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Neuroscience

प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स के इंट्रासैरेब्रल इंजेक्शन द्वारा प्रेरित व्यापक सेरेब्रल कॉर्टिकल डेमिलिनेशन का चूहा मॉडल

Published: September 21, 2021 doi: 10.3791/57879
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4, 1, 2, 2
1Research Unit of Experimental Neurotraumatology, Department of Neurosurgery, Medical University Graz, 2Department of Neurology, Medical University Graz, 3Centre for Molecular Medicine, Department of Clinical Neuroscience, Karolinska Institutet, 4Division of Vascular Biology, Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Karolinska Institutet
* These authors contributed equally

Summary

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल वयस्क पुरुष डार्क अगौटी चूहों में दोनों कॉर्टिकल गोलार्द्धों के व्यापक ग्रे मैटर डिमाइलेशन के प्रजनन की अनुमति देता है। इस विधि में कैथेटर के इंट्रासेरेब्रल प्रत्यारोपण, मायलिन ओलिगोडेन्ड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन के खिलाफ उप-नैदानिक प्रतिरक्षण, और प्रत्यारोपित कैथेटर के माध्यम से समर्थक भड़काऊ साइटोकिन मिश्रण का इंट्रासेरेब्रल इंजेक्शन शामिल है।

Abstract

मल्टीपल स्क्लेरोसिस (एमएस) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) की सबसे आम प्रतिरक्षा-मध्यस्थता बीमारी है और उत्तरोत्तर शारीरिक विकलांगता और मृत्यु की ओर जाता है, रीढ़ की हड्डी और सेरिबैलम में सफेद पदार्थ घावों के कारण, साथ ही ग्रे मैटर में जनसांख्यिकी द्वारा। जबकि प्रयोगात्मक एलर्जी एन्सेफेलोमाइलाइटिस के पारंपरिक मॉडल रीढ़ की हड्डी और सेरिबेलर सफेद पदार्थ में सेल-मध्यस्थता सूजन की जांच के लिए उपयुक्त हैं, वे ग्रे मैटर विकृतियों को संबोधित करने में विफल रहते हैं। यहां, हम कॉर्टिकल डिमाइलेशन के एक उपन्यास चूहा मॉडल के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिससे रोग और आणविक तंत्र की जांच होती है जिससे कॉर्टिकल घाव होते हैं। डेमिलिएंशन को एक अपूर्ण फ्रायंड के एडजुवेंट में कम खुराक मायलिन ओलिगोडेन्ड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन (एमओजी) के साथ प्रतिरक्षण से प्रेरित किया जाता है जिसके बाद कैथेटर-मध्यस्थता वाले इंट्रासेरेब्रल डिलीवरी प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स होते हैं। कैथेटर, इसके अलावा, इंजेक्शन प्रेरित आघात के कारण के बिना demyelination के कई दौर सक्षम बनाता है, साथ ही संभावित चिकित्सकीय दवाओं के इंट्रासेरेब्रल वितरण एक पूर्व नैदानिक जांच के दौर से गुजर । विधि भी नैतिकता की दृष्टि से अनुकूल है के रूप में पशु दर्द और संकट या विकलांगता नियंत्रित कर रहे है और अपेक्षाकृत कम । पूरे प्रोटोकॉल के कार्यान्वयन के लिए अपेक्षित समय सीमा लगभग 8 - 10 सप्ताह है।

Introduction

एमएस सीएनएस की एक प्रतिरक्षा-मध्यस्थता, भड़काऊ बीमारी है, जो मुख्य रूप से माइलिन शीट्स को नुकसान पहुंचाती है, लेकिन अंततः अक्षीय हानि और स्थायी न्यूरोनल क्षति की ओर ले जाती है। एमएस सीएनएस की सबसे आम प्रतिरक्षा-मध्यस्थता बीमारी है, जिसमें दुनिया भर में लगभग 2.3 मिलियन लोगों की अनुमानित व्यापकता है, नेशनल एमएस सोसाइटी1के अनुसार, और एक प्रमुख व्यक्तिगत और सामाजिक आर्थिक बोझ का प्रतिनिधित्व करता है। रोग की शुरुआत की औसत आयु 30 वर्ष है और गंभीर विकलांगता के कारण उत्पादक वर्षों के नुकसान की ओर जाता है। एमएस वर्तमान में लाइलाज है, और वर्तमान उपचार के तौर-तरीकों का उद्देश्य पतन-प्रेषण एमएस में एक तीव्र पतन के दौरान लक्षणों का प्रबंधन करना और इम्यूनोमोडुलेटरी थेरेपी2,3द्वारा रिलेप्स आवृत्ति को कम करने के लिए रोग के पाठ्यक्रम को संशोधित करना है। कोई उपचार विकल्प अभी तक प्रगतिशील प्रकार4के लिए प्रभावोत्पादक साबित हो गया है, बी सेल घट चिकित्सा के हाल ही में एक नैदानिक परीक्षण के अपवाद के साथ, जो सक्रिय सूजन5के साथ प्राथमिक प्रगतिशील एमएस (PPMS) रोगियों के एक उपसमूह में प्रभावोत्पादक होना दिखाया गया था । जबकि कई संभावित आनुवंशिक6 और पर्यावरण जोखिमकारकों 7 की पहचान की गई है, एमएस की एटियोलॉजी, हालांकि, अज्ञात रहता है ।

एमएस में बड़े भड़काऊ demyelinating सजीले टुकड़े की विशेषता है, और चोटों को फैलाना, सफेद बात8,9। फोकल घावों को एक व्यापक टी-सेल मध्यस्थता हमले, ओलिगोडेन्ड्रोसाइट विनाश, प्रतिक्रियाशील एस्ट्रोग्लियोसिस और अक्षीय अध: पतन के साथ जोड़ा गया है, जिससे मोटर न्यूरॉन में गिरावट आई है। ग्रे मैटर डेमेलियेशन और शोष को इस बीमारी की अतिरिक्त हिस्टोपैथोलॉजिकल विशेषताओं के रूप में मान्यता मिली है9,10,11. बाद में12,13रोगियों में न्यूरोलॉजिकल रोग और संज्ञानात्मक गिरावट में योगदान करनेकासुझाव दिया गया है । कॉर्टिकल डिमाइलेशन के तीन पैटर्न को प्रतिष्ठित किया गया है, अर्थात् मैं) ल्यूकोक्रैटिकल, सफेद पदार्थ के घावों (34%), ii) छोटे, पेरिवास्कुलर (16%), और iii) उपपिअल (50%) के साथ समीपस्थ। फोकल व्हाइट मैटर घावों के विपरीत, इन ग्रे मैटर घावों को टी-सेल मध्यस्थता हमले की कमी की सूचना दी गई है और इसके बजाय एक बढ़ी हुई माइक्रोग्लियल सक्रियण, एपोप्टोसिस और न्यूरोनल लॉस12की विशेषता है।

आज तक, बीमारी की जटिलता के कारण, एक ही पशु मॉडल में मानव एमएस को फिर से काटना संभव नहीं हो पाया है। विभिन्न प्रकार के एमएस पशु मॉडल, प्रत्येक रोग रोगजनन और प्रगति के विभिन्न पहलुओं का अनुकरण करते हुए, इसके बजाय,14,15विकसित किए गए हैं। वर्तमान पशु मॉडल तीन अलग-अलग रोग प्रक्रियाओं की नकल करते हैं: i) फोकल भड़काऊ घाव, ii) सफेद पदार्थ की चोट को फैलाना, और iii) ग्रे मैटर पैथोलॉजी को फैलाना।

एमएस व्हाइट मैटर सजीले टुकड़े के पशु अध्ययन ज्यादातर कृंतक एन्सेफेलोमायलाइटिस (EAE) मॉडल में आयोजित किए गए हैं। टेस्ट जानवरों को एक पायस के साथ सक्रिय रूप से प्रतिरक्षित किया जाता है जिसमें मायलिन एंटीजन [आमतौर पर मायलिन ओलिगोडेन्ड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन (एमओजी)16,17,मायलिन बेसिक प्रोटीन (एमबीपी)18,या प्रोटेओलिपिड प्रोटीन (पीएलपी)19]एक साथ एक पूर्ण फ्रांड के एडजूवंट (सीएफए)20]के साथ। इस बीमारी को माइलिन-विशिष्ट टी-कोशिकाओं21के दत्तक अंतरण से भी निष्क्रिय रूप से प्रेरित किया जा सकता है। रोग पाठ्यक्रम एंटीजन/माउस स्ट्रेन कॉम्बिनेशन पर निर्भर करता है जिसका उपयोग किया जाता है। उदाहरण के लिए, C57BL/6 में एमओजी35-55, एक मोनोफेसिक क्रोनिक डिजीज22में परिणाम देता है, जबकि स्विस जिम लैम्बर्ट (एसजेएल) चूहों में पीएलपी139-151 चूहों के कारण लिंग-विशिष्ट तरीके से24 में एक रिलैपिंग-प्रेषण रोग पाठ्यक्रम23 होताहै । चूहा एमओजी35-55,इसके अलावा, एक एंसेपाइलोजेनिक टी-सेल प्रतिक्रिया को प्रेरित करता है, जबकि मानव एमओजी35-55 C57BL/6 चूहों25में बी-सेल-निर्भर सूजन को प्रेरित करता है। विभिन्न ईएई मॉडल मुख्य रूप से रीढ़ की हड्डी और सेरिबैलम में सेल-मध्यस्थता सूजन का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण प्रदान करते हैं, लेकिन कॉर्टेक्स, कॉर्पस कैलोसम और उपकॉकृतीय संरचनाओं जैसी अग्रेब्राण संरचनाएं काफी हद तक26से बच जाती हैं। न तो सफेद पदार्थ की चोट को फैलाना और न ही ग्रे मैटर डिमाइलेशन, इसके अलावा, EAE मॉडल26, 27में पर्याप्त रूप से दोहरायाजाताहै। सक्रिय ईएई प्रेरण से जुड़े कॉर्टिकल डिमाइलेशन को मार्मोसेट28, 29 और कुछ लुईस चूहे उप उपभेदों में सूचित किया गया है, बाद के मामले में एमएचसी वर्ग 1 और वर्ग द्वितीय आइसोटाइप और एलील्स30के प्रचलित संयोजनों के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है।

क्यूप्रीजोन मॉडल31 कॉर्टिकल, उप-कॉर्टिकल 32 और हिप्पोकैम्पल 33 क्षेत्रों के साथ-साथ कॉर्पस कैलोसम 34 और कॉडेट पुटामेन35के व्यापक डिमाइलेशन के साथ फैलाना सफेद पदार्थ डिमाइलेशन और ग्रे मैटर पैथोलॉजी का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है। क्यूप्रिजोन नशा, जो सैद्धांतिक रूप से, ओलिगोडेन्ड्रोसाइट्स के मेटाबोलिक तनाव-प्रेरित एपोप्टोसिस में परिणाम देता है, एमएस दिमाग के कॉर्टिकल डेमीलिनिंग घावों जैसे माइक्रोग्लिया एक्टिवेशन, एस्ट्रोग्लियोसिस और घुसपैठ परिधीय प्रतिरक्षा कोशिकाओं की सापेक्ष कमी की कुछ विशेषताओं की नकल करता है। न्यूरोनल एपोप्टोसिस और थैलेसीमिक शोष की कमी, साथ ही आहार क्यूपरिजोन सप्लीमेंट32की समाप्ति पर मनाए गए एक मजबूत पुनर्मीलन के साथ डिमाइलेशन का पूरा समाधान, हालांकि, क्यूपरीजोन के उपयोग को प्रीक्लिनिकल एमएस मॉडल के रूप में सीमित करता है। विषाक्त डिमाइलेशन को सफेद पदार्थ के इलाकों36, 37में लिसोलेिथिन या एथिडियम ब्रोमाइड के फोकल इंजेक्शन द्वारा भी प्रेरित किया जा सकता है, लेकिन इन तरीकों का शायद ही कभी उपयोग कियाजाताहै। विषाक्त डिमाइलेशन मॉडल रेमियोलेशन के जटिल तंत्रों के विश्लेषण के लिए विशेष रूप से उपयुक्त हैं, जैसे ओलिगोडेन्ड्रोसाइट प्रोजेनिटर कोशिकाओं और एस्ट्रोसाइट्स38,39के लिए आवश्यकता। हाल की दो समीक्षाओं15,40में ईएई और नशा मॉडलों के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान की गई है .

साइटोकिन-प्रेरित डिमिलिनेशन को शुरू में ईएई41में रीढ़ की हड्डी के सफेद पदार्थ के घावों का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था। बाद में, इसे एमएस डार्क अगूटी (डीए) या लुईस चूहों में कॉर्टिकल ग्रे मैटर विकृतियों का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया गया था, जो पहले एक अधूरे फ्रायंड के एडजुवंट (आईएफए) में एमओजी1-12542,43 या एमओजी1-11644 के साथ एक उप-नैदानिक प्रतिरक्षण द्वारा किया जाता है। शास्त्रीय EAE मॉडल के विपरीत, ये प्राइमेड जानवर रीढ़ की हड्डी में फोकल भड़काऊ घावों के नैदानिक लक्षणों का प्रदर्शन नहीं करते हैं। इसके बजाय, मस्तिष्क में एक भड़काऊ प्रतिक्रिया और demyelination बाद में एक समर्थक भड़काऊ साइटोकाइन मिश्रण के एक इंट्रासैरेब्रल प्रशासन द्वारा प्राप्त कर रहे है [ट्यूमर परिग कारक अल्फा (TNFα) और इंटरफेरॉन गामा (IFNγ)] एक बार जानवरों के रक्त में विरोधी MOG एंटीबॉडी के एक स्थिर टाइटर प्राप्त किया है ।

मर्कलर एट अल द्वारा अध्ययन। ४२ और गार्डनर एट अल । 44 ने उप-नैदानिक एमओजी प्रतिरक्षण और एक इंट्रासर्नेब्रल या सबराक्नेबल साइटोकिन इंजेक्शन द्वारा उप-क्लिनिकल कॉर्टिकल डिमिलिनेशन प्रेरण की प्रभावकारिता साबित की है। हालांकि, डिमाइलेशन की रिपोर्ट की गई अवधि 14 दिनों या उससे कम समय में बहुत कम थी, जिससे किसी भी औषधीय हस्तक्षेप परीक्षण के लिए खिड़की सीमित हो गई। दोनों मॉडल, इसके अलावा, एक दर्दनाक इंजेक्शन मोडस का उपयोग करते हैं, जो प्रति इंजेक्शन आघात और रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) टूटने का कारण बन सकता है और इस प्रकार परेंचिमा में भड़काऊ कोशिकाओं की अनियंत्रित भर्ती का कारण बन सकता है। इसके अलावा, दोनों अध्ययनों ने एक सीमित क्षेत्र तक, इप्सिलाटेरल कॉर्टेक्स में, या साइटोकिन इंजेक्शन की साइट के करीब के आसपास तक सीमित क्षेत्र तक सीमित है।

इन सीमाओं को दूर करने के लिए, हमने डीए चूहों के दाहिने पैरीटल कॉर्टेक्स में एक कैथेटर प्रत्यारोपित किया, जिसमें कैथेटर टिप कॉर्पस कैलोसम के ठीक ऊपर स्थित था। BBB अखंडता की पूरी वसूली की अनुमति देने के लिए, जानवरों कैथेटर प्रत्यारोपण के बाद 2 सप्ताह की एक आराम अवधि की अनुमति दी गई । बाद में, चूहों को आईएफए में 5 माइक्रोन्ड रिकॉम्बिनेंट एमओजी1-125 के साथ उप-चिकित्सकीय रूप से प्रतिरक्षित किया गया था। लगभग 4 सप्ताह के बाद एक स्थिर एंटी-एमओजी एंटीबॉडी टिटर की प्राप्ति के बाद, एक प्रोग्रामेबल सिरिंज पंप का उपयोग करके 10 मिनट के भीतर कैथेटर के माध्यम से साइटोकिन मिश्रण के 2 माइक्रोन इंजेक्ट किए गए थे। इस प्रक्रिया ने 15 दिनों में इप्सी और कॉन्ट्रालेटरल सेरेब्रल गोलार्द्धों दोनों के व्यापक कॉर्टिकल डिमाइलेशन को प्राप्त किया, जिसमें साइटोकिन इंजेक्शन43के लगभग 30 दिनों के बाद आंशिक पुनर्जंमीकरण हुआ। इसके अलावा, कैथेटर के माध्यम से प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स के दोहराए गए प्रशासन द्वारा कई डिमाइलेशन चरणों को प्रेरित किया जा सकता है, और वैश्विक मस्तिष्क शोष, प्रगतिशील एमएस उपप्रकार45की एक आम विशेषता, दूसरे डिमाइलेशन चरण43के बाद के रूप में जल्दी प्रेरित किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि प्रत्यारोपित कैथेटर का उपयोग औषधीय हस्तक्षेपों का परीक्षण करने के लिए भी किया जा सकता है।

नीचे वर्णित प्रोटोकॉल एक इंट्रासेब्रल कैथेटर का उपयोग करके डीए चूहों के दोनों मस्तिष्क गोलार्द्धों में व्यापक कॉर्टिकल डिमिटेरियनेशन की प्रजनन योग्य पीढ़ी के लिए प्रयोगात्मक चरणों का विस्तृत विवरण प्रदान करता है।

Protocol

यहां वर्णित सभी तरीकों को स्थानीय प्राधिकरणों (बुंदेमिनिस्ट्रियम फ्यूर विस्सेन्स्चैफ्ट एंड फोर्स्चुंग (ऑस्ट्रिया के विज्ञान और अनुसंधान मंत्रालय) द्वारा अनुमोदित किया गया है; लाइसेंस संख्या: 66.010/0132-WF/V/3b/2014) । वयस्क पुरुष दा चूहों (10-12 सप्ताह की उम्र) भोजन और पानी के लिए मुफ्त पहुंच के साथ एक 12/12 एच प्रकाश/अंधेरे चक्र में रखे गए थे ।

1. सामग्री तैयार करना
नोट: सर्जरी aseptic परिस्थितियों में आयोजित किया जाता है । शुरू करने से पहले, सुनिश्चित करें कि ड्रिल बिट्स सहित सभी सर्जिकल उपकरणों को उचित कीटाणुनाशक के साथ साफ किया जाता है।

  1. एक संवेदनाहारी मिश्रण तैयार करें: फेन्टनाइल का 0.02 मिलीग्राम/एमएल, मिडाजोलम का 0.4 मिलीग्राम/एमएल, और मेडेटोमिडीन का 0.2 मिलीग्राम/एमएल (मिश्रण में अंतिम सांद्रता)।
    नोट: वैकल्पिक एनेस्थेटिक्स के लिए संबंधित चर्चा अनुभाग देखें।
  2. एक मारक मिश्रण तैयार करें: फ्लूमजेनिल का 0.07 मिलीग्राम/एमएल और अतिपैमेजोल का 0.42 मिलीग्राम/एमएल (मिश्रण में अंतिम सांद्रता)।
  3. कैथेटर और कैथेटर टोपी को इनलेट और स्क्रू के साथ इकट्ठा करें। कैथेटर को स्केलपेल(चित्रा 1)के साथ 2 मिमी की लंबाई में काट लें।
    नोट: इसके लिए कैंची का उपयोग न करें, क्योंकि वे कैथेटर टिप के परिपत्र क्रॉस-सेक्शनल आकार को निचोड़ते और विकृत करते हैं।

2. सर्जिकल तैयारी

  1. एनेस्थेटिक मिश्रण (शरीर के वजन के 1.5 एमएल/किलो) के एक इंट्रापेरिटोनियल ( आईपी) प्रशासन द्वारा चूहे को एनेस्थेटाइज करें।
  2. विद्युत शेवर का उपयोग करके कानों के बीच चूहे के सिर को शेव करें। सर्जरी के दौरान हाइपोथर्मिया से बचने के लिए, जानवर को स्थिति से पहले स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम पर एक होमथेरामिक कंबल रखें।
  3. कान की सलाखों और काटने की प्लेट का उपयोग करके स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम में चूहे के सिर को स्थिर करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि सिर क्षैतिज और स्थिर है। उंगली या संदंश के साथ खोपड़ी पर दबाव लागू करके स्थिरता की जांच करें।
    नोट: स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम के भीतर एक ढीला निर्धारण और गैर-क्षैतिज स्थिति इच्छित निर्देशांक से विचलन का कारण बन सकती है।
  4. सर्जरी के दौरान कॉर्निया सूखापन को रोकने के लिए लुब्रिकेंट आई ड्रॉप लगाएं। किसी भी सर्जिकल प्रकाश जोखिम को रोकने के लिए एक अपारदर्शी सामग्री के साथ आंखों को कवर करें।
  5. 70% इथेनॉल और 10% पोविडोन-आयोडीन परिसर के आवेदन को बारी-बारी से मुंडा क्षेत्र को साफ करें।
    नोट: संक्रमण से बचने के लिए सर्जरी के दौरान सभी एहतियाती उपायों का पालन करें। सर्जरी एसेप्टिक परिस्थितियों में आयोजित की जाती है। यदि एसेप्सिस टूट गया है, तो दूषित सामग्री को बदलना होगा।

3. कैथेटर प्रत्यारोपण

  1. सिर की त्वचा के बीच में लगभग 2 सेमी लंबाई का अनुदैर्ध्य चीरा बनाएं। त्वचा को किनारों पर रखने के लिए बुलडॉग क्लैंप का उपयोग करें। इन चरणों के अवलोकन के लिए, चित्रा 2देखें ।
  2. कपास-इत्तला देने वाले एप्लिकेटर का उपयोग करके रक्त निकालें।
  3. खोपड़ी पेरिओस्टियम निकालें। कॉटन-टिप एप्लिकेटर के साथ ऊतक को साफ करें और खोपड़ी की हड्डी का पर्दाफाश करें। खोपड़ी को लगभग 1 मिनट तक सूखने दें।
  4. शारीरिक स्थलों, लैम्ब्डा, ब्रेग्मा और मध्यीय सीवन की पहचान करें। स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम पर स्थापित ड्रिल के साथ, ब्रेग्मा में ड्रिल टिप को शुरुआती बिंदु के रूप में रखें। ब्रेग्मा से 2 मिमी पीछे ले जाएं और ~ 2.4 मिमी को मध्यीय सीवन में ले जाएं।
  5. इस स्थिति में कैथेटर के लिए 0.5 मिमी व्यास छेद ड्रिल करें। धीरे से किसी भी हड्डी धूल दूर कश ।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है कि ड्यूरा मेटर ड्रिलिंग के दौरान बरकरार रहता है । यह सुनिश्चित करने के लिए, 1) एक ड्रिल का उपयोग करें जिसे स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम पर स्थापित किया जा सकता है, 2) ड्रिलिंग के दौरान अक्सर छेद का निरीक्षण करता है, और 3) छोटे चरणों में ड्रिल करें - यदि खोपड़ी पर बहुत अधिक दबाव लगाया जाता है, तो ड्रिल टिप जारी रहेगी, और खोपड़ी पूरी तरह से प्रवेश होने पर मस्तिष्क को नुकसान पहुंचता है।
  6. ड्रिल 3 आगे छेद (व्यास में ~ 1.3 मिमी) लंगर शिकंजा के लिए पहले छेद से कुछ मिलीमीटर दूर। धीरे-धीरे हड्डी की धूल को दूर करें।
    नोट: एंकर स्क्रू स्थानों का चयन करें जो कैथेटर टॉप (~ 2 मिमी व्यास) और एंकर स्क्रू टॉप (~ 1 मिमी) के लिए पर्याप्त जगह प्रदान करते हैं।
  7. एक सिरिंज का उपयोग करके बाँझ फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) या शारीरिक खारा के लगभग 1 -2 मिलील के साथ सिंचाई द्वारा हड्डी धूल निकालें। खोपड़ी को साफ करें। 2 - 3 पूर्ण बदल जाता है द्वारा लंगर शिकंजा कस।
    नोट: लंगर शिकंजा दंत सीमेंट पकड़ द्वारा सेट अप को स्थिर करने के लिए आवश्यक हैं, और, इस तरह, कैथेटर, जगह में । एक एंकर पेंच को कसते हुए, यह सुनिश्चित करें कि इसे धीरे-धीरे संदंश के साथ ऊपर की ओर उठाने से आसानी से हटाने योग्य नहीं है। कैथेटर के प्रत्यारोपण के बाद से ही ऊतक आघात का कारण बनता है, अतिरिक्त ड्यूरा चोट के लिए ड्रिलिंग whilst, या लंगर शिकंजा कस कई दर्दनाक चोटों के लिए नेतृत्व करेंगे, और संभवतः एक समूह के भीतर तुलनीयता में बाधा । पहले लंगर शिकंजा कस और कैथेटर पिछले डालें।
  8. खोपड़ी की सतह के लंबवत पहले छेद के माध्यम से 2-मिमी लंबाई कैथेटर डालें। जबकि अभी भी कैथेटर में पकड़, एक छोटे से दंत सीमेंट लागू होते है और यह एक संक्षिप्त (~ 5 एस) दंत चिकित्सा प्रकाश के लिए जोखिम के साथ बहुलक कैथेटर को स्थिर करने के लिए, अगले कदम में दोनों हाथों के उपयोग की अनुमति ।
    सावधानी: दंत चिकित्सा प्रकाश के साथ काम करते समय, सीधे टिप पर या आवेदन क्षेत्र से परिलक्षित प्रकाश पर देखने से बचें, क्योंकि इस प्रकाश की उच्च तीव्रता रेटिना क्षति का कारण बन सकती है। उचित सुरक्षात्मक चश्मे का उपयोग करें।
  9. कैथेटर के चारों ओर अधिक दंत सीमेंट लागू करें, शिकंजा लंगर, और दंत चिकित्सा इलाज प्रकाश (~ 15 - 30 एस) के साथ दंत सीमेंट जमना। एक संदंश की नोक के साथ सीमेंट के सख्त होने की पुष्टि करें।

4. घाव और संज्ञाहरण के विरोध का समापन

  1. कैथेटर के लिए फिर से संचियों, पूर्वकाल और पीछे के साथ सिर की त्वचा को बंद करें।
    नोट: चूंकि प्रत्यारोपण के अंत में खोपड़ी पर एक ऊबड़ सेट-अप होगा, इसलिए तदनुसार घाव बंद करें। त्वचा को बहुत अधिक उठाने से जानवर के लिए असुविधा होगी।
  2. 26 जी सुई के साथ 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करके मारक मिश्रण को चमड़े (शरीर के वजन के 1.5 एमएल/किलो) का इंजेक्ट करें।
  3. रोगनिरोधी एंटीबायोटिक उपचार के लिए चमड़े के नीचे इंजेक्शन (7.5 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन) द्वारा एन्फ्लोक्सेसिन (2.5%) का प्रशासन करें। चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा दर्द से राहत के लिए कार्प्रोफेन (1 मिलीग्राम/एमएल; 5 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर का वजन) और बुप्रेनोरफिन (१.२ मिलीग्राम/किलो) का प्रशासन करें ।

5. पोस्ट-ऑपरेटिव केयर और दवा

  1. संशोधित पिंजरे में जानवर को वापस करें और हाइपोथर्मिया से बचने के लिए अवरक्त प्रकाश के अनुप्रयोग के साथ, 1 - 3 घंटे के लिए इसे अवलोकन में रखें। लगातार निरीक्षण और पोस्ट ऑपरेटिव वसूली तक हर 5 से 10 मिनट जानवर को फिर से स्थान। रिकवरी तक आंखों में लगातार लाइट एक्सपोजर से बचने के लिए विशेष ध्यान रखें।
  2. सर्जरी के बाद दिन में चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा एन्फ्लोक्सासिन (७.५ मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर का वजन) और कारप्रोफेन (1 मिलीग्राम/एमएल; 5मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर का वजन) दोहराएं । बुप्रेनोरफिन को ताजा करने की आवश्यकता नहीं है क्योंकि पिछला उपचार 72 घंटों के लिए प्रभावी है।

6. प्रतिरक्षण मिश्रण की तैयारी (कैथेटर प्रत्यारोपण के बाद जल्द से जल्द 14 दिनों में)

नोट: तैयारी प्रक्रिया के दौरान सीरिंज को बर्फ पर रखें।

  1. दो 10 एमएल Luer लॉक टिप ग्लास सीरिंज को 3-तरह के स्टॉपकॉक की छोटी बाहों से कनेक्ट करें और तीसरे आउटलेट को लंबी बांह से बंद करें।
  2. सुनिश्चित करें कि कनेक्शन सुरक्षित और रिसाव मुक्त हैं: पिस्टन 2 पकड़े हुए खुले सिरिंज में बाँझ पीबीएस के लगभग 4 एमएल जोड़ें। पिस्टन 1 डालें और रिसाव की जांच करते हुए दोनों पिस्टन को आगे-पीछे धकेल दें। यदि कोई रिसाव नहीं होता है, तो पीबीएस को त्यागें और पिस्टन 1 को फिर से हटा दें।
  3. आईएफए के पिपेट 1 एमसीए और आरएमओजी1-125 के 50 माइक्रोग्राम एक साथ और एक उपयुक्त ट्यूब में बाँझ पीबीएस (पीएच 7.4) के साथ 2 एमएल की अंतिम मात्रा में मिश्रण को समायोजित करें।
    नोट: तैयारी के दौरान सीरिंज के सुझावों या दीवारों पर पायस के नुकसान के कारण, प्रशासन के लिए इरादा की तुलना में एक बड़ा मात्रा तैयार करें। इसी तरह एक बार में 1 से अधिक जानवर के लिए तैयार करना अधिक व्यावहारिक है।
  4. पतला आईफा और आरएमओजी1-125 मिश्रण को खुली सिरिंज में रखें। पिस्टन को धीरे से डालें, जबकि विपरीत पिस्टन(चित्रा 3ए)पर ढीला दबाव बनाए रखा जाता है।
  5. पिस्टन को आगे और पीछे धकेलकर एक सिरिंज से दूसरे सिरिंज में चलाकर इनोकुलम को पायस करें, जब तक कि यह सफेद और चिपचिपा(चित्र 3बी)न हो जाए।
  6. 3-तरह के स्टॉपकॉक की खुली छोटी बांह में 1 एमएल लूयर लॉक सिरिंज को ठीक करें और इसे इनोकुलम(चित्रा 3सी) सेभरें। सभी इनोकुलम को 1 मिली सीरिंज वितरित करें। इसे इंजेक्शन तक बर्फ पर रखें। तैयारी के दिन मिश्रण को प्रशासित करें।

7. प्रतिरक्षण

  1. एक कक्ष में आइसोफ्लोरेन के साथ चूहे को एनेस्थेटाइज करें (~ 2 मिनट, ऑक्सीजन 2 एल/मिनट के साथ मिश्रित) और फिर एक मास्क के माध्यम से संज्ञाहरण को बनाए रखें (ऑक्सीजन 1.5 एल/मिनट के साथ मिश्रित)।
  2. 21 जी सुई का उपयोग करके पूंछ के आधार पर 200 μL का इंजेक्शन लगाएं।
    नोट: इंजेक्शन को धीरे-धीरे प्रशासित करें क्योंकि समाधान चिपचिपा है।

8. एंटीबॉडी टाइटर्स का निर्धारण

  1. एंटी-एमओजी एंटीबॉडी टाइटर्स को निर्धारित करने के लिए प्रतिरक्षण के 4 सप्ताह बाद ~ 200 माइक्रोन रक्त वापस लें।
  2. एमओजी (पीबीएस में 5 माइक्रोग्राम/एमएल) के साथ 96-वेल प्लेट के कुओं को कोट करें और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए पीबीएस में 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के साथ प्लेट को ब्लॉक करें।
  4. प्लेट को चूहे सीरम (1:50) के साथ इनक्यूबेट करें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए मानक करें। पीबीएस/पॉलीसॉरबेट 20 के 200 माइक्रोन के साथ प्लेट 3x धोएं।
  5. सहिजन पेरोक्सिडास-संयुग्मित विरोधी चूहा आईजीजी माध्यमिक एंटीबॉडी (1:10,000) के साथ प्लेट को इनक्यूबेट करें। पीबीएस/पॉलीसॉरबेट 20 के 200 माइक्रोन के साथ प्लेट 3x धोएं।
  6. प्रति अच्छी तरह से पेरोक्सिडास सब्सट्रेट समाधान का 100 माइक्रोन जोड़ें और इसे कमरे के तापमान पर अंधेरे में 20 - 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  7. एक 405 एनएम तरंगदैर्ध्य पर ऑप्टिकल घनत्व को मापें और एक मानक वक्र का उपयोग करके ऑप्टिकल घनत्व से एंटीबॉडी टिटर की गणना करें।

9. इंट्रासेरेब्रल साइटोकिन इंजेक्शन

  1. कनेक्टर कैनुला (2 मिमी) की लंबाई को समायोजित करें। (तैयारी चरणों के लिए चित्रा 4 देखें।
  2. साइटोकिन मिश्रण (टीएनएफ-अल्फा के 500 एनजी/μL, बाँझ पीबीएस में रिकॉम्बिनेंट चूहा IFN-गामा के 300 यू/μL) के साथ एक 1 मिलीएल सिरिंज भरें। सिरिंज को कनेक्टर कैनुला से कनेक्ट करें। कैनुला को साइटोकिन मिश्रण से भरें। किसी भी बुलबुले से बचें।
  3. प्रोग्रामेबल सिरिंज पंप पर सिरिंज माउंट और यह 0.2μL/ कैनुला की नोक पर हवा के बुलबुले के गठन से बचने के लिए पंप शुरू करें और इसे काम करते रहें।
    नोट: इंजेक्शन की गति को उपयोग की जाने वाली विशिष्ट सिरिंज के आंतरिक व्यास को ध्यान में रखना चाहिए; जिससे पंप स्थापित करने के दौरान सिरिंज व्यास का पंजीकरण करना पड़ता है।
  4. एक कक्ष में आइसोफ्लुएरेन के साथ चूहे को एनेस्थेटाइज करें (~ 2 मिनट, ऑक्सीजन के 2 एल/मिनट के साथ मिश्रित) और फिर एक मास्क के माध्यम से संज्ञाहरण को बनाए रखें (ऑक्सीजन के 1.5 एल/मिनट के साथ मिश्रित)(आंकड़े 5B और 5C)। चिकनाई वाली आई ड्रॉप लगाएं क्योंकि जानवर को कम से कम 30 मिनट के लिए एनेस्थेटाइज्ड किया जाएगा।
  5. इनलेट के साथ कैथेटर कैप निकालें। कैथेटर और स्क्रू में कनेक्टर कैनुला डालें और इसे कस लें(आंकड़े 5D और 5E)।
    नोट: इसे अधिक तंग न करें, क्योंकि यह कैथेटर के ऊपरी सिरे को नष्ट कर देगा।
  6. इंजेक्शन को 10 मिनट के लिए आगे बढ़ने की अनुमति दें (इंजेक्शन की कुल मात्रा 2 माइक्रोल जा रही है)। पंप बंद करो। इंजेक्शन की मात्रा को पूरी तरह से फैलाना करने की अनुमति देने के लिए कैथेटर के अंदर कैनुला को 20 मिनट के लिए छोड़ दें।
  7. कनेक्टर कैनुला को अनस्क्रू करें और वैक्यूम प्रभाव से बचने के लिए इसे धीरे-धीरे हटा दें।
  8. कैथेटर कैप को इनलेट से फिर से अटैच करें और उसे स्क्रू करें। जानवर को पिंजरे में संज्ञाहरण से ठीक होने दें।

Representative Results

प्रोटियोलिपिड प्रोटीन (पीएलपी)(चित्रा 6)के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा साइटोकिन इंजेक्शन के बाद कॉर्टिकल डिमाइलेशन का मूल्यांकन अलग-अलग समय बिंदुओं पर किया जा सकता है। चित्रा 6ए एक एमओजी-प्रतिरक्षित नियंत्रण जानवर में 15 दिन में बरकरार पीएलपी इम्यूनोरेएक्टिविटी से पता चलता है जो प्रत्यारोपित कैथेटर के माध्यम से केवल बाँझ पीबीएस प्राप्त करता है। साइटोकिन इंजेक्शन के बाद 1 दिन, डिमाइलेशन पहले से ही एमओजी-प्राइमेड जानवरों में पाया जा सकता है, हालांकि केवल कैथेटरीकृत क्षेत्र(चित्रा 6बी)के करीब आसपास के क्षेत्र में। पीएलपी इम्यूनोरेएक्टिविटी कॉन्ट्रालेट्रल कॉर्टेक्स 1-डे पोस्ट-साइटोकिन इंजेक्शन में बरकरार रहती है। तीसरे दिन, पीएलपी इम्यूनोरेएक्टिविटी के नुकसान में क्रमिक वृद्धि, जो इप्सिलाटरल कॉर्टेक्स(चित्र 6सी)में फैलती है, देखी जा सकती है। 3 दिन(चित्रा 6डी)में कॉन्ट्रालेट्रल कॉर्टिकल डिमाइलेशन का भी पता लगाया जा सकता है, लेकिन यह लंगर शिकंजा के नीचे के क्षेत्र तक ही सीमित है, संभवतः लंगर शिकंजा43के कारण अंतर-प्रवाह तरल पदार्थ के कम प्रवाह वाले क्षेत्र के कारण। पीबीएस-इंजेक्ट किए गए नियंत्रण जानवरों में इसी तरह की टिप्पणी के अभाव में लंगर पेंच से उपजी आघात-प्रेरित जनसांख्यिकी की संभावना शामिल नहीं है।

9 - 15 दिनों के बीच, डिमाइलेशन दोनों गोलार्द्धों(आंकड़े 6E, 6Fऔर 6G)के कॉर्टेक्स के बड़े हिस्से को प्रभावित करता है। यह धीमे व्यवहार के अवलोकन के साथ मेल खाता है, हालांकि रोटारोड परीक्षण43में मोटर कौशल में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण कमी के बिना। कॉर्टिकल डिमाइलेशन दोनों गोलार्द्धों(आंकड़े 6H और 6I)में केवल आंशिक पुनर्मीयन के साथ 30 दिनों तक साइटोकिन इंजेक्शन के लिए निरंतर है। चित्रा 6जे इंट्रासैरेब्रल साइटोकिन इंजेक्शन के बाद कॉर्टिकल ग्रे मैटर में पीएलपी हानि का मात्राकरण दिखाता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि पीएलपी इम्यूनोरेएक्टिविटी का मूल्यांकन अभी तक 30 दिनों से अधिक अवधि के बाद नहीं किया गया है; इस प्रकार, पुनर्मीलन का तात्कालिक संकल्प, यदि कोई है, तो आगे के प्रयोग द्वारा मूल्यांकन किया जाना बाकी है । 15 दिन(चित्रा 7)में चिह्नित मस्तिष्क शोष में पहले इंजेक्शन परिणाम के 30 दिनों के बाद प्रत्यारोपित कैथेटर के माध्यम से साइटोकिन मिश्रण का एक दूसरा प्रशासन ।

Figure 1
चित्रा 1:कैथेटर की तैयारी। (ए और बी)गाइड कैनुला और डमी कैनुला (इनलेट के साथ कैथेटर कैप) इकट्ठे और खराब हो जाते हैं। (ग)फिर कैथेटर को स्केलपेल की मदद से आकार में 2 मिमी तक काटा जाता है। सूक्ष्म अवलोकन से पता चला है कि उस उद्देश्य के लिए कैंची का उपयोग कैनुला टिप के परिपत्र आकार को विकृत करता है, और इस प्रकार, इससे बचा जाना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:कैथेटर का प्रत्यारोपण। (क)सर्जरी एक देशांतर चीरा और पेरिओस्टियम को हटाने के साथ शुरू होता है । (B, C) यह पैनल ब्रेग्मा से 2 मिमी पीछे कैथेटर के लिए जगह की अंकन और सगिटल सीवन से दाईं ओर 2.4 मिमी पार्श्व दिखाता है; साथ ही कैथेटर और लैम्ब्डा से एक उचित दूरी के साथ तीन लंगर शिकंजा के लिए इरादा छेद के लिए स्थानों। (घ)कैथेटर छेद (एक गोल ड्रिल टिप के साथ एक 0.5 मिमी व्यास) ड्रिलिंग के बाद और लंगर शिकंजा के लिए छेद (एक मुड़ ड्रिल टिप के साथ 1.3 मिमी व्यास), लंगर शिकंजा कस रहे हैं। (ई, एफ) फिर कैथेटर डाला जाता है और पूरे सेटअप को पॉलीमराइजिंग डेंटल सीमेंट के साथ स्थिर किया जाता है। (जी)घाव कैथेटर के लिए दो या तीन समुद्री मील पूर्वकाल और पीछे के साथ सिले है । B = ब्रेग्मा; एल = लैम्ब्डा; C = कैथेटर; S1, S2 और S3 = तीन लंगर शिकंजा के लिए छेद के लिए स्थानों । स्केल बार = 1 सेमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3-आरएमओजी/आईफा पायस की तैयारी। (ए)आरएमओजी, पीबीएस और आईएफए के मिश्रण को एक सिरिंज से दूसरे सिरिंज में दबाकर पिस्टन को आगे-पीछे धकेलकर पायस किया जाता है,(ख)जब तक यह सफेद और चिपचिपा न हो । (ग)इसके बाद इंजेक्शन के लिए 1 एमएल सीरिंज में इनोकुलम का वितरण किया जाता है । आरएमओजी का 5 माइक्रोन का उपयोग पीबीएस/आईएफए मिश्रण के 200 माइक्रोन में एक चूहे को उप चिकित्सकीय रूप से प्रतिरक्षित करने के लिए किया जाता है; हालांकि, तैयारी के दौरान सीरिंज के सुझावों और दीवारों पर नुकसान के कारण, एक बड़ी मात्रा तैयार की जानी चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:कनेक्टर कैनुला की तैयारी। (A-D) ये पैनल दिखाते हैं कि कैसे एक कनेक्टर और एक आंतरिक 2-मिमी आकार के टेम्पलेट गाइड कैनुला के साथ इकट्ठा किया जाता है। (ई)आंतरिक एक स्केलपेल(एफ)की मदद से गाइड कैनुला के रूप में एक ही आकार के लिए काट दिया जाता है और टेम्पलेट गाइड तो unscrewed है । (जी)कनेक्टर कैनुला के दूसरे छोर को 1 एमएल सिरिंज के लिए तय किया जाता है, जिसमें इंजेक्शन मिक्स होता है, जिसमें 20 जी सुई होती है । स्केल बार = 3 सेमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:इंट्रासेरेब्रल इंजेक्शन। (A)एक प्रोग्रामेबल सिरिंज पंप को 2 माइक्रोन/मिनट इंजेक्शन की गति के लिए समायोजित किया जाता है, और साइटोकिन मिश्रण (या नियंत्रण के लिए बाँझ पीबीएस) से भरी 1 मिलीग्राम सिरिंज पंप पर लगाई जाती है। (ख)जानवर को पहले कक्ष में 2 एल/मिन ऑक्सीजन प्रवाह के साथ 5% आइसोफ्लाणे का उपयोग करके एनेस्थेटाइज्ड किया जाता है और फिर(ग)एनेस्थीसिया को 1.5 एल/मिन ऑक्सीजन प्रवाह के साथ 2.5% आइसोफ्लाणेन का उपयोग करके मास्क के माध्यम से निरंतर किया जाता है। (घ)इनलेट (डमी कैनुला) के साथ कैथेटर कैप खराब हो जाता है और प्रत्यारोपित कैथेटर के माध्यम से इंजेक्शन कैनुला डाला जाता है। चूंकि इंजेक्शन की मात्रा बहुत छोटी है, इसलिए जांचकर्ता को कैनुला की नोक पर हवा के बुलबुले से बचने के लिए सतर्क रहना चाहिए। इस कारण से, पंप के संचालन में होने के दौरान प्रविष्टि शुरू करना महत्वपूर्ण है और केवल तभी जब टिप पर तरल बुलबुला बढ़ रहा हो। अतिरिक्त मात्रा वैसे भी मस्तिष्क में नहीं जाना होगा, क्योंकि यह प्रविष्टि से पहले कैथेटर के शीर्ष पर टूट जाता है। (ई)तो कनेक्टर cannula कड़ा है, और पंप के लिए 10 मिनट के लिए काम करने के लिए जाने दिया जाता है । इंजेक्शन के 10 मिनट के बाद, पंप बंद कर दिया है, और cannula 15-20 मिनट के लिए अंदर छोड़ दिया है बीच का तरल पदार्थ के लिए इंजेक्शन मात्रा के प्रसार के लिए अनुमति देने के लिए । स्केल बार = 5 सेमी, जब तक कि अन्यथा संकेत न दिया जाए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6:कोरोनल मस्तिष्क वर्गों में पीएलपी इम्यूनोरेएक्टिविटी। (ए)यह पैनल पीबीएस इंजेक्शन (15 दिन) के साथ एक कंट्रोल ब्रेन (एमओजी-प्राइम्ड) दिखाता है, जिसके परिणामस्वरूप कॉर्टिकल डिमॉनेटेशन नहीं होता है । (ख)दिन के रूप में 1 के बाद साइटोकिन इंजेक्शन, कैथेटर क्षेत्र में demyelination स्पष्ट है । (ग)3 दिन,(डी)के साथ-साथ कॉन्ट्रालेटरल साइड में आईपीएसइलेटरल कॉर्टेक्स में पीएलपी इम्यूनोरेएक्टिविटी का व्यापक नुकसान देखा जाता है । पीएलपी इम्यूनोरेएक्टिविटी का व्यापक नुकसान 15 दिन में दोनों गोलार्द्धों में मनाया जाता है, क्योंकि(ई)यह पैनल इप्सिल्टरल कॉर्टेक्स को दिखाता है और(एफ)यह पैनल कॉन्ट्रालेटरल कॉर्टेक्स दिखाता है। (जी)15 दिन में पीएलपी के व्यापक नुकसान को दिखाने में दोनों गोलार्द्धों का अवलोकन किया जाता है । 30 दिन में, जैसा कि(एच)यह पैनल इप्सिल्टरल कॉर्टेक्स दिखाता है और(I)यह पैनल कॉन्ट्रालेटरल कॉर्टेक्स के लिए दिखाता है, अभी भी उल्लेखनीय डिमाइलेशन है, लेकिन कुछ रेमिलिनेटेड क्षेत्रों को भी देखा जा सकता है। (जम्मू)यह पैनल डिमाइलेशन(एमएम 2/गोलार्द्धमें पीएलपी लॉस) की मात्रा को दर्शाता है । 1.5 - 2 माइक्रोन कोरोनल मस्तिष्क वर्गों का उपयोग 1:500 के कमजोर पड़ने वाले कारक के साथ एमएस एंटी-पीएलपी के साथ पीएलपी डिटेक्शन के लिए किया गया था। कोशिका नाभिक के लिए हेमैटोक्सीलिन के साथ वर्गों का प्रतिकूल रूप था। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के बारे में विस्तृत जानकारी के लिए, Ucal एट अल देखें। 43. पैनल जी और जे Ucal एट अल से संशोधित किया गया । 43. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7:दूसरे साइटोकिन इंजेक्शन के बाद ब्रेन शोष। (A)यह पैनल पीबीएस इंजेक्शन (दिन 15) के साथ एक कंट्रोल ब्रेन (एमओजी-प्राइमेड) दिखाता है । (ख)पहले साइटोकिन इंजेक्शन के बाद 15 दिन में, एक दूसरे इंजेक्शन 15 दिनों के भीतर मस्तिष्क शोष की ओर जाता है । 1.5 - 2 माइक्रोन कोरोनल मस्तिष्क वर्गों का उपयोग 1:500 के कमजोर पड़ने वाले कारक के साथ एमएस एंटी-पीएलपी के साथ पीएलपी डिटेक्शन के लिए किया गया था। कोशिका नाभिक के लिए हेमैटोक्सीलिन के साथ वर्गों का प्रतिकूल रूप था। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के बारे में विस्तृत जानकारी के लिए, ब्लेकमोर37देखें। स्केल सलाखों = 500 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8:जानवर द्वारा कैथेटर हटाने को रोकने के लिए संशोधित पिंजरों। मानक पिंजरों में, ग्रिड पर खाद्य धारक अंतरिक्ष पिंजरे के नीचे के करीब स्थित है, एक जोखिम भरा संकीर्ण स्थान है कि कैथेटर ग्रिड के साथ उलझने की संभावना बढ़ जाती है और, जिससे, इसे हटाने का निर्माण । इससे बचने के लिए पिंजरे में बदलाव करना होगा। इस संकीर्ण स्थान को पारदर्शी विमान के साथ अवरुद्ध कर दिया गया था, जिससे जानवर का पालन हो गया था। इन संशोधित पिंजरों में पिंजरे के अंदर खाना दिया जाना है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

हमारी विधि दा चूहों का उपयोग करता है। चूहों के अनुकूलन की संभावना एक छोटे कैथेटर और शिकंजा के उपयोग की आवश्यकता होगी । यह भी ध्यान में रखना चाहिए कि रोग पाठ्यक्रम, भड़काऊ प्रतिक्रिया, और demyelination की हद तक क्या यहां प्रस्तुत किया है अगर एक अलग प्रजाति/तनाव का उपयोग किया जाता है से अलग हो सकता है । चूहों के विभिन्न उपभेदों का उपयोग करके शास्त्रीय ईएई मॉडल के साथ इस तरह के अंतर देखे गए हैं। चूहा मूल के MOG92-106, उदाहरण के लिए, ए एसडब्ल्यू चूहों में प्राथमिक प्रगतिशील या माध्यमिक प्रगतिशील EAE के परिणामस्वरूप, whilst यह SJL/J चूहों४६में relaping-प्रेषण EAE प्रेरित किया । इसलिए एक ही तनाव के जानवरों का इस्तेमाल किया जाना चाहिए । पिछले विभिन्न अध्ययनों में ईएई अभिव्यक्ति में लैंगिकमतभेदोंकी भी सूचना दी गई है । इस तरह के लिंग प्रभाव की घटना अच्छी तरह से यहां वर्णित प्रोटोकॉल के लिए उंमीद की जा सकती है अभी तक आगे के प्रयोगों में मांय किया जाना बाकी है ।

एक एनेस्थेटिक्स मिश्रण का इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) प्रशासन जिसमें फेन्टनाइल का 0.02 मिलीग्राम/एमएल, मिदाजोलम का 0.4 मिलीग्राम/एमएल और मेडेटोमिडीन का 0.2 मिलीग्राम/एमएल शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप के लिए उपयोग किया जाता है। वयस्क पुरुष डीए चूहों का वजन 270 - 300 ग्राम है, इस मिश्रण के लगभग 0.4 - 0.6 एमएल(यानी,~ 1.5 एमएल/किलो) की आवश्यकता होती है ताकि 60 -90 मिनट तक चलने वाले संज्ञाहरण को प्रेरित किया जा सके। सर्जरी के बाद, संज्ञाहरण एक मारक के एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा विरोधी है जिसमें फ्लूमजेनिल के 0.07 मिलीग्राम/एमएल और शारीरिक नमकीन (0.9% एनएसीएल) में एटीपेमेज़ोल के 0.42 मिलीग्राम/एमएल शामिल हैं। 1 -1.5 एमएल/किलो की खुराक 5 मिनट के भीतर संज्ञाहरण का विरोध करती है। वैकल्पिक रूप से, जानवरों को एनेस्थेटिक्स से शारीरिक रूप से धोने पर अनायास जागने की अनुमति दी जा सकती है, लेकिन उस मामले में, जानवरों को निगरानी में रखने की आवश्यकता होगी जब तक कि वे पूरी तरह से सचेत न हों।

पशुओं की सर्जरी के लिए अक्सर उपयोग किए जाने वाले अन्य संज्ञाहरण विकल्प, जैसे केटामाइन और जाइलाज़ीन47 या सोडियम पेंटोबार्बिटल48का आईपी इंजेक्शन, या आइसोफ्लोरेन49 और हेलोथेन50जैसे अस्थिर एनेस्थेटिक्स का साँस लेना, यहां प्रस्तुत सर्जरी के लिए भी विचार किया जा सकता है। हालांकि, एक एनेस्थेटिक एजेंट चुनना महत्वपूर्ण है जो इच्छित डाउनस्ट्रीम हस्तक्षेप (एस) में हस्तक्षेप नहीं करता है।

प्रतिरक्षण और इंट्रासैरेब्रल साइटोकिन इंजेक्शन के दौरान, एनेस्थीसिया के लिए 5% आइसोफ्लुन का उपयोग किया जाता है। यहां वर्णित मॉडल चूहों का उपयोग करके स्थापित किया गया था, और सूचीबद्ध प्रायोगिक विवरण, इस प्रकार, विशेष रूप से चूहे पर लागू होते हैं। कैथेटर प्रत्यारोपण निर्देशांक का चयन संभव सफेद पदार्थ परिवर्तन (कॉर्पस कैलोसम में कैथेटर टिप) के एक साथ विश्लेषण को सक्षम करने के लिए किया गया था। जबकि कैथेटर प्रविष्टि साइट को एंटेरोपोस्टेरियर और पार्श्व स्थिति के संबंध में भिन्न किया जा सकता है, केंद्रीय सल्कस के चयन के लिए बेहतर सगित्तल साइनस को नुकसान से बचने की आवश्यकता होती है।

वर्णित विधि की एक और विशेषता इप्सी और कॉन्ट्रालेट्रल गोलार्द्धों दोनों का समकक्ष डिमाइलेशन है, संभवतः कॉर्टिकल क्षेत्रों51से मध्यवर्ती तरल पदार्थ के शारीरिक प्रवाह द्वारा इंजेक्शन साइटोकीन मिश्रण को सबराक्नेइड अंतरिक्ष में ले जाने के परिणामस्वरूप। इंजेक्शन मोड, और कैथेटर का स्थान नहीं, इसलिए, सेरेब्रल कॉर्टेक्स में विलीनीकरण का कारण बनता है, और दाएं या बाएं पार्श्व प्रांतस्था का विकल्प, इस प्रकार, इस संबंध में सारहीन होना चाहिए।

प्रोटोकॉल एक 26 जी कैथेटर का उपयोग करता है, जो व्यापक दर्दनाक चोट से बचने के लिए काफी छोटा है और प्रयोग के लंबे समय तक कैथेटर टिप के क्लोजिंग की बढ़ी हुई दर से बचने के लिए काफी बड़ा है। निश्चित रूप से, प्रत्यारोपण और कैथेटर की उपस्थिति ही एक एस्ट्रोसाइटिक और माइक्रोग्लियाल सक्रियण का कारण बनती है, नियंत्रण जानवरों में भी केवल कैथेटर प्रत्यारोपण प्राप्त होता है; हालांकि, साइटोकिन-इंजेक्शन वाले जानवरों की तुलना में यह मामूली है। 43 बाद के विश्लेषणों में किसी भी हस्तक्षेप से बचने के लिए, हमने पॉली-ईथर-ईथर-कीटोन (तिरछी) से बने एमआरआई-संगत कैथेटर का इस्तेमाल किया।

वास्तव में, डिमाइलेशन की एक समान गहराई, प्रस्तुत विधि के साथ आईपीएसआई और कॉन्ट्रालेटरल दोनों क्षेत्रों में बनाई गई है। इसका तात्पर्य यह है कि कैथेटर गहराई/लंबाई प्रांतस्था में जनसांख्यिकी के पैटर्न और सीमा में एक प्रमुख भूमिका नहीं निभा सकता है । इसलिए, कैथेटर-प्रेरित घाव आकार को कम करने के लिए कैथेटर लंबाई के संशोधन पर विचार किया जा सकता है। फिर भी, एक काफी कम कैथेटर लंबाई थोड़ा कम स्पष्ट कॉर्टिकल डेमिलेशन का कारण बन सकती है, जबकि कैथेटर लंबाई के लिए विशेष रूप से परीक्षण के प्रयोगों द्वारा एक निर्णायक उत्तर प्राप्त किया जाएगा।

मॉडल का एक लाभ यह है कि प्रत्यारोपित कैथेटर कैथेटर के माध्यम से कॉर्टेक्स को प्रशासित संभावित चिकित्सीय के परीक्षण के लिए अनुमति देता है ताकि हिस्टोलॉजिकल रूप से पता लगाने योग्य कॉर्टिकल डेमिलेशन (दिन 15 या बाद में) के शिखर पर या बाद में रेमियोलेशन की अनुमति दी जा सके, जबकि एक प्रीट्रीटेशन सेटिंग में यह प्रतिरक्षण के बाद होगा लेकिन साइटोकिन इंजेक्शन से पहले। समय सीमा पर निर्णय जब चिकित्सा प्रशासन प्रशासित किया जाएगा, इसलिए, विशेष अनुसंधान सवाल और ब्याज की दवा पर निर्भर करेगा ।

कैथेटर प्रत्यारोपण के बाद, अध्ययन के अंत तक कैथेटर हटाने से बचने के लिए संशोधित (अधिमानतः उच्च शीर्ष) पिंजरों में एकल जानवरों को घर करना महत्वपूर्णहै (चित्रा 8)। जानवरों को भी इनलेट के साथ कैथेटर टोपी unscrew हो सकता है, हालांकि यह शायद ही कभी होता है । जानवरों को दैनिक रूप से देखा जाना चाहिए और हटाई गई टोपियां ताजा लोगों के साथ प्रतिस्थापित की जानी चाहिए, ताकि इनलेट की अनुपस्थिति में कैथेटर टिप रुकावट से बचा जा सके, और इंट्रासेरेब्रल इंजेक्शन के बाद परेंन्चिमा में सटीक वितरण सुनिश्चित किया जा सके। जानवरों को कैथेटर प्रत्यारोपण के बाद जल्द से जल्द 2 सप्ताह में प्रतिरक्षित किया जाता है ताकि रक्त-मस्तिष्क बाधा के उपचार और बंद होने की अनुमति दी जा सके।

प्रतिरक्षण के बाद सीरम एंटी एमओजी एंटीबॉडी टाइटर्स को मापा जाना चाहिए। एक खुराक प्रतिक्रिया प्रयोग से पता चला है कि MOG1-125 के 5 माइक्रोन (आईएफए में) वयस्क पुरुष दा चूहों में 4 सप्ताह के भीतर पर्याप्त प्रतिरक्षण प्रदान की है । ५,००० μg/ml और उच्च का एक टाइटर पर्याप्त होगा, लेकिन निश्चित रूप से MOG तैयारी और पशु तनाव सहित कई कारकों पर निर्भर करेगा और इस प्रकार, व्यक्तिगत रूप से निर्धारित किया जाना होगा । साइटोकिन इंजेक्शन से पहले भी लकवाग्रस्त हिंद अंगों के साथ शास्त्रीय ईएई फेनोटाइप के परिणामस्वरूप अत्यधिक उच्च एंटीजन खुराक से बचना महत्वपूर्ण है।

प्रत्येक जानवर को 5 माइक्रोन के साथ प्रतिरक्षित किया जाता है, जिसमें 5 माइक्रोनिंट मायलिन ओलिगोडेन्ड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन (आरएमओजी1-125)को अधूरा फ्रायंड के एडजुवेंट (आईएफए) के 200 माइक्रोल में पायस किया जाता है। चूंकि तैयारी के दौरान सिरिंज के भीतर कुछ पायस खो जाता है, इसलिए प्रत्येक जानवर के लिए इस राशि से अधिक तैयार करने की सलाह दी जाती है। हमने चूहे के एन-टर्मिनस से पुनः संयोजन एमओजी (1-125) का उपयोग किया, जिसे एस्चेरिचिया कोलाई में व्यक्त किया गया था और फिर चेलेट क्रोमेटोग्राफी द्वारा एकरूपता को शुद्ध किया गया था, 6 एम यूरिया में भंग किया गया था, और शारीरिक तैयारी प्राप्त करने के लिए पीबीएस के खिलाफ डायलाइज्ड किया गया था52,53। हालांकि, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एमओजी का भी उपयोग किया जा सकता है।

एमओजी1-116,एमओजी35-55 या पीएलपी 139-151 जैसे अन्य एंटीजन तैयारी का उपयोग विभिन्न ईएई मॉडलों में किया जाता है, और एंटीजन और पशु तनाव मतभेदों को इन मॉडलों में अलग-अलग रोग फेनोटाइप प्रेरित करने के लिए जाना जाता है20। इन एंटीजन तैयारी का परीक्षण डीए चूहों में नहीं किया गया था और, यदि आरएमओजी1-125को वरीयता में उपयोग किया जाता है, तो यहां प्रस्तुत की गई बीमारी फेनोटाइप या हिस्टालॉजी परिणामों से भिन्न हो सकता है।

एक कनेक्टर कैनुला कैथेटर के समान लंबाई इंट्रासेरेब्रल इंजेक्शन से पहले तैयार किया जाता है। यह एक टेम्पलेट कैथेटर के साथ कोडांतरण और एक ही आकार (लंबाई में 2 मिमी)(चित्रा 4)को काटने के द्वारा किया जा सकता है । यह महत्वपूर्ण है कि कनेक्टर कैनुला साइटोकिन इंजेक्शन के दौरान हवा बुलबुला मुक्त हो- क्योंकि इंजेक्शन की मात्रा केवल 2 माइक्रोन है, यहां तक कि कैनुला टिप पर एक छोटे से हवा का बुलबुला भी सफलतापूर्वक मस्तिष्क में वितरित तरल की मात्रा को काफी कम कर देगा। यह पंप को चालू रखने और कैनुला डालने से तभी हासिल किया जाता है जब टिप पर इंजेक्शन लिक्विड की बढ़ती बूंद मौजूद होती है। कैनुला प्रविष्टि के बाद, कनेक्टर कैथेटर से खराब हो जाता है, जबकि ओवरटाइटिंग से बचता है ताकि कैथेटर के ऊपरी सिरे को नुकसान न पहुंचाया जा सके, जिससे इंजेक्शन के बाद फिर से जाना मुश्किल हो जाएगा। इंजेक्शन-प्रेरित आघात से बचने के लिए 0.2 माइक्रोन/न्यूनतम की इंजेक्शन गति का उपयोग किया जाता है। इसके अलावा, एक धीमी गति से इंजेक्शन, इंजेक्शन के बाद एक 20 मिनट प्रतीक्षा अवधि के साथ संयुक्त, मध्यवर्ती तरल पदार्थ में इंजेक्शन तरल के प्रसार और CSF में एक प्रभावी draining सुनिश्चित करता है । वैक्यूम प्रभाव से बचने के लिए कैनुला को धीरे-धीरे हटा दिया जाता है।

रिपोर्ट की गई विधि में शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप शामिल है और इसलिए, कर्मचारियों को स्टीरियोटाटिक सर्वाइवल सर्जरी करने में सक्षम होना आवश्यक है। जानवरों के साथ सीधे संपर्क में कर्मियों को उपयुक्त पशु प्रयोग पाठ्यक्रम लेना चाहिए था । प्रोटोकॉल के शेष सक्षम प्रयोगशाला सदस्यों द्वारा किया जा सकता है।

विधि का उद्देश्य सेरेब्रल कॉर्टेक्स के सूजन-ट्रिगर डिमाइलेशन का उत्पादन करना है और मानव एमएस की सभी विशेषताओं को पुन: पेश नहीं करताहै (उदाहरण के लिए,फोकल भड़काऊ सफेद पदार्थ घावों की घटना, जो मानव एमएस की एक पहचान है)।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक मेडिकल यूनिवर्सिटी ग्राज़ में इंस्टीट्यूट ऑफ बायोमेडिकल रिसर्च के सभी कर्मियों को उनकी मदद और सहयोग के साथ-साथ पांडुलिपि को प्रूफरीडिंग के लिए क्रिस्टोफर जॉन राइटन का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adult male Dark Agouti rats (300 ±25 g) 
Fentanyl Hameln pharma plus, Germany  as Fentanyl-Citrate, 50 µg/ml
Midazolam ERWO Pharma, Austria 50039017 5 mg/ml
Medetomidin  Orion Pharma, Finland as Medetomidin hydrochloride, 1mg/ml
Flumazenil  Roche, Switzerland 0.1 mg/ml
Atipamezol  Orion Pharma, Finland as Atipamezol hydrochloride, 5 mg/ml
10% povidone-iodine complex  Mundipharma, Austria
Dental cement  Heraeus Kulzer, Germany 6603 7633
Physiological saline solution  Fresenius Kabi, Austria 0.9% NaCl
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich, Germany P3813
Isofluorane  AbbVie, Austria
Lubricating eye drops  Thea Pharma, Austria
70% EtOH Merck, Germany 1070172511 Absolute ethanol was diluted in ddH2O for preparation of 70% v/v
2.5% enrofloxacin Bayer, Germany Prophylactic antibiotics 
carprofen Pfizer, USA Painkillers, 50 mg/ml 
Tween-20  Sigma-Aldrich, Germany P9416
Pentobarbital  Richter Pharma, Austria pentobarbital sodium, 400 mg/ml
Interferon gamma  PeproTech, USA  400-20
Tumor necrosis factor alfa R&D Systems, USA 510-RT-050/CF
rMOG1-125 own product at the Centre of Molecular Medicine, Karolinska Institute, Sweden Recombinant rat myelin oligodendrocyte glycoprotein, amino acids 1-125 from the N-terminus, also commercially available: AnaSpec, AS-55152-500, USA
Anti-MOG antibody  Ana Spec/Kaneka Corporation, Japan AS-555157 Standard from ELISA-Kit; Ana Spec/Kaneka  
Incomplete Freund’s adjuvant  Sigma-Aldrich, Germany  F5506
Horse radish peroxidase conjugated anti-rat IgG secondary antibody  Ana Spec/Kaneka Corporation, Japan AS-555157 Secondary Antibody from ELISA-Kit; Ana Spec/Kaneka Corporation
Bovine serum albumin  Sigma-Aldrich, Germany A9576
Peroxidase substrate solution Vector Laboratories, USA SK-45000
Stereotactic frame  David Kopf Instruments, USA
Catheters, MRI suitable  PlasticsOne, USA 8IC315GPKXXC
Dummy cannulas  PlasticsOne, USA 8IC315DCNSPC
Plastic screws, MRI suitable  PlasticsOne, USA 8L080X093N01
Connector cannula  PlasticsOne, USA 8IC313CXSPCC
Screw driver with 2mm tip-size
Drill with flexible shaft extension  Proxxon, Germany NO 28 472, NO 28 706, NO 28 620,  
Drill bit, round, 0.5 mm  Hager & Meisinger, Germany  REF310 104 001 001 009
Drill bit, twisted, 1.3 mm  Hager & Meisinger, Germany  REF350 104 417 364 013
Scalpel  Braun, Germany BB510
Scalpel handle  Fine Science Tools, Germany 91003-12
Cotton tip applicator  Henry Schein Medical, Austria 900-3155
Surgical scissors Fine Science Tools, Germany 14101-14, 14088-10 
Surgical forceps Fine Science Tools, Germany 11002-12, 11251-35
Bulldog clamps  Fine Science Tools, Germany 18050-35
Homoeothermic blanket  TSE systems, Germany
Infrared Lamp Beurer, Germany 616.51
Dental curing light  Guilin Woodpecker Medical, China
Absorbable suture  Johnson & Johnson, Belgium V792E
Programmable syringe pump  World Precision Instruments, USA AL-1000
Exam gloves
Surgical gown
Electric Shaver Aesculap, Germany GT420
Volatile anesthetic vaporizer  Rothacher Medical, Switzerland CV 30-301-D
Oxygen source for volatile anesthetic vaporizer Air Liquide, Austria 19,113
Volatile anesthesia chamber  Rothacher Medical, Switzerland PS-0347
Anesthesia mask for rats  Rothacher Medical, Switzerland PS-0307-A
1 ml syringe  Codan, Denmark REF 62.1612
26 Gauge needle for injection  Braun, Germany 4657683
20 Gauge needle for cytokine injection and immunization  Braun, Germany 4657519
Luer lock tip glass syringes  Poulten & Graf, Germany 7.140-37
3 way stopcock  Becton Dickinson, Sweden 394600
96-well plate  Thermo Fisher Scientific, USA 442404
Plate reader  Cole-Parmer, USA EW-1396-00
37°C incubator Kendro, Germany 50042301
Micropipettes  Gilson, USA F167350

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Üçal, M., Haindl, M. T., Adzemovic, M. Z., Zeitelhofer, M., Schaefer, U., Fazekas, F., Hochmeister, S. Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines. J. Vis. Exp. (175), e57879, doi:10.3791/57879 (2021).

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