer, Germany | Prophylactic antibiotics | |
| carprofen | Pfizer, USA | Painkillers, 50 mg/ml | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich, Germany | P9416 | |
| Pentobarbital | Richter Pharma, Austria | pentobarbital sodium, 400 mg/ml | |
| Interferon gamma | PeproTech, USA | 400-20 | |
| Tumor necrosis factor alfa | R&D Systems, USA | 510-RT-050/CF | |
| rMOG1-125 | own product at the Centre of Molecular Medicine, Karolinska Institute, Sweden | Recombinant rat myelin oligodendrocyte glycoprotein, amino acids 1-125 from the N-terminus, also commercially available: AnaSpec, AS-55152-500, USA | |
| Anti-MOG antibody | Ana Spec/Kaneka Corporation, Japan | AS-555157 | Standard from ELISA-Kit; Ana Spec/Kaneka |
| Incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich, Germany | F5506 | |
| Horse radish peroxidase conjugated anti-rat IgG secondary antibody | Ana Spec/Kaneka Corporation, Japan | AS-555157 | Secondary Antibody from ELISA-Kit; Ana Spec/Kaneka Corporation |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, Germany | A9576 | |
| Peroxidase substrate solution | Vector Laboratories, USA | SK-45000 | |
| Stereotactic frame | David Kopf Instruments, USA | ||
| Catheters, MRI suitable | PlasticsOne, USA | 8IC315GPKXXC | |
| Dummy cannulas | PlasticsOne, USA | 8IC315DCNSPC | |
| Plastic screws, MRI suitable | PlasticsOne, USA | 8L080X093N01 | |
| Connector cannula | PlasticsOne, USA | 8IC313CXSPCC | |
| Screw driver with 2mm tip-size | |||
| Drill with flexible shaft extension | Proxxon, Germany | NO 28 472, NO 28 706, NO 28 620, | |
| Drill bit, round, 0.5 mm | Hager & Meisinger, Germany | REF310 104 001 001 009 | |
| Drill bit, twisted, 1.3 mm | Hager & Meisinger, Germany | REF350 104 417 364 013 | |
| Scalpel | Braun, Germany | BB510 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools, Germany | 91003-12 | |
| Cotton tip applicator | Henry Schein Medical, Austria | 900-3155 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools, Germany | 14101-14, 14088-10 | |
| Surgical forceps | Fine Science Tools, Germany | 11002-12, 11251-35 | |
| Bulldog clamps | Fine Science Tools, Germany | 18050-35 | |
| Homoeothermic blanket | TSE systems, Germany | ||
| Infrared Lamp | Beurer, Germany | 616.51 | |
| Dental curing light | Guilin Woodpecker Medical, China | ||
| Absorbable suture | Johnson & Johnson, Belgium | V792E | |
| Programmable syringe pump | World Precision Instruments, USA | AL-1000 | |
| Exam gloves | |||
| Surgical gown | |||
| Electric Shaver | Aesculap, Germany | GT420 | |
| Volatile anesthetic vaporizer | Rothacher Medical, Switzerland | CV 30-301-D | |
| Oxygen source for volatile anesthetic vaporizer | Air Liquide, Austria | 19,113 | |
| Volatile anesthesia chamber | Rothacher Medical, Switzerland | PS-0347 | |
| Anesthesia mask for rats | Rothacher Medical, Switzerland | PS-0307-A | |
| 1 ml syringe | Codan, Denmark | REF 62.1612 | |
| 26 Gauge needle for injection | Braun, Germany | 4657683 | |
| 20 Gauge needle for cytokine injection and immunization | Braun, Germany | 4657519 | |
| Luer lock tip glass syringes | Poulten & Graf, Germany | 7.140-37 | |
| 3 way stopcock | Becton Dickinson, Sweden | 394600 | |
| 96-well plate | Thermo Fisher Scientific, USA | 442404 | |
| Plate reader | Cole-Parmer, USA | EW-1396-00 | |
| 37°C incubator | Kendro, Germany | 50042301 | |
| Micropipettes | Gilson, USA | F167350 |
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