Summary
Witte vetweefsel (WAT) heeft kritieke tekortkomingen in de huidige primaire cultuur modellen, belemmeren farmacologische ontwikkeling en metabole studies. Hier presenteren we een protocol voor de productie van een systeem van de obesitas microphysiological door klemmen WAT tussen bladen van stromale cellen. Deze constructie biedt een stabiele en flexibele platform voor primaire WAT cultuur.
Abstract
Witte vetweefsel (WAT) speelt een cruciale rol bij het reguleren van gewicht en dagelijks gezondheid. Er zijn echter belangrijke beperkingen aan beschikbaar primaire cultuur modellen, die allemaal gelukt te trouw de obesitas communicatie recapituleren of WAT levensvatbaarheid na twee weken uit te breiden. Het gebrek aan een betrouwbare primaire cultuur model belemmert ernstig onderzoek in WAT metabolisme en Geneesmiddelenontwikkeling. Daartoe hebben we de NIH normen van een microphysiologic systeem voor de ontwikkeling van een nieuw platform voor primaire cultuur WAT genaamd 'SWAT' (ingeklemd witte vetweefsel) gebruikt. We overwinnen de natuurlijke drijfvermogen van adipocytes door sodat gehakt WAT clusters tussen bladen van adipeus-afgeleide stromale cellen. In deze constructie zijn WAT monsters levensvatbaar meer dan acht weken in cultuur. SWAT onderhoudt de intact ECM, cel-naar-cel contactpersonen en fysieke druk van in vivo WAT voorwaarden; Daarnaast onderhoudt SWAT een robuuste transcriptionele profiel, gevoeligheid voor exogene chemische signalen, en hele weefsel functie. SWAT vertegenwoordigt een effectieve, eenvoudige en reproduceerbare methode van primaire obesitas cultuur. Potentieel, is het een breed toepasbare platform voor onderzoek in WAT fysiologie, pathofysiologie, metabolisme en farmaceutische ontwikkeling.
Introduction
Adipeus weefsel is het belangrijkste orgaan van obesitas, dat bestemd is voor rechtstreekse jaarlijkse medische kosten tussen $147 miljard en 210 miljard dollar in de US1. De ophoping van vetweefsel draagt ook bij tot andere belangrijkste doodsoorzaken zoals hart-en vaatziekten, diabetes type II en bepaalde soorten kanker2. In vitro cultuur modellen zijn essentieel voor metabole studies en Geneesmiddelenontwikkeling, maar de huidige onderzoeksmodellen van vetweefsel hebben grote tekortkomingen. Adipocytes zijn kwetsbaar, veerkrachtige en terminaal gedifferentieerde cellen die niet voldoet aan de cel cultuur kunststoffen, en daarom niet kunnen worden gekweekt met behulp van conventionele cel kweekmethoden. Sinds de jaren 1970, hebben verschillende methoden gebruikt in pogingen om deze belemmeringen, waaronder het gebruik van glas coverslips, plafond cultuur, cultuur van de opschorting en extracellulaire matrices3,4,5, 6 , 7. echter, deze methoden werden gekenmerkt door celdood en dedifferentiation, en ze worden doorgaans gebruikt voor niet meer dan een twee weken durende studieperiode. Bovendien, deze modellen niet proberen de inheemse obesitas communicatie recapituleren als ze niet kunnen het intact ECM bewaren, de interacties tussen adipocytes en stromale cellen steunen, noch de cellen contractiele krachten op elkaar in in vivo uitoefenen WAT.
In de afwezigheid van een gouden standaard primaire obesitas cultuur-methode, heeft obesitas onderzoek ingeroepen voornamelijk gedifferentieerde pre adipocytes (diffAds). DiffAds zijn multilocular, aanhangend en metabolisch actief. Daarentegen, primaire witte adipocytes zijn unilocular, nonadherent, en getuigen van de relatief lage stofwisseling. Het falen van de huidige obesitas cultuur modellen te recapituleren de Fysiologie van gezonde volwassen adipeus weefsel is waarschijnlijk een belangrijke factor bij gebrek aan FDA-goedgekeurde medicijnen die rechtstreeks gericht zijn op adipocytes. In feite, is het gebrek aan fysiologische in vitro orgel modellen een groot probleem in de meeste organen en ziekte.
In haar stellingname aankondiging van de oprichting van het programma van de Microphysiological systemen (MPS), de National Institutes of Health (NIH) gemeld dat het slagingspercentage van 2013 over alle menselijke farmaceutische klinische proeven slechts 18% voor fase II en 50% voor fase III was klinische proeven8. Het MPS programma is ontworpen om direct het onvermogen van in vitro monocultuur te model menselijke fysiologie. De NIH definieert MPSs als cultuur systemen bestaat uit menselijke primaire of stamcellen in meercellige 3D constructies die orgel werking recapituleren. In tegenstelling tot reductionistische modellen van homogene, vereeuwigd celculturen, moet de MPSs nauwkeurig model cel, drug-cel, drug-drug en orgel-drug interacties9. In tegenstelling tot korte termijn primaire kweekmethoden dicteren NIH normen MPS duurzaamheid meer dan 4 weken in cultuur8. Verdere details van het MPS programma vindt u op de de NIH RFAs (#RFA-TR-18-001)10.
We hebben ontwikkeld, een eenvoudig, roman, flexibel, en goedkope obesitas MPS genoemd "ingeklemd witte vetweefsel" (SWAT)11. We overwinnen de natuurlijke drijfvermogen van adipocytes door "sodat" gehakt primaire adipeus weefsel tussen bladen van adipeus-afgeleide stromale cellen (ADSCs) (Figuur 1). De resulterende 3D constructie recapituleert de cel-cel-contact en de inheemse obesitas communicatie door omringende volwassen adipocytes met een natuurlijke adipocyte ondersteuning-celpopulatie. SWAT is gevalideerd door het tonen van de 8-weekse levensvatbaarheid, reactie op exogene signalering, de secretie van de adipokine en engraftment in een dierlijk model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle taken werden uitgevoerd in naleving protocollen #8759 en #9189, zoals goedgekeurd door de IRB Office van LSUHSC-NO. Alle dierlijke werk werd uitgevoerd in naleving van protocol #3285 goedgekeurd door het Bureau van de IACUC op LSUHSC-nr.
1. zaaien van sodat cel bladen
Opmerking: Zie Figuur 1.
- Zaad ADSCs op ongeveer 80% confluentie in weefselkweek platen (6 cm of 6-Wells-platen). Voor elk putje van SWAT gewenst, seed 1 conventionele weefselkweek goed en 1 putje van de grootte van de bijbehorende op poly(N-isopropylacrylamide (pNIPAAm) beklede weefselkweek kunststof plaat.
Opmerking: Dienovereenkomstig, een 6-well-plate voor SWAT vergt seeding cellen op één standaard 6-well weefselkweek plaat (basislaag) en één weefselkweek 6-well pNIPAAm beklede plaat (bovenste laag). pNIPAAm-gecoate platen commercieel kunnen worden gekocht of geproduceerd in-lab12,13,14. - Handhaven van ADSCs bij 37 ° C en 5% CO2 in de Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% FBS en 1 x penicilline/streptomycine. Media elke 2 dagen wijzigen.
- Cellen naar samensmelten tot ze 100% heuvels worden en op een gestreept patroon (ongeveer 6-8 dagen nemen) toestaan.
Opmerking: Deze cellen zal moeten functioneren als een intact eencellige vel om te stabiliseren van de uitbundige adipeus weefsel. Onvoldoende confluente cellen zal fragment bij zaaien met WAT.
2. voorbereiding voor SWAT levert
- Bereiden van verschillende 10 mL aliquots van 1 x Henks evenwichtig zout oplossing (HBSS); genoeg voor het gewenste aantal platen met volume te sparen voor te bereiden.
-
Voorbereiden op het apparaat van de plunjer SWAT zaaien. Construeer de plunjer gebruik van eenvoudige acryl plastic, bestaat uit een stam die is gekoppeld aan een ronde schijf. Zorgen dat het past binnen de omtrek van de weefselkweek putten (diameter: < 6 cm voor 6 cm schotel, < 3.5 cm voor 6-well plaat; geschatte massa: 6,7 g voor een 6 cm schotel, 5.1 g voor een 6-well-plate).
- Extra plunjers om ervoor te zorgen dat de procedure zal verlopen in geval zich een probleem voordoet met elke individuele plunjer voor te bereiden.
- Wikkel lab tape rond de rand van de schijf van de plunjer, minstens 2 x, om te voorkomen lekkage van gelatine oplossing.
- Spray een bioveiligheid kabinet (BSC) met 70% EtOH. Spray beneden een rack conische buis 15 mL binnen het BSC met lege, afgetopte 15 mL conische buizen; buizen zal de plaatsing van de gelatine plunjers beveiligen.
- Spray elke tape gewikkeld plunjer grondig met 70% EtOH en plaats in een conische tube van 15mL op het rek. Spuiten metalen sluitringen (geschatte massa 6.3 g) en leg ze op het rek samen met een paar van verslaafd verlostang; de sluitringen zal toevoegen gewicht aan de plunjers tijdens SWAT zaaien.
- Sluit de BSC raamvleugel en zet het UV licht te vergemakkelijken drogen en sterilisatie.
Opmerking: in het ideale geval voeren deze stap 24 h vóór SWAT zaaien. U kunt ook het proces te voeren op de dag van het weefsel collectie/SWAT zaaien; evenwel toestaan in dit geval 15-45 min voor UV drogen/sterilisatie.
3. voorbereiding van de gelatine plunjers — toepassing naar bovenste cel bladen
- Verwarm een waterbad tot 75 ° C.
-
Bereid de gelatine-oplossing door het toevoegen van 0,75 gram gelatine poeder 10 mL-voorraad 1 x HBSS. Voeg 100 µL van 1 M NaOH aan het balanceren van de pH van de oplossing onder een zuurkast.
- De 10 mL-bestanden toevoegen aan het waterbad en schud krachtig om 5 min tot het poeder in oplossing oplost. Doel te ontbinden de poedervorm gelatine kort na toe te voegen aan het verwarmd waterbad.
- De BSC blazer inschakelen, uitschakelen van het UV-licht en verhogen van de vleugel. Spray de BSC oppervlak en bereiden het filter leveringen (5 mL luer-lock spuiten en 0,2 µm spuit filters). Meerdere filters om efficiënt stam voldoende hoeveelheden gelatine toe te passen op plunjers voor te bereiden.
- Wanneer de gelatine oplossing een homogene consistentie bereikt, filtreer de oplossing en het toepassen van de plunjers. Laden van de spuit met gelatine. De gelatine van toepassing op de plastic plunjers door het filter van de spuit (~2.5 mL voor een 6-well-plate, ~4.5 mL voor een schotel 6 cm) en laten stollen (~ 20 min).
- Zodra de gelatine solide is, uitpakken de tape van de rand van de plunjers. Met een verslaafd Tang, de gelatine te verwijderen van de buitenste rand van de zuiger (dat wil zeggen, de verhoogde randen van de meniscus). Zorg ervoor dat de resterende gelatine in het midden van de plunjer volledig niveau te maximaliseren contact met ADSC blad.
- Zodra overtollige gelatine is verwijderd, voorzichtig toepassing de plunjers van de gelatine aan de ADSC pNIPAAm beklede platen. Gebruik de metalen ringen om de plunjer terneerdrukken. Niet schuintrekken cel bladen tijdens het toepassen van de plunjers.
-
Laat de plunjers op de cel bladen gedurende 1,5 uur op kamertemperatuur. Incubeer de platen/plunjers in een bad met ijs water gedurende 1,5 uur te voltooien dissociatie van de cellaag van het oppervlak pNIPAAm beklede plaat.
- Wees voorzichtig tijdens het broeden in het ijsbad; het ijsbad te besmetten de mobiele media tijdens de incubatie niet toegestaan.
- Na incubatie, reinig de onderkant van de pNIPAAm-gecoate platen om niet-steriel water te verwijderen.
4. witte vetweefsel Processing
- Bij het verzamelen van menselijke adipeus weefsel van de operatiekamer, houden alle monsters in een steriele container dat is op ijs totdat SWAT is om te worden ontpit. Steriele onderhoud media, zoals-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), toevoegen aan vetweefsel container voor weefsel stabiliteit.
- Voeg koude cel kweekmedium 1,5 mL microcentrifuge buizen voor elk goed/gerecht te worden ontpit (100 µL van een 6-well-plaat, 200 µL voor een 6 cm schotel).
-
Het blad van het vetweefsel.
- Voor solide adipeus weefsel segmenten, gaat u als volgt.
- Wassen grote segmenten van vetweefsel 3 x in steriele PBS en verwijder zoveel PBS mogelijk.
- Grof gehakt weefsel met pincet en steriele scheermes en Verwijder zo veel therapieën en fascia mogelijk (zie bespreking voor meer detail).
- Fijn gehakt vet met scheermes totdat gehakt weefsel overneemt van dik, vloeibare consistentie.
Opmerking: Een ideale weefsel verschijnt homogene met geen zichtbare afzonderlijke segmenten van WAT hoewel dit niet altijd mogelijk is.
- Lipoaspirate als volgt verwerken.
- Onder de BSC, tape steriel gaas over de bovenkant van een bekerglas en plaats deze bekerglas in een grotere bekerglas te verzamelen alle overtollige vocht.
- Met behulp van serologische Pipetteer 25 mL, trekken zoveel lipoaspirate als nodig en toe te passen op het oppervlak van de steriel gaas. PBS rechtstreeks toepassen op dit oppervlak te wassen lipoaspirated vet en overtollige bloed en lipide residu te verwijderen.
- Gebruik pincet gedraineerde weefsel herstellen, over te brengen naar een steriele hakken oppervlak en gehakt van de lipoaspirate.
- Voor solide adipeus weefsel segmenten, gaat u als volgt.
- Gebruik een steriele scheermes afgesneden van het distale einde van p1000 Pipetteer tips voor het overbrengen van gehakt weefsel; Dit zal het minimaliseren van shear stress die tot lysis van de adipocyte leiden kunnen. Het gewenste volume van gehakt weefsel overbrengen elke 1,5 mL-buis (300 – 400 µL voor 6-well plaat, 500-600 µL voor 6 cm schotel) zodra een goede weefsel consistentie is bereikt. Meng gehakt WAT en media kort in de buizen.
-
Neem de ADSC grondplaten en decanteren/aspirate de media. De media wordt vervangen door het mengsel WAT/media uit elke 1,5 mL-buis.
- Zachtjes de gelatine plunjers verwijderen uit de pNIPAAm-gecoate platen en deze toepassen op het mengsel WAT op de ADSC grondplaten. Onderzoeken de enkelgelaagde van de pNIPAAm-gecoate platen onder een microscoop te bevestigen van cellulaire detachement.
- Stel een warmte-blok op ongeveer 37-40 ° C onder de BSC. Met de plunjers nog op zijn plaats, de platen naar de warmte blok's oppervlak te verplaatsen. Voeg 2-3 mL verwarmde voedingsbodems Incubeer de cellen te vergemakkelijken gelatine smelten.
- Na ~ 30 min, zachtjes de plunjers van het oppervlak van de plaat te verwijderen. Vervang de deksels van de base weefselkweek platen en verplaatsen naar een cel cultuur incubator. Zodra de gelatine heeft volledig vloeibaar bij 37 ° C, gecombineerd en cel voedingsbodems vervangen.
- Handhaven van SWAT op 37 ° C en 5% CO2 in fenol rood-vrije M199 medium met 7 µM insuline, 30 µM dexamethason, 1 x penicilline/streptomycine. In ongeveer 2 mL media voor 6-Wells-platen en 3 mL voor 6 cm gerechten handhaven. Media elke 2 dagen wijzigen.
5. SWAT oogst
- Bereiden van collagenase (0,5 mg/mL collagenase, 500 nM adenosine, in PBS) aliquots in 15 mL conische buisjes (benaderend volume van 10 mL). Bevriezen van de buizen en bewaar ze bij-20 ° C.
- Iedere voedingsbodem uit cellen gecombineerd, 1 x met PBS wassen en vervolgens gecombineerd PBS. Prep het collagenase aliquots door hen in een waterbad 37 ° C te ontdooien.
Opmerking: in het ideale geval de collagenase oplossing zal bereiken 37 ° C; onmiddellijk daarna, voeg weefsel. -
Alle weefsel van de SWAT-plaat aan de individuele aliquots toevoegen. SWAT met behulp van een steriele cel scrapper oogst en overbrengen naar de collagenase aliquots met een licht-donkerscheiding p1000 pipette uiteinde. Weefsel rechtstreeks toevoegen aan de 15 mL conische buisjes met collagenase oplossing.
- Als alternatief, Incubeer het weefsel/collagenase mengsel in een conische tube van 50 mL; de grotere oppervlakte zal verder enzymatische spijsvertering te vergemakkelijken.
- Schakel Monster buizen in een bebroede roteerschudapparaat onder een hoek van 45°. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30-60 min-200 rpm.
- Plaats een 250 µm fijnmazige filter in een nieuwe conische tube van 15 mL voor collectie. Giet de oplossing verteerd adipocyte door het filter.
Opmerking: Dit zal alle cellen te passeren, terwijl filteren op vezelig weefsel toestaan. - Toestaan doorstroomtest om te zitten voor 5 minuten bij kamertemperatuur te voorzien van fase-separatie zichtbaar.
Opmerking: De adipocytes wordt een zwevende werkbalk naar de bovenkant van de oplossing terwijl de obesitas stromale cellen (ASC's) in de lagere fasen zal regelen. Centrifugeren voor 5 min op 500 x g kan ook maximaliseren cel scheiding of omringende ADSCs in de pellet van de oogst. -
Met behulp van een licht-donkerscheiding p1000 pipette uiteinde, overbrengen in de adipocytes (de drijvende laag boven aan collagenase oplossing) een tube van 1,5 mL microcentrifuge collectie. ~ 250 µL nemen op een moment, Pipetteer langzaam langs de rand van de buis te verzamelen van de adipocytes.
- De buis langzaam draaien terwijl het verzamelen van de adipocytes om te maximaliseren van het herstel van cellen vast te houden aan de binnenkant. Houd meer cellen tekenen totdat de 1,5 mL microcentrifuge buis vol is.
- Verwijder overtollige vocht uit de geïsoleerde adipocytes met behulp van een injectiespuit gekoppeld aan een naald (~ 21 G). Het onderdompelen van de naald onder de drijvende laag van de adipocyte. De naald kort als u wilt verjagen cellen vast te houden aan de schacht van de naald doorroeren en dan wachten op de dislodged adipocytes te zweven naar de top.
- Langzaam trekken de overtollige vloeistof, voorzichtig om te voorkomen dat onbedoelde verwijdering van adipocytes. Gebruik microcentrifuge buis afstudeerders consequent isoleren monster volumes (bijv. 0,1 mL voor elk monster).
- De geïsoleerde cellen gebruiken voor de DNA/RNA extractie, glucose opname assay, lipolyse assay, enz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Levensvatbaarheid van SWAT was in eerste instantie beoordeeld door seriële helderveld beeldvorming van individuele WAT clusters (n = 12) ongeveer 7,6 weken. Clusters bleef beveiligde in plaats op de enkelgelaagde gedurende deze tijd. Lichte morfologische veranderingen werden waargenomen met individuele adipocytes iets kromtrekken of posities verschuiven. Maar, adipocytes evenmin worden multilocular na verloop van tijd, met vermelding van een gebrek aan dedifferentiation, noch deed ze vertonen zichtbare tekenen van celdood zoals cellulaire blebbing, lysis of fragmentatie (Figuur 2). Adipocyte identiteit van clusters werd bevestigd op twee weken oude SWAT met lipide vlek Nile rood (NR). Duidelijke NR kleuring van unilocular adipocyte clusters aangegeven dat deze inderdaad adipocytes met ongeschonden membranen, in plaats van artefact, cysten of dode adipocytes. Het ontbreken van NR vlekken in de omliggende ADSC bladen geeft aan dat deze cellen zijn niet lipide accumuleren en daarom niet naar een adipogenic afstamming zelf (Figuur 3a differentiëren). 53 dagen oude SWAT werd Propidium jodide kleuring uitgevoerd. Uitsluiting van de vlek binnen adipocyte clusters op geavanceerde timepoints toont een gebrek aan celdood (Figuur 3b). Olie-Red-O (ORO) vlek werd uitgevoerd op 51 dagen oude SWAT met de lipide vlek lokaliseren binnen de vaste adipocyte clusters, die aangeeft dat SWAT adipocytes handhaven levensvatbaarheid met intact adipocytes zelfs op geavanceerde timepoints (Figuur 3 c).
Immunocytochemie (ICC) werd uitgevoerd om aan te tonen van de verwachte eiwit expressie en lokalisatie van volwassen adipocyte markeringen binnen SWAT. Intact SWAT platen werden gekleurd met antilichamen tegen perilipin (ab3526, 1:200 verdunning), PPARγ2 (sc-166731, 1:100 verdunning), en FABP4 (ab92501, 1:1,000 verdunning). Confocale beelden van 12 dagen oude SWAT aangetoond verwachte lokalisatie van perilipin rond lipide druppel oppervlak (figuur 4a). Fluorescentie microscopie van 3 dagen oude SWAT met de lipide teller vlek BODIPY aangetoond FABP4 lokalisatie in het cytoplasma (figuur 4b) en overlappende signaal van PPARG en DAPI kleuring aangetoond PPARG localization voor de kern ( Figuur 4 c).
SWAT transcriptionele profiel werd geëvalueerd in weefsel zaadjes uit meerdere vakken (n = 4 donoren). Bij de inzameling, werd een gedeelte van adipeus weefsel gebruikt voor een baseline RNA extractie (d0), terwijl de rest werd gebruikt om zaad SWAT platen. Deze platen werden vervolgens verzameld in 24 h, 14 dagen en 28 dagen in SWAT cultuur. One-Step kwantitatieve omgekeerde transcriptie polymerasekettingreactie (RT-qPCR) werd uitgevoerd om te bepalen van transcriptie niveaus. Zes belangrijke adipocyte genen werden onderzocht: PPARG, FABP4, LPL, CEBPA, HSL en ADIPOQ (Figuur 5). ACTB werd gebruikt als een interne controle en transcriptionele niveaus werden uitgedrukt als een percentage van expressie van het onderwerp-matched basislijn (d0). Alle genen aangetoond robuuste transcriptie in SWAT, hoewel niveaus naar beneden trend na verloop van tijd. Wij zijn van mening dat waargenomen transcriptionele profielen kunnen worden verbeterd met verdere media optimization zoals we in de sectie discussie werken.
Basale endocriene functie werd geëvalueerd op de dezelfde culturen voor het transcriptionele profiel gebruikt. Supernatant werd bijeengezocht uit SWAT platen en leptine niveaus werden gemeten met behulp van enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (ab100581). SWAT weergegeven basale leptin secretie dagen 1, 14 en 28 (Figuur 6a). ADSC bladen werden onderhouden parallel met SWAT platen als een besturingselement (dat wil zeggen, ADSC sheets zonder ingeklemd WAT). Secreted leptin kon niet worden opgespoord in deze besturingselementen (gegevens niet worden weergegeven).
Om te bepalen of SWAT capaciteit voor een afleidbare reactie na verloop van tijd kon onderhouden, lipolyse werd onderzocht (n = 4). Om te beoordelen afleidbare Lipolytische capaciteit, een deel van vers verzameld is WAT (d0) werd gehakt en adipocytes waren enzymatisch geïsoleerd (vergelijkbaar met SWAT oogst in Protocol sectie 5), terwijl de rest werd gebruikt om het zonebeheer van SWAT platen. Geïsoleerde adipocytes werden geïncubeerd gedurende 3 uur bij 37 ° C in 300 µL van 2% vetzuren-zuurvrij bovien serumalbumine in HBSS met 100 µM forskolin, 1 µM epinefrine, of control buffer. Glycerol in verzamelde media werd gemeten met gratis Glycerol reagens. SWAT was dan dagen 1 en 5 en Lipolytische capaciteit werden beoordeeld op dezelfde wijze geoogst. Chemische stimulatie verhoogd glycerol release aanzienlijk op alle drie timepoints (Figuur 6b): glycerol release van behandelde adipocytes werd verhoogd in d0 WAT 82 ± 46% (p = 0,01), 1-daagse SWAT 577 ± 387% (p = 0,02), en vijf-daagse SWAT 348 ± 343% (p = 0.03). bedoel glycerol niveaus in gestimuleerd adipocytes waren zeer vergelijkbaar in alle drie timepoints: primaire WAT 5.2 ± 0.8, 1-daagse SWAT 4.4 ± 1.9 en een 5-daagse SWAT 4,8 ± 1.8 µg glycerol/mg totaal eiwit. Gemiddelde glycerol niveaus in besturingselement (dat wil zeggen, basale lipolyse) relatief hoog waren in vers verzameld is WAT (d0) ten opzichte van de SWAT-geoogste cellen. Dit kan worden veroorzaakt door de toegenomen stress aan WAT weefsel op d0 tijdens chirurgische excisie, vervoer naar het lab, en hakken. Deze experimenten tonen echter geen intoxicatie in Lipolytische capaciteit in SWAT op 1 of 5 dagen in vergelijking met WAT vers verzameld is.
SWAT werd aangetoond dat zij geschikt zijn voor transplantatie en herstel in een muismodel (n = 4) als een demonstratie van complexe, hele weefsel functie. Het is ook dat een mogelijke toepassing van het platform moet een onderzoeker wil SWAT om te manipuleren WAT in vitro voordat het transplanteren van weefsels in een dierlijk model gebruiken. SWAT gekweekte was voor 10 dagen en geoogst met behulp van het standaard protocol; geïsoleerde adipocytes van SWAT platen werden vervolgens in een 1 mL spuit (zonder naald) geladen. Een insnijding gemaakt onder de huid aan de dorsale zijde van een immuungecompromitteerde eGFP-uiten muizen (NOD. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl Tg(CAG-EGFP)1Osb/SzJ). Dit gemaakt een dorsale subcutane zakje waarin de SWAT-gekweekte adipocytes werden ingespoten met de spuit en de zak werd vervolgens ingehecht gesloten. Na 10 dagen na transplantatie, werden muizen opgeofferd. Transplantaties waren duidelijk zichtbaar en gemakkelijk hersteld (figuur 7a). Zowel de herstelde transplantatie en een muis contralaterale vet depot werden vastgesteld, paraffine ingesloten en gesegmenteerd. Immunohistochemistry werd uitgevoerd op de verdeelde dia's met primaire antilichamen tegen GFP (A10262, 1:100 verdunning) en menselijke PLIN (sc-390169, 1:100 verdunning). Het geselecteerde anti-PLIN antilichaam werd experimenteel gevalideerd om vlekken van menselijke PLIN maar geen muis. Adipocytes van de herstelde transplantatie in grootte, die het verwachte bereik voor menselijke adipocytes is ongeveer 50-120 µm en waren volkomen negatief voor GFP (figuur 7b). Ongeveer 31% van de adipocytes waren echter positief voor menselijke PLIN, met vermelding van de succesvolle engraftment in de gastheer. De adipocytes in de muis vet depots waren 20 – 40 µm, die strookt met de muis adipocytes, terwijl volledig positieve kleuring voor GFP en volledig negatieve voor menselijke PLIN (Figuur 7 c) formaat. ADSC bladen (met geen ingeklemd WAT) waren geschraapt uit cel cultuur gerechten en getransplanteerd in muizen als besturingselement. Echter, deze niet opbrengst elk herstelbaar weefsel (gegevens niet worden weergegeven). Hieruit bleek dat de herstelde adipocytes van de volwassen gekweekte SWAT, en niet het resultaat van gedifferentieerde menselijke ADSCs waren.
Figuur 1: de SWAT methode. (een) schematische van SWAT tonen de overdracht van een blad van eGFP-geëtiketteerden ASC's van een weefselkweek pNIPAAm beklede schotel op een tweede, labelloze vel van ASC's geteeld op een standaard weefselkweek schotel. Gehakt, primaire menselijke WAT is ingeklemd tussen de 2 ASC's vellen. (b) fluorescentie microscopie demonstreren helderveld, GFP en samengevoegde kanalen voor een SWAT gemaakt door de techniek beschreven in (a). Schaal bar = 100 µm. (c) Digital foto van een vertegenwoordiger, 5 dagen oude SWAT gekweekt in een standaard 6-well-plate. De grote hoeveelheid WAT wordt stabiel vastgezet aan de bodem van de put. Figuur is uit Lau et al.gewijzigd. 11 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: SWAT op 8 weken in cultuur levensvatbaar blijft. Seriële helderveld imaging van één SWAT cluster meer dan 55 dagen toont geen morfologische veranderingen die consistent is met de dood van de cel. Schaal bars = 100 µm. figuur is aangepast ten opzichte van Lau et al. 11 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: SWAT blijft levensvatbaar meer dan 50 dagen. (een) Nile rode kleuring toont kleuring SWAT gekweekt voor 15 dagen, die aangeeft live levensvatbare adipocytes beperking. Omringende stromale cellen heeft geen vlekken. Figuur staan 40 X vergroting, en schaal bar = 100 µm. (b) Propidium jodide (PI) kleuring voor SWAT gekweekt naar 53 dagen onthult vult PI uitsluiting, die aangeeft geen adipocyte dood; Schaal bar = 100 µm. (c) olie-Red-O kleuring van een 51 dagen oude SWAT toont beperking van neutrale lipiden aan de adipocytes, met vermelding van de stabiliteit op lange termijn van adipocyte celmembranen. Figuur is uit Lau et al.gewijzigd. 11 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: immunocytochemie toont aan dat SWAT positief voor volwassen adipocyte cel markeringen met verwachte localisatie vlekken. (een) Confocal Microscopie van 2 weken oude SWAT geopenbaard menselijke PLIN + unilocular cellen met localisatie aan lipide druppel oppervlakte. Schaal bar = 100 µm. (b) Fluorescent microscopie van 3 dagen oude SWAT geopenbaard menselijke FABP4 + cellen met localisatie naar het cytoplasma en (c) PPARγ + cellen met localization voor celkern. Schaal bar = 100 µm. figuur is aangepast ten opzichte van Lau et al. 11 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: SWAT onderhoudt belangrijke adipocyte identiteit genexpressie. SWAT clusters waren collagenase verteerd na 1, 14 en 28 dagen in cultuur en gen-expressie door RT-qPCR vastgesteld. RT-qPCR toont aan dat 1-dag-oud en 14 dagen oude SWAT behoud van hoge niveaus van (een) PPARG, (b) FABP, (c) HSL, (d) CbEBPA, (e) LPL en (f) ADIPOQ. ACTB diende als referentie gen. Foutbalken = standaardafwijking. Figuur wordt gewijzigd van Lau et al.. 11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: SWAT basally adipokines scheidt en beantwoordt fysiologisch catecholamine stimulatie. (een) ELISA kwantificering van 24u basale leptin secretie toont geen significante verandering na 28 dagen in cultuur. (b) Adrenergic stimulatie met epinefrine en forskolin genereert een significante glycolytic reactie in vers geoogste primaire WAT (1,7 x) en onderwerp-matched SWAT op 1 en 5 dagen in de cultuur. Dag 1 SWAT gereageerd op catecholamine prikkel met een verhoging van de 6.3-fold over basale glycolyse terwijl dag 5 SWAT aangetoond een verhoging van de 3.3-fold over basale glycolyse dat. Gestimuleerd glycolyse was niet significant verschillend in SWAT in vergelijking met gecompenseerde vers WAT (p = 0,53, n = 4). Foutbalken = standaardafwijking. Figuur is gemodificeerde Lau et al. 11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: SWAT kunnen bewaarfaciliteiten in vivo, demonstreren hele weefsel functie behouden. (een) SWAT was gemakkelijk gevisualiseerde 10 dagen na de transplantatie in een immuungecompromitteerde muis (sterretje). Had SWAT niet met succes geïmplanteerd, door 10 dagen zou het necrotische SWAT hebben is vloeibaar. (b) secties voor herstelde SWAT aangetoond grote, unilocular adipocytes (diameter 50 tot 120 µm) die eGFP waren-. 31.3% van de adipocytes waren menselijke PLIN +. De menselijke PLIN + adipocytes doorgaans kleiner, die zou passen bij de klinische waarnemingen vet enten bij mensen waar kleinere adipocytes hebben meer kans om te overleven van de overdracht. Schaal bar = 100 µm, 200 X vergroting. (c) contralaterale vet pads overgenomen uit de dezelfde muizen aangetoond dat veel kleiner adipocytes (20-40 µm) en waren menselijke PLIN-. Schaal bar = 100 µm, 200 X vergroting. Figuur is van Lau et al. gewijzigd 11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol gegevens het gebruik van ADSCs om sandwich menselijke witte adipeus weefsel; menselijke ADSC cellijnen kunnen worden geïsoleerd via gevestigde protocollen15. Het systeem kan echter aangepast voor geïndividualiseerde onderzoek eisen (zoals het gebruik van sandwich muis WAT cellen 3T3L-1). Dit proces omvat de behandeling van primaire menselijk weefsel. Standaard voorzorgsmaatregelen moeten worden gebruikt; omgaan met menselijke weefsels als BSL-2 pathogenen (bijvoorbeeld HIV, HepC). Alleen behandelen weefsel direct onder een BSC. Alle passende PPE dragen zoals gedicteerd door institutionele veiligheidsnormen — dubbele handschoenen zijn sterk aanbevolen. Goed ontsmetten alle leveringen en afval met 10% bleekwater oplossing of 70% ethanol oplossing voor hergebruik of verwijdering.
De eerste kritieke stap in SWAT cultuur is aanschaf en het onderhoud van weefselkweek pNIPAAm beklede platen. Dergelijke platen commercieel beschikbaar zijn, of ze kunnen worden geproduceerd door middel van gevestigde methoden12,13,14. Deze platen zijn temperatuur-responsief cel cultuur oppervlakken. Boven de kritische temperatuur (~ 32 ° C), het oppervlak is hydrofoob en cellen zal houden, vergelijkbaar met andere behandelde kunststoffen voor weefselkweek. Echter, kritische temperatuur, het oppervlak wordt hydrofiele en de cellen zal distantiëren van de kunststof oppervlak16. As a result, moet worden gezorgd om vast te stellen: 1) hoe snel een bepaald celtype zal distantiëren van de enkelgelaagde vóór het bereiken van volledige confluentie (dat wil zeggen, tijdens normale media wijzigingen) en 2) de nodige tijd voor het verlagen van de temperatuur met de gelatine stoter toegepast op de pNIPPAm beklede plaat, om ervoor te zorgen dat de gehele cellaag distantieert. Wijzigingen van de media moeten worden uitgevoerd met media opgewarmd tot 37 ° C; Als cellen gevoelig voor snelle dissociatie zijn, voert u media wijzigingen op een warmte blok ingesteld op 37 ° C onder de BSC.
De tweede cruciale stap is de verwerking van het vetweefsel voor SWAT zaaien te bereiden. We onze karakterisering uitgevoerd door WAT hakken met gesteriliseerde pincet en gesteriliseerde scheerapparaten. Menselijke fascia niet kan echter gemakkelijk worden gesneden met een scheermes. Maximaliseren van de adipocyte-naar-fascia-verhouding is belangrijk om zo veel vetweefsel binnen SWAT mogelijk behouden gedurende een lange periode. Grote stukken van intact fascia voorkomt cel contact tussen de ADSCs en de adipocytes, die is essentieel voor het houden van SWAT samen. Grote hoeveelheden fascia kunnen ook een "trekken op een draad" effect hebben. Overwegende dat de één WAT cluster kunt distantiëren van een plaat zonder de naburige clusters, kunnen meerdere clusters verbonden door fascia trekken genoeg clusters uit een enkelgelaagde aan een SWAT goed onbruikbaar te maken. Liposuctie, waarbij de gemechaniseerde hakken van WAT, kan dit probleem omzeilen als fascia is fijngehakt tijdens de operatie. Echter tijdens de liposuctie, patiënten routinematig behandeld met hoge doses van epinefrine; de mogelijke gevolgen van deze behandeling op het weefsel (en latere experimenten) moeten administratief worden verwerkt tijdens een studie.
De laatste kritieke stap in SWAT cultuur is het selecteren van een experimentele voedingsbodems. We onze eerste karakterisering experimenten met behulp van een standaard cel cultuur formulering uitgevoerd (10% FBS, 1 x penicilline/streptomycine in DMEM). Echter, gebaseerd op beschikbare literatuur met betrekking tot het maximaliseren van adipocyte transcriptie, gebruikten we een gespecialiseerde formulering (7 µM insuline, 30 µM dexamethason, 1 x penicilline/streptomycine in M199 media)17. Deze formulering verbeterd de vroege niveaus van transcriptie, maar niveaus daalde na verloop van tijd. Wij geloven dat dit omdat in het lichaam, adipocytes worden blootgesteld aan een breed scala aan chemische signalen, vaak tussen de fed en uitgehongerd Staten in de loop van een dag fietsen. Aldus, moet het mogelijk zijn om de waargenomen transcriptionele profiel na verloop van tijd door het verder optimaliseren van de aanvullingen op onze cel-cultuur-media.
SWAT oogst (Protocol, sectie 5) isoleert adipocytes van de cultuur, vermindert het monstervolume en storing verwijderd in de omliggende ADSC bladen. Dit kan voorafgaan aan de homogenisering van de adipocyte (die nodig is voor isolatie van de eiwit- of nucleïnezuur) of functionele testen van intact adipocytes (zoals glycolyse of glucose opname testen). Als alternatief, de intact SWAT plaat kan worden geoogst voor immunocytochemische kleuring, waardoor de ADSC bladen om de WAT clusters aan de enkelgelaagde gedurende de kleuring proces veilig te stellen. In dit geval de voedingsbodems gecombineerd en monteren van de hele cultuur via standaardprotocollen. Wij raden echter aan een glas dekglaasje aan toe te voegen voordat de imaging afvlakken van de 3D adipocyte clusters en verbetering van de kwaliteit van de resulterende afbeelding.
Wij geloven dat SWAT heeft groot potentieel als een drug screening platform. De techniek is eenvoudig, reproduceerbare en maakt gebruik van conventionele weefselkweek platen. Daarom zijn drug screening experimenten uitvoerbaar door het toevoegen van een farmacologisch werkzame stof aan het kweekmedium. Adipocytes kunnen dan worden geoogst om te onderzoeken van het effect van de compound op genexpressie epigenetische profiel, insulinegevoeligheid, etc. die de toevoeging van milieu-toxines aan kweekmedium kan ook worden gebruikt om te onderzoeken op hun effecten op adipocytes. SWAT kunnen de onderzoeker voor het bijhouden van de individuele adipocyte clusters na verloop van tijd, is het uniek geschikt om te evalueren van een behandeling die een zichtbare fenotypische wijziging in de adipocytes aanbrengt. Een prominent voorbeeld zou menselijke adipocyte "browning", waarin een witte, lipide-storing adipocyte "bruin" of soortgelijk aan een thermogene, multilocular bruine adipocyte18wordt. Dit is een verschijnsel van potentieel grote klinische relevantie dat is aangetoond in muismodellen, maar nooit in een mens. Co gekweekte variaties op SWAT houdt ook enorme onderzoek potentiële. SWAT is een natuurlijke co cultuur-systeem dat gebruik maakt van standaard cel cultuur wells. Daarom kan een de adipocytes onder andere klinisch relevante celtypes handhaven door de sandwiching cellen te wijzigen of door gebruik te maken van weefselkweek membraan inzetstukken. Bijvoorbeeld, kon de hepatocyten functioneren als de bovenste sandwiching cellaag om het scherm van een medicament dat via de lever wordt gefilterd alvorens het vetweefsel. Ook kunnen kankercellen worden gegroeid op een membraan invoegen SWAT te onderzoeken hoe de adipocytes bijdragen tot kanker pathologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs wil erkennen de institutionele steun van LSU Health Sciences Center, dat het project gefinancierd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x HBSS | Thermofisher | 14185052 | |
| Gelatin | Sigma-aldrich | G9391 | |
| Collagenase | Sigma-aldrich | C5138 | |
| Adenosine | Sigma-aldrich | A9251 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995065 | |
| M199 Media | Thermofisher | 11043023 | Phenol red-free |
| 250 µm Mesh Filter | Pierce | 87791 | |
| 0.2 µm Syringe Filter | Celltreat | 229747 | |
| 5 mL Luer-Lok syringes | BD | 309646 | |
| Metal Washers | These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3 g | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heated Equipment | |||
| Incubated Orbital Shaker | VWR | 10020-988 | Samples should be pitched at 45° angle to facilitate collagenase digestion |
| Heat Block | Set to 37-40 °C and placed under Biosafety Cabinet | ||
| Water Bath | Set to ~75 °C | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Specialized Plastics | |||
| Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell | Nunc | 174902 or 174901 | These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: <6 cm for 6 cm dish, <3.5 cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6 cm dish, 5.1 g for 6-well plate |
| Plastic Plunger Apparatus | These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics |
References
- Cawley, J., Meyerhoefer, C. The medical costs of obesity: An instrumental variables approach. Journal of Health Economics. 31 (1), 219-230 (2012).
- Pi-Sunyer, X.
- Smith, U. Morphologic studies of human subcutaneous adipose tissue in vitro. Anatomical Record. 169 (1), 97-104 (1971).
- Sugihara, H., Yonemitsu, N., Miyabara, S., Yun, K. Primary cultures of unilocular fat cells: characteristics of growth in vitro and changes in differentiation properties. Differentiation. 31 (1), 42-49 (1986).
- Sugihara, H., Yonemitsu, N., Toda, S., Miyabara, S., Funatsumaru, S., Matsumoto, T. Unilocular fat cells in three-dimensional collagen gel matrix culture. The Journal of Lipid Research. 29, 691-697 (1988).
- Hazen, S. A., Rowe, W. A., Lynch, C. J. Monolayer cell culture of freshly isolated adipocytes using extracellular basement membrane components. The Journal of Lipid Research. 36, 868-875 (1995).
- Fried, S. K., Kral, J. G. Sex differences in regional distribution of fat cell size and lipoprotein lipase activity in morbidly obese patients. International Journal of Obesity. 11 (2), 129-140 (1987).
- Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. The National Institutes of Health. Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline. Stem Cell Research and Therapy. 4, (2013).
- Wikswo, J. P. The relevance and potential roles of microphysiological systems in biology and medicine. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1061-1072 (2014).
- National Institutes of Health. NIH-CASIS Coordinated Microphysiological Systems Program for Translational Research in Space (#RFA-TR-18-001). , Available from: https://grants.nih.gov/grants/guide/rfa-files/RFA-TR-18-001.html (2017).
- Lau, F. H., Vogel, K., Luckett, J. P., Hunt, M., Meyer, A., Rogers, C. L., Tessler, O., Dupin, C. L., St Hilaire, H., Islam, K. N., Frazier, T., Gimble, J. M., Scahill, S. Sandwiched White Adipose Tissue: A Microphysiological System of Primary Human Adipose Tissue. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (3), (2018).
- Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and 'smart' polymers. Radiation Physics and Chemistry. 76, 1409-1413 (2007).
- Lin, J. B., Isenberg, B. C., Shen, Y., Schorsch, K., Sazonova, O. V., Wong, J. Y. Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).
- Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets. Journal of Visualized Experiments. (92), e51044 (2014).
- Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
- Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control. Langmuir. 20 (13), 5506-5511 (2004).
- Fried, S. K., Russell, C. D., Grauso, N. L., Brolin, R. E. Lipoprotein lipase regulation by insulin and glucocorticoid in subcutaneous and omental adipose tissues of obese women and men. Journal of Clinical Investigation. 92 (5), 2191-2198 (1993).
- Keipert, S., Jastroch, M. Brite/beige fat and UCP1 - is it thermogenesis? Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (7), 1075-1082 (2014).
