Summary
Protokollen som presenteres her tillater reproduksjon av en utbredt grå materiedeyelinasjon av begge kortikale halvkule hos voksne mannlige Dark Agouti-rotter. Metoden består av intracerebral implantasjon av et kateter, subklinisk immunisering mot myelin oligodendrocytt glykoprotein, og intracerebral injeksjon av en proinflammatorisk cytokinblanding gjennom det implanterte kateteret.
Abstract
Multippel sklerose (MS) er den vanligste immunmediert sykdom i sentralnervesystemet (CNS) og fører gradvis til fysisk funksjonshemming og død, forårsaket av hvite materielesjoner i ryggmargen og cerebellum, samt ved demyelinering i grå materie. Mens konvensjonelle modeller av eksperimentell allergisk encefalomyelitt er egnet for undersøkelse av cellemediert betennelse i ryggraden og cerebellar hvit materie, klarer de ikke å adressere grå materiepatologier. Her presenterer vi den eksperimentelle protokollen for en ny rottemodell av kortikale demyelinering som tillater undersøkelse av de patologiske og molekylære mekanismene som fører til kortikale lesjoner. Demyelinasjonen er indusert av en immunisering med lavdose myelin oligodendrocytt glykoprotein (MOG) i en ufullstendig Freunds adjuvans etterfulgt av et katetermediert intracerebral levering av proinflammatoriske cytokiner. Kateteret muliggjør dessuten flere runder med demyelinasjon uten å forårsake injeksjonsindusert traume, samt intracerebral levering av potensielle terapeutiske legemidler som gjennomgår en preklinisk undersøkelse. Metoden er også etisk gunstig ettersom dyresmerter og nød eller funksjonshemming kontrolleres og relativt minimal. Forventet tidsramme for implementering av hele protokollen er rundt 8 - 10 uker.
Introduction
MS er en immunmediert, inflammatorisk sykdom i CNS, som hovedsakelig skader myelinplater, men til slutt fører til axonal tap og permanent nevronskade. MS er den vanligste immunmedierte sykdommen i CNS med en estimert prevalens på rundt 2,3 millioner mennesker over hele verden, ifølge National MS Society1, og representerer en stor personlig og sosioøkonomisk byrde. Gjennomsnittlig alder av sykdommen utbruddet er 30 år og fører til tap av produktive år ved å forårsake alvorlig funksjonshemming. MS er for tiden uhelbredelig, og dagens behandlingsmodaliteter tar sikte på å håndtere symptomene under et akutt tilbakefall i relapsing-remitterende MS og å endre sykdomsforløpet for å redusere tilbakefallsfrekvensen ved immunmodulerende behandling2,3. Ingen behandlingsalternativ har ennå vist seg å være effektive for de progressive typene4, med unntak av en nylig klinisk studie av B-celle utarmingsterapi, som viste seg å være effektiv i en undergruppe av primære progressive MS (PPMS) pasienter med aktiv betennelse5. Mens flere potensielle genetiske6- og miljørisikofaktorer7 er identifisert, forblir etiologien til MS imidlertid ukjent.
MS er preget av store inflammatoriske demyeliniserende plakk i, og diffuse skader på, det hvite stoffet8,9. Fokale lesjoner har vært forbundet med et omfattende T-cellemediert angrep, oligodendrocytt ødeleggelse, reaktiv astrogliose og axonal degenerasjon, noe som fører til en motorisk nevronnedgang. Grå materie demyelinering og atrofi har fått anerkjennelse som ytterligere histopalogiske trekk ved sykdommen9,10,11. Sistnevnte har blitt foreslått å bidra til nevrologisk dysfunksjon og kognitiv nedgang hos pasienter12,13. Tre mønstre av kortikale demyelinering har blitt skilt ut, nemlig i) leukocortiske, sammenhengende med de hvite materielesjonene (34%), ii) små, perivasculære (16%), og iii) subpiale (50%). I motsetning til fokale hvite materielesjoner, har disse grå materielesjonene blitt rapportert å mangle et T-cellemediert angrep og er i stedet preget av en forbedret mikroglial aktivering, apoptose og nevronal tap12.
Til dags dato har det ikke vært mulig å rekapitulere menneskelig MS i en enkelt dyremodell, hovedsakelig på grunn av sykdommens kompleksitet. En rekke MS dyremodeller, som hver simulerer forskjellige aspekter av sykdomspatogenese og progresjon, har i stedet blitt utviklet14,15. Nåværende dyremodeller etterligner tre forskjellige sykdomsprosesser: i) fokale inflammatoriske lesjoner, ii) diffus hvit materieskade, og iii) diffus grå materiepatologi.
Dyrestudier av MS white matter plakk har for det meste blitt utført i gnager encefalomyelitt (EAE) modeller. Testdyr immuniseres aktivt med en emulsjon som inneholder et myelinantigen [vanligvis myelin oligodendrocytt glykoprotein (MOG)16,17, myelin grunnleggende protein (MBP)18, eller proteolipidprotein (PLP)19], sammen med en komplett Freunds adjuvans (CFA)20. Sykdommen kan også passivt induseres ved en adoptivoverføring av myelinspesifikke T-celler21. Sykdomsforløpet avhenger av antigen/mus-stammekombinasjonen som brukes. MOG35-55 i C57BL/6 resulterer for eksempel i en monofasisk kronisk sykdom22, mens PLP139-151 hos sveitsiske Jim Lambert (SJL) mus fører til et relapsing-remitterende sykdomskurs23 på en kjønnsspesifikk måte24. Rotte MOG35-55, videre, induserer en encefalitogen T-celle respons, mens menneskelig MOG35-55 induserer B-celleavhengig betennelse i C57BL / 6 mus25. Ulike EAE-modeller gir et utmerket verktøy for å studere cellemediert betennelse primært i ryggmargen og cerebellum, men forebrain strukturer som cortex, corpus callosum og subkortiske strukturer forblir i stor grad spart26. Verken diffus hvit materieskade eller grå materiedemyelinering er i tillegg tilstrekkelig replikert i EAE-modellene26,27. Kortikale demyelinering assosiert med aktiv EAE-induksjon er rapportert i marmosets28,29 og i visse Lewis rotte sub stammer, i sistnevnte tilfelle tilskrevet de rådende kombinasjonene av MHC klasse I og klasse II isotyper og alleler30.
Cuprizone-modellen31 er et nyttig verktøy for å studere diffus hvit materiedemyelinasjon og grå materiepatologi med en omfattende demyelinering av kortikale, sub-kortikale32, og hippocampal33 regioner, samt corpus callosum34 og caudate putamen35. Cuprizoneforgiftning, som i prinsippet resulterer i metabolsk stressindusert apoptose av oligodendrocytter, etterligner noen egenskaper ved de kortikale demyeliniserende lesjonene i MS-hjerner som mikrogliaaktivering, astrogliose og en relativ mangel på infiltrerende perifere immunceller. Mangelen på nevronal apoptose og thalamic atrofi, samt fullstendig oppløsning av demyelinasjon med en robust remyelination observert ved opphør av diett cuprizone tilskudd32, men begrense cuprizoneforgiftningens bruk som en preklinisk MS-modell. Giftig demyelinering kan også induseres ved en fokal injeksjon av lysolecitin eller ethidiumbromid i de hvite materiekanalene36,37, men disse metodene brukes sjelden. Giftige demyelinasjonsmodeller er spesielt egnet for analyse av de komplekse mekanismene for remyelinasjon, for eksempel kravet til oligodendrocytt stamceller og astrocytter38,39. Detaljert informasjon om EAE og beruselsesmodeller er gitt i to nylige anmeldelser15,40.
Den cytokininduserte demyelinasjonen ble opprinnelig utviklet for å studere spinal hvite materielesjoner i EAE41. Senere ble det modifisert for å studere kortikale gråstoffpatologier i MS. Dark Agouti (DA) eller Lewis rotter er først primet av en sub-klinisk immunisering med MOG1-12542,43 eller MOG1-11644 i en ufullstendig Freunds adjuvant (IFA). I motsetning til klassiske EAE-modeller viser disse primede dyrene ikke kliniske symptomer på fokale inflammatoriske lesjoner i ryggmargen. I stedet oppnås en inflammatorisk respons og demyelinasjon i hjernen ved en intracerebral administrering av en proinflammatorisk cytokinblanding [tumornekrosefaktor alfa (TNFα) og interferongamma (IFNγ)] når dyrene har oppnådd en stabil titer av anti-MOG-antistoffer i blodet.
Studier av Merkler et al. 42 og Gardner et al. 44 har bevist effekten av en subpial kortikale demyelinasjonsinduksjon ved en subklinisk MOG-immunisering og en intrarebral eller subarachnoidal cytokininjeksjon. Den rapporterte varigheten av demyelinasjonen var imidlertid for kort-en fullstendig remyelination skjedde i 14 dager eller mindre, og dermed begrense vinduet for noen farmakologisk intervensjon testing. Begge modellene bruker dessuten en traumatisk injeksjonsmodus, som i seg selv kan forårsake et injeksjonstraumer og en blod-hjerne barriere (BBB) sammenbrudd og dermed føre til en ukontrollert rekruttering av inflammatoriske celler i parenchyma. Begge studiene viste videre demyelinering som er begrenset til et begrenset område, i ipsilateral cortex, eller i nærheten av stedet for cytokininjeksjonen.
For å overvinne disse begrensningene implanterte vi et kateter i riktig parietal cortex av DA-rotter, med kateterspissen plassert like over corpus callosum. For å tillate full gjenoppretting av BBB-integriteten, fikk dyrene en hvileperiode på 2 uker etter kateterimplantasjonen. Deretter ble rottene sub-klinisk immunisert med 5 μg rekombinant MOG1-125 i IFA. Etter oppnåelsen av et stabilt anti-MOG antistofftitrøver etter rundt 4 uker ble 2 μL cytokinblanding injisert via kateteret innen 10 minutter ved hjelp av en programmerbar sprøytepumpe. Denne prosedyren fremkalte en utbredt kortikale demyelinering av både ipsi- og de kontralaterale hjernehalvdelene på 15 dager, med en delvis remyelinasjon rundt 30 dager etter cytokinininjeksjon43. Flere demyelinasjonsfaser kan dessuten induseres ved gjentatt administrering av proinflammatoriske cytokiner gjennom kateteret, og global hjerneatrofi, et vanlig trekk ved progressive MS-undertyper45, kan induseres så tidlig som etter den andre demyelinasjonsfasen43. Det er viktig at det implanterte kateteret også kan brukes til å teste farmakologiske inngrep.
Protokollen beskrevet nedenfor gir en detaljert forklaring av de eksperimentelle trinnene for en reproduserbar generasjon av utbredt kortikale demyelinasjon i begge hjernehalvdelene av DA-rotter ved hjelp av et intracerebral kateter.
Protocol
Alle metoder beskrevet her er godkjent av lokale myndigheter (Bundesministerium für Wissenschaft und Forschung (det østerrikske vitenskaps- og forskningsdepartementet); Lisensnummer: 66.010/0132-WF/V/3b/2014). De voksne mannlige DA-rottene (10- 12 ukers alder) ble plassert i en 12/12 t lys / mørk syklus med fri tilgang til mat og vann.
1. Materialforberedelse
MERK: Operasjonen utføres under aseptiske forhold. Før du begynner, må du sørge for at alle kirurgiske instrumenter, inkludert borene, rengjøres med et passende desinfeksjonsmiddel.
- Forbered en bedøvelsesblanding: 0,02 mg/ml fentanyl, 0,4 mg/ml midazolam og 0,2 mg/ml medetomidin (endelige konsentrasjoner i blandingen).
MERK: Se den respektive diskusjonsdelen for alternativ bedøvelse. - Forbered en motgiftblanding: 0,07 mg/ml flumazenil og 0,42 mg/ml atipamezol (endelige konsentrasjoner i blandingen).
- Monter kateteret og kateterhetten med innløpet og skruen. Skjær kateteret i en lengde på 2 mm med en skalpell (figur 1).
MERK: Ikke bruk saks til dette, da de klemmer og forvrenger den sirkulære tverrsnittsformen på kateterspissen.
2. Kirurgisk forberedelse
- Bedøv rotten ved en intraperitoneal (i.p.) administrering av bedøvelsesblandingen (1,5 ml/kg kroppsvekt).
- Barber hodet på rotten mellom ørene ved hjelp av den elektriske barbermaskinen. Plasser et homeothermic teppe på den stereotaktiske rammen før du plasserer dyret, for å unngå hypotermi gjennom hele operasjonen.
- Immobiliser rottens hode i den stereotaktiske rammen ved hjelp av ørestengene og biteplaten, og sørg for at hodet er horisontalt og stabilt. Kontroller stabiliteten ved å legge trykk på skallen med finger eller tang.
MERK: En løs fiksering og ikke-horisontal plassering i den stereotaktiske rammen kan forårsake avvik fra de tiltenkte koordinatene. - Påfør smøreøyedråper for å forhindre tørrhet i hornhinnen under operasjonen. Dekk øynene med et ugjennomsiktig materiale for å forhindre kirurgisk lyseksponering.
- Rengjør det barberte området ved å veksle mellom anvendelsen av 70% etanol og 10% povidon-jodkompleks.
MERK: Følg alle forholdsregler under operasjonen for å unngå infeksjon. Operasjonen utføres under aseptiske forhold. Hvis asepsis er ødelagt, må det forurensede materialet byttes ut.
3. Implantasjon av kateter
- Lag et langsgående snitt på ca 2 cm lengde i midten av hodehuden. Bruk bulldogklemmer for å holde huden av til sidene. Hvis du vil ha en oversikt over disse trinnene, kan du se Figur 2.
- Fjern blodet ved hjelp av en bomullsspisset applikator.
- Fjern skallen periosteum. Rengjør vevet med bomullsspissapplikatoren og eksponer skallebenet. La skallen tørke i ca 1 min.
- Identifiser de anatomiske landemerkene Lambda, Bregma og medial sutur. Når boret er installert på den stereotaktiske rammen, plasserer du borspissen på Bregma som utgangspunkt. Beveg 2 mm bakre fra Bregma og flytt ~2,4 mm sidelengs til medial suturen.
- Bor et hull med en diameter på 0,5 mm for kateteret i denne posisjonen. Pust forsiktig bort eventuelt benstøv.
MERK: Det er viktig at dura mater forblir intakt under boringen. For å sikre dette, 1) bruk en bor som kan installeres på den stereotaktiske rammen, 2) inspiser hullet ofte under boringen, og 3) bor ned i små trinn - hvis for mye trykk påføres skallen, vil borspissen fortsette inn og skade hjernen når skallen er helt penetrert. - Bor ytterligere 3 hull (~1,3 mm i diameter) for ankerskruene noen millimeter unna det første hullet. Blås forsiktig benstøv bort.
MERK: Velg ankerskrueplasseringer som gir nok plass til katetertoppen (~2 mm i diameter) og ankerskrueplatene (~1 mm). - Fjern benstøvet ved vanning med rundt 1 - 2 ml steril fosfatbufret saltvann (PBS) eller fysiologisk saltvann ved hjelp av en sprøyte. Rengjør skallen. Stram ankerskruene med 2 - 3 fulle omdreininger.
MERK: Ankerskruene er nødvendige for å stabilisere oppsettet ved å holde tannsementen, og dermed kateteret, på plass. Mens du strammer en ankerskrue, må du sørge for at den ikke lett kan fjernes ved å løfte den forsiktig oppover med tang. Siden implantasjonen av kateteret selv forårsaker vevstraumer, vil ytterligere duraskade under boring for, eller stramming av ankerskruene føre til flere traumatiske skader, og muligens hemme sammenlignbarheten i en gruppe. Stram ankerskruene først og sett inn kateteret sist. - Sett det 2 mm lange kateteret gjennom det første hullet, vinkelrett på skalleoverflaten. Mens du fortsatt holder kateteret inne, bruk litt tannsement og la det polymerisere med en kort (~ 5 s) eksponering for tannherdelyset for å stabilisere kateteret, slik at begge hender kan brukes i neste trinn.
FORSIKTIG: Når du arbeider med et tannherdende lys, må du unngå å se direkte på spissen eller på lyset som reflekteres fra bruksområdet, da den høye intensiteten til dette lyset kan forårsake netthinneskade. Bruk passende vernebriller. - Påfør mer tannsement rundt kateteret, forankre skruene og størkne tannsementen med tannherdelyset (~15 - 30 s). Bekreft herdingen av sementen med spissen av en tang.
4. Lukking av sår og antagonisering av anestesi
- Lukk hodehuden med resorberbare suturer, fremre og bakre til kateteret.
MERK: Siden det vil være et humpete oppsett over skallen på slutten av implantasjonen, gjør sårlukkingen tilsvarende. Løfting av huden for mye vil resultere i ubehag for dyret. - Injiser motgiftblandingen subkutant (1,5 ml/kg kroppsvekt) med en 1 ml sprøyte med en 26 G nål.
- Administrer enrofloxacin (2,5 %) ved subkutan injeksjon (7,5 mg/kg kroppsvekt) for profylaktisk antibiotikabehandling. Administrer carprofen (1 mg/ml, 5 mg/kg kroppsvekt) og buprenorfin (1,2 mg/kg) for smertelindring ved subkutan injeksjon.
5. Postoperativ omsorg og medisinering
- Returner dyret til det modifiserte buret og hold det under observasjon i 1 - 3 timer, med påføring av infrarødt lys for å unngå hypotermi. Vær konstant oppmerksom på og omplasser dyret hvert 5 til 10 minutter til postoperativ gjenoppretting. Vær spesielt forsiktig for å unngå konstant lyseksponering for øynene til utvinning.
- Gjenta enrofloxacin (7,5 mg/kg kroppsvekt) og karprofen (1 mg/ml, 5 mg/kg kroppsvekt) ved subkutane injeksjoner dagen etter operasjonen. Buprenorfin er ikke nødvendig å bli oppdatert da den forrige behandlingen er effektiv i 72 timer.
6. Fremstilling av immuniseringsblanding (tidligst 14 dager etter kateterimplantasjon)
Merk: Legg sprøytene på is under tilberedningsprosedyren.
- Koble to 10 ml Luer-låsespissglasssprøyter til de korte armene på en 3-veis stoppekran og lukk det tredje uttaket med den lange armen.
- Kontroller at tilkoblingene er sikre og lekkasjefrie: Tilsett ca. 4 ml steril PBS i den åpne sprøyten mens du holder stempel 2. Sett inn stempel 1 og skyv begge stemplene frem og tilbake mens du ser etter lekkasje. Hvis det ikke oppstår lekkasje, kast PBS og fjern stempel 1 igjen.
- Pipette 1 ml IFA og 50 μg rMOG1-125 sammen og juster blandingen til et sluttvolum på 2 ml med steril PBS (pH 7.4) i et egnet rør.
MERK: På grunn av tap av emulsjon på sprøytens spisser eller vegger under preparatet, lag et større volum enn beregnet for administrering. Det er på samme måte mer praktisk å forberede seg på mer enn 1 dyr samtidig. - Plasser den fortynnede IFA- og rMOG1-125-blandingen i den åpne sprøyten. Sett stempelet forsiktig inn mens du opprettholder et løst trykk på det motsatte stempelet (Figur 3A).
- Emulger inokulumet ved å kjøre det fra den ene sprøyten til den andre ved å skyve stemplene frem og tilbake, til det er hvitt og viskøst (figur 3B).
- Fest en luerlåssprøyte på 1 ml til den åpne korte armen på den 3-veis stoppekranen og fyll den med inokulum (figur 3C). Fordel alle inoculum til 1 ml sprøyter. Hold den på is til injeksjonen. Administrer blandingen på dagen for preparatet.
7. Immunisering
- Bedøv rotten med isofluoron i et kammer (~ 2 min, blandet med oksygen 2 L / min) og deretter opprettholde anestesi gjennom en maske (blandet med oksygen 1,5 l / min).
- Injiser 200 μL inoculum subkutant ved halebasen ved hjelp av en 21 G nål.
MERK: Administrer injeksjonen langsomt når oppløsningen er viskøs.
8. Bestemmelse av antistofftitre
- Trekk ~200 μL blod 4 uker etter immuniseringen for å bestemme anti-MOG antistofftiter.
- Belegge brønnene på en 96-brønnsplate med MOG (5 μg/ml i PBS) og inkuber dem i 1 time ved 37 °C.
- Blokker platen med 1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS i 1 time ved romtemperatur.
- Inkuber platen med rotteserum (1:50) og standard den i 2 timer ved 37 °C. Vask platen 3x med 200 μL PBS/Polysorbat 20.
- Inkuber platen med pepperrotperoksidasekonjugert antirotter IgG sekundært antistoff (1:10,000). Vask platen 3x med 200 μL PBS/Polysorbat 20.
- Tilsett 100 μL peroksidase substratløsning per brønn og inkuber den i 20 - 30 min i mørket ved romtemperatur.
- Mål den optiske tettheten ved en bølgelengde på 405 nm og beregn antistofftitren fra den optiske tettheten ved hjelp av en standardkurve.
9. Intracerebral Cytokine injeksjon
- Juster lengden på koblingskanylen (2 mm). (Se figur 4 for klargjøringstrinnene.)
- Fyll en 1 ml sprøyte med cytokinblandingen (500 ng/μL TNF-alfa, 300 U/μL rekombinant rotte IFN-gamma i steril PBS). Koble sprøyten til en koblingskanyle. Fyll kanylen med cytokinblandingen. Unngå bobler.
- Monter sprøyten på den programmerbare sprøytepumpen og programmer den til å injisere 0,2 μL/min (figur 5A). Start pumpen og la den virke for å unngå en luftbobleformasjon på spissen av kanylen.
MERK: Injeksjonshastigheten må ta hensyn til den indre diameteren til den spesifikke sprøyten som brukes; Dermed må sprøytediameteren registreres under pumpeoppsettet. - Bedøv rotten med isofluran i et kammer (~2 min, blandet med 2 l/min oksygen) og deretter opprettholde anestesi gjennom en maske (blandet med 1,5 l/min oksygen) (Figur 5B og 5C). Påfør smøreøydråper da dyret vil bli bedøvet i minst 30 min.
- Fjern kateterhetten med innløpet. Sett koblingskanylen inn i kateteret og skru og stram den (Figur 5D og 5E).
MERK: Ikke spenn den for mye, da dette vil ødelegge den øvre spissen av kateteret. - La injeksjonen fortsette i 10 min (det totale injeksjonsvolumet er 2 μL). Stopp pumpen. La kanylen være inne i kateteret i 20 minutter slik at det injiserte volumet kan spres helt.
- Skru av koblingskanylen og fjern den langsomt for å unngå vakuumeffekt.
- Fest kateterhetten igjen med innløpet og skru den. La dyret gjenopprette fra anestesi i et bur.
Representative Results
Kortikale demyelinering kan vurderes på forskjellige tidspunkter etter en cytokininjeksjon ved immunhiistokjemi for proteolipidprotein (PLP) (figur 6). Figur 6A viser intakt PLP-immunoreaktivitet på dag 15 i et MOG-immunisert kontrolldyr som bare fikk steril PBS gjennom det implanterte kateteret. På dag 1 etter cytokininjeksjonen kunne demyelinering allerede påvises hos MOG-primede dyr, om enn bare i nærheten av det kateteriserte området (Figur 6B). PLP-immunoreaktiviteten forblir intakt i den kontralaterale cortex 1-dagers post-cytokininusjeksjonen. På dag 3 kunne en gradvis økning i tapet av PLP-immunoreaktivitet, som sprer seg i ipsilateral cortex (figur 6C), observeres. Kontralateral kortikale demyelinering kan også påvises på dag 3 (figur 6D), men det er ganske begrenset til området under ankerskruene, muligens på grunn av et lavstrømsområde med interstitiell væske forårsaket av ankerskruene43. Fraværet av en lignende observasjon i PBS-injiserte kontrolldyr utelukker muligheten for traumeindusert demyelinering som stammer fra ankerskruen.
Mellom dag 9 - 15 påvirker demyelinering store deler av cortexen på begge halvkule (Figur 6E, 6Fog 6G). Dette sammenfaller med en observasjon av langsom oppførsel, men uten en statistisk signifikant reduksjon i motoriske ferdigheter i en rotarodtest43. Den kortikale demyelinasjonen opprettholdes i opptil 30 dager etter cytokinininjeksjon på begge halvkule (figur 6H og 6I) med bare en delvis remyelinasjon. Figur 6J viser en kvantifisering av PLP-tap i kortikalegrå materie etter intracerebral cytokininusering. Det skal bemerkes at PLP immunoreaktivitet ennå ikke er vurdert etter perioder lengre enn 30 dager; Dermed gjenstår den øyeblikkelige oppløsningen av remyelination, hvis det er noen, å bli vurdert ved videre eksperimentering. En annen administrering av cytokinblanding gjennom det implanterte kateteret 30 dager etter den første injeksjonen resulterer i markert hjerneatrofi på dag 15 (figur 7).
Figur 1: Tilberedning av kateteret. (A og B) Føringskanylen og dummykanylen (kateterhetten med innløp) monteres og skrues. (C) Deretter kuttes kateteret til 2 mm ved hjelp av en skalpell. Den mikroskopiske observasjonen viste at bruken av saks til det formål forvrenger den sirkulære formen på kanylespissen, og dermed må unngås. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Implantasjonen av kateteret. (A) Operasjonen starter med et langsgående snitt og fjerning av periosteum. (B, C) Dette panelet viser markeringen av stedet for kateteret ved 2 mm bakre fra Bregma og 2,4 mm lateral til høyre fra sagittal suturen; samt stedene for hullene beregnet på de tre ankerskruene med passende avstand fra kateteret og Lambda. (D) Etter boring av kateterhullet (en diameter på 0,5 mm, med en rund borspiss) og hullene til ankerskruene (1,3 mm-diameter med vridd borspiss), strammes ankerskruene. (E, F) Deretter settes kateteret inn og hele oppsettet stabiliseres med polymeriserende tannsement. (G) Såret er sydd med to eller tre knop fremre og bakre til kateteret. B = Bregma; L = Lambda; C = Kateter; S1, S2 og S3 = plasser for hullene for de tre ankerskruene. Skalastengene = 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Fremstilling av rMOG/IFA-emulsjon. (A) Blandingen av rMOG, PBS og IFA emulgeres ved å trykke inokulumet fra en sprøyte til en annen ved å skyve stemplene frem og tilbake, (B) til det er hvitt og viskøs. (C) Deretter fordeles inokulumet til 1 ml sprøyter til injeksjonen. 5 μg rMOG brukes i 200 μL PBS/IFA-blanding for å sub klinisk immunisere en rotte; På grunn av tapene på sprøytens spisser og vegger under preparatet, bør det imidlertid utarbeides et større volum. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Klargjøring av koblingskanylen. (A - D) Disse panelene viser hvordan en kontakt og en intern er montert med en malførerkanyle i 2 mm størrelse. (E) Den interne kuttes i samme størrelse som føringskanylen ved hjelp av en skalpell (F), og malføreren skrus deretter av. (G) Den andre enden av koblingskanylen er festet til en 1 ml sprøyte, som inneholder injeksjonsblandingen, med en 20 G nål. Skalastengene = 3 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Intracerebral injeksjon. (A) En programmerbar sprøytepumpe justeres for en 2 μL/min injeksjonshastighet, og 1 ml sprøyte fylt med cytokinblanding (eller steril PBS for kontrollene) monteres på pumpen. (B) Dyret bedøves først i kammeret ved hjelp av 5% isofluran med en 2 L / min oksygenstrøm og deretter (C) anestesi opprettholdes gjennom masken ved hjelp av 2,5% isofluran med en 1,5 L / min oksygenstrøm. (D) Kateterhetten med innløpet (dummykanylen) er skrudd av og injeksjonskanylen settes inn gjennom det implanterte kateteret. Siden injeksjonsvolumet er svært lite, bør undersøkeren være forsiktig for å unngå luftbobler på spissen av kanylen. Av den grunn er det viktig å starte innsettingen mens pumpen er i drift, og bare når det er en voksende væskeboble på spissen. Det ekstra volumet vil ikke gå inn i hjernen uansett, da det bryter ned på toppen av kateteret før innsettingen. (E) Deretter strammes koblingskanylen, og pumpen må brukes i 10 minutter. Etter 10 min injeksjon stoppes pumpen, og kanylen blir igjen inne i 15 - 20 min for å tillate diffusjon av det injiserte volumet til interstitialvæsken. Skalastengene = 5 cm, med mindre annet er angitt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: PLP-immunoreaktivitet i koronal hjerneseksjoner. (A) Dette panelet viser en kontrollhjerne (MOG-primet) med en PBS-injeksjon (dag 15), noe som ikke resulterer i en kortikale demyelinasjon. (B) Allerede på dag 1 etter cytokininusering er demyelinering tydelig i kateterområdet. (C) Et bredere tap av PLP-immunoreaktivitet observeres i ipsilateral cortex på dag 3, (D) samt på den kontralaterale siden. Utbredt tap av PLP immunoreaktivitet observeres i begge halvkule på dag 15, som (E) dette panelet viser ipsilateral cortex og (F) dette panelet viser kontralateral cortex. (G) En oversikt over begge halvkule er gitt i å vise det utbredte tapet av PLP på dag 15. På dag 30, som (H) viser dette panelet ipsilateral cortex og (I) dette panelet viser for kontralateral cortex, det er fortsatt bemerkelsesverdig demyelinasjon, men også noen remyelinerte områder kan observeres. (J) Dette panelet viser kvantifiseringen av demyelinasjonen (PLP-tap i mm2/halvkule). 1,5 - 2 μm koronal hjerneseksjoner ble brukt til PLP-deteksjon med MS anti-PLP med en fortynningsfaktor på 1:500. Seksjonene ble motarbeidet med hematoksylin for cellekjerner. For detaljert informasjon om immunhiistokjemi, se Ucal et al. 43. Panel G og J ble modifisert fra Ucal et al. 43. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Hjerneatrofi etter andre cytokininjeksjon. (A) Dette panelet viser en kontrollhjerne (MOG-primet) med en PBS-injeksjon (dag 15). (B) På dag 15 etter den første cytokininjeksjonen fører en ny injeksjon til hjerneatrofi innen 15 dager. 1,5 - 2 μm koronal hjerneseksjoner ble brukt til PLP-deteksjon med MS anti-PLP med en fortynningsfaktor på 1:500. Seksjonene ble motarbeidet med hematoksylin for cellekjerner. For detaljert informasjon om immunhiistokjemi, se Blakemore37. Skalastengene = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Modifiserte bur for å forhindre at kateteret fjernes av dyret. I standardburene ligger matholderplassen på rutenettet nærmere burbunnen, noe som skaper et risikabelt smalt rom som øker kateterets sjanse til å floke med rutenettet og dermed fjerningen. For å unngå dette må buret endres. Dette smale rommet ble blokkert med et gjennomsiktig plan, slik at dyrets overholdelse. Maten må gis inne i buret i disse modifiserte burene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Vår metode bruker DA rotter. Tilpasningen til mus vil sannsynligvis kreve bruk av et mindre kateter og skruer. Det bør også tas i betraktning at sykdomsforløpet, den inflammatoriske responsen og omfanget av demyelinering kan avvike fra det som presenteres her hvis en annen art / stamme brukes. Slike forskjeller har blitt observert med klassiske EAE-modeller ved hjelp av forskjellige stammer av mus. MOG92-106 av rotteopprinnelse resulterte for eksempel i primær progressiv eller sekundær progressiv EAE i A.SW-mus, mens den induserte relapsing-remitterende EAE i SJL / J mus46. Dyr med samme stamme bør derfor brukes. Kjønnsforskjeller i EAE-manifestasjon er også rapportert i ulike tidligere studier24. Forekomsten av slike kjønnseffekter kan godt forventes for protokollen som er beskrevet her, men gjenstår å validere i ytterligere eksperimenter.
Intraperitoneal (IP) administrering av en bedøvelsesblanding bestående av 0,02 mg/ml fentanyl, 0,4 mg/ml midazolam og 0,2 mg/ml medetomidin brukes til kirurgisk inngrep. Voksne hann-DA-rotter som veier 270 -300 g krever rundt 0,4 - 0,6 ml av denne blandingen (dvs., ~ 1,5 ml / kg) for å indusere en anestesi som varer 60 - 90 min. Etter operasjonen antagoniseres anestesi ved en subkutan injeksjon av en motgift som består av 0,07 mg/ml flumazenil og 0,42 mg/ml atipamezol i fysiologisk saltvann (0,9 % NaCl). En dose på 1 - 1,5 ml/kg motvirker anestesi innen 5 min. Alternativt kan dyrene få lov til å våkne spontant på en fysiologisk vask ut av bedøvelsen, men i så fall må dyrene holdes under observasjon til de er fullt bevisste.
Andre anestesialternativer som ofte brukes til dyreoperasjoner, for eksempel en IP-injeksjon av ketamin og xylazin47 eller natrium pentobarbital48, eller en innånding av flyktige bedøvelser som isofluorane49 og halothane50, kan også vurderes for operasjonen presentert her. Det er imidlertid viktig å velge et bedøvelsesmiddel som ikke forstyrrer de tiltenkte nedstrømsintervensjonen(e).
Under immunisering og intracerebral cytokin injeksjon brukes 5% isofluran til anestesi. Modellen beskrevet her ble etablert ved hjelp av rotter, og de eksperimentelle detaljene som er oppført, er dermed spesielt gjeldende for rotten. Kateterimplantasjonskoordinatene ble valgt for å muliggjøre samtidig analyse av mulige endringer i hvitt materiale (kateterspissen i corpus callosum). Mens kateterets innsettingssted kan varieres med hensyn til anteroposterior og lateral posisjon, krever valget av den sentrale sulcus unngåelse av skade på den overlegne skytten sinus.
Et annet trekk ved den beskrevne metoden er tilsvarende demyelinering av både ipsi- og kontralaterale halvkule, muligens som følge av transport av den injiserte cytokinblandingen til subarachnoid-rommet av den fysiologiske strømmen av interstitialvæsken fra kortikale regioner51. Injeksjonsmodusen, og ikke plasseringen av kateteret, forårsaker derfor demyelinering gjennom hjernebarken, og valget av høyre eller venstre parietal cortex bør derfor være uvesentlig i denne forbindelse.
Protokollen bruker et 26 G kateter, som er lite nok til å unngå omfattende traumatisk skade og stor nok til å unngå økt tilstopping av kateterspissen i løpet av eksperimentet. Implantasjonen og tilstedeværelsen av kateteret selv forårsaker en astrocytisk og mikroglial aktivering, også i kontrolldyrene som bare mottar kateterimplantasjonen; Dette er imidlertid mindre sammenlignet med cytokin-injiserte dyr. 43 For å unngå interferens med påfølgende analyser brukte vi MR-kompatible katetre laget av polyeter-eter-eter-keton (PEEK).
En lignende dybde av demyelinasjon er faktisk opprettet i både ipsi- og kontralaterale regioner med den presenterte metoden. Dette innebærer at kateterets dybde/lengde kanskje ikke spiller en viktig rolle i mønsteret og omfanget av demyelinering i cortex. Derfor kan en modifikasjon av kateterslengden vurderes for å redusere den kateterinduserte lesjonsstørrelsen. Likevel kan en betydelig kortere kateterlengde føre til en litt mindre uttalt kortikale demyelinasjon, mens et avgjørende svar bare vil bli oppnådd ved eksperimenter som spesifikt tester for kateterslengden.
En fordel med modellen er at det implanterte kateteret tillater testing av potensielle terapeutiske behandlinger administrert til cortex via kateteret for å tillate remyelinasjon på eller etter toppen av histologisk påvisbar kortikale demyelinering (dag 15 eller senere), mens i en forbehandlingsinnstilling ville dette være etter immuniseringen, men før cytokininuseringen. Beslutningen om tidsrammen når terapeutiske behandlinger vil bli administrert, vil derfor avhenge av det aktuelle forskningsspørsmålet og stoffet av interesse.
Etter kateterimplantasjon er det viktig å huse dyr enkelt i de modifiserte (helst høye toppen) burene for å unngå fjerning av kateteret til slutten av studien (Figur 8). Dyr kan også skru av kateterhetten med innløpet, selv om dette sjelden skjer. Dyrene bør observeres daglig og fjernede hetter bør erstattes med friske, for å unngå kateterspissblokkering i fravær av et innløp, og for å sikre en nøyaktig levering i parenchyma etter intracerebral injeksjon. Dyrene immuniseres tidligst 2 uker etter kateterimplantasjonen for å tillate helbredelse og lukking av blod-hjernebarrieren.
Serum anti-MOG antistofftiter bør måles etter immunisering. Et doseresponseksperiment viste at 5 μg MOG1-125 (i IFA) ga tilstrekkelig immunisering innen 4 uker hos voksne hann-DA-rotter. En titer på 5000 μg / ml og høyere vil være tilstrekkelig, men vil sikkert avhenge av flere faktorer, inkludert MOG-preparatet og dyrestammen, og må derfor bestemmes individuelt. Det er viktig å unngå for høye antigendoser som potensielt resulterer i en klassisk EAE-fenotype med lammede bakre lemmer selv før cytokininuseringen.
Hvert dyr er immunisert med 5 μg rekombinant myelin oligodendrocytt glykoprotein (rMOG1-125) emulgert i 200 μL ufullstendig Freunds Adjuvant (IFA). Siden noe av emulsjonen går tapt i sprøyten under preparatet, anbefales det å forberede mer enn dette beløpet for hvert dyr. Vi brukte rekombinant MOG (1-125 fra N-terminus av rotte MOG), som ble uttrykt i Escherichia coli og ble deretter renset til homogenitet ved chelate kromatografi, oppløst i 6 M urea, og dialysert mot PBS for å oppnå et fysiologiskpreparat 52,53. Kommersielt tilgjengelig MOG kan imidlertid også brukes.
Andre antigenpreparater, som MOG1-116, MOG35-55 eller PLP139-151, brukes i forskjellige EAE-modeller, og antigen- og dyrestammeforskjeller er kjent for å indusere distinkte sykdomsfenotyper i disse modellene20. Disse antigenpreparatene ble ikke testet hos DA-rotter, og hvis de brukes i stedet for rMOG1-125, kan det føre til en sykdomsfenotype eller histologiresultater som skiller seg fra det som presenteres her.
En koblingskanyle med samme lengde som kateteret fremstilles før intracerebral injeksjonen. Dette kan gjøres ved å montere det med et malkateter og kutte det i samme størrelse (2 mm i lengde) (Figur 4). Det er viktig at koblingskanylen er luftboblefri under cytokininjeksjonen - fordi injeksjonsvolumet bare er 2 μL, selv en liten luftboble på kanylespissen vil redusere volumet av væsken som leveres inn i hjernen betydelig. Dette oppnås ved å holde pumpen i gang og sette inn kanylen bare når en voksende dråpe injeksjonsvæske er til stede på spissen. Etter kanyleinnsettingen skrues kontakten til kateteret samtidig som den unngår overtettelse for ikke å skade den øvre spissen av kateteret, noe som vil gjøre det vanskelig å oppsummere etter injeksjonen. En injeksjonshastighet på 0,2 μL/min brukes til å unngå injeksjonsindusert traumer. Videre sikrer en langsom injeksjon, kombinert med en 20 min ventetid etter injeksjonen, diffusjonen av den injiserte væsken i interstitialvæsken og en effektiv drenering i CSF. Kanylen fjernes deretter sakte for å unngå vakuumeffekt.
Den rapporterte metoden inkluderer kirurgisk inngrep og krever derfor at personalet kan utføre stereotaktisk overlevelseskirurgi. Personell i direkte kontakt med dyrene skal ha tatt de aktuelle dyreforsøkskursene. Resten av protokollen kan utføres av kompetente laboratoriemedlemmer.
Metoden er ment å produsere betennelsesutløst demyelinering av hjernebarken og reproduserer ikke alle egenskapene til menneskelig MS (f.eks.forekomsten av fokalinflammatoriske hvite materielesjoner, som er et kjennetegn på menneskelig MS).
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil takke alt personell fra Institutt for biomedisinsk forskning ved Medical University Graz for deres hjelp og samarbeid, samt Christopher John Wrighton for korrekturlesing av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adult male Dark Agouti rats (300 ±25 g) | |||
| Fentanyl | Hameln pharma plus, Germany | as Fentanyl-Citrate, 50 µg/ml | |
| Midazolam | ERWO Pharma, Austria | 50039017 | 5 mg/ml |
| Medetomidin | Orion Pharma, Finland | as Medetomidin hydrochloride, 1mg/ml | |
| Flumazenil | Roche, Switzerland | 0.1 mg/ml | |
| Atipamezol | Orion Pharma, Finland | as Atipamezol hydrochloride, 5 mg/ml | |
| 10% povidone-iodine complex | Mundipharma, Austria | ||
| Dental cement | Heraeus Kulzer, Germany | 6603 7633 | |
| Physiological saline solution | Fresenius Kabi, Austria | 0.9% NaCl | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Germany | P3813 | |
| Isofluorane | AbbVie, Austria | ||
| Lubricating eye drops | Thea Pharma, Austria | ||
| 70% EtOH | Merck, Germany | 1070172511 | Absolute ethanol was diluted in ddH2O for preparation of 70% v/v |
| 2.5% enrofloxacin | Bayer, Germany | Prophylactic antibiotics | |
| carprofen | Pfizer, USA | Painkillers, 50 mg/ml | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich, Germany | P9416 | |
| Pentobarbital | Richter Pharma, Austria | pentobarbital sodium, 400 mg/ml | |
| Interferon gamma | PeproTech, USA | 400-20 | |
| Tumor necrosis factor alfa | R&D Systems, USA | 510-RT-050/CF | |
| rMOG1-125 | own product at the Centre of Molecular Medicine, Karolinska Institute, Sweden | Recombinant rat myelin oligodendrocyte glycoprotein, amino acids 1-125 from the N-terminus, also commercially available: AnaSpec, AS-55152-500, USA | |
| Anti-MOG antibody | Ana Spec/Kaneka Corporation, Japan | AS-555157 | Standard from ELISA-Kit; Ana Spec/Kaneka |
| Incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich, Germany | F5506 | |
| Horse radish peroxidase conjugated anti-rat IgG secondary antibody | Ana Spec/Kaneka Corporation, Japan | AS-555157 | Secondary Antibody from ELISA-Kit; Ana Spec/Kaneka Corporation |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, Germany | A9576 | |
| Peroxidase substrate solution | Vector Laboratories, USA | SK-45000 | |
| Stereotactic frame | David Kopf Instruments, USA | ||
| Catheters, MRI suitable | PlasticsOne, USA | 8IC315GPKXXC | |
| Dummy cannulas | PlasticsOne, USA | 8IC315DCNSPC | |
| Plastic screws, MRI suitable | PlasticsOne, USA | 8L080X093N01 | |
| Connector cannula | PlasticsOne, USA | 8IC313CXSPCC | |
| Screw driver with 2mm tip-size | |||
| Drill with flexible shaft extension | Proxxon, Germany | NO 28 472, NO 28 706, NO 28 620, | |
| Drill bit, round, 0.5 mm | Hager & Meisinger, Germany | REF310 104 001 001 009 | |
| Drill bit, twisted, 1.3 mm | Hager & Meisinger, Germany | REF350 104 417 364 013 | |
| Scalpel | Braun, Germany | BB510 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools, Germany | 91003-12 | |
| Cotton tip applicator | Henry Schein Medical, Austria | 900-3155 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools, Germany | 14101-14, 14088-10 | |
| Surgical forceps | Fine Science Tools, Germany | 11002-12, 11251-35 | |
| Bulldog clamps | Fine Science Tools, Germany | 18050-35 | |
| Homoeothermic blanket | TSE systems, Germany | ||
| Infrared Lamp | Beurer, Germany | 616.51 | |
| Dental curing light | Guilin Woodpecker Medical, China | ||
| Absorbable suture | Johnson & Johnson, Belgium | V792E | |
| Programmable syringe pump | World Precision Instruments, USA | AL-1000 | |
| Exam gloves | |||
| Surgical gown | |||
| Electric Shaver | Aesculap, Germany | GT420 | |
| Volatile anesthetic vaporizer | Rothacher Medical, Switzerland | CV 30-301-D | |
| Oxygen source for volatile anesthetic vaporizer | Air Liquide, Austria | 19,113 | |
| Volatile anesthesia chamber | Rothacher Medical, Switzerland | PS-0347 | |
| Anesthesia mask for rats | Rothacher Medical, Switzerland | PS-0307-A | |
| 1 ml syringe | Codan, Denmark | REF 62.1612 | |
| 26 Gauge needle for injection | Braun, Germany | 4657683 | |
| 20 Gauge needle for cytokine injection and immunization | Braun, Germany | 4657519 | |
| Luer lock tip glass syringes | Poulten & Graf, Germany | 7.140-37 | |
| 3 way stopcock | Becton Dickinson, Sweden | 394600 | |
| 96-well plate | Thermo Fisher Scientific, USA | 442404 | |
| Plate reader | Cole-Parmer, USA | EW-1396-00 | |
| 37°C incubator | Kendro, Germany | 50042301 | |
| Micropipettes | Gilson, USA | F167350 |
References
- MS Prevalence. National Multiple Sclerosis Society. , Available from: http://www.nationalmssociety.org/About-the-Society/MS-Prevalence (2017).
- Berkovich, R. Treatment of acute relapses in multiple sclerosis. Neurotherapeutics. 10 (1), 97-105 (2013).
- Kalincik, T. Multiple Sclerosis Relapses: Epidemiology, Outcomes and Management. A Systematic Review. Neuroepidemiology. 44 (4), 199-214 (2015).
- Feinstein, A., Freeman, J., Lo, A. C. Treatment of progressive multiple sclerosis: what works, what does not, and what is needed. The Lancet Neurology. 14 (2), 194-207 (2015).
- Montalban, X., et al. Ocrelizumab versus Placebo in Primary Progressive Multiple Sclerosis. The New England Journal of Medicine. 376 (3), 209-220 (2017).
- Dyment, D. A., Ebers, G. C., Sadovnick, A. D. Genetics of multiple sclerosis. The Lancet Neurology. 3 (2), 104-110 (2004).
- Ascherio, A. Environmental factors in multiple sclerosis. Expert Review of Neurotherapeutics. 13, 12 Suppl 3-9 (2013).
- Allen, I. V., McQuaid, S., Mirakhur, M., Nevin, G. Pathological abnormalities in the normal-appearing white matter in multiple sclerosis. Neurological Sciences. 22 (2), 141-144 (2001).
- Kutzelnigg, A., et al. Cortical demyelination and diffuse white matter injury in multiple sclerosis. Brain. 128 (11), 2705-2712 (2005).
- Kutzelnigg, A., Lassmann, H. Cortical lesions and brain atrophy in MS. Journal of the Neurological Sciences. 233 (1-2), 55-59 (2005).
- Lucchinetti, C. F., et al. Inflammatory cortical demyelination in early multiple sclerosis. The New England Journal of Medicine. 365 (23), 2188-2197 (2011).
- Peterson, J. W., Bo, L., Mork, S., Chang, A., Trapp, B. D. Transected neurites, apoptotic neurons, and reduced inflammation in cortical multiple sclerosis lesions. Annals of Neurology. 50 (3), 389-400 (2001).
- Kutzelnigg, A., Lassmann, H. Cortical demyelination in multiple sclerosis: a substrate for cognitive deficits. Journal of the Neurological Sciences. 245 (1-2), 123-126 (2006).
- Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. European Journal of Pharmacology. 759, 182-191 (2015).
- Kipp, M., Nyamoya, S., Hochstrasser, T., Amor, S. Multiple sclerosis animal models: a clinical and histopathological perspective. Brain Pathology. 27 (2), 123-137 (2017).
- Lebar, R., Lubetzki, C., Vincent, C., Lombrail, P., Boutry, J. M. The M2 autoantigen of central nervous system myelin, a glycoprotein present in oligodendrocyte membrane. Clinical and Experimental Immunology. 66 (2), 423-434 (1986).
- Linington, C., Bradl, M., Lassmann, H., Brunner, C., Vass, K. Augmentation of demyelination in rat acute allergic encephalomyelitis by circulating mouse monoclonal antibodies directed against a myelin/oligodendrocyte glycoprotein. The American Journal of Pathology. 130 (3), 443-454 (1988).
- Panitch, H., Ciccone, C. Induction of recurrent experimental allergic encephalomyelitis with myelin basic protein. Annals of Neurology. 9 (5), 433-438 (1981).
- Tuohy, V. K., Sobel, R. A., Lees, M. B. Myelin proteolipid protein-induced experimental allergic encephalomyelitis. Variations of disease expression in different strains of mice. The Journal of Immunology. 140 (6), 1868-1873 (1988).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Passive induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nature Protocols. 1 (4), 1952-1960 (2006).
- Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25 (7), 1951-1959 (1995).
- McRae, B. L., et al. Induction of active and adoptive relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) using an encephalitogenic epitope of proteolipid protein. Journal of Neuroimmunology. 38 (3), 229-240 (1992).
- Bebo, B. F., Vandenbark, A. A., Offner, H. Male SJL mice do not relapse after induction of EAE with PLP 139-151. Journal of Neuroscience Research. 45 (6), 680-689 (1996).
- Oliver, A. R., Lyon, G. M., Ruddle, N. H. Rat and human myelin oligodendrocyte glycoproteins induce experimental autoimmune encephalomyelitis by different mechanisms in C57BL/6 mice. The Journal of Immunology. 171 (1), 462-468 (2003).
- Scheld, M., et al. Neurodegeneration Triggers Peripheral Immune Cell Recruitment into the Forebrain. The Journal of Neuroscience. 36 (4), 1410-1415 (2016).
- Chanaday, N. L., Roth, G. A. Microglia and astrocyte activation in the frontal cortex of rats with experimental autoimmune encephalomyelitis. Neuroscience. 314, 160-169 (2016).
- Pomeroy, I. M., Matthews, P. M., Frank, J. A., Jordan, E. K., Esiri, M. M. Demyelinated neocortical lesions in marmoset autoimmune encephalomyelitis mimic those in multiple sclerosis. Brain. 128 (11), 2713-2721 (2005).
- Merkler, D., et al. Differential macrophage/microglia activation in neocortical EAE lesions in the marmoset monkey. Brain Pathology. 16 (2), 117-123 (2006).
- Storch, M. K., et al. Cortical demyelination can be modeled in specific rat models of autoimmune encephalomyelitis and is major histocompatibility complex (MHC) haplotype-related. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 65 (12), 1137-1142 (2006).
- Ludwin, S. K. Central nervous system demyelination and remyelination in the mouse: an ultrastructural study of cuprizone toxicity. Laboratory Investigation. 39 (6), 597-612 (1978).
- Skripuletz, T., et al. Cortical demyelination is prominent in the murine cuprizone model and is strain-dependent. The American Journal of Pathology. 172 (4), 1053-1061 (2008).
- Norkute, A., et al. Cuprizone treatment induces demyelination and astrocytosis in the mouse hippocampus. Journal of Neuroscience Research. 87 (6), 1343-1355 (2009).
- Acs, P., et al. 17beta-estradiol and progesterone prevent cuprizone provoked demyelination of corpus callosum in male mice. Glia. 57 (8), 807-814 (2009).
- Pott, F., et al. Cuprizone effect on myelination, astrogliosis and microglia attraction in the mouse basal ganglia. Brain Research. 1305, 137-149 (2009).
- Jeffery, N. D., Blakemore, W. F. Remyelination of mouse spinal cord axons demyelinated by local injection of lysolecithin. Journal of Neurocytology. 24 (10), 775-781 (1995).
- Blakemore, W. F. Ethidium bromide induced demyelination in the spinal cord of the cat. Neuropathology and Applied Neurobiology. 8 (5), 365-375 (1982).
- Mason, J. L., et al. Oligodendrocytes and progenitors become progressively depleted within chronically demyelinated lesions. The American Journal of Pathology. 164 (5), 1673-1682 (2004).
- Franco, P. G., Silvestroff, L., Soto, E. F., Pasquini, J. M. Thyroid hormones promote differentiation of oligodendrocyte progenitor cells and improve remyelination after cuprizone-induced demyelination. Experimental Neurology. 212 (2), 458-467 (2008).
- Lassmann, H., Bradl, M. Multiple sclerosis: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 223-244 (2017).
- Kerschensteiner, M., et al. Targeting experimental autoimmune encephalomyelitis lesions to a predetermined axonal tract system allows for refined behavioral testing in an animal model of multiple sclerosis. The American Journal of Pathology. 164 (4), 1455-1469 (2004).
- Merkler, D., Ernsting, T., Kerschensteiner, M., Bruck, W., Stadelmann, C. A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination. Brain. 129, Pt 8 1972-1983 (2006).
- Ucal, M., et al. Widespread cortical demyelination of both hemispheres can be induced by injection of pro-inflammatory cytokines via an implanted catheter in the cortex of MOG-immunized rats. Experimental Neurology. 294, 32-44 (2017).
- Gardner, C., et al. Cortical grey matter demyelination can be induced by elevated pro-inflammatory cytokines in the subarachnoid space of MOG-immunized rats. Brain. 136, Pt 12 3596-3608 (2013).
- Minagar, A., et al. The thalamus and multiple sclerosis: modern views on pathologic, imaging, and clinical aspects. Neurology. 80 (2), 210-219 (2013).
- Tsunoda, I., Kuang, L. Q., Theil, D. J., Fujinami, R. S. Antibody association with a novel model for primary progressive multiple sclerosis: induction of relapsing-remitting and progressive forms of EAE in H2s mouse strains. Brain Pathology. 10 (3), 402-418 (2000).
- Lifshitz, J., Witgen, B. M., Grady, M. S. Acute cognitive impairment after lateral fluid percussion brain injury recovers by 1 month: evaluation by conditioned fear response. Behavioural Brain Research. 177 (2), 347-357 (2007).
- Kabadi, S. V., Hilton, G. D., Stoica, B. A., Zapple, D. N., Faden, A. I. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nature Protocols. 5 (9), 1552-1563 (2010).
- Leonard, J. R., Grady, M. S., Lee, M. E., Paz, J. C., Westrum, L. E. Fluid percussion injury causes disruption of the septohippocampal pathway in the rat. Experimental Neurology. 143 (2), 177-187 (1997).
- Hare, G. M., et al. Severe hemodilutional anemia increases cerebral tissue injury following acute neurotrauma. Journal of Applied Physiology. 103 (3), 1021-1029 (2007).
- Abbott, N. J. Evidence for bulk flow of brain interstitial fluid: significance for physiology and pathology. Neurochemistry International. 45 (4), 545-552 (2004).
- Amor, S., et al. Identification of epitopes of myelin oligodendrocyte glycoprotein for the induction of experimental allergic encephalomyelitis in SJL and Biozzi AB/H mice. The Journal of Immunology. 153 (10), 4349-4356 (1994).
- Adzemovic, M. Z., Zeitelhofer, M., Hochmeister, S., Gustafsson, S. A., Jagodic, M. Efficacy of vitamin D in treating multiple sclerosis-like neuroinflammation depends on developmental stage. Experimental Neurology. , 39-48 (2013).
