Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

منصة ميكروفيسيولوجيك للدهون البشرية: تقع في الأنسجة الدهنية البيضاء

Published: August 15, 2018 doi: 10.3791/57909
Automatic Translation
1, 2, 2, 2
1Department of Pharmacology, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Surgery, Louisiana State University Health Sciences Center

Summary

وقد الأنسجة الدهنية البيضاء (وات) أوجه القصور الهامة في نماذجها الثقافة الأولية الحالية، التي تعوق التنمية الدوائية والدراسات الأيضية. نقدم هنا، بروتوكولا لإنتاج نظام ميكروفيسيولوجيكال الدهنية بوات يقحم بين الأوراق من الخلايا اللحمية. يوفر هذا بناء منصة مستقرة وقابلة للتكيف للابتدائي وات الثقافة.

Abstract

الأنسجة الدهنية البيضاء (وات) يلعب دوراً حاسما في تنظيم الصحة الوزن وكل يوم. مع ذلك، هناك قيود كبيرة على نماذج الثقافة الأولية المتاحة، التي أخفقت في إخلاص الخص المكروية الدهنية أو تمديد صلاحية وات بعد أسبوعين. عدم وجود نموذج الثقافة الأولية موثوقة يعوق بشدة البحث في الأيض وات وتطوير الأدوية. وتحقيقا لهذه الغاية أننا استخدمت معايير المعاهد الوطنية للصحة لنظام ميكروفيسيولوجيك لوضع منهاج جديد للثقافة الأولية وات دعا 'سوات' (تقع الأنسجة الدهنية البيضاء). نتغلب على الطفو الطبيعي adipocytes التي يقحم مفروم وات مجموعات بين الأوراق من الخلايا اللحمية المستمدة من الدهنية. في هذا البناء، عينات وات قابلة للاستمرار أسابيع ما يزيد على ثمانية في الثقافة. وتحتفظ سوات ECM سليمة وخلية إلى جهات الاتصال، والضغوط المادية في فيفو ظروف وات؛ بالإضافة إلى ذلك، تحتفظ سوات تشكيل جانبي النسخي قوية، وحساسية للإشارات الكيميائية خارجية المنشأ، ووظيفة الأنسجة كاملة. سوات يمثل طريقة بسيطة واستنساخه وفعالة لثقافة الدهنية الأساسية. يحتمل أن تكون، أنها منبر المطبقة على نطاق واسع للبحوث في علم وظائف الأعضاء وات والفيزيولوجيا المرضية، والايض وتطوير الأدوية.

Introduction

الأنسجة الدهنية هي الجهاز الأساسي للسمنة، التي تحمل التكاليف الطبية السنوية المباشرة بين مبلغ 147 بیلیون ومبلغ 210 بیلیون في الولايات المتحدة1. كما يسهم تراكم الأنسجة الدهنية الأخرى الأسباب الرئيسية للوفاة مثل أمراض القلب والنوع الثاني من السكري، وأنواع معينة من السرطان2. في المختبر نماذج الثقافة ضرورية للدراسات الأيضية وتطوير الأدوية، لكن النماذج البحثية الحالية في الأنسجة الدهنية لأوجه القصور الرئيسية. Adipocytes هي هشة، وازدهار، والميؤوس من شفائهم متباينة الخلايا التي لم تنضم إلى خلية ثقافة البلاستيك، ولذلك لا يمكن أن يكون مثقف على استخدام أساليب الثقافة التقليدية الخلية. ومنذ السبعينات، استخدمت عدة أساليب في محاولات للتغلب على هذه العوائق، بما في ذلك استخدام الزجاج كوفيرسليبس وسقف الثقافة وثقافة الوقف ومصفوفات خارج الخلية3،،من45، 6 , 7-ومع ذلك، لقد اتسمت هذه الأساليب بموت الخلايا وديديفيرينتييشن، ويتم استخدامها عادة للا يزيد عن فترة دراسة أسبوعين. وعلاوة على ذلك، لا تحاول هذه النماذج الخص المكروية الدهنية الأصلية كما أنها لا تحتفظ بالمحتوى سليمة، دعم التفاعلات بين adipocytes و stromal خلايا، ولا خلايا قوات الهوس بذل كل منهما على الآخر في الحية في وات.

نظراً لغياب أسلوب الثقافة الدهنية الأساسية معيار الذهب، اعتمدت البحوث الدهنية أساسا على adipocytes المسبق متباينة (ديفدس). ديفدس مولتيلوكولار وملتصقة أيضي نشطة. على النقيض من ذلك، adipocytes الأبيض الأساسي نوناديرينت، والثلاجات، وتثبت الأيض منخفضة نسبيا. ومن المرجح عدم النماذج الدهنية الثقافة الحالية للخص فسيولوجيا الأنسجة الدهنية ناضجة صحية عاملاً رئيسيا في عدم وجود الأدوية التي وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير التي تستهدف مباشرة adipocytes. في الواقع، عدم وجود الفسيولوجية في المختبر نماذج الجهاز مشكلة كبيرة عبر معظم الأجهزة والمرض.

في ورقة موقف يعلن إنشاء برنامجها لأنظمة ميكروفيسيولوجيكال (MPS)، والمعاهد الوطنية للصحة (NIH) أفادت أنه معدل نجاح 2013 عبر جميع التجارب السريرية البشرية الصيدلانية فقط 18% للمرحلة الثانية و 50% للمرحلة الثالثة 8من التجارب السريرية. تم تصميم برنامج MPS لمباشرة معالجة عجز الأحادية في المختبر لفسيولوجيا الإنسان النموذجي. المعاهد الوطنية للصحة يعرف مبس نظم الثقافة تتألف من الابتدائي البشرية أو الخلايا الجذعية في بني ثلاثية الأبعاد متعددة الخلايا التي الخص أداء الجهاز. خلافا للنماذج الاختزالية الثقافات الخلية متجانسة، مخلدة، ينبغي أن دقة نموذج مبس خلية خلية وخلية المخدرات والمخدرات-المخدرات والجهاز--المخدرات التفاعلات9. خلافا لأساليب الثقافة الأولية، قصيرة الأجل وتملي معايير المعاهد الوطنية للصحة الاستدامة النواب أكثر من 4 أسابيع في الثقافة8. يمكن الاطلاع على مزيد من التفاصيل عن البرنامج من أعضاء البرلمان في المعاهد الوطنية للصحة في رفاس (#RFA-أون-18-001)10.

ووضعنا رواية بسيطة وقابلة للتكيف، ووصف النواب الدهنية غير مكلفة "تقع في الأنسجة الدهنية البيضاء" (سوات)11. يمكننا التغلب على الطفو الطبيعي adipocytes بالانسجة الدهنية الأساسية مفروم "يقحم" بين الأوراق المشتقة من الدهنية الخلايا اللحمية (أدسكس) (الشكل 1). ويجمل بنية ثلاثية الأبعاد الناتجة عن جهة الاتصال خلية خلية والمكرويه الدهنية أصلي قبل adipocytes ناضجة مع عدد سكان خلية دعم adipocyte طبيعية المحيطة. وقد تم التحقق من صحة سوات بإثبات صلاحية 8 أسابيع، استجابة للخارجية مما يشير إلى إفراز أديبوكيني وانجرافتمينت في نموذج حيوان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وأجريت جميع المهام في الانضمام إلى البروتوكولين #8759 و #9189، كما وافق عليها مكتب مجلس الهجرة واللاجئين من LSUHSC-NO. جميع الحيوانات من العمل قد أنجز في الانضمام إلى البروتوكول 3285 # وافق عليها "مكتب إياكوك" في لسوهسك--رقم

1-البذر يقحم أوراق الخلية

ملاحظة: انظر الشكل 1.

  1. أدسكس البذور في حوالي 80% في كونفلوينسي في لوحات زراعة الأنسجة (6 سم أو لوحات 6-جيدا). لكل بئر من سوات المرجوة، البذور 1 زراعة الأنسجة التقليدية جيدا وكذلك 1 حجم المقابلة على لوحة البلاستيك المغلفة poly(N-isopropylacrylamide (pNIPAAm) زراعة الأنسجة.
    ملاحظة: تبعاً لذلك، لوحة 6-جيدا من سوات سيتطلب بذر خلايا على لوح واحد قياسي 6-جيدا زراعة الأنسجة (طبقة الأساس) وزراعة الأنسجة المغلفة بنيبام 6-جيدا لوح واحد (الطبقة العليا). لوحات بنيبام المغلفة يمكن شراؤها تجارياً أو أنتجت13،،في مختبر1214.
  2. الحفاظ على أدسكس في 37 درجة مئوية و 5% CO2 في تعديل النسر المتوسطة (دميم دولبيكو) وتستكمل مع 10% FBS و 1 × البنسلين/ستربتوميسين. تغيير وسائل الإعلام كل يومين.
  3. السماح للخلايا الاندماج حتى تصبح روافد 100% وتأخذ على نمط striated (حوالي 6-8 أيام).
    ملاحظة: سوف تحتاج إلى هذه الخلايا تعمل كورقة وحيدة خلية سليمة من أجل تحقيق الاستقرار في الأنسجة الدهنية للطفو. سيتم تفتيت الخلايا المتلاقية غير كاف عند البذر مع وات.

2-إعداد لوازم سوات

  1. إعداد عدة 10 مل مختبرين من موازنة الملح الحل (حبس هانك س 1 ل)؛ بإعداد كافية للعدد المطلوب من لوحات مع وحدة التخزين لقطع الغيار.
  2. إعداد جهاز المكبس لبذر سوات. بناء المكبس استخدام البلاستيك اﻷكريليك بسيطة، تتكون من جذع يعلق على قرص جولة. ضمان أن تناسبها داخل محيط الآبار زراعة الأنسجة (القطر: < 6 سم للطبق 6 سم، < 3.5 سم للوحة 6-جيدا؛ والإعلام التقريبي: 6.7 ز لطبق 6 سم، ز 5.1 للوحة 6-جيدا).
    1. إعداد بلونجيرس إضافية التأكد من أن الإجراء بسلاسة في الحالة هناك مشكلة مع أي الغطاس الفردية.
    2. مختبر الشريط التفاف حول حافة القرص المكبس، x 2 على الأقل، لمنع التسرب من الجيلاتين الحل.
    3. الرش خزانة السلامة الأحيائية (BSC) مع 70% EtOH. رذاذ أسفل رف أنبوبة مخروطية 15 مل داخل البكالوريوس مع أنابيب مخروطية فارغة، ولم يسبق لهم اللعب 15 مل؛ وسيساعد أنابيب تأمين موضع بلونجيرس الجيلاتين.
    4. رش كل المكبس التفاف الشريط جيدا مع 70% EtOH ومكان في أنبوب مخروطي 15 مل على الرف. رش غسالات معدنية (الكتلة التقريبية ز 6.3) ووضعها على الرف جنبا إلى جنب مع زوج من الملقط مدمن مخدرات؛ الغسالات إضافة الوزن بلونجيرس خلال سوات بذر.
    5. إغلاق وشاح BSC وتشغيل الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة تيسيرا للتجفيف والتعقيم.
      ملاحظة: من الناحية المثالية، إجراء هذه الخطوة 24 ساعة قبل البذر سوات. وبدلاً من ذلك، إجراء العملية في اليوم من الأنسجة جمع/سوات بذر؛ ومع ذلك، في هذه الحالة، تسمح 15 – 45 دقيقة للأشعة فوق البنفسجية تجفيف في التعقيم.

3-إعداد بلونجيرس الجيلاتين – التطبيق إلى أوراق الخلية العلوية

  1. الحرارة حمام مائي على 75 درجة مئوية.
  2. إعداد الحل الجيلاتين بإضافة 0.75 غ مسحوق الجيلاتين للأوراق المالية 10 مل من 1 x HBSS. تحت غطاء دخان إضافة 100 ميليلتر من هيدروكسيد الصوديوم م 1 لتحقيق التوازن بين درجة حموضة الحل.
    1. إضافة الأرصدة السمكية 10 مل إلى حمام الماء واهتز بشدة كل 5 دقائق حتى يذوب المسحوق في الحل. وتهدف لإذابة الجيلاتين مسحوق قريبا بعد إضافة إلى حمام الماء الساخن.
    2. تشغيل منفاخ BSC وإيقاف ضوء الأشعة فوق البنفسجية، ورفع وشاح. رش السطح بكالوريوس العلوم وإعداد عامل التصفية الإمدادات (5 مل اللوير لوك المحاقن و 0.2 ميكرون حقنه مرشحات). إعداد عوامل تصفية متعددة لكفاءة سلالة كميات كافية من الجيلاتين لتطبيق بلونجيرس.
  3. عندما يصل الحل الجيلاتين اتساق متجانس، تصفية الحل وتطبيقه بلونجيرس. تحميل المحاقن مع الجيلاتين. تطبيق الجيلاتين إلى بلونجيرس البلاستيكية من خلال تصفية المحاقن (مل ~2.5 للوحة 6، حسنا، مل ~4.5 لطبق 6 سم) والسماح لترسيخ (~ 20 دقيقة).
  4. وبمجرد الجيلاتين الصلبة، بسط الشريط من الحافة بلونجيرس. مع الملقط مدمن مخدرات، إزالة الجيلاتين من الحافة الخارجية للمكبس (أي حواف التي أثيرت غضروف). التأكد من أن الجيلاتين المتبقية في وسط المكبس مستوى تماما تحقيق أقصى قدر من الاتصال مع ورقة آخر.
  5. بمجرد إزالة الجيلاتين الزائدة، بلطف تطبيق بلونجيرس الجيلاتين على لوحات آخر المغلفة بنيبام. استخدام غسالات معدنية لوزن أسفل المكبس. لا للقص أوراق الخلية أثناء تطبيق بلونجيرس.
  6. إجازة في بلونجيرس على الأوراق خلية ل 1.5 ح في درجة حرارة الغرفة. احتضان لوحات/بلونجيرس في حمام الماء المثلج ل 1.5 ح لاستكمال الانفصال ورقة خلية من سطح لوحة المغلفة بنيبام.
    1. توخي الحذر أثناء حضانة في حمام الثلج؛ عدم السماح بحمام الثلج لتلويث الإعلام الخلية أثناء الحضانة.
    2. بعد الانتهاء من الحضانة، بتنظيف الجزء السفلي من لوحات المغلفة بنيبام لإزالة المياه غير معقمة.

4-تجهيز الأنسجة الدهنية البيضاء

  1. عند جمع الأنسجة الدهنية البشرية من غرفة العمليات، تبقى جميع العينات في حاوية عقيمة التي على الجليد حتى سوات أن يكون المصنف. إضافة وسائط الصيانة العقيمة، مثل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، إلى حاوية الأنسجة الدهنية للاستقرار الأنسجة.
  2. إضافة خلية الباردة الثقافة المتوسطة إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي أنابيب لكل بئر/طبق يكون المصنف (100 ميليلتر للوحة 6، حسنا، 200 ميليلتر لطبق 6 سم).
  3. فرم الأنسجة الدهنية.
    1. لشرائح الأنسجة الدهنية الصلبة، القيام بما يلي.
      1. تغسل شرائح كبيرة من الأنسجة الدهنية 3 x في برنامج تلفزيوني العقيمة وإزالة برنامج تلفزيوني قدر الإمكان.
      2. خشنا فرم الأنسجة بالملقط وأسلاك شائكة العقيمة وإزالة قدر المفرج واللفافة ممكن (انظر مناقشة لمزيد من التفاصيل).
      3. فرم ناعما الدهون مع أسلاك شائكة حتى يأخذ الأنسجة مفروم في سميكة، السائل والاتساق.
        ملاحظة: من الناحية المثالية الأنسجة سوف تظهر متجانسة مع لا شرائح فردية مرئية وات على الرغم من أن هذا ليس ممكناً دائماً.
    2. عملية ليبواسبيراتي كما يلي.
      1. بكالوريوس العلوم، تحت الشريط شاش معقم عبر الجزء العلوي من كوب، ومكان هذا الكأس في كوب أكبر لجمع أي سائل الزائدة.
      2. استخدام ماصة 25 مل مصلية، رسم قدر ليبواسبيراتي حسب الحاجة وتطبيقه على سطح شاش معقم. تطبيق برنامج تلفزيوني مباشرة على هذا السطح لغسل ليبواسبيراتيد الدهون وإزالة الدم الزائدة وبقايا الدهن.
      3. استخدام الملقط لاستعادة الأنسجة المصفى ونقلها إلى سطح تنميق عقيمة وتخطر ليبواسبيراتي.
  4. استخدام الشفرة عقيمة بقطع نهاية القاصي p1000 ماصة نصائح لنقل الأنسجة مفروم؛ سيؤدي ذلك إلى تقليل إجهاد القص يمكن أن تؤدي إلى تحلل adipocyte. حالما يتم التوصل إلى اتساق أنسجة سليمة نقل وحدة التخزين المطلوبة للأنسجة مفروم لكل أنبوبة 1.5 مل (300-400 ميليلتر للوحة 6، حسنا، 500-600 ميليلتر للطبق 6 سم). مزيج مفروم وات ووسائط الإعلام بإيجاز في الأنابيب.
  5. تأخذ لوحات آخر قاعدة وصب/أسبيراتي وسائل الإعلام. استبدال وسائط الإعلام مع خليط وات/وسائل الإعلام من كل أنبوبة 1.5 مل.
    1. بلطف إزالة بلونجيرس الجيلاتين من لوحات المغلفة بنيبام وتطبيقها على خليط وات على لوحات آخر قاعدة. بحث أحادي الطبقة المغلفة بنيبام لوحات تحت مجهر للتأكد من مفرزة الخلوية.
  6. تعيين كتلة حرارة إلى حوالي 37 – 40 ° ج تحت بكالوريوس العلوم. مع بلونجيرس لا تزال في مكانها، نقل اللوحات للسطحية الكتلة الحرارة. إضافة 2-3 مل وسائط الثقافة المعالجون احتضان الخلايا وتسهيل ذوبان الجيلاتين.
  7. بعد ~ 30 دقيقة، إزالة بلطف بلونجيرس من سطح اللوحة. استبدال أغطية لوحات قاعدة زراعة الأنسجة والانتقال إلى حاضنة ثقافة خلية. مرة واحدة قد المسال الجيلاتين تماما عند 37 درجة مئوية، نضح واستبدال خلية ثقافة وسائل الإعلام.
  8. الحفاظ على سوات في 37 درجة مئوية و 5% CO2 في المتوسط M199 خالية من الفينول الحمراء مع 7 ميكرومتر الأنسولين، 30 ميكرون الديكساميتازون، 1 x البنسلين/ستربتوميسين. تحتفظ في حوالي 2 مل الإعلام للوحات 6-جيدا ومل 3 للاطباق 6 سم. تغيير وسائل الإعلام كل يومين.

5-وادي سوات الحصاد

  1. إعداد كولاجيناز (كولاجيناز 0.5 ملغ/مل، 500 الادينوسين شمال البحر الأبيض المتوسط، في برنامج تلفزيوني) مختبرين في 15 مل أنابيب مخروطية الشكل (الحجم التقريبي لمل 10). تجميد الأنابيب وتخزينها في-20 درجة مئوية.
  2. نضح المتوسطة الثقافة أي من الخلايا وغسل x 1 مع برنامج تلفزيوني، ومن ثم نضح برنامج تلفزيوني. الإعدادية مختبرين كولاجيناز بذوبان الجليد لهم في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: من الناحية المثالية، أن الحل كولاجيناز سوف تصل إلى 37 درجة مئوية؛ وبعد ذلك مباشرة، أضف الأنسجة.
  3. إضافة جميع الأنسجة من لوحة سوات إلى مختبرين الفردية. حصاد سوات استخدام المزيل خلية عقيم ونقلها إلى مختبرين كولاجيناز مع تلميح ماصة p1000 وقف إنتاج المواد الانشطارية. إضافة الأنسجة مباشرة إلى أنابيب مخروطية الشكل 15 مل يحتوي على الحل كولاجيناز.
    1. بدلاً من ذلك، تبني الأنسجة/كولاجيناز الخليط في أنبوب 50 مل مخروطية؛ سيزيد من مساحة السطح زيادة تسهيل الهضم الأنزيمي.
  4. وضع أنابيب العينة في شاكر مداري المحتضنة بزاوية 45 درجة. احتضان 200 لفة في الدقيقة، في 37 درجة مئوية لمدة 30 – 60 دقيقة.
  5. مش مكان مكم 250 عامل التصفية في أنبوب 15 مل مخروطية الشكل جديد لمجموعة. من أجل حل adipocyte هضمها من خلال عامل تصفية.
    ملاحظة: هذا سوف يسمح كافة الخلايا بالمرور بينما تسربت أنسجة ليفية.
  6. السماح بتدفق خلال الجلوس لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة للسماح بانفصال.
    ملاحظة: سوف تطفو adipocytes بينما سوف تستقر الخلايا الدهنية stromal (الخزفية) إلى مراحل أدنى إلى الأعلى من الحل. يمكن أيضا زيادة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 x ز فصل الخلية أو الحصاد المحيطة أدسكس في بيليه.
  7. استخدام تلميح ماصة p1000 وقف إنتاج المواد الانشطارية، نقل adipocytes (الطبقة العائمة أعلى الحل كولاجيناز) إلى أنبوب جمع 1.5 مل ميكروسينتريفوجي. أخذ ~ 250 ميليلتر في وقت واحد، "الماصة؛" ببطء على طول حافة الأنبوب بجمع في adipocytes.
    1. قم بتدوير الأنبوب ببطء حين جمع adipocytes تحقيق أقصى قدر من الانتعاش من الانضمام إلى الداخل الخلايا. الحفاظ على رسم المزيد من الخلايا حتى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل كاملة.
  8. إزالة السائل الزائد من adipocytes المعزولة باستخدام المحاقن المرفقة بإبرة (~ 21). تغرق إبرة تحت طبقة adipocyte العائمة. تحرض الإبرة بإيجاز لإزاحة الخلايا أي التمسك برمح إبرة ومن ثم انتظر adipocytes المزاحة تطفو إلى الأعلى.
  9. رسم ببطء السائل الزائد، مع الحرص على تجنب إزالة adipocytes غير مقصودة. استخدام أنبوب ميكروسينتريفوجي التخرج إلى استمرار عزل حجم العينة (مثلاً- 0.1 مل لكل عينة).
  10. تستخدم الخلايا المعزولة لاستخراج الحمض النووي/الجيش الملكي النيبالي، مقايسة الامتصاص الجلوكوز، lipolysis المقايسة، إلخ

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

جدوى سوات قيمت في البداية قبل تصوير المسلسل برايتفيلد لكل وات مجموعات (ن = 12) على مدى أسبوعين تقريبا من 7.6. وظلت مجموعات المضمون في مكان في أحادي الطبقة طوال هذا الوقت. ولوحظت التغييرات الشكلية الطفيفة مع adipocytes الفردية تزييفها قليلاً أو تحويل المواقف. ولكن adipocytes لا تصبح مولتيلوكولار مع مرور الوقت، مما يشير إلى عدم وجود ديديفيرينتييشن، كما أنهم يحمل أي علامات مرئية لموت الخلية مثل بلبينغ الخلوية، وتحلل، أو تجزئة (الشكل 2). وأكدت هوية مجموعات adipocyte في سوات عمرها يومين في الأسبوع مع الدهن وصمة عار النيل الأحمر (NR). NR واضح تلطيخ مجموعات adipocyte الثلاجات أشارت إلى أن هذه في الواقع adipocytes مع أغشية سالمة، بدلاً من القطع الأثرية أو الخراجات adipocytes قتيلا. نظراً لغياب NR تلطيخ في صحائف آخر المحيطة تشير إلى أن هذه الخلايا لا تتراكم الدهون وذلك لا التفريق نحو نسب أديبوجينيك أنفسهم (الشكل 3a). وأجرى تلطيخ يوديد Propidium في سوات اليوم عمره 53. الاستبعاد من وصمة عار داخل مجموعات adipocyte في تيميبوينتس المتقدمة يدل على عدم موت الخلية (الشكل 3b). وأجرى وصمة عار النفط-الأحمر-O (أورو) في سوات اليوم عمره 51 مع تعريب وصمة عار الدهن داخل مجموعات adipocyte الثابتة، مشيراً إلى أن adipocytes سوات الحفاظ على استمرارية مع adipocytes سليمة حتى في تيميبوينتس المتقدمة (الشكل 3 ج).

وأجرى إيمونوسيتوتشيميستري (المحكمة الجنائية الدولية) لإظهار التعبير البروتين المتوقعة والتعريب علامات adipocyte ناضجة داخل سوات. سليمة سوات لوحات كانت ملطخة بأجسام مضادة ضد بيريليبين (ab3526، وتمييع 1: 200)، PPARγ2 (sc-166731، تمييع 1: 100)، و FABP4 (ab92501، 1:1,000 إضعاف). أظهرت الصور [كنفوكل] 12 يوم من العمر سوات التعريب المتوقعة من بيريليبين حول الدهن الحبرية السطح (الشكل 4 أ). مجهرية الأسفار 3 سوات عمرها يوما مع وصمة عار العداد دهن بوديبي أثبت التعريب FABP4 داخل السيتوبلازم (الشكل 4 باء)، وتداخل الإشارات من برج و DAPI تلطيخ أثبت التعريب برج للنواة ( الشكل 4 ج).

تم تقييم الشخصية النسخي سوات في الأنسجة المصنف من موضوعات متعددة (n = 4 الجهات المانحة). عند جمع واستخدام جزء من الأنسجة الدهنية لخط أساس استخراج الحمض النووي الريبي (d0)، بينما استخدمت بقية إلى لوحات سوات البذور. ثم كانت تحصد هذه اللوحات في ح 24، 14 يوما، و 28 يوما في الثقافة سوات. وأجرى خطوة واحدة النسخ العكسي الكمية البلمرة المتسلسل (RT-qPCR) لتحديد مستويات النسخ. تم فحص الجينات adipocyte الرئيسية الستة: برج، FABP4، LPL، سيببا، والاعرج، و ADIPOQ (الشكل 5). واستخدمت أكتب كرقابة داخلية ومستويات النسخي أبديت كنسبة مئوية من التعبير مطابقة الموضوع الأساس (d0). أظهر جميع الجينات النسخ قوية في سوات، على الرغم من أن مستويات الاتجاه نزولا على مر الزمن. ونحن نعتقد أن لاحظ يمكن تحسين الملامح النسخي مع زيادة تحسين وسائل الإعلام كما نضع في قسم مناقشة.

وكان تقييم الدالة الغدد الصماء القاعدية في الثقافات نفسها المستخدمة للتشكيل الجانبي النسخي. وجمعت المادة طافية من لوحات سوات وقيست مستويات ليبتين استخدام مقايسة الممتز المرتبط بالانزيم (ELISA) (ab100581). عرض سوات إفراز اللبتين القاعدية في أيام 1 و 14 و 28 (الشكل 6a). وأبقى على أوراق آخر بالتوازي مع لوحات سوات كعنصر تحكم (أي أوراق آخر دون وات تقع). قد لا يتم الكشف عن اللبتين يفرز في عناصر التحكم هذه (البيانات لا تظهر).

لتحديد ما إذا كانت سوات يمكن الحفاظ على القدرة استجابة إيندوسيبلي مع مرور الوقت، تم فحص lipolysis (n = 4). كان مفروم جزء من وات الطازجة التي تم جمعها (d0) لتقييم القدرات دهون إيندوسيبلي، و adipocytes انزيماتيكالي كانت معزولة (مشابهة للحصاد سوات في البروتوكول القسم 5)، بينما استخدمت بقية البذور لوحات سوات. كانت المحتضنة adipocytes معزولة عن ح 3 في 37 درجة مئوية في 300 ميليلتر من ألبومين المصل البقري خالية من الأحماض الدهنية 2% في حبس مع 100 ميكرومتر فورسكولين، أدرينالين 1 ميكرومتر أو المخزن المؤقت في عنصر التحكم. تم قياس مستويات والغليسيرول في وسائل الإعلام التي تم جمعها مع "الحرة والغليسيرول كاشف". وكان حصاد سوات ثم أيام تم تقييم قدرة 1 و 5 ودهون بنفس الطريقة. زيادة التحفيز الكيميائي والغليسيرول الإفراج عن الثلاثة إلى حد كبير في جميع تيميبوينتس (الشكل 6b): والغليسيرول الإفراج عن adipocytes المعالجة قد زاد في وات d0 82% 46 ± (ف = 0.01)، 1-يوم سوات 577% 387 ± (ف = 0.02)، وخمسة أيام سوات 348% 343 ± (ف = 0.03). يعني مستويات والغليسيرول في adipocytes حفز متشابهة جداً عبر جميع تيميبوينتس الثلاثة: الابتدائي وات 5.2 ± 0.8، ويوم 1 4.4 سوات ± 1.9 و 5 أيام 4.8 سوات ± 1.8 ميكروغرام والغليسيرول/ملغ إجمالي البروتين. يعني والغليسيرول مستويات في عنصر التحكم (أي، lipolysis القاعدية) مرتفعة نسبيا في وات الطازجة التي تم جمعها (d0) بالمقارنة مع الخلايا سوات تحصد. قد يكون هذا بسبب زيادة الضغط على الأنسجة وات في d0 خلال الاستئصال الجراحي، النقل إلى المختبر، وتنميق. غير أن هذه التجارب تثبت لا تضاؤل في القدرات دهون في سوات في أما 1 أو 5 أيام مقارنة بوات الطازجة التي تم جمعها.

سوات اتضح أن تكون قادرة على زرع والانتعاش في طراز ماوس (n = 4) إظهارا للأنسجة المعقدة، وكل وظيفة. وأيضا إمكانية تطبيق النظام الأساسي ينبغي أن باحث رغبتها في الاستفادة من سوات التلاعب وات في المختبر قبل زرع الأنسجة في نموذج حيوان. سوات كان مثقف لمدة 10 أيام وتحصد استخدام البروتوكول القياسي؛ ثم حملت adipocytes معزولة من لوحات سوات في محقن 1 مل (بدون إبرة). وقد أدلى شق تحت الجلد في الجهة الظهرية المناعة الفئران معربا عن اجفب (إيماءة. Cg-بركدكسسيد Il2rgtm1Wjl Tg(CAG-EGFP)1Osb/SzJ). وهذا خلق جيب تحت الجلد الظهرية صغيرة التي تم حقن adipocytes مثقف سوات مع المحاقن، وخياطة الجيب كان ثم إغلاق. وبعد 10 أيام ما بعد زرع الأعضاء، جرى التضحية بالفئران. عمليات زرع الأعضاء كانت واضحة للعيان وسهولة استرداد (الشكل 7 أ). زرع المستردة ومستودع الدهون contralateral ماوس ثابتة، البارافين جزءا لا يتجزأ، ومقطوع. وأجرى Immunohistochemistry على شرائح مقطعة مع الأجسام المضادة الأولية ضد التجارة والنقل (A10262، وتمييع 1: 100)، وبلين البشرية (مقرر اتفاقية استكهولم--390169، وتمييع 1: 100). تم التحقق من صحة جسم بلين المضادة المحددة في تجريبيا وصمة عار وبلين البشرية لكن لا الماوس. Adipocytes من زرع تعافي حوالي 50 – 120 ميكرومتر في الحجم، وهو النطاق المتوقع ل adipocytes البشرية، وكانت سلبية تماما للتجارة والنقل (الشكل 7). بيد أن حوالي 31 في المائة adipocytes كانت إيجابية بالنسبة بلين البشرية، مما يشير إلى engraftment ناجحة في البلد المضيف. كان الحجم adipocytes في مستودعات الدهون الماوس 20 – 40 ميكرون، الذي يتسق مع الماوس adipocytes، بينما تلطيخ إيجابية تماما للتجارة والنقل وتماماً السلبية بلين البشرية (الشكل 7 ج). أوراق آخر (مع أي تقع وات) تم كشط من خلية ثقافة الأطباق وزرعها في الفئران كعنصر التحكم. ومع ذلك، هذه لم تسفر عن أي أنسجة قابلة للاسترداد (البيانات لا تظهر). هذا وأشار إلى adipocytes المستردة من تنضج سوات مثقف، وليس نتيجة أدسكس البشرية المتباينة.

Figure 1
رقم 1: أسلوب "سوات". () "التخطيطي سوات" عرض نقل ورقة الخزفية المسمى اجفب من طبق استنبات الأنسجة المغلفة بنيبام في ورقة ثانية، غير مسمى من الخزفية التي نمت على طبق استنبات الأنسجة قياسية. وات البشرية مفروم، الأولى هي تقع بين الأوراق الخزفية 2. (ب) الأسفار مجهرية مما يدل على برايتفيلد والتجارة والنقل وقنوات المدمجة سوات التي تم إنشاؤها بواسطة الأسلوب الموصوفة في الفقرة (أ). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (ج) الرقمية صورة فوتوغرافية لممثل، 5 سوات عمرها يوما مثقف في صفيحة 6-جيدا قياسية. يتم تأمين الحجم الكبير لوات ستابلي إلى أسفل البئر. تم تعديل الرقم من لاو وآخرون. 11 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: سوات لا تزال قابلة للتطبيق في 8 أسابيع في الثقافة- برايتفيلد المسلسل التصوير في كتلة سوات واحد أكثر من 55 يوما يوضح أية تغييرات السمات متسقة مع موت الخلية. تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر. الشكل يتم تعديل من لاو وآخرون. 11 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: سوات ما زالت قابلة للتطبيق في أكثر من 50 يوما. () "النيل الأحمر" تلطيخ يوضح تقييد المصبوغة إلى سوات مثقف لمدة 15 يوما، مشيراً إلى adipocytes قابلة للبقاء حية. المحيطة بالخلايا اللحمية لا وصمة عار. الرقم في 40 × التكبير، ومقياس بار = 100 ميكرومتر-(ب) Propidium يوديد (PI) تلطيخ سوات مثقف 53 يوما يكشف عن إكمال الاستبعاد PI، مما يشير إلى لا الموت adipocyte؛ شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (ج) النفط-الأحمر-O تلطيخ 51 يوضح سوات عمرها يوما تقييد الدهون المحايدة إلى adipocytes، مما يشير إلى استقرار طويل الأمد في أغشية الخلية adipocyte. تم تعديل الرقم من لاو وآخرون. 11 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: إيمونوسيتوتشيميستري يوضح أن سوات البقع إيجابيا لعلامات خلية adipocyte ناضجة مع التعريب المتوقعة. () كونفوكال المجهري 2 منذ أسابيع سوات كشف خلايا الثلاجات البشرية بلين + مع الترجمة إلى السطح الحبرية الدهن. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (ب) المجهري نيون سوات يوم عمره 3 كشف خلايا FABP4 + الإنسان مع الترجمة إلى السيتوبلازم و (ج) PPARγ + الخلايا مع الترجمة إلى نواة الخلية. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الشكل يتم تعديل من لاو et al. 11 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: سوات تحتفظ adipocyte مفتاح الهوية التعبير الجيني- كانت مجموعات سوات كولاجيناز هضمها بعد 1، 14 و 28 يوما في التعبير الثقافة والجينات يحدده RT-قبكر. RT-قبكر يوضح أن سوات عمرها 1 يوم وعمرها 14 يوم الحفاظ على مستويات عالية من () برج، (ب) فابب، (ج) الأعرج، (د) كبيببا، (ه) LPL و (f) ADIPOQ. أكتب كمرجع الجينات. أشرطة الخطأ = الخطأ المعياري. تم تعديل الرقم من لاو et al. 11- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: سوات بسالي تفرز adipokines وفسيولوجيا ويستجيب للتحفيز الكاتيكولامينات. () أليسا الكمي لإفراز اللبتين القاعدية ح 24 يظهر أي تغيير ملموس بعد 28 يوما في الثقافة. (ب) تحفيز ادريناليه مع أدرينالين وفورسكولين يولد استجابة جليكوليتيك كبيرة في وات الابتدائي المقطوع حديثا (1.7 x) وموضوع المطابقة سوات في 1 و 5 أيام في الثقافة. سوات يوم 1 رد على التحفيز الكاتيكولامينات بزيادة 6.3-fold على مدى تحلل القاعدية بينما "يوم 5 سوات" أظهرت زيادة بنسبة 3.3-fold على مدى تحلل القاعدية. تحلل حفز لم تكن تختلف اختلافاً كبيرا في سوات المتطابقة وات الطازجة بالمقارنة مع (p = 0.53, n = 4). أشرطة الخطأ = الخطأ المعياري. الشكل تعديل لاو et al. 11- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
الشكل 7: سوات يمكن أن تتم في فيفو، مما يدل على الاحتفاظ بوظيفة النسيج كله. () سوات كان تصور سهولة بعد 10 أيام من زرع الأعضاء إلى ماوس المناعة (العلامة النجمية). قد لا بنجاح مزروع سوات، قبل 10 أيام سوات نخرية سيكون قد تم المسال. (ب) أقسام سوات المستردة أظهرت adipocytes الكبيرة والثلاجات (أقطار 50 إلى 120 ميكرومتر) التي كانت اجفب-. 31.3 في المائة adipocytes كانت البشرية بلين +. Adipocytes بلين + البشرية تميل إلى أن تكون أصغر حجماً، الذي سيكون مناسباً مع الملاحظات السريرية لتطعيم الدهون في البشر حيث adipocytes أصغر من المرجح أن البقاء على قيد الحياة النقل. شريط المقياس = 100 ميكرومتر، 200 X التكبير. منصات (ج) Contralateral الدهون المأخوذة من الفئران نفس أظهر adipocytes أصغر بكثير (20 – 40 ميكرومتر)، وكانت البشرية بلين-. شريط المقياس = 100 ميكرومتر، 200 X التكبير. تم تعديل الرقم من لاو et al. 11- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تفاصيل هذا البروتوكول استعمال أدسكس ساندويتش البيض الأنسجة الدهنية البشرية؛ خطوط الخلايا البشرية في آخر يمكن أن تكون معزولة عن طريق بروتوكولات راسخة15. ومع ذلك، يمكن تكييفها لمتطلبات البحوث فردية (مثل استخدام الخلايا 3T3L-1 إلى ساندويتش الماوس وات) النظام. تنطوي هذه العملية على التعامل مع الأنسجة البشرية الأساسية. وينبغي استخدام احتياطات السلامة القياسية؛ التعامل مع الأنسجة البشرية كممرضات BSL-2 (مثل فيروس نقص المناعة البشرية، فيروس). فقط التعامل مع الأنسجة مباشرة تحت BSC. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة وفق ما تمليه معايير السلامة المؤسسية – يوصي بشدة بقفازات مزدوج. تطهير جميع الإمدادات بشكل صحيح والنفايات مع 10 ٪ التبييض الحل أو الحل الإيثانول 70% قبل إعادة استخدامها أو التخلص منها.

الخطوة الحاسمة الأولى في الثقافة سوات القوادة والحفاظ على لوحات زراعة الأنسجة المغلفة بنيبام. هذه اللوحات متاحة تجارياً، أو أنها يمكن أن تنتج عن طريق الأساليب المتبعة12،،من1314. هذه اللوحات هي الأسطح ثقافة الخلية تستجيب لدرجة الحرارة. فوق درجة الحرارة الحرجة (~ 32 درجة مئوية)، السطح مسعور وتنضم الخلايا، مماثلة لغيرها من المواد البلاستيكية المعالجة لزراعة الأنسجة. ومع ذلك، أدناه هذا درجة الحرارة الحرجة، يصبح السطح ماء وسيتم فصل الخلايا من سطح البلاستيك16. As a result، وينبغي الحرص على وضع: 1) كيف بسرعة نوع خلية معينة سوف ننأى عن أحادي الطبقة قبل أن يصل إلى كونفلوينسي الكامل (أي، أثناء التغييرات الوسائط العادية) و 2) الوقت اللازم لتخفيض درجة الحرارة مع الجيلاتين المكبس المطبقة على لوحة بنيبام المغلفة، لضمان أن تنأى بالورقة الخلية بأكملها. يجب إجراء التغييرات وسائط الإعلام مع وسائل الإعلام ارتفعت درجة حرارة إلى 37 درجة مئوية؛ إذا كانت الخلايا المعرضة للتفكك السريع، إجراء تغييرات الوسائط على كتلة حرارة تعيين إلى 37 درجة مئوية تحت درجة البكالوريوس.

والخطوة الحاسمة الثانية معالجة الأنسجة الدهنية للتحضير لبذر سوات. نحن يؤديها لدينا توصيف تنميق وات مع الملقط المعقم وشفرات الحلاقة المعقم. ومع ذلك، لا يمكن قص اللفافة البشرية بسهولة بشفرة حلاقة. تحقيق الحد الأقصى من نسبة adipocyte برباط المهم الاحتفاظ قدر الأنسجة الدهنية داخل سوات ممكن على مدى فترة طويلة الأجل. سوف يمنع قطع كبيرة من اللفافة سليمة خلية خلية الاتصال بين أدسكس و adipocytes، هو أمر أساسي للحفاظ على سوات معا. كميات مفرطة من رباط يمكن أيضا أثر "سحب على مؤشر ترابط". مجموعات متعددة متصلة بواسطة رباط حين وات كتلة واحدة يمكن أن ننأى عن لوحة دون التأثير على المجموعات المجاورة، يمكن سحب ما يكفي المجموعات قبالة أحادي الطبقة تجعل من سوات أيضا غير قابل للاستخدام. شفط الدهون، الذي ينطوي على تنميق ميكانيكية وات، يمكن الالتفاف حول هذه المسألة كما اللفافة هو مفروم ناعما أثناء الجراحة. ومع ذلك، أثناء شفط الدهون، المرضى بشكل روتيني يعالجون بجرعات عالية من أدرينالين؛ يجب أن تحسب العواقب المحتملة لهذا العلاج على الأنسجة (والتجارب اللاحقة) أثناء دراسة.

هو تحديد الخطوة النهائية الحاسمة في الثقافة سوات وسائط الثقافة تجريبية. أجرينا تجاربنا الأولية توصيف استخدام صياغة ثقافة خلية قياسي (10% FBS، 1 x البنسلين/ستربتوميسين في دميم). ومع ذلك، استناداً إلى الكتابات المتاحة فيما يتعلق تحقيق الحد الأقصى من النسخ adipocyte، استخدمنا صيغة متخصصة (7 ميكرومتر الأنسولين، 30 ميكرون الديكساميتازون، 1 x البنسلين/ستربتوميسين في وسائل الإعلام M199)17. تحسين صياغة هذه المستويات المبكرة من النسخ، ولكن المستويات انخفضت على مر الزمن. نعتقد أن هذا يرجع في الجسم، ويتعرض adipocytes لمجموعة متنوعة واسعة من الإشارات الكيميائية، ركوب الدراجات وكثيراً ما بين الدول جوعاً وبنك الاحتياطي الفيدرالي على مدى يوم واحد. وبالتالي، ينبغي أن يكون من الممكن تحسين الشخصية النسخي لوحظ على مر الزمن بمزيد تحسين ملاحق لدينا وسائل الإعلام ثقافة الخلية.

سوات الحصاد (البروتوكول، القسم 5) يعزل adipocytes من الثقافة ويقلل من حجم العينة، ويزيل التدخل من أوراق آخر المحيطة بها. وهذا يمكن أن تسبق تجانس adipocyte (وضرورية لعزل البروتين أو الأحماض النووية)، أو فحوصات الوظيفية من سليمة adipocytes (مثل فحوصات امتصاص تحلل أو الجلوكوز). وبدلاً من ذلك، يمكن حصادها لوحة سوات سليمة ل immunocytochemical تلطيخ، الذي يسمح للأوراق آخر لتأمين المجموعات وات إلى المونولاير طوال عملية المصبوغة. وفي هذه الحالة، نضح وسائل الإعلام الثقافة وإصلاح ثقافة كاملة عن طريق البروتوكولات القياسية. ومع ذلك، نوصي بإضافة ساترة من زجاج قبل التصوير لتسطيح مجموعات adipocyte ثلاثي الأبعاد وتحسين جودة الصورة الناتجة.

ونحن نعتقد أن سوات لديها إمكانات كبيرة كدواء فحص منصة. التقنية بسيطة، واستنساخه، ويستخدم صفائح التقليدية زراعة الأنسجة. ولذلك، تجارب فحص المخدرات القابل للتنفيذ بإضافة مركب عقاقيري نشط إلى متوسط الثقافة. ثم يمكن أن تحصد adipocytes لدراسة تأثير المركب على التعبير الجيني، الشخصية جينية، حساسية الأنسولين، إلخ ، وبالمثل يمكن استخدام إضافة السموم البيئية للثقافة المتوسطة لدراسة آثارها على adipocytes. لأن يسمح سوات الباحث تتبع مجموعات adipocyte الفردية على مر الزمن، أنها مناسبة فريدة لتقييم علاج الذي يجعل تغيير المظهرية مرئية إلى adipocytes. وسيكون مثالاً بارزا adipocyte البشرية "إنضاج"، حيث يصبح adipocyte بيضاء، وتخزين الدهون "أحمر" أو ما شابهها adipocyte براون حرارة، مولتيلوكولار18. وهذه ظاهرة أهمية سريرية رئيسية يحتمل أن أظهر في نماذج الماوس، ولكن ابدأ في إنسان. شارك مثقف تنويعات سوات أيضا عقد الأبحاث الهائلة المحتملة. سوات هو نظام ثقافة المشارك طبيعية التي تستخدم الآبار ثقافة الخلية القياسية. ولذلك، أحد الحفاظ على adipocytes بين سائر أنواع الخلايا ذات الصلة سريرياً بتغيير الخلايا يقحم أو عن طريق إدراج غشاء زراعة الأنسجة. على سبيل المثال، يمكن أن تعمل خلايا الكبد كالورقة خلية يقحم العلوي للشاشة المخدرات التي يتم تصفيتها عن طريق الكبد قبل أن يصل إلى الأنسجة الدهنية. وبالمثل، يمكن أن نما الخلايا السرطانية على إدراج غشاء على سوات لدراسة الكيفية التي تسهم بها adipocytes في أمراض السرطان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

الكتاب تود أن تقر بالدعم المؤسسي المقدمة من مركز علوم الصحة LSU، التي تمول المشروع.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x HBSS Thermofisher 14185052
Gelatin Sigma-aldrich G9391
Collagenase Sigma-aldrich C5138
Adenosine Sigma-aldrich A9251
DMEM Thermofisher 11995065
M199 Media Thermofisher 11043023 Phenol red-free 
250 µm Mesh Filter Pierce 87791
0.2 µm Syringe Filter Celltreat 229747
5 mL Luer-Lok syringes  BD 309646
Metal Washers These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3 g 
Name Company Catalog Number Comments
Heated Equipment
Incubated Orbital Shaker VWR 10020-988 Samples should be pitched at 45° angle to facilitate collagenase digestion
Heat Block Set to 37-40 °C and placed under Biosafety Cabinet
Water Bath Set to ~75 °C
Name Company Catalog Number Comments
Specialized Plastics
Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell Nunc 174902  or 174901 These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: <6 cm for 6 cm dish, <3.5 cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6 cm dish, 5.1 g for 6-well plate
Plastic Plunger Apparatus These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cawley, J., Meyerhoefer, C. The medical costs of obesity: An instrumental variables approach. Journal of Health Economics. 31 (1), 219-230 (2012).
  2. Pi-Sunyer, X. The Medical Risks of Obesity. Postgraduate Medicine. 121 (6), 21-33 (2009).
  3. Smith, U. Morphologic studies of human subcutaneous adipose tissue in vitro. Anatomical Record. 169 (1), 97-104 (1971).
  4. Sugihara, H., Yonemitsu, N., Miyabara, S., Yun, K. Primary cultures of unilocular fat cells: characteristics of growth in vitro and changes in differentiation properties. Differentiation. 31 (1), 42-49 (1986).
  5. Sugihara, H., Yonemitsu, N., Toda, S., Miyabara, S., Funatsumaru, S., Matsumoto, T. Unilocular fat cells in three-dimensional collagen gel matrix culture. The Journal of Lipid Research. 29, 691-697 (1988).
  6. Hazen, S. A., Rowe, W. A., Lynch, C. J. Monolayer cell culture of freshly isolated adipocytes using extracellular basement membrane components. The Journal of Lipid Research. 36, 868-875 (1995).
  7. Fried, S. K., Kral, J. G. Sex differences in regional distribution of fat cell size and lipoprotein lipase activity in morbidly obese patients. International Journal of Obesity. 11 (2), 129-140 (1987).
  8. Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. The National Institutes of Health. Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline. Stem Cell Research and Therapy. 4, (2013).
  9. Wikswo, J. P. The relevance and potential roles of microphysiological systems in biology and medicine. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1061-1072 (2014).
  10. National Institutes of Health. NIH-CASIS Coordinated Microphysiological Systems Program for Translational Research in Space (#RFA-TR-18-001). , Available from: https://grants.nih.gov/grants/guide/rfa-files/RFA-TR-18-001.html (2017).
  11. Lau, F. H., Vogel, K., Luckett, J. P., Hunt, M., Meyer, A., Rogers, C. L., Tessler, O., Dupin, C. L., St Hilaire, H., Islam, K. N., Frazier, T., Gimble, J. M., Scahill, S. Sandwiched White Adipose Tissue: A Microphysiological System of Primary Human Adipose Tissue. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (3), (2018).
  12. Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and 'smart' polymers. Radiation Physics and Chemistry. 76, 1409-1413 (2007).
  13. Lin, J. B., Isenberg, B. C., Shen, Y., Schorsch, K., Sazonova, O. V., Wong, J. Y. Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).
  14. Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets. Journal of Visualized Experiments. (92), e51044 (2014).
  15. Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
  16. Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control. Langmuir. 20 (13), 5506-5511 (2004).
  17. Fried, S. K., Russell, C. D., Grauso, N. L., Brolin, R. E. Lipoprotein lipase regulation by insulin and glucocorticoid in subcutaneous and omental adipose tissues of obese women and men. Journal of Clinical Investigation. 92 (5), 2191-2198 (1993).
  18. Keipert, S., Jastroch, M. Brite/beige fat and UCP1 - is it thermogenesis? Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (7), 1075-1082 (2014).

Tags

السلوك، 138 قضية، الأنسجة الدهنية، adipocytes، والسمنة، ونظم ميكروفيسيولوجيكال، والأجهزة على رقائق، فحص المخدرات، وتطوير العقاقير، السمية البيئية، الثقافة الأولية، والسكري، والايض
منصة ميكروفيسيولوجيك للدهون البشرية: تقع في الأنسجة الدهنية البيضاء
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. … More

Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. L., Lau, F. H. A Microphysiologic Platform for Human Fat: Sandwiched White Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (138), e57909, doi:10.3791/57909 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter