गुणवाला Luteinizing हार्मोन स्राव के आकलन के लिए चूहों में लगातार पूंछ-टिप रक्त का नमूना
Summary
यहाँ हम अनर्गल चूहों में लगातार नमूना संग्रह के लिए एक पूंछ टिप रक्त नमूना प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इस विधि गुणवाला luteinizing हार्मोन स्राव के पैटर्न का आकलन करने के लिए उपयोगी है और अन्य परिसंचारी कारकों के विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
Abstract
कई अंत-स्रावी प्रणालियों में, परिसंचारी कारकों या हार्मोन लगातार जारी नहीं कर रहे हैं, लेकिन एक जारी कारक के जवाब में एक असतत पल्स के रूप में स्रावित कर रहे हैं. एकल बिंदु नमूना उपायों को पूरी तरह से सामांय शारीरिक शर्तों के तहत या dysregulation की शर्तों के दौरान या तो गुणवाला हार्मोन के स्रावी पैटर्न के जैविक महत्व को समझने के लिए अपर्याप्त हैं । Luteinizing हार्मोन (LH) पूर्वकाल पिट्यूटरी gonadotrope कोशिकाओं द्वारा संश्लेषित किया जाता है और एक गुणवाला पैटर्न है जो नाड़ी आकलन के लिए रक्त के नमूनों की लगातार संग्रह की आवश्यकता में स्रावित । यह हाल ही में जब तक चूहों में संभव नहीं किया गया है, एक उच्च संवेदनशीलता LH परख और लगातार कम मात्रा नमूना संग्रह के लिए एक तकनीक में उंनति के विकास के कारण, शुरू में स्टेन और सहकर्मियों द्वारा वर्णित है । 1 यहां हम पर्याप्त हैंडलिंग acclimatization के साथ चूहों से लगातार परिधीय रक्त नमूना संग्रह के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन LH के गुणवाला स्राव का पता लगाने के लिए । वर्तमान प्रोटोकॉल विवरण एक विस्तारित acclimatization अवधि कि LH के मजबूत और सतत दालों का आकलन कई घंटे से अधिक की अनुमति देता है । इस प्रोटोकॉल में, पूंछ की नोक काटा गया है और रक्त पूंछ से एकत्र की है एक हाथ का उपयोग कर पिपेट आयोजित की । gonadectomized चूहों में गुणवाला LH के आकलन के लिए, सीरियल नमूने हर 5-6 मिनट के लिए 90-180 मिनट के लिए एकत्र कर रहे हैं । महत्वपूर्ण बात, रक्त और LH की मजबूत दालों की माप के संग्रह जाग में पूरा किया जा सकता है, स्वतंत्र रूप से व्यवहार चूहों, पर्याप्त हैंडलिंग दिया acclimatization और प्रयास पर्यावरण तनाव को कम करने के लिए । पर्याप्त acclimatization 4-5 सप्ताह के भीतर रक्त संग्रह करने से पहले प्राप्त किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल पद्धति में प्रगति पर प्रकाश डाला गया माउस में कई घंटे से अधिक गुणवाला LH स्राव पैटर्न के आकलन के लिए पूरे रक्त के नमूनों का संग्रह सुनिश्चित करने के लिए, neuroendocrine अनुसंधान के लिए एक शक्तिशाली पशु मॉडल ।
Introduction
स्तनधारियों में Gonad समारोह गोनॉडोट्रॉफिन स्राव पर निर्भर है, luteinizing हार्मोन (LH) और कूप उत्तेजक हार्मोन, पिट्यूटरी ग्रंथि से. गोनैडोट्रॉपिंस या तो एक गुणवाला या वृद्धि पैटर्न गोनॉडोट्रॉफिन रिलीज हार्मोन (GnRH) के हाइपोथैलेमस स्राव के जवाब में स्रावित कर रहे हैं । संश्लेषण और दोनों LH और FSH के स्राव हाइपोथैलेमस GnRH, जननांगों स्टेरॉयड हार्मोन सहित अणुओं की एक किस्म से अंत में स्रावी, paracrine और autocrine कार्रवाई के माध्यम से विनियमित रहे हैं, और activin-inhibin-follistatin प्रणाली, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक के असंख्य तनाव और ऊर्जा संतुलन सहित शारीरिक स्थिति । 2
रक्त में lh के गुणवाला पैटर्न परिधीय रक्त में एक नहीं बल्कि अचानक निर्वहन lh से उठता है, लगभग घातीय उंमूलन के बाद । पैटर्न के महत्वपूर्ण सुविधाओं प्रत्येक lh निर्वहन की आवृत्ति और lh प्रतिक्रिया के आयाम, दोनों जिनमें से तय कर रहे हैं, भाग में, GnRH की रिहाई के द्वारा शामिल हैं । हाइपोथैलेमस के माप के लिए-पिट्यूटरी पोर्टल रक्त एकत्रित करने में कठिनाई के कारण गुणवाला GnRH, नमूना और LH की माप हाइपोथैलेमस-पिट्यूटरी-जननांगों अक्ष के GnRH विनियमन के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में उपयोग किया जाता है । इसलिए, महत्वपूर्ण जानकारी आवृत्ति और LH दालों, जो एक ही नमूने से निर्धारित नहीं किया जा सकता है की आयाम में एंकोडेड है ।
गुणवाला LH स्राव का विश्लेषण ऐतिहासिक रूप से अपने बड़े रक्त मात्रा और अक्सर रक्त नमूना संग्रह के लिए सहिष्णुता के कारण बड़े स्तनधारियों (मनुष्यों, रहनुमाओं, और भेड़) तक ही सीमित किया गया है । कुतर में, लगातार रक्त नमूना चूहे को सीमित किया गया था और निवास अलिंद कैथेटर के माध्यम से हासिल की । 3 , 4 अपेक्षाकृत कम लागत और आनुवंशिक की उपलब्धता (जैसे cre-लोक्स, CRISPR) और जटिल तंत्रिका सर्किट (जैसे optogenetics, chemogenetics) जोड़तोड़ चूहों एक आकर्षक मॉडल जीव बनाने; हालांकि, लगातार रक्त के नमूनों की प्राप्ति और LH सांद्रता के बाद विश्लेषण हाल ही में जब तक है, सिद्ध मायावी । इस महासंग्राम टास्क को लेकर स्टेन और सह कार्यकर्ताओं ने बीड़ा उठाया था. 1 तब से, कई प्रयोगशालाओं प्रयोगात्मक मानदंड की एक किस्म में गुणवाला LH स्राव का आकलन करने के लिए अक्सर रक्त नमूना और अति संवेदनशील LH परख का उपयोग करने के लिए शुरू कर दिया है । 5 , 6 , 7 , 8 , 9 यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि चूहों से कई रक्त के नमूनों को इकट्ठा करने की एक व्यावहारिक विधि की खोज के लिए प्रगति में कम से ४० साल10 के लिए कई तरह के साथ बनाया शोधन के साथ किया गया है । 11 , 12
LH पल्स पैटर्न का आकलन (यानी आवृत्ति और आयाम) इस आनुवंशिक रूप से परितंत्रीय पशु मॉडल में बेसल गोनॉडोट्रॉफिन स्राव की निगरानी में एक प्रमुख शोधन का प्रतिनिधित्व करता है । परंपरागत रूप से, चूहों में LH सांद्रता एक एकल रक्त के नमूने में निर्धारित किया गया । एक कमजोरी एकल बिंदु नमूनों की एक उच्च चर डेटा सेट है क्योंकि LH सांद्रता स्वाभाविक रूप से प्रत्येक पल्स के दौरान उतार चढ़ाव कर रहे हैं । एक और कमजोरी यह है कि अलग माप स्वाभाविक महत्वपूर्ण जानकारी LH पल्स स्राव के पैटर्न से अवगत याद आती है । इस प्रकार, स्वतंत्र रूप से व्यवहार में अक्सर रक्त के नमूनों को इकट्ठा करने के लिए एक विधि, अनर्गल चूहों (नमूना के दौरान कोमल हैंडलिंग के लिए छोड़कर) बढ़ाया जानकारी प्रदान करेगा और कई गुणवाला हार्मोन विनियमन की जांच प्रयोगशालाओं के लिए उपयोगी साबित.
यहां, हम जाग, अनर्गल चूहों से लगातार (हर 6 मिनट) रक्त के नमूने के संग्रह के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । महत्वपूर्ण बात, हम एक हैंडलिंग acclimatization प्रोटोकॉल है कि पूरे रक्त में समय की एक लंबी अवधि के लिए एक तीव्र चुनौती के लिए मूल्यांकन और निर्धारित किया जा सकता है की लंबाई से अधिक एकत्र पूरा खून नमूनों में गुणवाला LH स्राव के मजबूत और निरंतर पता लगाने के लिए अनुमति देता है शामिल हैं, जैसे कि स्थिरीकरण और संयम के मनोसामाजिक तनाव की प्रतिक्रिया. पूरे रक्त के नमूनों से LH सांद्रता के लिए एक प्रभावी परख पहले वर्णित किया गया है; 1 यह प्रोटोकॉल LH पल्स माप के लिए रक्त के नमूनों को इकट्ठा करने के लिए एक विधि पर ध्यान केंद्रित है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां हम पूरे रक्त पूंछ के लगातार रक्त संग्रह के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन-चूहों में गुणवाला LH स्राव के आकलन के लिए टिप नमूने । यह प्रोटोकॉल गुणवाला lh स्राव में तीव्र परिवर्तन का पता लगाने के लिए नमूनों क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक डीआरएस का शुक्रिया अदा करते हैं । जेनिफर यांग और अलेक्जेंडर (साशा) इस तकनीक के साथ ही कई उपयोगी और महत्वपूर्ण विचार विमर्श के साथ तकनीकी सहायता के लिए Kauffman । सीरम हार्मोन परख प्रजनन Ligand परख और विश्लेषण कोर, Eunice कैनेडी श्राइवर niched/NIH (NCTRI) अनुदान P50-HD28934 द्वारा समर्थित में अनुसंधान के लिए वर्जीनिया सेंटर के विश्वविद्यालय में यांग एट अल., २०१७ द्वारा प्रदर्शन किया गया ।
अनुसंधान के समर्थन के स्रोत: R01 niched ८६१०० (KMB), RBM T32 niched ००७२०३ द्वारा समर्थित था ।
Materials
| Biosaftey cabinet | Lab Products Inc | L/F-B | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A5403 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Na2HPO4 (anhydrous) | Sigma | S7907 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Ultrapure water | Millipore | Purified and filtered water | |
| Broome Rodent Restraint Device | Harvard Apparatus | 52-0460 | Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data. |
| DynPeak | n/a | n/a | http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001 |
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