Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo de amostragem de sangue de cauda-dica para coleta de amostra frequente em camundongos desenfreados. Este método é útil para avaliar os padrões de secreção pulsátil de hormônio luteinizante e pode ser adaptado para a análise de outros fatores circulantes.
Abstract
Em muitos sistemas endócrino, hormônios ou fatores circulantes não são liberados continuamente, mas são secretados como um pulso discreto em resposta a um fator liberador. Medidas de amostragem de ponto único são inadequadas para compreender plenamente o significado biológico do padrão secretora de hormônios pulsátil ou sob condições fisiológicas normais, ou nas condições de desregulação. Hormônio luteinizante (LH) é sintetizado pelas células gonadotróficas da hipófise anterior e secretado em um padrão pulsátil que requer coleta frequente de amostras de sangue para avaliação do pulso. Isto não foi possível, em camundongos, até recentemente, devido ao desenvolvimento de um ensaio de LH de alta sensibilidade e frequente de avanço em uma técnica para coleta de amostra de baixo volume, inicialmente descrita por Steyn e colegas. 1 aqui descrevemos um protocolo para a coleta de amostra de sangue periférico frequentes de ratos com aclimatação de manipulação suficiente para detectar a secreção pulsátil de LH. O atual protocolo detalha um período de aclimatação expandida que permite a avaliação de robustos e contínuas de pulsos de LH durante várias horas. Neste protocolo, a ponta da cauda é cortada e o sangue é colhido da cauda com uma pipeta à mão. Para avaliação do LH pulsátil em ratos gonadectomized, seriais amostras são coletadas a cada 5-6 min de 90-180 min. importante, a coleta de sangue e medição de robustas pulsos de LH podem ser realizados em ratos acordados, livremente comportamento, dados a adequada manipulação aclimatação e esforço para minimizar os estressores ambientais. Aclimatação suficiente pode ser alcançada dentro de 4-5 semanas antes da coleta de sangue. Este protocolo destaca avanços na metodologia para garantir a coleta de amostras de sangue total para a avaliação dos padrões de secreção de LH pulsátil durante várias horas no mouse, um poderoso modelo animal para pesquisa neuroendócrino.
Introduction
Função gonadal em mamíferos é dependente da secreção de gonadotrofinas, hormônio luteinizante (LH) e folículo estimulante hormônio, da glândula pituitária. As gonadotrofinas são secretadas em um padrão pulsátil ou aumento em resposta à secreção hipotalâmica do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH). A síntese e secreção de LH e FSH são regulados através de ação endócrina, parácrina e autócrina de uma variedade de moléculas incluindo GnRH hipotalâmico, hormônios esteroides gonadais e o sistema de União-inibina-folistatina, bem como uma miríade de condições fisiológicas, incluindo equilíbrio de energia e estresse. 2
O padrão pulsátil de LH no sangue que decorre uma descarga bastante abrupta de LH no sangue periférico, seguido por aproximadamente exponencial eliminação. Importantes características do padrão incluem a frequência de cada descarga de LH e a amplitude da resposta do LH, ambos os quais são ditados, em parte, pela liberação de GnRH. devido à dificuldade em coletar sangue portal do eixo hipotálamo-hipófise para medição de GnRH pulsátil, a amostragem e a medição de LH é usado como um proxy para o Regulamento de GnRH do eixo hipotálamo-hipófise-gonadal. Portanto, a informação crítica é codificada na frequência e a amplitude dos pulsos de LH, o que não pode ser determinada a partir de uma única amostra.
Análise da secreção pulsátil de LH historicamente tem sido limitada a grandes mamíferos (os seres humanos, primatas e ovelhas) devido ao seu volume de sangue grande e tolerância para coleta de amostra de sangue frequente. Em roedores, amostragem de sangue frequentes limitou-se o rato e conseguida através de habitação cateter atrial. 3 , 4 o custo relativamente baixo e a disponibilidade de genética (por exemplo, cre-lox, CRISPR) e manipulações de complexo circuito neural (por exemplo, optogenetics, chemogenetics) fazem ratos um organismo modelo atraente; no entanto, obtenção de amostras de sangue frequentes e posterior análise das concentrações de LH até recentemente, provou indescritíveis. Esta tarefa monumental foi pioneira por Steyn e colegas de trabalho. 1 desde então, diversos laboratórios começaram a utilizar de amostra de sangue frequentes e ensaios de LH ultra sensíveis para avaliar a secreção pulsátil de LH em uma variedade de paradigmas experimentais. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 Note-se que a busca de um método prático de coletar várias amostras de sangue dos ratos foi em andamento pelo menos 40 anos10 , com vários refinamentos feitos ao longo do caminho. 11 , 12
Avaliação dos padrões de pulso do LH (ou seja, frequência e amplitude) representa um refinamento maior no acompanhamento a secreção de gonadotrofinas basal neste modelo animal geneticamente tractable. Tradicionalmente, as concentrações de LH em camundongos foram determinadas em uma amostra de sangue. Uma fraqueza de amostras de ponto único é um conjunto de dados altamente variável, porque as concentrações de LH são naturalmente flutuando durante cada pulso. Outro ponto fraco é que medidas isoladas inerentemente perder informação crítica veiculada pelos padrões de secreção de LH pulso. Assim, um método para coletar amostras de sangue frequentes em comportar-se livremente, ratos desenfreados (exceto para manuseio suave durante a amostragem) fornecerá informações avançadas e revelar-se útil para muitos laboratórios investigando Regulamento hormônio pulsátil.
Aqui, descrevemos um protocolo para a recolha de frequentes (a cada 6 min) amostras de ratos acordados, desenfreadas de sangue. É importante, inclui uma manipulação de protocolo de aclimatação que permite a detecção robusta e contínua de secreção pulsátil de LH em amostras de sangue total coletado durante um período de tempo em que pré e pós-avaliação para um desafio agudo pode ser determinado, como a resposta ao estresse psicossocial de imobilização e contenção. Um ensaio eficaz para as concentrações de LH de amostras de sangue total foi descrito anteriormente; 1 que este protocolo está focado em um método para coletar as amostras de sangue para medição de pulso do LH.
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Protocol
O método descrito aqui é de acordo com o National institutos de saúde Cuidado Animal e diretrizes de uso e foram autorizados pelo Comitê de uso da Universidade da Califórnia, San Diego e institucional Cuidado Animal.
1. a aclimatação para manipulação
- Procedimento de tratamento
- Coloque gaiolas de rato na biossegurança do armário. Retire o primeiro rato da gaiola e coloque sobre uma superfície apropriada (por exemplo, uma tampa de gaiola limpa) dentro da armário de biossegurança.
- Contenha suavemente o mouse na superfície de trabalho, mantendo a base da cauda com o indicador e o polegar de uma mão. Então, firmemente acaricie a superfície ventral da cauda, da base até a ponta da cauda, com o indicador e o polegar da outra mão. Repetir esta acariciando 6 vezes (ou seja, 1 conjunto) e retornar o mouse para sua gaiola.
- Esperar 6 min e repita a etapa 1.1.2.
Nota: No total, passo 1.1.2 será repetido 4 vezes por rato (ou seja, 4 conjuntos de 6 cursos), para que cada rato receberá um total de 24 cursos de cauda em cada dia de tratamento.
- A frequência de manipulação diária
- De cinco até duas semanas antes do dia de coleta de sangue planejada, lidar com ratos, conforme descrito na etapa 1.1, cinco dias por semana (os ratos não são tratados no sábado ou no domingo até as duas semanas finais de aclimatação).
- Se o tratamento experimental durante o período de amostragem incluirá qualquer manipulação adicional (por exemplo, agarrando ou injeção intraperitoneal), aclimatar os ratos para esta atividade de manipulação durante cada sessão de manipulação.
Nota: Para a aclimatação aos procedimentos de injeção, utilize uma agulha cega para realizar uma injeção de Souza. - Durante as duas semanas antes do dia de coleta de sangue planejada, lidar com ratos, conforme descrito no ponto 1.1, sete dias por semana.
- Pelo menos duas semanas antes do dia da coleta de sangue planejada, casa de ratos em pares para minimizar as interrupções aos ratos durante a amostragem.
2. preparação dos tubos de colheita de sangue
- Preparar o buffer de ensaio de LH ultra-sensível em uma garrafa de vidro: albumina de soro bovino 0,2% e 0,05% Tween-20 em PBS [0,2 g de KCl, 8 g de NaCl, 1,44 g Na2HPO4 (anidro), 0,24 g KH2PO4, água ultrapura para 1 L, pH 7,4, filtro e autoclave] , loja a 4° C. 1
Nota: Volume do buffer de ensaio de LH ultra-sensível estar preparado pode ser calculado com base no número de amostras e o volume por exemplo, como indicado abaixo (2.2 & discussão) - Prepare tubos de colheita de sangue (tubos de microcentrifuga de 0,6 mL). Rotule os tubos e buffer de ensaio alíquota (57 µ l de buffer por tubo; note-se, este volume pode variar dependendo do volume de sangue coletado ou a proporção do sangue para o buffer desejado). Tubos pode ser preparado dias à frente de amostragem, loja a 4 ° C.
3. coleta de sangue
- Preparação dos materiais de coleta de sangue.
- Preparar o gabinete de segurança biológica para uso e providenciar os seguintes materiais de capuz ou em um carrinho nas proximidades: 10 µ l Pipetar (conjunto de 3 µ l ou volume de coleta de sangue desejado), pontas de pipeta, escaninho para pontas de pipetas utilizadas, temporizador, impressão com o número de animais e amostra números (waste para notas em relação a problemas de amostragem ou animais), gelo balde com tubos de colheita de sangue, tesouras e gaze pequena (2 "x 2").
Nota: O "contar até" função com um temporizador de laboratório é útil porque ele não tem um alarme sonoro que poderia perturbar os ratos - Use um marcador permanente para marcar a cauda de cada rato (perto da base) para auxiliar a identificação rápida do mouse correto durante a amostragem.
- Preparar o gabinete de segurança biológica para uso e providenciar os seguintes materiais de capuz ou em um carrinho nas proximidades: 10 µ l Pipetar (conjunto de 3 µ l ou volume de coleta de sangue desejado), pontas de pipeta, escaninho para pontas de pipetas utilizadas, temporizador, impressão com o número de animais e amostra números (waste para notas em relação a problemas de amostragem ou animais), gelo balde com tubos de colheita de sangue, tesouras e gaze pequena (2 "x 2").
- Recorte da preparação coleção cauda e pre-sangue.
- Em 45 min antes do início da coleção de sangue, remover o primeiro rato de sua gaiola e coloque sobre uma superfície apropriada (uma tampa de gaiola limpa funciona bem) dentro a biossegurança do armário.
- Use uma tesoura afiada, estéril para remover 1-2 mm da ponta da cauda do rato, após preparação asséptica (ou seja, esfregar com álcool e betadine).
Nota: Isto pode ser realizado em animais acordados com contenção suave ou sob anestesia de isoflurano. Além disso, analgesia pode ser fornecida após a recomendação do IACUC local. - Cuidadosamente acariciar a cauda do rato como descrito acima (1.1.2; 1-2 traços são geralmente suficientes) até a gota de formas de sangue na ponta da cauda.
- Use uma pipeta com uma ponta limpa 3 µ l de sangue da ponta da cauda e descartar a ponta da pipeta com sangue.
- Antes de retornar o mouse para sua gaiola, certifique-se de que o fluxo de sangue parou. Se necessário, aplique uma pressão suave com gaze estéril.
- Repita as etapas 3.2.1 - 3.2.5 para todos os mouses. Podem ser colhidas amostras de sangue subsequente por firmemente acariciando cauda do rato até que uma gotícula de formas de sangue na ponta da cauda.
Nota: Se uma gota de sangue não forma após pinceladas firmes, a cauda pode ser dabbed com uma gaze embebida em soro fisiológico. Os coágulos são mais propensos a forma durante a amostragem menos frequente (ou seja, > intervalos de 15 min). Uma vez que o coágulo é liberado da veia, pode continuar a amostragem. - Continue a coletar 3 µ l de sangue de cada rato conforme descrito acima cada 6 min para aproximadamente 45 min, durante este período de preparação de pré-sangue coleção. Descarte a sangue e pipeta de ponta.
- Colheita de sangue
- Colete 3 µ l de sangue da ponta da cauda como descrito acima. Tenha cuidado para assegurar que o inteiro 3 µ l amostra para a ponta da pipeta (sem bolhas ou contaminação de roupa de cama). Ejete a amostra de sangue para o buffer de ensaio em um tubo rotulado. Misturar por inversão e retornar o tubo de gelo.
- Antes de retornar o mouse para sua gaiola, certifique-se de que o fluxo de sangue parou. Se necessário, aplique uma pressão suave com gaze estéril.
- Repita os passos de 3.3.1 - 3.3.2 para cada mouse, cada 6 min, durante o período de amostragem predeterminado. Monitorar cada animal por sinais de perigo (pálpebras, por exemplo, parcialmente fechadas, posição encurvada [não causado por outro tratamento] ou falta de resposta ao tratamento) e encerrar a colheita de amostras, se necessário.
Nota: Aflição comportamental ou outras complicações que exigem o término da amostragem extremamente raramente ocorrem em nosso laboratório. - Se os animais não são sacrificados após colheita de sangue, certifique-se de que o fluxo de sangue da ponta da cauda completamente parou. Limpe qualquer sangue derramado desde o interior da cada animal gaiola (ou gaiolas de mudança) e retornar as gaiolas animais para o rack de habitação.
4. processamento e análise da amostra
- Armazenar as amostras de sangue a-20 ° C até análise.
Nota: LH é analisada em amostras de sangue total diluídas no buffer de ensaio; Não há separação de soro ou plasma é necessária antes de armazenamento ou análise. - Amostras de sangue de ensaio por ELISA ultra-sensível como descrito anteriormente, os valores1 e relatório em ng/mL de sangue total, após a correção para a diluição do volume da amostra no buffer de ensaio.
- Identifica os pulsos de LH no conjunto de dados. Calcular e comparar a amplitude de pulso média e frequência de pulso (ou intervalo de pulso inter) conforme apropriado para o conjunto de dados.
Nota: Programas e critérios publicados13,14 ,15,16 , para a detecção de pulsos de LH estão disponíveis.
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Representative Results
Padrões de pulso LH representativos de 4 ratos são mostrados na Figura 1 (dados reimpressos de Yang et al., 2017). LH foi medida em amostras de sangue frequentes para determinar a resposta a um desafio de estresse psicossocial agudo. Adultos camundongos C57/Bl6 fêmeas foram ovariectomia e manipulados conforme detalhado neste protocolo para coleta de sangue frequente. Foram coletadas amostras de sangue para o primeiro 90 min em todos os animais para estabelecer uma base de pré-tratamento de secreção pulsátil de LH. Durante a segunda 90 min de amostragem, controle (não-forçado) animais permaneceram em suas gaiolas e retenção tensão animais foram colocados em dispositivos de retenção para roedores e isolados para gaiolas novas. Controle de animais mostraram claros e inequívocos de pulsos de LH durante todo o período de amostragem toda. Em contraste, o estresse psicossocial de contenção rapidamente e de forma inequívoca suprimida secreção pulsátil de LH.
Figura 1: padrões de pulso LH representativa dos ratos ovariectomizados. (A, C) Ratos não-forçado do controle. (B, D) Salientou os ratos como contenção foi imposta a partir de 0-90 min (região sombreado cinza) e LH foi analisada. Pontos de dados abertos representam impulsos identificados por DynPeak. 15 esta figura foi modificada de Yang et al, 158(11) de Endocrinologia: 3716-3723, 2017, com permissão da sociedade endócrino, Copyright 2017. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui descrevemos um protocolo para coleta de sangue frequentes toda a cauda-dica de amostras de sangue para avaliação da secreção pulsátil de LH em camundongos. Este protocolo permite a coleta de amostras para a deteção das alterações agudas na secreção pulsátil de LH após a exposição ao estresse psicossocial e é well-suited para avaliação dos pulsos de LH sob outras manipulações agudas ou crônicas.
Um componente crítico do presente protocolo para alcançar perfis confiáveis e robustos, de pulsos de LH é a manipulação de período de aclimatação. A ideia de que lidar com estresse pode prejudicar a secreção do hormônio tem sido especulada sobre na literatura,17 mas não explicitamente testada. No entanto, análise dos padrões representativos de pulso LH retratado em publicações recentes demonstra claramente uma vantagem para aclimatação completa para manipulação. Em estudos iniciais, utilizando 10 dias de tratamento, de pulsos de LH ocorreram em intervalos irregulares, com períodos prolongados em que não LH pulsos foram detectados. 1 após essa publicação seminal, tem havido uma tendência na literatura por longos períodos de tratamento (ou seja, 3 ou 4 semanas de tratamento diário). 5 , 6 , 8 o protocolo descrito aqui envolve um total de 5 semanas de tratamento, mas omite a manipular os 3 primeiros fins de semana, assim, alcançar um número semelhante de manipulação de sessões e minimizar as cargas de trabalho de fim de semana para experimentalistas. Embora não podemos fornecer um número de limiar validados de sessões de tratamento necessárias para sucesso deteção de pulsos de LH, que encorajamos novos praticantes deste procedimento para considerar um período de aclimatação prolongada. Sob certas paradigmas experimentais (por exemplo, estudando os pulsos de LH em animais jovens), várias semanas de tratamento aclimatação podem não ser práticas. Para estas experiências, é fundamental que suficiente manipulação de aclimatação é alcançada; Talvez, várias sessões de manipulação por dia seria suficientes.
Minimizar o estresse ambiental durante o período de coleta de sangue também é fundamental para o sucesso do presente protocolo. Perseguindo esse objetivo, nós da casa nossos mouses em um quarto quieto dentro do viveiro durante o período de aclimatação inteira. Colocação de um sinal "Silêncio por favor" do lado de fora da porta do quarto animal no dia da amostragem pode ajudar a eliminar interrupções inesperadas. Durante o período de coleta de sangue, um pano pode ser usado no gabinete a biossegurança para fornecer um lugar para descansar a pipeta, pipetar dicas e canetas, desse modo, minimizando o ruído provocado pela manipulação desses itens. Finalmente, recomenda-se que uma pessoa deve lidar com os ratos e coletar todas as amostras de sangue no dia experimental. Este indivíduo deve ser diligente na manipulação de animais com cuidado e cada vez consistente do dia (que deve ser semelhante do tempo de amostragem), desde que circadian entradas são conhecidas por influenciar respostas de estresse. 18 pulsos de LH se são pouco frequentes ou indetectável, fontes de estresse estranho devem ser identificadas e minimizadas. Outro detalhe processual relacionado para minimizar o estresse durante o período de coleta de sangue é a quantidade de tempo que decorre entre o corte da cauda e coletando amostras para ser analisada para LH. Cortarmos o rabo de cada rato 45 min antes de coletar as amostras para ensaio de LH. Este atraso serve para separar temporalmente o estresse associado com cauda de recorte de eventuais tratamentos adicionais impostos durante a amostragem, como a cauda de recorte em paz demonstrou elevar as concentrações de corticosterona circulante. 19 amostras de sangue são retiradas (mas descartados) durante esta janela de 45 min de aclimatar os ratos para o procedimento de tratamento e evitar a formação de coágulos de sangue durante esse atraso ainda mais.
Uma consideração final quando empregando este protocolo para coleta de sangue frequentes em ratos é que o volume de sangue pequena desta espécie limitará o número e o volume de cada amostra coletada. De acordo com o USDA Animal guia de inspeção, os ratos têm 72 mL de sangue por kg de peso corporal. 20 para experiências de sobrevivência, 7,5% do volume do sangue pode ser coletado em um período de amostragem único dado um período de recuperação de 1 semana e 10% do volume do sangue pode ser coletada com um período de 2 semanas de recuperação. Nós coletamos rotineiramente < 7,5% do volume do sangue estimado do mouse usando o protocolo de coleta de sangue frequentes atual (incluindo resultados representativos mostrados aqui), sem qualquer efeito adverso sobre os padrões de secreção de LH. Em nosso viveiro, ratos adultos C57/Bl6 ovariectomia pesam cerca de 22 g (volume de sangue teórica de 1,58 mL), permitindo a 118.5 µ l de sangue a ser coletado. Além de 7 amostras de pré-coleção tratamento (que não são doseados ou analisados), 30 amostras são coletadas mais de 180 min para um total de 111 µ l de sangue (3 µ l por exemplo), que está abaixo do limite de volume de sangue de 7,5%. Note-se que o volume de amostra de sangue poderá necessitar de ser ajustado para detectar LH em determinadas condições, quando as concentrações de LH são esperadas ser baixa. Em ratos gonadectomized, 3 µ l de sangue total é suficiente para detectar LH. Coleta de um maior volume de sangue deve ser considerada quando as concentrações de LH são baixas e, portanto, é esperado para estar mais perto a sensibilidade do ensaio do LH. Assim, apesar do volume de sangue pequena de um rato, podem ser coletadas amostras de sangue suficiente para avaliar um perfil descomprometido da secreção pulsátil de LH durante um período de 180 min.
Em conclusão, este sangue frequente destaques protocolo de amostragem um extenso tratamento período de aclimatação para assegurar a avaliação da secreção de LH pulsátil em ratos durante um período prolongado de tempo. Temos demonstrado que este protocolo é suficiente para caracterizar o robustos e regulares de pulsos de LH que pode ser monitorado antes e seguir a exposição ao estresse psicossocial. Este protocolo pode ser adaptado para avaliar a resposta do LH para outros tipos de stress ou outros tratamentos que podem alterar a secreção do hormônio reprodutivo. Além disso, este protocolo de coleta de sangue pode ser adaptado para a medição de outros fatores circulantes que variam na concentração ao longo do tempo, como tem sido relatado para o hormônio de crescimento. 21 é uma notável contribuição para o campo do que o padrão de secreção de LH pode agora ser monitorado em uma espécie de neuroendocrinologia onde complexo genético e na vivo abordagens moleculares para estudar o Regulamento de pulso do LH estão disponíveis e prático.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores Obrigado DRS Jennifer Yang e Alexander (Sasha) Kauffman para assistência técnica com esta técnica, bem como numerosas discussões úteis e críticas. Soro hormônio ensaios foram realizados por Yang et al., 2017 do The University of Virginia centro de pesquisas em reprodução ligante ensaio e núcleo de análise, apoiado por Eunice Kennedy Shriver FORMULADORES/NIH (NCTRI) Grant P50-HD28934.
Fontes de apoio à pesquisa: R01 FORMULADORES 86100 (KMB), RBM foi apoiado por T32 FORMULADORES 007203.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosaftey cabinet | Lab Products Inc | L/F-B | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A5403 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Na2HPO4 (anhydrous) | Sigma | S7907 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Ultrapure water | Millipore | Purified and filtered water | |
| Broome Rodent Restraint Device | Harvard Apparatus | 52-0460 | Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data. |
| DynPeak | n/a | n/a | http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001 |
References
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