Summary
Protokollet som presenteras här tillåter reproduktion av en utbredd grå materia demyelination av båda när halvklot i vuxna manliga Dark Agouti råttor. Metoden består av intracerebral implantation av en kateter, subklinisk immunisering mot myelin oligodendrocyte glykoprotein och intracerebral injektion av en proinflammatorisk cytokinblandning genom implanterad kateter.
Abstract
Multipel skleros (MS) är den vanligaste immunmedierade sjukdomen i centrala nervsystemet (CNS) och leder gradvis till fysisk funktionsnedsättning och död, orsakad av vita materia organskador i ryggmärgen och lillhjärnan, samt av demyelination i grå materia. Medan konventionella modeller av experimentell allergisk encefalomyelit är lämpliga för undersökning av cellmedierad inflammation i ryggraden och cerebellar vit fråga, misslyckas de med att ta itu med grå materia patologier. Här presenterar vi det experimentella protokollet för en ny råtta modell av när demyelination tillåter undersökning av patologiska och molekylära mekanismer leder till när skador. Demyelinationen framkallas av en immunisering med låg dos myelin oligodendrocyte glykoprotein (MOG) i en ofullständig Freunds adjuvans följt av en kateter-medierad intracerebral leverans av proinflammatoriska cytokiner. Katetern möjliggör dessutom flera omgångar av demyelination utan att orsaka injektionsinducerat trauma, liksom intracerebral leverans av potentiella terapeutiska läkemedel som genomgår en preklinisk undersökning. Metoden är också etiskt gynnsam eftersom djursmärta och ångest eller funktionshinder är kontrollerade och relativt minimala. Den förväntade tidsramen för genomförandet av hela protokollet är cirka 8-10 veckor.
Introduction
MS är en immunmedierad, inflammatorisk sjukdom i CNS, som främst skadar myelinark, men leder så småningom till axonal förlust och permanenta neuronal skada. MS är den vanligaste immunmedlade sjukdomen i CNS med en uppskattad prevalens på cirka 2,3 miljoner människor över hela världen, enligt National MS Society1, och utgör en stor personlig och socioekonomisk börda. Medelåldern för sjukdomen är 30 år och leder till förlust av produktiva år genom att orsaka allvarlig funktionsnedsättning. MS är för närvarande obotlig, och de nuvarande behandlingsmetoderna syftar till att hantera symtomen under ett akut återfall i skovvis förlöpande MS och att ändra sjukdomsförloppet för att minska återfallsfrekvensen genom immunmodulerande terapi2,3. Inget behandlingsalternativ har ännu visat sig vara effektivt för de progressivatyperna 4, med undantag för en nyligen genomförd klinisk studie av B-cells utarmningsbehandling, som visade sig vara effektiv i en undergrupp av primära progressiva MS (PPMS) patienter med aktiv inflammation5. Flera potentiellagenetiska 6 och miljömässigariskfaktorer 7 har identifierats, men ms etiologi är fortfarande okänd.
MS kännetecknas av stora inflammatoriska demyelinating plack i, och diffusa skador på, den vita frågan8,9. Focal organskador har associerats med en omfattande T-cells medierad attack, oligodendrocyte förstörelse, reaktiva astrogliosis och axonal degeneration, vilket leder till en motor neuron nedgång. Grå materia demyelination och atrofi har fått erkännande som ytterligare histopatologiska funktioner i sjukdomen9,10,11. Den senare har föreslagits att bidra till neurologisk dysfunktion och kognitiv nedgång hos patienter12,13. Tre mönster av när demyelination har utmärkts, nämligen i) leukocortical, sammanhängande med vit fråga organskador (34%), ii) små, perivaskulära (16%), och iii) subpial (50%). Till skillnad från focal vit fråga organskador, dessa grå fråga organskador har rapporterats sakna en T-cells medierad attack och kännetecknas istället av en förbättrad microglial aktivering, apoptos och neuronal förlust12.
Hittills har det inte varit möjligt att rekapitulera mänskliga MS i en enda djurmodell, till stor del på grund av sjukdomens komplexitet. En mängd olika MS djurmodeller, var och en simulera olika aspekter av sjukdom patogenes och progression har istället utvecklats14,15. Nuvarande djurmodeller efterliknar tre olika sjukdomsprocesser: i) fokala inflammatoriska lesioner, ii) diffus vit materia skada och iii) diffusa grå materia patologi.
Djurstudier av MS white matter plack har mestadels utförts i modeller av gnagare encefalomyelit (EAE). Försöksdjur immuniseras aktivt med en emulsion som innehåller ett myelinantigen [vanligtvis myelin oligodendrocyte glykoprotein (MOG)16,17, myelin basprotein (MBP)18, eller proteolipidprotein (PLP)19], tillsammans med en komplett Freunds adjuvans (CFA)20. Sjukdomen kan också passivt induceras genom en adoptivöverföring av myelinspecifika T-celler21. Sjukdomskursen beror på kombinationen av antigen/musstam som används. MOG35-55 i C57BL/6, till exempel, resulterar i en monofasisk kronisksjukdom 22, medan PLP139-151 hos schweiziska Jim Lambert (SJL) möss leder till en skovvis-remittering sjukdom kurs23 på ett könsspecifikt sätt24. Råtta MOG35-55, vidare, inducerar en encefalitogen T-cellsrespons, medan human MOG35-55 inducerar B-cellsberoende inflammation i C57BL/6 möss25. Olika EAE-modeller ger ett utmärkt verktyg för att studera cellmedierad inflammation främst i ryggmärgen och lillhjärnan, men förhjärnstrukturer som cortex, corpus callosum och subkortikala strukturer förblir i stort sett skonade26. Varken diffus vit materiaskada eller grå materia demyelination replikeras dessutom tillräckligt i EAE-modellerna26,27. När demyelination i samband med aktiv EAE-induktion har rapporterats i marmosets28,29 och i vissa Lewis råtta sub stammar, i det senare fallet tillskrivas de rådande kombinationerna av MHC klass I och klass II isotyper och alleler30.
Cuprizone modell31 är ett användbart verktyg för att studera diffusa vit materia demyelination och grå materia patologi med en omfattande demyelination av när, sub-cortical32, och hippocampal33 regioner, liksom corpus callosum34 och caudate putamen35. Cuprizonförgiftning, som i princip resulterar i metabolisk stressinducerad apoptos av oligodendrocyterna, efterliknar vissa egenskaper hos de kortikala demyelinating organskador av MS hjärnor såsom en microglia aktivering, astrogliosis och en relativ brist på infiltrera perifera immunceller. Bristen på neuronal apoptos och thalamic atrofi, liksom fullständig upplösning av demyelination med en robust remyelination observeras vid upphörande av kost cuprizonetillskott 32, dock begränsa cuprizon berusning användning som en preklinisk MS modell. Giftig demyelination kan också induceras genom en fokal injektion av lysolecithin eller ethidiumbromid i de vitamateriaorganen 36,37, men dessa metoder används sällan. Giftiga demyelinationsmodeller är särskilt lämpliga för analys av de komplexa mekanismerna för remyelination, såsom kravet på oligodendrocyt stamceller och astrocyter38,39. Detaljerad information om EAE och berusningsmodeller finns i två senaste recensioner15,40.
Cytokin-inducerad demyelination utvecklades ursprungligen för att studera spinal vit fråga organskador i EAE41. Senare modifierades det för att studera när grå materia patologier i MS. Dark Agouti (DA) eller Lewis råttor först primeras av en subklinisk immunisering med MOG1-12542,43 eller MOG1-11644 i en ofullständig Freunds adjuvans (IFA). Till skillnad från klassiska EAE-modeller uppvisar dessa primade djur inte kliniska symtom på fokala inflammatoriska lesioner i ryggmärgen. Istället uppnås ett inflammatoriskt svar och demyelination i hjärnan därefter genom en intracerebral administrering av en proinflammatorisk cytokinblandning [tumörnekrosfaktor alfa (TNFα) och interferon gamma (IFNγ)] när djuren har uppnått en stabil titer av anti-MOG antikroppar i blodet.
Studier av Merkler et al. 42 och Gardner et al. 44 har visat effekten av en subpial när demyelination induktion genom en subklinisk MOG immunisering och en intratrahera eller subarachnoidal cytokin injektion. Den rapporterade varaktigheten av demyelinationen var dock alltför kort-en fullständig remyelination inträffade i 14 dagar eller mindre, vilket begränsar fönstret för eventuella farmakologiska intervention testning. Båda modellerna använder dessutom en traumatisk injektion modus, som i sig kan orsaka en injektion trauma och en blod-hjärnbarriär (BBB) nedbrytning och därmed leda till en okontrollerad rekrytering av inflammatoriska celler i parenkym. Båda studierna visade dessutom demyelination som är begränsad till ett begränsat område, i den ensidiga cortex, eller i närheten av platsen för cytokin injektion.
För att övervinna dessa begränsningar implanterade vi en kateter i rätt parietal cortex av DA råttor, med kateterspetsen belägen strax ovanför corpus callosum. För att möjliggöra en fullständig återhämtning av BBB-integriteten tilläts djuren en viloperiod på 2 veckor efter kateterimplantationen. Därefter var råttorna subkliniskt immuniserade med 5 μg rekombinant MOG1-125 i IFA. Efter uppnåendet av en stabil anti-MOG antikroppstiter efter cirka 4 veckor injicerades 2 μL cytokinblandning via katetern inom 10 minuter med hjälp av en programmerbar sprutpump. Detta förfarande framkallade en utbredd när demyelination av både ipsi- och kontralateral cerebrala halvklot i 15 dagar, med en partiell remyelination cirka 30 dagar post-cytokin injektion43. Flera demyelination faser kan dessutom framkallas genom upprepad administrering av pro-inflammatoriska cytokiner genom katetern, och globala hjärnan atrofi, en gemensam egenskap hos progressiva MS subtyper45, kan induceras så tidigt som efter den andra demyelination fas43. Viktigt är att den implanterade katetern också kan användas för att testa farmakologiska ingrepp.
Protokollet som beskrivs nedan ger en detaljerad förklaring av de experimentella stegen för en reproducerbar generation av utbredd när demyelination i båda cerebrala halvklotet av DA råttor med hjälp av en intracerebral kateter.
Protocol
Alla metoder som beskrivs här har godkänts av lokala myndigheter (Bundesministerium für Wissenschaft und Forschung (Österrikes vetenskaps- och forskningsministerium); Licensnummer: 66.010/0132-WF/V/3b/2014). De vuxna manliga DA råttorna (10-12 veckors ålder) var inhyst i en 12/12 h ljus / mörk cykel med fri tillgång till mat och vatten.
1. Materialberedning
OBS: Operationen utförs under aseptiska förhållanden. Innan du börjar, se till att alla kirurgiska instrument inklusive borrkronorna rengörs med lämpligt desinfektionsmedel.
- Bered en bedövningsblandning: 0,02 mg/ml fentanyl, 0,4 mg/ml midazolam och 0,2 mg/ml medetomidin (slutliga koncentrationer i blandningen).
OBS: Se respektive diskussionsavsnitt för alternativa bedövningsmedel. - Bered en motgiftsblandning: 0,07 mg/ml flumazenil och 0,42 mg/ml atipamezole (slutliga koncentrationer i blandningen).
- Montera katetern och kateterlocket med inloppet och skruven. Skär katetern till en längd av 2 mm med en skalpell (Bild 1).
OBS: Använd inte sax för detta, eftersom de klämmer och förvränger kateterns cirkulära tvärsnittsform.
2. Kirurgisk förberedelse
- Bedöva råttan genom intraperitoneal (dvs. administrering av bedövningsblandningen (1,5 ml/kg kroppsvikt).
- Raka råttans huvud mellan öronen med hjälp av den elektriska rakapparaten. Placera en homeothermic filt på stereotaktisk ram innan du placerar djuret, för att undvika hypotermi under hela operationen.
- Immobilisera råttans huvud i stereotaktisk ram med hjälp av öronstängerna och bettplattan, vilket säkerställer att huvudet är horisontellt och stabilt. Kontrollera stabiliteten genom att trycka på skallen med finger eller tång.
OBS: En lös fixering och icke-horisontell positionering inom stereotaktisk ram kan orsaka avvikelse från de avsedda koordinaterna. - Applicera smörjande ögondroppar för att förhindra hornhinnetorrhet under operationen. Täck ögonen med ett ogenomskinligt material för att förhindra kirurgisk ljusexponering.
- Rengör det rakade området genom att alternera appliceringen av 70% etanol och 10% povidone-jodkomplex.
OBS: Följ alla försiktighetsåtgärder under operationen för att undvika infektion. Operationen utförs under aseptiska förhållanden. Om asepsis bryts måste det förorenade materialet bytas ut.
3. Kateterimplantation
- Gör ett längsgående snitt på ca 2 cm längd i mitten av huvudhuden. Använd bulldogklämmor för att hålla huden borta från sidorna. En översikt över dessa steg finns i figur 2.
- Ta bort blodet med en bomullsspetsad applikator.
- Ta bort skallperiosteumet. Rengör vävnaden med bomullsspetsapplikatorn och exponera skallbenet. Låt skallen torka i ca 1 min.
- Identifiera de anatomiska landmärkena, Lambda, Bregma och medial sutur. Med borren installerad på stereotaktisk ram placerar du borrspetsen vid Bregma som utgångspunkt. Flytta 2 mm bakre från Bregma och flytta ~ 2,4 mm i följd till den mediala suturen.
- Borra ett hål med diametern 0,5 mm för katetern i detta läge. Puffa försiktigt bort eventuellt bendamm.
OBS: Det är viktigt att dura mater förblir intakt under borrningen. För att säkerställa detta, 1) använd en borr som kan installeras på stereotaktisk ram, 2) inspektera hålet ofta under borrningen och 3) borra ner i små steg - om för mycket tryck appliceras på skallen, borrspetsen fortsätter in och skadar hjärnan när skallen är helt penetrerad. - Borra ytterligare 3 hål (~ 1,3 mm i diameter) för ankarskruvarna några millimeter från det första hålet. Blås försiktigt bort bendammet.
OBS: Välj ankarskruvplatser som ger tillräckligt med utrymme för katetertoppen (~ 2 mm i diameter) och ankarskruvtopparna (~ 1 mm). - Avlägsna bendammet genom bevattning med cirka 1- 2 ml steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) eller fysiologisk saltlösning med en spruta. Rengör skallen. Dra åt ankarskruvarna med 2 - 3 varv.
OBS: Ankarskruvarna är nödvändiga för att stabilisera uppsättningen genom att hålla dentalcementet och därmed katetern på plats. När du drar åt en ankarskruv, se till att den inte lätt kan tas bort genom att försiktigt lyfta den uppåt med tång. Eftersom implantationen av katetern själv orsakar vävnadstrauma, kommer ytterligare duraskada under borrning eller åtdragning av ankarskruvarna att leda till flera traumatiska skador och eventuellt hämma jämförbarheten inom en grupp. Dra åt ankarskruvarna först och sätt in katetern sist. - För in katetern med 2 mm längd genom det första hålet, vinkelrätt mot skallytan. Medan du fortfarande håller katetern i, applicera lite tandcement och låt det polymerisera med en kort (~ 5 s) exponering för tandhärdningsljuset för att stabilisera katetern, vilket gör det möjligt att använda båda händerna i nästa steg.
VARNING: När du arbetar med tandhärdningslampa bör du undvika att titta direkt på spetsen eller på ljuset som reflekteras från appliceringsområdet, eftersom den höga intensiteten hos detta ljus kan orsaka näthinneskador. Använd lämpliga skyddsglasögon. - Applicera mer dental cement runt katetern, förankra skruvarna och stelna tandcementet med tandhärdningsljuset (~ 15 - 30 s). Bekräfta härdningen av cementet med spetsen av en tång.
4. Stängning av såret och antagonisering av anestesi
- Stäng huvudhuden med resorbable suturer, främre och bakre till katetern.
OBS: Eftersom det kommer att finnas en ojämn uppsättning över skallen i slutet av implantationen, gör sårstängningen i enlighet därmed. Att lyfta upp huden för mycket kommer att resultera i obehag för djuret. - Injicera motgiftsblandningen subkutant (1,5 ml/kg kroppsvikt) med en 1 ml spruta med en 26 G-nål.
- Administrera enrofloxacin (2, 5%) genom subkutan injektion (7, 5 mg/kg kroppsvikt) för profylaktisk antibiotikabehandling. Administrera karprofen (1 mg/ml, 5 mg/kg kroppsvikt) och buprenorfin (1,2 mg/kg) för smärtlindring genom subkutan injektion.
5. Postoperativ vård och medicinering
- Sätt tillbaka djuret i den modifierade buren och håll det under observation i 1 - 3 h, med en applicering av infrarött ljus för att undvika hypotermi. Observera och flytta djuret var 5:e till 10:e minut tills det är efteroperativ återhämtning. Var särskilt försiktig så att du undviker konstant ljusexponering för ögonen till återhämtning.
- Upprepa enrofloxacin (7,5 mg/kg kroppsvikt) och karprofen (1 mg/ml; 5 mg/kg kroppsvikt) administreringar genom subkutana injektioner dagen efter operationen. Buprenorfin är inte nödvändigt att uppdatera eftersom den tidigare behandlingen är effektiv i 72 timmar.
6. Beredning av immuniseringsblandning (tidigast 14 dagar efter kateterimplantation)
Obs: Placera sprutorna på is under beredningen.
- Anslut två 10 ml luerlåsspetsglassprutor till de korta armarna på en 3-vägskran och stäng det tredje uttaget med den långa armen.
- Se till att anslutningarna är säkra och läckagefria: tillsätt cirka 4 ml steril PBS till den öppna sprutan medan du håller kolven 2. Sätt i kolv 1 och tryck båda kolvarna fram och tillbaka samtidigt som du kontrollerar läckage. Om inget läckage uppstår, kassera PBS och ta bort kolven 1 igen.
- Pipett 1 ml IFA och 50 μg rMOG1-125 tillsammans och justera blandningen till en slutlig volym på 2 ml med steril PBS (pH 7.4) i ett lämpligt rör.
OBS: På grund av förluster av emulsion på sprutors spetsar eller väggar under beredningen, förbered en större volym än avsedd för administrering. Det är också mer praktiskt att förbereda sig för mer än 1 djur på en gång. - Placera den utspädda IFA- och rMOG1-125-blandningen i den öppna sprutan. För försiktigt in kolven samtidigt som du håller ett löst tryck på den motsatta kolven (figur 3A).
- Emulgera inokulat genom att driva det från en spruta till en annan genom att trycka kolvarna fram och tillbaka tills det är vitt och trögflytande (figur 3B).
- Fäst en 1 ml Luer låsspruta på den öppna korta armen på 3-vägskranen och fyll den med inokulat (Figur 3C). Fördela alla inokulat till 1 ml sprutor. Håll den på is tills injektionen. Administrera blandningen på preparatets dag.
7. Immunisering
- Bedöva råttan med isofluoran i en kammare (~2 min, blandad med syre 2 L/min) och uthärda sedan anestesi genom en mask (blandad med syre 1,5 L/min).
- Injicera 200 μL inokulat subkutant vid svansbasen med en 21 G-nål.
OBS: Administrera injektionen långsamt eftersom lösningen är trögflytande.
8. Bestämning av antikroppstitrar
- Dra tillbaka ~ 200 μL blod 4 veckor efter immuniseringen för att bestämma anti-MOG-antikroppstitrar.
- Täck brunnarna på en 96-brunnsplatta med MOG (5 μg/ml i PBS) och inkubera dem i 1 timme vid 37 °C.
- Blockera plattan med 1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS i 1 timme vid rumstemperatur.
- Inkubera plattan med råtserum (1:50) och standardisera den i 2 timmar vid 37 °C. Tvätta plattan 3x med 200 μL PBS/Polysorbat 20.
- Inkubera plattan med pepparrot peroxidaskonjugerad antiråtta IgG sekundär antikropp (1:10,000). Tvätta plattan 3x med 200 μL PBS/Polysorbat 20.
- Tillsätt 100 μL peroxidassubstratlösning per brunn och inkubera den i 20-30 minuter i mörker vid rumstemperatur.
- Mät den optiska densiteten vid en våglängd på 405 nm och beräkna antikroppstittraren från den optiska densiteten med hjälp av en standardkurva.
9. Intracerebral cytokininjektion
- Justera längden på anslutningsbaleln (2 mm). (Se figur 4 för förberedelsestegen.)
- Fyll en 1 ml spruta med cytokinblandningen (500 ng/μL TNF-alfa, 300 U/μL rekombinant råtta IFN-gamma i steril PBS). Anslut sprutan till en kontaktbalbin. Fyll kanylen med cytokinblandningen. Undvik bubblor.
- Montera sprutan på den programmerbara sprutpumpen och programmera den att injicera 0,2 μL/min (Bild 5A). Starta pumpen och håll den i arbete för att undvika en luftbubblabildning vid kanylspetsen.
OBS: Injektionshastigheten måste ta hänsyn till den inre diametern på den specifika sprutan som används. Därmed måste sprutdiametern registreras under pumpens uppförande. - Bedöva råttan med isofluran i en kammare (~2 min, blandad med 2 L/min syre) och uthärda sedan anestesin genom en mask (blandad med 1,5 L/min syre) (figurerna 5B och 5C). Applicera smörjande ögondroppar eftersom djuret kommer att bedövas i minst 30 minuter.
- Ta bort kateterlocket med inloppet. För in anslutningsbaleln i katetern och skruva och dra åt den (figurerna 5D och 5E).
OBS: Övertätta den inte, eftersom detta förstör kateterns övre spets. - Låt injektionen fortsätta i 10 minuter (den totala injektionsvolymen är 2 μL). Stoppa pumpen. Lämna kanylen inuti katetern i 20 minuter så att den injicerade volymen kan spridas helt.
- Skruva loss anslutningsbaleln och ta bort den långsamt för att undvika vakuumeffekt.
- Sätt tillbaka kateterlocket med inloppet och skruva fast det. Låt djuret återhämta sig från anestesin i en bur.
Representative Results
När demyelination kunde bedömas vid olika tidpunkter efter en cytokininjektion av immunohistokemi för proteolipidprotein (PLP) (figur 6). Figur 6A visar intakt PLP-immunoreaktivitet dag 15 i ett MOG-immuniserat kontrolldjur som endast fick steril PBS genom den implanterade katetern. Dag 1 efter cytokininjektionen kunde demyelination redan detekteras hos MOG-primade djur, om än endast i närheten av det catheteriserade området (figur 6B). PLP immunoreactivity förblir intakt i kontralateral cortex 1-dagars post-cytokin injektion. Dag 3 kunde en gradvis ökning av förlusten av PLP-immunoreaktiviteten, som sprider sig i den ensidiga cortex (figur 6C), observeras. Kontralateral närdelination kan också detekteras dag 3 (figur 6D), men det är ganska begränsat till området under ankarskruvarna, möjligen på grund av ett lågt flödesområde av interstitiell vätska orsakad av ankarskruvarna43. Avsaknaden av en liknande observation hos pbs-injicerade kontrolldjur utesluter möjligheten till traumainducerad demyelination som härrör från ankarskruven.
Mellan dag 9 - 15 påverkar demyelination stora delar av cortex på båda halvkloten (figurerna 6E, 6Foch 6G). Detta sammanfaller med en observation av långsamt beteende, men utan en statistiskt signifikant minskning av motoriska färdigheter i ett rotarodtest43. När demyelination upprätthålls i upp till 30 dagar post-cytokin injektion i båda halvkloten (figurerna 6H och 6I) med endast en partiell remyelination. Figur 6J visar en kvantifiering av PLP-förlusten i den närgrå materian efter intracerebral cytokininjektion. Det bör noteras att PLP-immunoreaktivitet ännu inte har bedömts efter perioder som är längre än 30 dagar. Därmed återstår den momentana upplösningen av remyelination, om det finns några, att bedömas genom ytterligare experiment. En andra administrering av cytokinblandningen genom den implanterade katetern 30 dagar efter den första injektionen resulterar i markerad hjärnatrofi dag 15 (figur 7).
Bild 1:Beredning av katetern. (A och B) Styrbalken och provdockans kanyl (kateterlock med inlopp) monteras och skruvas. (C) Därefter skärs katetern till 2 mm i storlek med hjälp av en skalpell. Den mikroskopiska observationen visade att användningen av sax för detta ändamål förvränger kanylspetsens cirkulära form och därmed måste undvikas. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 2:Kateterns implantation. (A) Operationen börjar med ett längsgående snitt och avlägsnande av periosteum. B,C) Denna panel visar märkningen av platsen för katetern vid 2 mm bakre från Bregma och 2,4 mm lateral till höger från sagittal suturen; samt platserna för hålen avsedda för de tre ankarskruvarna med lämpligt avstånd från katetern och Lambda. (D) Efter borrning av kateterhålet (en diameter på 0,5 mm, med rund borrspets) och hålen för ankarskruvarna (1,3 mm i diameter med vriden borrspets) dras ankarskruvarna åt. (E, F) Därefter sätts katetern in och hela installationen stabiliseras med polymeriserande dentalcement. ( G) Såret sys med två eller tre knop främre och bakre till katetern. B = Bregma; L = Lambda; C = Kateter; S1, S2 och S3 = platser för hålen för de tre ankarskruvarna. Skalstängerna = 1 cm. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Beredning av rMOG/IFA-emulsion. (A) Blandningen av rMOG, PBS och IFA emulgeras genom att inokulat pressas från en spruta till en annan genom att kolvarna trycks fram ochtillbaka, B)tills det är vitt och trögflytande. C)Därefter fördelas inokulatet till 1 ml sprutor för injektionen. 5 μg rMOG används i 200 μL PBS/IFA-blandning för att subimmunisera en råtta kliniskt. På grund av förlusterna vid sprutorna spetsar och väggar under beredningen bör dock en större volym förberedas. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 4:Förberedelse av kopplingsbalk. (A - D) Dessa paneler visar hur en kontakt och en intern monteras med en 2 mm stor mallguide kanyl. (E) Den inre skärs till samma storlek som styrballen med hjälp av en skalpell (F) och mallguiden skruvas sedan av. g)Den andra änden av kontaktballen är fastsatt på en 1 ml spruta, som innehåller injektionsblandningen, med en 20 G-nål. Skalstängerna = 3 cm. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 5:Intracerebral injektion. (A) En programmerbar sprutpump justeras för en injektionshastighet på 2 μL/min, och den 1 ml-sprutan fylld med cytokinblandning (eller steril PBS för kontrollerna) monteras på pumpen. B)Djuret bedövas först i kammaren med 5 % isofluran med 2 L/min syreflöde och sedan (C) upprätthålls anestesin genom masken med 2,5 % isofluran med syreflöde på 1,5 L/min. (D) Kateterlocket med inloppet (provdockans kanyl) skruvas av och injektionskabalken sätts in genom den implanterade katetern. Eftersom injektionsvolymen är mycket liten bör prövaren vara försiktig för att undvika luftbubblor vid kanylspetsen. Av den anledningen är det viktigt att starta införandet medan pumpen är i drift och endast när det finns en växande vätskebubbla vid spetsen. Den extra volymen kommer ändå inte att gå in i hjärnan, eftersom den bryts ner ovanpå katetern före insättningen. (E) Sedan dras anslutningsbalen åt och pumpen får användas i 10 minuter. Efter 10 minuters injektion stoppas pumpen och kanylen lämnas inuti i 15-20 minuter för att möjliggöra diffusion av den injicerade volymen till den interstitiella vätskan. Skalstängerna = 5 cm, om inget annat anges. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6: PLP-immunoreaktivitet i koronal hjärnsektioner. (A) Denna panel visar en kontrollhjärna (MOG-primed) med en PBS-injektion (dag 15), vilket inte resulterar i en kortikal demyelination. B)Redan dag 1 efter cytokininjektionen är demyelination uppenbar i kateterområdet. (C) En bredare förlust av PLP immunoreactivity observeras i den ensidiga cortex vid dag 3, (D) samt på kontralateral sidan. Utbredd förlust av PLP immunoreactivity observeras i båda halvkloten dag 15, som (E) denna panel visar den ensidiga cortex och (F) denna panel visar kontralateral cortex. G)En översikt över båda halvkloten ges för att visa den utbredda förlusten av PLP vid dag 15. Dag 30, som (H) denna panel visar den ensidiga cortex och (I) denna panel visar för kontralateral cortex, det finns fortfarande anmärkningsvärd demyelination, men också vissa remyelinated områden kunde observeras. J)Denna panel visar kvantifieringen av demyelinationen (PLP-förlust i mm 2/halvklot). 1,5 - 2 μm koronar hjärnsektioner användes för PLP detektion med MS anti-PLP med en utspädningsfaktor på 1:500. Avsnitten var motarbetade med hematoxylin för cellkärnor. För detaljerad information om immunohistokemi, se Ucal et al. 43.Panel G och J har modifierats från Ucal et al. 43. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7:Hjärnans atrofi efter andra cytokininjektionen. (A) Denna panel visar en kontrollhjärna (MOG-primed) med en PBS-injektion (dag 15). B)Dag 15 efter den första cytokininjektionen leder en andra injektion till hjärnans atrofi inom 15 dagar. 1,5 - 2 μm koronar hjärnsektioner användes för PLP detektion med MS anti-PLP med en utspädningsfaktor på 1:500. Avsnitten var motarbetade med hematoxylin för cellkärnor. För detaljerad information om immunohistokemi, se Blakemore37. Skalstängerna = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8:Modifierade burar för att förhindra att djuret avlägsnar katetern. I standardburarna ligger mathållarutrymmet på gallret närmare burbotten, vilket skapar ett riskabelt smalt utrymme som ökar kateterns chans att trassla med gallret och därmed avlägsnandet. För att undvika detta måste buret modifieras. Detta smala utrymme blockerades med ett genomskinligt plan, vilket gjorde det möjligt att observera djuret. Maten måste ges inuti buret i dessa modifierade burar. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Discussion
Vår metod använder DA råttor. Anpassningen till möss kommer sannolikt att kräva användning av en mindre kateter och skruvar. Man bör också komma ihåg att sjukdomsförloppet, det inflammatoriska svaret och omfattningen av demyelination kan skilja sig från vad som presenteras här om en annan art / stam används. Sådana skillnader har observerats med klassiska EAE-modeller med olika stammar av möss. MOG92-106 av råtta ursprung, till exempel, resulterade i primära progressiva eller sekundära progressiva EAE i A.SW möss, medan det inducerade skovvis-remittering EAE i SJL/J möss46. Djur av samma stam bör därför användas. Könsskillnader i EAE-manifestationen har också rapporterats i olika tidigare studier24. Förekomsten av sådana könseffekter kan mycket väl förväntas för det protokoll som beskrivs här, men det återstår att validera i ytterligare experiment.
Intraperitoneal (IP) administrering av en bedövningsmedel blandning bestående av 0,02 mg/mL fentanyl, 0,4 mg/mL midazolam och 0,2 mg/mL medetomidine används för kirurgiskt ingrepp. Vuxna manliga DA råttor som väger 270 - 300 g kräver cirka 0,4 - 0,6 ml av denna blandning(dvs.~ 1,5 mL / kg) för att inducera en anestesi som varar 60 - 90 min. Efter operationen retar anestesin genom en subkutan injektion av ett motgift bestående av 0, 07 mg/ml flumazenil och 0, 42 mg/ml atipamezole i fysiologisk saltlösning (0, 9% NaCl). En dos på 1 - 1,5 ml/kg retar upp anestesin inom 5 min. Alternativt kan djuren tillåtas vakna spontant på en fysiologisk tvättning av bedövningsmedel, men i så fall skulle djuren behöva hållas under observation tills de är fullt medvetna.
Andra anestesialternativ som ofta används för djuroperationer, såsom en IP-injektion av ketamin och xylazin47 eller natriumpentobarbital48, eller inandning av flyktiga bedövningsmedel som isofluoran49 och halotan50, kan också övervägas för den operation som presenteras här. Det är dock viktigt att välja ett bedövningsmedel som inte stör de avsedda ingripandena nedströms.
Under immuniseringen och intracerebral cytokininjektion används 5% isofluran för anestesin. Modellen som beskrivs här fastställdes med hjälp av råttor, och de experimentella detaljerna som anges är därför särskilt tillämpliga på råttan. Kateterimplantationskoordinaterna valdes för att möjliggöra samtidig analys av eventuella förändringar av vit materia (kateterspetsen i corpus callosum). Medan kateter insättningsstället kan varieras med avseende på anteroposterior och laterala läge, kräver valet av centrala sulcus undvikande av skador på den överlägsna sagittala sinus.
En annan egenskap hos den beskrivna metoden är motsvarande demyelination av både ipsi- och kontralaterala halvklot, eventuellt till följd av transport av den injicerade cytokinblandningen till det subarachnoid utrymmet genom det fysiologiska flödet av interstitiell vätska från när regioner51. Injektionsläget, och inte kateterns placering, orsakar därför demyelination i hela hjärnbarken, och valet av höger eller vänster parietal cortex bör därför vara oväsentligt i detta avseende.
Protokollet använder en 26 G kateter, som är tillräckligt liten för att undvika omfattande traumatisk skada och tillräckligt stor för att undvika en ökad hastighet av igensättning av kateterspetsen under experimentets långa gång. Visst orsakar implantationen och närvaron av katetern själv en astrocytisk och mikroglial aktivering, även hos kontrolldjur som endast får kateterimplantationen; Detta är dock mindre jämfört med de cytokinin injicerade djuren. 43 För att undvika störningar i efterföljande analyser använde vi MR-kompatibla katetrar av poly-eter-eter-keton (PEEK).
Ett liknande djup av demyelination skapas faktiskt i både ipsi- och kontralaterala regioner med den presenterade metoden. Detta innebär att kateterdjupet/längden kanske inte spelar någon större roll i mönstret och omfattningen av demyelination i cortex. Därför kan en ändring av kateterlängden övervägas för att minska katetern-inducerad lesion storlek. En betydligt kortare kateterlängd kan dock orsaka en något mindre uttalad närdelination, medan ett avgörande svar endast skulle erhållas genom experiment som specifikt testar kateterns längd.
En fördel med modellen är att den implanterade katetern möjliggör testning av potentiella terapier som administreras till cortex via katetern för att tillåta remyelination vid eller efter toppen av histologiskt detekterbar när demyelination (dag 15 eller senare), medan detta i en förbehandlingsinställning skulle vara efter immuniseringen men före cytokininjektionen. Beslutet om tidsramen för när terapier skulle administreras kommer därför att bero på den särskilda forskningsfrågan och det läkemedel som är av intresse.
Efter kateterimplantation är det viktigt att förvara djur singlar i de modifierade (helst höga) burarna för att undvika kateterborttagning till slutet av studien (figur 8). Djur kan också skruva loss kateterlocket med inloppet, även om detta sällan händer. Djuren bör observeras dagligen och borttagna lock bör ersättas med färska, för att undvika kateterspetsblockering i avsaknad av ett inlopp och för att säkerställa en korrekt leverans till parenkymen efter intracerebral injektionen. Djuren immuniseras tidigast 2 veckor efter kateterimplantationen för att möjliggöra läkning och stängning av blod- hjärnbarriären.
Serum anti-MOG antikroppstitrar bör mätas efter immuniseringen. Ett dos-respons experiment visade att 5 μg MOG1-125 (i IFA) gav tillräcklig immunisering inom 4 veckor hos vuxna manliga DA råttor. En titer på 5 000 μg/ml och högre skulle vara tillräcklig, men kommer säkert att bero på flera faktorer, inklusive MOG-preparatet och djurstammen och måste därför bestämmas individuellt. Det är viktigt att undvika alltför höga antigendoser som kan resultera i en klassisk EAE fenotyp med förlamade bakben redan före cytokininjektionen.
Varje djur immuniseras med 5 μg rekombinant myelin oligodendrocyte glykoprotein (rMOG1-125)emulgerat 200 μL ofullständig Freunds adjuvans (IFA). Eftersom en del av emulsionen går förlorad i sprutan under preparatet, är det lämpligt att förbereda mer än denna mängd för varje djur. Vi använde rekombinant MOG (1-125 från N-ändstationen av råtta MOG), som uttrycktes i Escherichia coli och sedan renades till homogenitet genom kelatkromatografi, upplöst i 6 M urea och dialyserad mot PBS för att erhålla ett fysiologisktpreparat 52,53. Kommersiellt tillgänglig MOG får dock också användas.
Andra antigenpreparat, såsom MOG1-116,MOG35-55 eller PLP139-151 används i olika EAE-modeller, och skillnader mellan antigener och djurstammar är kända för att inducera distinkta sjukdoms fenotyper i dessamodeller 20. Dessa antigenpreparat testades inte hos DA-råttor och, om de används i stället för rMOG1-125, kan inducera en sjukdom fenotyp eller histologi resultat skiljer sig från vad som presenteras här.
En anslutnings cannula samma längd som katetern är beredd före intrakraniell injektion. Detta kan göras genom att montera den med en mallkateter och skära den till samma storlek (2 mm lång) (Figur 4). Det är viktigt att anslutningsballen är luftbubblafri under cytokininjektionen - eftersom injektionsvolymen bara är 2 μL, även en liten luftbubbla vid kanylspetsen kommer att avsevärt minska volymen av vätskan som framgångsrikt levereras in i hjärnan. Detta uppnås genom att hålla pumpen igång och sätta i kanylen endast när en växande droppe injektionsvätska finns på spetsen. Efter kanylinsättningen skruvas kontakten fast i katetern samtidigt som övertätning undviks för att inte skada kateterns övre spets, vilket gör det svårt att kapslar om efter injektionen. En injektionshastighet på 0,2 μL/min används för att undvika injektionsinducerat trauma. Dessutom säkerställer en långsam injektion, i kombination med en väntetid på 20 minuter efter injektionen, diffusionen av den injicerade vätskan i mellansidesvätskan och en effektiv dränering i CSF. Kanylen avlägsnas sedan långsamt för att undvika vakuumeffekt.
Den rapporterade metoden inkluderar kirurgiskt ingrepp och kräver därför att personalen kan utföra stereotaktisk överlevnadskirurgi. Personal som är i direkt kontakt med djuren borde ha gått lämpliga djurförsökskurser. Resten av protokollet kan utföras av kompetenta labbmedlemmar.
Metoden är avsedd att producera inflammation-utlöst demyelination av hjärnbarken och reproducerar inte alla funktioner i mänskliga MS(t.ex.förekomsten av focal inflammatoriska vit materia organskador, som är ett kännetecken för mänskliga MS).
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka all personal vid Institute of Biomedical Research vid Medical University Graz för deras hjälp och samarbete, liksom Christopher John Wrighton för korrekturläsning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult male Dark Agouti rats (300 ±25 g) | |||
| Fentanyl | Hameln pharma plus, Germany | as Fentanyl-Citrate, 50 µg/ml | |
| Midazolam | ERWO Pharma, Austria | 50039017 | 5 mg/ml |
| Medetomidin | Orion Pharma, Finland | as Medetomidin hydrochloride, 1mg/ml | |
| Flumazenil | Roche, Switzerland | 0.1 mg/ml | |
| Atipamezol | Orion Pharma, Finland | as Atipamezol hydrochloride, 5 mg/ml | |
| 10% povidone-iodine complex | Mundipharma, Austria | ||
| Dental cement | Heraeus Kulzer, Germany | 6603 7633 | |
| Physiological saline solution | Fresenius Kabi, Austria | 0.9% NaCl | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Germany | P3813 | |
| Isofluorane | AbbVie, Austria | ||
| Lubricating eye drops | Thea Pharma, Austria | ||
| 70% EtOH | Merck, Germany | 1070172511 | Absolute ethanol was diluted in ddH2O for preparation of 70% v/v |
| 2.5% enrofloxacin | Bayer, Germany | Prophylactic antibiotics | |
| carprofen | Pfizer, USA | Painkillers, 50 mg/ml | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich, Germany | P9416 | |
| Pentobarbital | Richter Pharma, Austria | pentobarbital sodium, 400 mg/ml | |
| Interferon gamma | PeproTech, USA | 400-20 | |
| Tumor necrosis factor alfa | R&D Systems, USA | 510-RT-050/CF | |
| rMOG1-125 | own product at the Centre of Molecular Medicine, Karolinska Institute, Sweden | Recombinant rat myelin oligodendrocyte glycoprotein, amino acids 1-125 from the N-terminus, also commercially available: AnaSpec, AS-55152-500, USA | |
| Anti-MOG antibody | Ana Spec/Kaneka Corporation, Japan | AS-555157 | Standard from ELISA-Kit; Ana Spec/Kaneka |
| Incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich, Germany | F5506 | |
| Horse radish peroxidase conjugated anti-rat IgG secondary antibody | Ana Spec/Kaneka Corporation, Japan | AS-555157 | Secondary Antibody from ELISA-Kit; Ana Spec/Kaneka Corporation |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, Germany | A9576 | |
| Peroxidase substrate solution | Vector Laboratories, USA | SK-45000 | |
| Stereotactic frame | David Kopf Instruments, USA | ||
| Catheters, MRI suitable | PlasticsOne, USA | 8IC315GPKXXC | |
| Dummy cannulas | PlasticsOne, USA | 8IC315DCNSPC | |
| Plastic screws, MRI suitable | PlasticsOne, USA | 8L080X093N01 | |
| Connector cannula | PlasticsOne, USA | 8IC313CXSPCC | |
| Screw driver with 2mm tip-size | |||
| Drill with flexible shaft extension | Proxxon, Germany | NO 28 472, NO 28 706, NO 28 620, | |
| Drill bit, round, 0.5 mm | Hager & Meisinger, Germany | REF310 104 001 001 009 | |
| Drill bit, twisted, 1.3 mm | Hager & Meisinger, Germany | REF350 104 417 364 013 | |
| Scalpel | Braun, Germany | BB510 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools, Germany | 91003-12 | |
| Cotton tip applicator | Henry Schein Medical, Austria | 900-3155 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools, Germany | 14101-14, 14088-10 | |
| Surgical forceps | Fine Science Tools, Germany | 11002-12, 11251-35 | |
| Bulldog clamps | Fine Science Tools, Germany | 18050-35 | |
| Homoeothermic blanket | TSE systems, Germany | ||
| Infrared Lamp | Beurer, Germany | 616.51 | |
| Dental curing light | Guilin Woodpecker Medical, China | ||
| Absorbable suture | Johnson & Johnson, Belgium | V792E | |
| Programmable syringe pump | World Precision Instruments, USA | AL-1000 | |
| Exam gloves | |||
| Surgical gown | |||
| Electric Shaver | Aesculap, Germany | GT420 | |
| Volatile anesthetic vaporizer | Rothacher Medical, Switzerland | CV 30-301-D | |
| Oxygen source for volatile anesthetic vaporizer | Air Liquide, Austria | 19,113 | |
| Volatile anesthesia chamber | Rothacher Medical, Switzerland | PS-0347 | |
| Anesthesia mask for rats | Rothacher Medical, Switzerland | PS-0307-A | |
| 1 ml syringe | Codan, Denmark | REF 62.1612 | |
| 26 Gauge needle for injection | Braun, Germany | 4657683 | |
| 20 Gauge needle for cytokine injection and immunization | Braun, Germany | 4657519 | |
| Luer lock tip glass syringes | Poulten & Graf, Germany | 7.140-37 | |
| 3 way stopcock | Becton Dickinson, Sweden | 394600 | |
| 96-well plate | Thermo Fisher Scientific, USA | 442404 | |
| Plate reader | Cole-Parmer, USA | EW-1396-00 | |
| 37°C incubator | Kendro, Germany | 50042301 | |
| Micropipettes | Gilson, USA | F167350 |
References
- MS Prevalence. National Multiple Sclerosis Society. , Available from: http://www.nationalmssociety.org/About-the-Society/MS-Prevalence (2017).
- Berkovich, R. Treatment of acute relapses in multiple sclerosis. Neurotherapeutics. 10 (1), 97-105 (2013).
- Kalincik, T. Multiple Sclerosis Relapses: Epidemiology, Outcomes and Management. A Systematic Review. Neuroepidemiology. 44 (4), 199-214 (2015).
- Feinstein, A., Freeman, J., Lo, A. C. Treatment of progressive multiple sclerosis: what works, what does not, and what is needed. The Lancet Neurology. 14 (2), 194-207 (2015).
- Montalban, X., et al. Ocrelizumab versus Placebo in Primary Progressive Multiple Sclerosis. The New England Journal of Medicine. 376 (3), 209-220 (2017).
- Dyment, D. A., Ebers, G. C., Sadovnick, A. D. Genetics of multiple sclerosis. The Lancet Neurology. 3 (2), 104-110 (2004).
- Ascherio, A. Environmental factors in multiple sclerosis. Expert Review of Neurotherapeutics. 13, 12 Suppl 3-9 (2013).
- Allen, I. V., McQuaid, S., Mirakhur, M., Nevin, G. Pathological abnormalities in the normal-appearing white matter in multiple sclerosis. Neurological Sciences. 22 (2), 141-144 (2001).
- Kutzelnigg, A., et al. Cortical demyelination and diffuse white matter injury in multiple sclerosis. Brain. 128 (11), 2705-2712 (2005).
- Kutzelnigg, A., Lassmann, H. Cortical lesions and brain atrophy in MS. Journal of the Neurological Sciences. 233 (1-2), 55-59 (2005).
- Lucchinetti, C. F., et al. Inflammatory cortical demyelination in early multiple sclerosis. The New England Journal of Medicine. 365 (23), 2188-2197 (2011).
- Peterson, J. W., Bo, L., Mork, S., Chang, A., Trapp, B. D. Transected neurites, apoptotic neurons, and reduced inflammation in cortical multiple sclerosis lesions. Annals of Neurology. 50 (3), 389-400 (2001).
- Kutzelnigg, A., Lassmann, H. Cortical demyelination in multiple sclerosis: a substrate for cognitive deficits. Journal of the Neurological Sciences. 245 (1-2), 123-126 (2006).
- Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. European Journal of Pharmacology. 759, 182-191 (2015).
- Kipp, M., Nyamoya, S., Hochstrasser, T., Amor, S. Multiple sclerosis animal models: a clinical and histopathological perspective. Brain Pathology. 27 (2), 123-137 (2017).
- Lebar, R., Lubetzki, C., Vincent, C., Lombrail, P., Boutry, J. M. The M2 autoantigen of central nervous system myelin, a glycoprotein present in oligodendrocyte membrane. Clinical and Experimental Immunology. 66 (2), 423-434 (1986).
- Linington, C., Bradl, M., Lassmann, H., Brunner, C., Vass, K. Augmentation of demyelination in rat acute allergic encephalomyelitis by circulating mouse monoclonal antibodies directed against a myelin/oligodendrocyte glycoprotein. The American Journal of Pathology. 130 (3), 443-454 (1988).
- Panitch, H., Ciccone, C. Induction of recurrent experimental allergic encephalomyelitis with myelin basic protein. Annals of Neurology. 9 (5), 433-438 (1981).
- Tuohy, V. K., Sobel, R. A., Lees, M. B. Myelin proteolipid protein-induced experimental allergic encephalomyelitis. Variations of disease expression in different strains of mice. The Journal of Immunology. 140 (6), 1868-1873 (1988).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Passive induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nature Protocols. 1 (4), 1952-1960 (2006).
- Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25 (7), 1951-1959 (1995).
- McRae, B. L., et al. Induction of active and adoptive relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) using an encephalitogenic epitope of proteolipid protein. Journal of Neuroimmunology. 38 (3), 229-240 (1992).
- Bebo, B. F., Vandenbark, A. A., Offner, H. Male SJL mice do not relapse after induction of EAE with PLP 139-151. Journal of Neuroscience Research. 45 (6), 680-689 (1996).
- Oliver, A. R., Lyon, G. M., Ruddle, N. H. Rat and human myelin oligodendrocyte glycoproteins induce experimental autoimmune encephalomyelitis by different mechanisms in C57BL/6 mice. The Journal of Immunology. 171 (1), 462-468 (2003).
- Scheld, M., et al. Neurodegeneration Triggers Peripheral Immune Cell Recruitment into the Forebrain. The Journal of Neuroscience. 36 (4), 1410-1415 (2016).
- Chanaday, N. L., Roth, G. A. Microglia and astrocyte activation in the frontal cortex of rats with experimental autoimmune encephalomyelitis. Neuroscience. 314, 160-169 (2016).
- Pomeroy, I. M., Matthews, P. M., Frank, J. A., Jordan, E. K., Esiri, M. M. Demyelinated neocortical lesions in marmoset autoimmune encephalomyelitis mimic those in multiple sclerosis. Brain. 128 (11), 2713-2721 (2005).
- Merkler, D., et al. Differential macrophage/microglia activation in neocortical EAE lesions in the marmoset monkey. Brain Pathology. 16 (2), 117-123 (2006).
- Storch, M. K., et al. Cortical demyelination can be modeled in specific rat models of autoimmune encephalomyelitis and is major histocompatibility complex (MHC) haplotype-related. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 65 (12), 1137-1142 (2006).
- Ludwin, S. K. Central nervous system demyelination and remyelination in the mouse: an ultrastructural study of cuprizone toxicity. Laboratory Investigation. 39 (6), 597-612 (1978).
- Skripuletz, T., et al. Cortical demyelination is prominent in the murine cuprizone model and is strain-dependent. The American Journal of Pathology. 172 (4), 1053-1061 (2008).
- Norkute, A., et al. Cuprizone treatment induces demyelination and astrocytosis in the mouse hippocampus. Journal of Neuroscience Research. 87 (6), 1343-1355 (2009).
- Acs, P., et al. 17beta-estradiol and progesterone prevent cuprizone provoked demyelination of corpus callosum in male mice. Glia. 57 (8), 807-814 (2009).
- Pott, F., et al. Cuprizone effect on myelination, astrogliosis and microglia attraction in the mouse basal ganglia. Brain Research. 1305, 137-149 (2009).
- Jeffery, N. D., Blakemore, W. F. Remyelination of mouse spinal cord axons demyelinated by local injection of lysolecithin. Journal of Neurocytology. 24 (10), 775-781 (1995).
- Blakemore, W. F. Ethidium bromide induced demyelination in the spinal cord of the cat. Neuropathology and Applied Neurobiology. 8 (5), 365-375 (1982).
- Mason, J. L., et al. Oligodendrocytes and progenitors become progressively depleted within chronically demyelinated lesions. The American Journal of Pathology. 164 (5), 1673-1682 (2004).
- Franco, P. G., Silvestroff, L., Soto, E. F., Pasquini, J. M. Thyroid hormones promote differentiation of oligodendrocyte progenitor cells and improve remyelination after cuprizone-induced demyelination. Experimental Neurology. 212 (2), 458-467 (2008).
- Lassmann, H., Bradl, M. Multiple sclerosis: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 223-244 (2017).
- Kerschensteiner, M., et al. Targeting experimental autoimmune encephalomyelitis lesions to a predetermined axonal tract system allows for refined behavioral testing in an animal model of multiple sclerosis. The American Journal of Pathology. 164 (4), 1455-1469 (2004).
- Merkler, D., Ernsting, T., Kerschensteiner, M., Bruck, W., Stadelmann, C. A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination. Brain. 129, Pt 8 1972-1983 (2006).
- Ucal, M., et al. Widespread cortical demyelination of both hemispheres can be induced by injection of pro-inflammatory cytokines via an implanted catheter in the cortex of MOG-immunized rats. Experimental Neurology. 294, 32-44 (2017).
- Gardner, C., et al. Cortical grey matter demyelination can be induced by elevated pro-inflammatory cytokines in the subarachnoid space of MOG-immunized rats. Brain. 136, Pt 12 3596-3608 (2013).
- Minagar, A., et al. The thalamus and multiple sclerosis: modern views on pathologic, imaging, and clinical aspects. Neurology. 80 (2), 210-219 (2013).
- Tsunoda, I., Kuang, L. Q., Theil, D. J., Fujinami, R. S. Antibody association with a novel model for primary progressive multiple sclerosis: induction of relapsing-remitting and progressive forms of EAE in H2s mouse strains. Brain Pathology. 10 (3), 402-418 (2000).
- Lifshitz, J., Witgen, B. M., Grady, M. S. Acute cognitive impairment after lateral fluid percussion brain injury recovers by 1 month: evaluation by conditioned fear response. Behavioural Brain Research. 177 (2), 347-357 (2007).
- Kabadi, S. V., Hilton, G. D., Stoica, B. A., Zapple, D. N., Faden, A. I. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nature Protocols. 5 (9), 1552-1563 (2010).
- Leonard, J. R., Grady, M. S., Lee, M. E., Paz, J. C., Westrum, L. E. Fluid percussion injury causes disruption of the septohippocampal pathway in the rat. Experimental Neurology. 143 (2), 177-187 (1997).
- Hare, G. M., et al. Severe hemodilutional anemia increases cerebral tissue injury following acute neurotrauma. Journal of Applied Physiology. 103 (3), 1021-1029 (2007).
- Abbott, N. J. Evidence for bulk flow of brain interstitial fluid: significance for physiology and pathology. Neurochemistry International. 45 (4), 545-552 (2004).
- Amor, S., et al. Identification of epitopes of myelin oligodendrocyte glycoprotein for the induction of experimental allergic encephalomyelitis in SJL and Biozzi AB/H mice. The Journal of Immunology. 153 (10), 4349-4356 (1994).
- Adzemovic, M. Z., Zeitelhofer, M., Hochmeister, S., Gustafsson, S. A., Jagodic, M. Efficacy of vitamin D in treating multiple sclerosis-like neuroinflammation depends on developmental stage. Experimental Neurology. , 39-48 (2013).
