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Behavior

Uma plataforma de Microphysiologic para gordura humana: imprensado tecido adiposo branco

Published: August 15, 2018 doi: 10.3791/57909
Automatic Translation
1, 2, 2, 2
1Department of Pharmacology, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Surgery, Louisiana State University Health Sciences Center

Summary

Tecido adiposo branco (WAT) tem deficiências críticas em seus modelos de cultura primária atual, dificultando o Desenvolvimento farmacológico e estudos metabólicos. Aqui, apresentamos um protocolo para produzir um sistema de microphysiological de tecido adiposo por WAT imprensar entre lençóis de células do estroma. Essa construção fornece uma plataforma estável e adaptável para a cultura primária de WAT.

Abstract

Tecido adiposo branco (WAT) desempenha um papel crucial na regulação da saúde peso e todos os dias. Ainda assim, existem limitações significativas para modelos de cultura primária disponíveis, os quais não conseguiram fielmente recapitular o microambiente adiposa ou estender a viabilidade WAT para além de duas semanas. A falta de um modelo de cultura primária confiável severamente impede investigação em WAT metabolismo e desenvolvimento de drogas. Para tal, utilizamos padrões do NIH de um sistema de microphysiologic para desenvolver uma nova plataforma para cultura primária de WAT chamada 'SWAT' (imprensada tecido adiposo branco). Superamos a flutuabilidade natural dos adipócitos por picada WAT aglomerados entre lençóis de células do estroma adiposo-derivado de imprensa. Nessa construção, WAT amostras são viáveis em oito semanas em cultura. SWAT mantém o ECM intacta, contatos de célula para célula e pressões físicas na vivo condições WAT; Além disso, a SWAT mantém um perfil transcricional forte, sensibilidade à sinalização química exógena e função do tecido inteiro. SWAT representa um método simples, reprodutível e eficaz de cultura primária de tecido adiposo. Potencialmente, é uma plataforma amplamente aplicável para pesquisa em fisiologia, fisiopatologia, metabolismo e desenvolvimento farmacêutico WAT.

Introduction

Tecido adiposo é o principal órgão de obesidade, que acarreta custos médicos anuais directos entre US $ 147 bilhões e US $ 210 bilhões nos E.U.1. O acúmulo de tecido adiposo contribui também para outras principais causas de morte, tais como doenças cardíacas, diabetes tipo II e certos tipos de câncer2. Modelos de cultura in vitro são essenciais para estudos metabólicos e desenvolvimento de drogas, mas modelos de pesquisa atual do tecido adiposo tem grandes deficiências. Adipócitos são frágeis, flutuante e células que não aderir ao plástico de cultura de células e, portanto, não podem ser cultivadas usando métodos de cultura de células convencional terminalmente diferenciadas. Desde a década de 1970, vários métodos têm sido utilizados em tentativas para superar esses obstáculos, incluindo a utilização de lamelas de vidro, teto cultura, cultura de suspensão e matrizes extracelulares3,4,5, 6 , 7. no entanto, esses métodos foram marcados por morte celular e o quê, e são usados tipicamente para não mais do que um período de duas semanas de estudo. Além disso, estes modelos não tente recapitular o microambiente adiposa nativo, como eles não mantêm o ECM intacta, as interações entre adipócitos e do estroma apoiar as células, nem as forças contráteis células exercem uns contra os outros em in vivo WAT.

Na ausência de um método de cultura de tecido adiposo primária padrão-ouro, pesquisa adiposa dependeu principalmente pre-adipócitos diferenciados (diffAds). DiffAds são multilocular, aderentes e metabolicamente ativas. Por outro lado, primários adipócitos brancos são unilocular, de e demonstram o metabolismo relativamente baixo. O fracasso dos modelos atuais de cultura de tecido adiposo para recapitular a fisiologia do tecido adiposo maduro saudável provavelmente é um fator importante na ausência de medicamentos aprovados pela FDA que destino diretamente adipócitos. Na verdade, a falta de fisiológica em vitro modelos de órgãos é um grande problema na maioria dos órgãos e doença.

Em seu papel de posição anunciando a criação de seu programa de sistemas de Microphysiological (MPS), o National Institutes of Health (NIH) informou que a taxa de sucesso de 2013 em todos os ensaios clínicos farmacêuticas humanas foi apenas 18% para a fase II e 50% para a fase III ensaios clínicos8. O programa MPS é projetado para atender diretamente a incapacidade da monocultura em vitro de fisiologia humana de modelo. O NIH define MPSs como sistemas de cultura compostos de humana primária ou células-tronco em multicelulares construções 3D que recapitular o funcionamento do órgão. Ao contrário dos modelos reducionistas de culturas celulares homogêneos, imortalizado, MPSs com precisão devem modelo celular, droga-célula, medicamentosas e interações de droga-órgão9. Ao contrário de métodos de cultura primária a curto prazo, padrões de NIH ditam sustentabilidade MPS durante 4 semanas em cultura8. Mais detalhes do programa MPS podem ser encontrados no RFAs (#RFA-TR-18-001)10 do NIH.

Nós desenvolvemos um simples, romance, adaptável, e barato MPS adiposa denominado "imprensado tecido adiposo branco" (SWAT)11. Superamos a flutuabilidade natural dos adipócitos por "imprensar" picado principal tecido adiposo entre lençóis de células do estroma adiposo-derivado (ADSCs) (Figura 1). A construção 3D resultante recapitula o contato célula-célula e o microambiente adiposa nativo cercando adipócitos maduros, com uma população de células de suporte natural dos adipócitos. SWAT foi validada por demonstrar a viabilidade de 8 semanas, resposta a sinalização exógenos, adipokine secreção e enxertia em um modelo animal.

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Protocol

Todas as tarefas foram realizadas em conformidade com os protocolos #8759 e #9189, aprovado pelo IRB escritório de LSUHSC-NO. Todo o trabalho animal foi realizado na adesão ao protocolo #3285 aprovado pelo Instituto IACUC no LSUHSC-n. º

1. semeadura de imprensa folhas de célula

Nota: Consulte a Figura 1.

  1. Sementes ADSCs em aproximadamente 80% de confluência em placas de cultura de tecidos (6 cm ou placas boas 6). Para cada poço da SWAT desejado, semente 1 cultura de tecido convencional bem e 1 poço de tamanho correspondente na placa de cultura de tecidos poly(N-isopropylacrylamide (pNIPAAm)-revestido plástico.
    Nota: Nesse sentido, uma placa de 6 da SWAT exigirá a propagação de células em uma placa de cultura de tecido padrão 6-bem (camada de base) e uma placa de cultura de tecido revestido pNIPAAm 6-poços (camada superior). Placas revestidas de pNIPAAm podem ser adquiridas comercialmente ou produziram em laboratório12,13,14.
  2. Manter ADSCs em 37 ° C e 5% CO2 em de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) suplementado com 10% FBS e 1 x penicilina/estreptomicina. Mudar a mídia cada 2 dias.
  3. Permitir que as células a se aglutinar até que eles se tornam 100% confluente e assumem um padrão estriado (aproximadamente 6-8 dias).
    Nota: Estas células precisa funcionar como uma folha única célula intacta para estabilizar o tecido adiposo flutuante. Insuficientemente confluentes fragmentará após semeadura com WAT.

2. preparação da SWAT suprimentos

  1. Preparar várias alíquotas de 10 mL de 1 x Hank está equilibrado sal solução (HBSS); Prepare o suficiente para o número desejado de placas com volume de sobra.
  2. Prepare o aparelho atuador para a propagação da SWAT. Construa o êmbolo usando plástico acrílico simples, composto de uma haste anexada a um disco redondo. Certifique-se de que ele se encaixa dentro da circunferência dos poços de cultura de tecidos (diâmetro: < 6cm para prato de 6cm, < 3,5 cm para placa de 6; massa aproximada: 6,7 g para um prato de 6cm, 5,1 g para uma placa de 6).
    1. Prepare os êmbolos extras para garantir que o procedimento será executado sem problemas no caso que há um problema com qualquer atuador individual.
    2. Enrole a fita de laboratório ao redor da borda do disco atuador, pelo menos 2x, para evitar o vazamento da solução de gelatina.
    3. Pulverizar um gabinete de segurança biológica (CSB) com 70% EtOH. Uma mangueirada um rack de tubo cônico de 15 mL dentro do BSC com tubos de 15ml vazias, sem tampa cónica; tubos ajudará a garantir o posicionamento dos êmbolos a gelatina.
    4. Pulverize cada êmbolo enrolado com fita cuidadosamente com 70% EtOH e coloque em um tubo cônico de 15mL na prateleira. Spray-anilhas metálicas (6,3 g de massa aproximada) e colocá-los na prateleira junto com um par de pinças adunco; as anilhas irão adicionar peso para os êmbolos durante a semeadura da SWAT.
    5. Feche a janela BSC e ligue o UV, luz para facilitar a secagem e a esterilização.
      Nota: O ideal realizar esta etapa 24 h antes da semeadura da SWAT. Alternativamente, conduzir o processo no dia do tecido coleção/SWAT de semeadura; no entanto, neste caso, permita 15-45 min para UV secagem/esterilização.

3. preparação da gelatina êmbolos — aplicativo para celular superior folhas

  1. Aqueça um banho de água a 75 ° C.
  2. Prepare a solução de gelatina, adicionando 0,75 g de pó de gelatina para 10 mL caldo de 1 x HBSS. Sob uma coifa Adicione 100 µ l de 1 M NaOH para equilibrar o pH da solução.
    1. Adicionar os estoques de 10 mL para o banho de água e agitar vigorosamente a cada 5 min até que o pó se dissolve na solução. Objectivo de dissolver a gelatina em pó logo após a adição no banho de água aquecida.
    2. Ligue o ventilador BSC, apague a luz UV e aumentar a faixa. Borrife a superfície BSC e preparar o filtro de suprimentos (seringas de 5ml luer-lock e filtros de seringa 0,2 µm). Prepare vários filtros de forma eficiente tensão volumes suficientes de gelatina para aplicar a êmbolos.
  3. Quando a solução de gelatina atinge uma consistência homogênea, filtrar a solução e aplicá-lo para o desentupidor. Carrega a seringa com gelatina. Aplicar a gelatina para os plásticos êmbolos através do filtro de seringa (~2.5 mL para uma placa de 6, ~4.5 mL para um prato de 6 cm) e deixar para solidificar (~ 20 min).
  4. Uma vez que a gelatina é sólida, Desembrulhe a fita da borda dos êmbolos. Com gancho pinça, retire a gelatina da aresta exterior do êmbolo (ou seja, as bordas levantadas do menisco). Certifique-se de que a gelatina restante no centro do êmbolo está completamente nivelada para maximizar o contato com folha ADSC.
  5. Uma vez que a gelatina em excesso é removida, aplica suavemente os êmbolos de gelatina para as placas ADSC pNIPAAm revestidas. Use as anilhas de metal para pesar para baixo o êmbolo. Não ao cisalhamento folhas de célula, aplicando os êmbolos.
  6. Deixe os êmbolos sobre as folhas de célula para 1,5 h à temperatura ambiente. Incube em um banho de água gelada para 1,5 h completar a dissociação da camada de células da superfície da placa pNIPAAm-revestido de placas/êmbolos.
    1. Tenha cuidado ao mesmo tempo incubando no banho de gelo; Não permita que o banho de gelo para contaminar a mídia celular durante a incubação.
    2. Depois de completar a incubação, limpe a parte inferior das placas revestidas pNIPAAm para remover a água não estéril.

4. processamento de tecido adiposo de branco

  1. Quando coletar tecido adiposo humano da sala de cirurgia, manter todas as amostras em recipiente estéril que é no gelo até SWAT é para ser semeado. Adicione mídia estéril de manutenção, tais como fosfato-salino (PBS), ao recipiente de tecido adiposo para estabilidade do tecido.
  2. Adicione o meio de cultura celular de frio para tubos de microcentrifuga 1,5 mL para cada poço/prato para ser semeado (100 µ l para uma placa de 6, 200 µ l para um prato de 6 cm).
  3. Picar o tecido adiposo.
    1. Para segmentos de sólido tecido adiposo, proceda como a seguir.
      1. Lave a grandes segmentos do tecido adiposo 3 x em PBS estéril e remover tanto PBS quanto possível.
      2. Grosseiramente picar tecido com pinça e navalha estéril e remover tanto vasculatura e fáscia quanto possível (veja a discussão para mais detalhes).
      3. Picar finamente gordura com navalha até picado tecido assume consistência espessa, líquida.
        Nota: Idealmente tecido aparecerá homogêneo com nenhum segmentos individuais visíveis de WAT embora isso nem sempre é possível.
    2. Processo de lipoaspirate da seguinte forma.
      1. Sob o BSC, fita de gaze estéril por cima de um copo e colocar esse copo num copo maior para coletar qualquer excesso de líquido.
      2. Usando uma pipeta de 25 mL serológicos, desenhar tanto lipoaspirate conforme necessário e aplicá-lo à superfície de gaze estéril. Aplica o PBS diretamente para esta superfície para lavar lipoaspirated gordura e para remover o excesso de sangue e resíduo de lipídios.
      3. Use fórceps para recuperar tecido drenado, transferi-lo para uma superfície estéril de picagem e picar o lipoaspirate.
  4. Use uma lâmina estéril para cortar a extremidade distal de pontas de pipetas p1000 transferir tecido picado; Isto minimizará a tensão de cisalhamento que podem levar a lise do adipócito. Uma vez atingida uma consistência adequada de tecido transferi o volume desejado de tecido picado para cada tubo de 1,5 mL (300 – 400 µ l para a placa de 6, 500 – 600 µ l para o prato de 6 cm). Misture picada WAT e mídia brevemente nos tubos.
  5. Levar os pratos ADSC base e decantar/aspiração da mídia. Substitua a mídia com a mistura WAT/meios de comunicação de cada tubo de 1,5 mL.
    1. Delicadamente, retire os êmbolos de gelatina as chapas revestidas pNIPAAm e aplicá-las à mistura com as placas base do ADSC WAT. Examine a monocamada das placas revestidas pNIPAAm sob um microscópio para confirmar o desprendimento celular.
  6. Defina um bloco de calor para aproximadamente 37 – 40 ° C sob o BSC. Com o desentupidor ainda no lugar, mova as placas à superfície do bloco calor. Adicione 2-3 mL de meios de cultura aquecido para incubar as células e facilitar a gelatina derreter.
  7. Depois de ~ 30 min, retire com cuidado os êmbolos da superfície da placa. Substitua as tampas das placas de cultura de tecido de base e mover para uma incubadora de cultura celular. Uma vez que a gelatina tem completamente liquefeito a 37 ° C, Aspire e substituir os meios de cultura de células.
  8. Manter a SWAT a 37 ° C e 5% de CO2 em vermelho de fenol-livre o meio M199 com 7 insulina µM, 30 dexametasona µM, 1x penicilina/estreptomicina. Manter-se em aproximadamente 2 mL mídia para placas boas 6 e 3 mL para os pratos de 6 cm. Mudar a mídia cada 2 dias.

5. SWAT colheita

  1. Preparar a colagenase (colagenase 0,5 mg/mL, adenosina de 500 nM, em PBS) alíquotas em tubos cônico de 15 mL (volume aproximado de 10 mL). Congelar os tubos e armazená-los a-20 ° C.
  2. Aspirar a qualquer meio de cultura de células, lavar 1x com PBS e depois Aspire PBS. Prepare as alíquotas de colagenase por-los descongelar em banho maria a 37 ° C.
    Nota: Idealmente, a solução de colagenase chegará a 37 ° C; imediatamente a seguir, adicione o tecido.
  3. Adicione todo o tecido da placa da SWAT para as alíquotas individuais. Colheita da SWAT usando uma scrapper célula estéril e transferi-lo para as alíquotas de colagenase com uma ponta de pipeta p1000 Cut-off. Adicione o tecido diretamente para os tubos cônico de 15 mL contendo solução de colagenase.
    1. Alternativamente, incubar a mistura de tecidos/colagenase em um tubo cónico de 50 mL; a maior área de superfície mais facilitará a digestão enzimática.
  4. Coloque os tubos de amostra em um agitador orbital incubado em um ângulo de 45°. Incube a 200 rpm, a 37 ° C por 30 a 60 min.
  5. Lugar uma 250 µm filtro de malha em um novo tubo cônico de 15 mL para coleção. Despeje a solução digerida dos adipócitos através do filtro.
    Nota: Isto permitirá que todas as células a passagem durante a filtragem de tecido fibroso.
  6. Permita a passagem sentar-se durante 5 min à temperatura ambiente para permitir a separação de fases.
    Nota: Os adipócitos irão flutuar para o topo da solução enquanto as células do estroma adiposas (ASCs) vão resolver para as fases mais baixas. Centrifugação por 5 min a 500 x g também pode maximizar a separação da pilha ou colheita em torno ADSCs em pelota.
  7. Usando uma ponta de pipeta corte p1000, transferi os adipócitos (a camada flutuante no topo da solução de colagenase) para um tubo de coleta de microcentrifuga de 1,5 mL. Tendo ~ 250 µ l de cada vez, pipete lentamente ao longo da borda do tubo para coletar os adipócitos.
    1. Gire o tubo lentamente enquanto coleta os adipócitos para maximizar a recuperação de células aderindo ao interior. Mantenha mais células de desenho até que o tubo de 1,5 mL microcentrifuga está cheio.
  8. Remova o excesso de líquido os adipócitos isolados, usando uma seringa anexada a uma agulha (~ 21). Submergi a agulha sob a camada flutuante do adipócito. Agitar a agulha brevemente para desalojar qualquer células aderindo ao eixo da agulha e depois esperar que os adipócitos desalojados a flutuar para o topo.
  9. Desenhe lentamente o líquido em excesso, tomando cuidado para evitar a remoção involuntária dos adipócitos. Use microcentrifuga graduações de tubo para isolar consistentemente volumes de amostra (por exemplo,. 0,1 mL para cada amostra).
  10. Use as células isoladas para extração de DNA/RNA, ensaio de Lipólise, ensaio de absorção de glicose, etc.

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Representative Results

Viabilidade da SWAT foi inicialmente avaliada por serial brightfield imagem de clusters individuais de WAT (n = 12) aproximadamente 7,6 semanas. Clusters de permaneceram seguras no lugar sobre a monocamada durante todo este tempo. Ligeiras alterações morfológicas foram observadas com adipócitos individuais entortar ligeiramente ou trocando de posição. No entanto, adipócitos nem tornar-se multilocular ao longo do tempo, indicando uma falta de quê, nem fizeram eles apresentam sinais visíveis de morte celular como celular blebbing, Lise ou fragmentação (Figura 2). Identidade dos adipócitos de clusters foi confirmada em duas semanas SWAT com mancha de lipídios Nilo vermelho (NR). Clara NR coloração de clusters adipócito unilocular indicado que estes eram na verdade adipócitos com membranas intactas, ao invés de artefato, cistos ou adipócitos mortos. A ausência de NR coloração nas folhas ADSC circundantes indica que estas células não são acumular lipídios e, portanto, não diferenciando no sentido de uma linhagem de adipogenic próprios (Figura 3a). Coloração de iodeto de propidium realizou-se em 53 dias de idade SWAT. Exclusão da mancha dentro de clusters de adipócitos nos momentos avançados demonstra uma falta de morte celular (Figura 3b). Mancha de óleo-vermelho-O (ORO) realizou-se em 51 SWAT do dia anterior com a mancha de lipídios localizando dentro dos clusters fixo dos adipócitos, indicando que a SWAT adipócitos mantenham viabilidade com adipócitos intactas, mesmo em momentos avançados (Figura 3C).

Imunocitoquímica (ICC) foi realizada para demonstrar a expressão da proteína esperada e localização dos marcadores dos adipócitos maduros dentro da SWAT. Placas SWAT intactas foram coradas com anticorpos contra o perilipin (ab3526, diluição de 1: 200), PPARγ2 (sc-166731, diluição 1: 100) e FABP4 (ab92501, 1:1,000 de diluição). Imagens confocal de 12 dias de idade SWAT demonstraram localização esperada de perilipin em torno da superfície de gotículas lipídicas (figura 4a). Microscopia de fluorescência de 3 dias de idade SWAT com a mancha de contador de lipídios BODIPY demonstrou FABP4 localização no citoplasma (figura 4b), e sobreposição de sinal do PPARG e DAPI coloração demonstrou a localização do PPARG para o núcleo ( Figura 4 c).

Perfil transcricional de SWAT foi avaliado em tecido semeado de múltiplos sujeitos (n = 4 doadores). Na coleção, uma parte do tecido adiposo foi usada para uma linha de base a extração do RNA (d0), enquanto o restante foi usado para placas SWAT de semente. Estas placas foram então colhidas em 24 h, dias 14 e 28 dias na cultura SWAT. Uma etapa quantitativa transcrição reversa cadeia da polimerase (RT-qPCR) foi realizada para determinar níveis de transcrição. Seis genes chave dos adipócitos foram examinados: PPARG, FABP4, LPL, CEBPA, HSL e ADIPOQ (Figura 5). ACTB foi usado como um controle interno e os níveis transcricionais foram expressos como uma porcentagem da expressão correspondente assunto de base (d0). Todos os genes demonstraram robusta transcrição em SWAT, embora os níveis a tendência para baixo ao longo do tempo. Acreditamos que observados perfis transcriptional poderiam ser melhoradas com mais otimização de mídia como elaboramos na seção de discussão.

Função endócrina basal foi avaliada sobre as culturas mesmas usadas para o perfil transcricional. Sobrenadante foi coletado de chapas de SWAT e os níveis de leptina foram medidos utilizando ensaio imunoenzimático (ELISA) (ab100581). SWAT exibido secreção de leptina basal nos dias 1, 14 e 28 (Figura 6a). Folhas ADSC mantiveram-se em paralelo com as placas da SWAT como um controle (ou seja, folhas ADSC sem imprensada WAT). Leptina secretada não podia ser detectada nesses controles (dados não mostrados).

Para determinar se o SWAT poderia manter capacidade para uma resposta inducible ao longo do tempo, foi examinada a lipólise (n = 4). Para avaliar a capacidade lipolítica inducible, uma porção de WAT recém coletado (d0) foi picada e adipócitos foram isolados enzimaticamente (semelhante ao SWAT colheita em protocolo seção 5), enquanto o resto foi usado para propagar as placas da SWAT. Adipócitos isolados foram incubados por 3 h a 37 ° C em 300 µ l de 2% ácido graxo livre albumina de soro bovino em HBSS com 100 µM forskolin, epinefrina de 1 µM ou buffer de controle. Níveis de glicerol na mídia coletado foi medido com reagente de glicerol livre. Então, SWAT foi colhida no dias 1 e 5 e lipolítica capacidade foram avaliados da mesma maneira. Estimulação química aumentou glicerol lançamento significativamente nos três momentos (Figura 6b): liberação de glicerol de adipócitos tratados foi aumentada em WAT d0 82 ± 46% (p = 0,01), 1-dia SWAT 577 ± 387% (p = 0,02) e cinco dias SWAT 348 ± 343% (p = 0.03). os níveis de glicerol em adipócitos estimulados eram muito semelhantes em todos os três momentos: primário WAT 5,2 ± 0,8, 1 dia SWAT 4,4 ± 1,9 e 5 dias SWAT 4,8 ± 1,8 µ g glicerol/mg proteína total. Níveis de glicerol média no controle (ou seja, lipólise basal) eram relativamente elevados em WAT recém coletado (d0) em comparação com células colhidas de SWAT. Isto pode ser devido ao aumento da pressão ao tecido WAT no d0 durante a excisão cirúrgica, transporte para o laboratório e picagem. No entanto, estas experiências não demonstram nenhuma diminuição na capacidade lipolítica em SWAT em 1 ou 5 dias, em comparação com o WAT recém coletado.

SWAT foi demonstrada ser capaz de transplante e recuperação em um modelo do rato (n = 4) como uma demonstração da função complexa, todo o tecido. É também que uma possível aplicação da plataforma deve um desejo do pesquisador de utilizar SWAT para manipular WAT em vitro antes de transplantar tecido em um modelo animal. SWAT foi cultivado por 10 dias e colhidas utilizando o protocolo padrão; adipócitos isolados de chapas de SWAT foram então carregados em uma seringa de 1 mL (sem agulha). Foi feita uma incisão sob a pele no lado dorsal de um ratos imunodeprimidos eGFP-expressando (assentimento. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl Tg(CAG-EGFP)1Osb/SzJ). Isto criou uma pequena bolsa subcutânea dorsal na qual os adipócitos SWAT-cultivadas foram injetados com a seringa e o bolso foi suturado então fechado. Após pós-transplante de 10 dias, os ratos foram sacrificados. Transplantes eram claramente visíveis e facilmente recuperaram (Figura 7a). Tanto o transplante recuperado e um depósito de gordura contralateral do mouse eram fixas, parafina incorporado e seccionado. Imuno-histoquímica foi realizada nos slides seccionados com anticorpos primários GFP (A10262, diluição de 1: 100) e PLIN humana (sc-390169, diluição de 1: 100). O anticorpo anti-PLIN selecionado foi validado experimentalmente para manchar PLIN humano mas não para o mouse. Adipócitos do transplante recuperado foram aproximadamente de 50 a 120 µm de tamanho, que é a escala prevista para adipócitos humanos, e foram completamente negativos para as boas práticas agrícolas (Figura 7b). No entanto, cerca de 31% dos adipócitos foram positivas para PLIN humana, indicando sucesso enxertia no hospedeiro. Os adipócitos em depósitos de gordura de rato foram dimensionados 20 – 40 µm, que é consistente com adipócitos de rato, enquanto mancha completamente positiva para as boas práticas agrícolas e completamente negativo para PLIN humana (Figura 7C). ADSC folhas (com nenhum imprensada WAT) foram raspadas de pratos de cultura celular e transplantadas em ratos como controle. No entanto, estas não deu qualquer tecido recuperável (dados não mostrados). Isto indicavam os adipócitos recuperados de maduro SWAT culta e não o resultado da ADSCs humanas diferenciadas.

Figure 1
Figura 1: método de SWAT o. (um) esquemático da SWAT mostrando a transferência de uma folha de ASCs eGFP-rotulada de cultura de tecido revestido pNIPAAm prato em uma folha de segunda, sem rótulo de ASCs cultivadas em um prato de cultura de tecido padrão. Picada, primário humano WAT é imprensada entre as 2 folhas de ASCs. (b), fluorescência microscopia demonstrando Brightfield, GFP e canais mescladas de uma SWAT criado pela técnica descrita na alínea a. Barra de escala = 100 µm. (c) Digital fotode um representante, 5 dias de idade SWAT cultivadas em uma placa padrão de 6. O grande volume de WAT estàvel é fixado no fundo do poço. A figura é modificada de Lau et al. 11 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: SWAT permanece viável em 8 semanas na cultura. Brightfield serial de imagem de um único cluster SWAT durante 55 dias não demonstra nenhuma alteração morfológica consistente com morte celular. Barras de escala = 100 µm. figura é modificado de Lau et al. 11 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: SWAT permanece viável no maior que 50 dias. (a) Nilo vermelho mancha demonstra coloração restrição à SWAT cultivada por 15 dias, indicando adipócitos viáveis ao vivo. Em torno de células do estroma não manchou. Figura são em 40 X de ampliação e a barra de escala = 100 µm. (b) Propidium iodeto (PI) coloração da SWAT cultivada por 53 dias revela completa exclusão do PI, não indicando nenhuma morte dos adipócitos; Barra de escala = 100 µm. (c), óleo-vermelho-O coloração de um 51 dias de idade SWAT demonstra restrição de lipídios neutros para os adipócitos, indicando estabilidade a longo prazo das membranas celulares dos adipócitos. A figura é modificada de Lau et al. 11 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: imunocitoquímica demonstra que a SWAT manchas positivamente para marcadores de célula dos adipócitos maduros com localização esperada. (um) Confocal microscopia de 2 semanas SWAT revelou PLIN + unilocular células humanas com localização à superfície de gotículas lipídicas. Barra de escala = 100 µm. (b) microscopia fluorescente de 3 dias de idade SWAT revelou FABP4 + células humanas com localização para os citoplasma e (c) PPARγ + células com localização ao núcleo da célula. Barra de escala = 100 µm. figura é modificado de Lau et al . 11 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: SWAT mantém a expressão de gene de identidade dos adipócitos chave. Clusters de SWAT foram colagenase digerido após 1, 14 e 28 dias na expressão de gene e cultura determinada por RT-qPCR. RT-qPCR demonstra que a SWAT 1 dias de idade e 14 dias de idade preservar elevados níveis de (um) PPARG, (b) FABP, (c), HSL, (d) CbEBPA, (e), LPL e (f), ADIPOQ. ACTB foi usado como gene de referência. Barras de erro = erro padrão. A figura é modificada de Lau et al. 11. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: SWAT basalmente segrega adipocinas e responde fisiologicamente à estimulação de catecolamina. (a) ELISA quantificação da secreção de leptina basal de 24 h não mostra nenhuma mudança significativa após 28 dias em cultura. (b) estimulação adrenérgica com epinefrina e forskolina gera uma resposta glicolítico significativa em recém-colhidas WAT primário (1.7 x) e assunto-combinadas da SWAT em 1 e 5 dias em cultura. Dia 1 SWAT respondeu ao estímulo de catecolamina, com um aumento de 6.3-fold sobre a glicólise basal enquanto dia 5 SWAT demonstrou um aumento de 3.3-fold sobre a glicólise basal. Glicólise estimulada não foi significativamente diferente em SWAT em relação ao correspondente fresca WAT (p = 0,53, n = 4). Barras de erro = erro padrão. A figura é modificado Lau et al 11. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: SWAT pode ser reimplantado em vivo, demonstrando todo tecido função preservada. (um) SWAT foi prontamente visualizados 10 dias após o transplante em um rato imunocomprometido (asterisco). SWAT não com êxito tinha implantado, por 10 dias a SWAT necrótico iria ter sido liquefeito. (b) seções da SWAT recuperada demonstraram grandes, unilocular adipócitos (diâmetros 50 a 120 µm) que eram eGFP-. 31,3% dos adipócitos foram humanos PLIN +. Os humano PLIN + adipócitos tendem a ser menores, que se encaixam com observações clínicas de enxerto de gordura em humanos onde adipócitos menores são mais propensos a sobreviver a transferência. Barra de escala = 100 µm, ampliação de X 200. (c) gordura Contralateral almofadas retiradas os ratos mesmos demonstraram adipócitos muito menores (20-40 µm) e eram humanos PLIN-. Barra de escala = 100 µm, ampliação de X 200. A figura é modificada de Lau et al . 11. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Este protocolo detalha o uso de ADSCs para sanduíche branco humana tecido adiposo; linhas de células humanas ADSC podem ser isoladas através de de protocolos bem estabelecidos15. No entanto, o sistema pode ser adaptado para as necessidades de pesquisa individualizada (como o uso de células de 3T3L-1 para mouse sanduíche WAT). Esse processo envolve manipulação de tecido humano primário. Precauções de segurança padrão devem ser empregadas; lidar com tecidos humanos como patógenos BSL-2 (por exemplo, HIV, VHC). Só lidar com tecido diretamente sob um BSC. Usar todos os EPI conforme ditado pelas normas de segurança institucional — luvas duplas são altamente recomendadas. Desinfectar adequadamente todos os fornecimentos e resíduos com 10% alvejante solução ou solução de etanol a 70% antes de re-utilização ou eliminação.

O primeiro passo crítico na cultura da SWAT é a aquisição e a manutenção de placas de cultura de tecidos revestidos pNIPAAm. Essas placas estão disponíveis comercialmente, ou eles podem ser produzidos através de métodos estabelecidos12,13,14. Estas placas são superfícies de cultura celular temperatura-responsivo. Acima da temperatura crítica (~ 32 ° C), a superfície é hidrofóbica e células irão aderir, semelhante a outros plásticos tratados para cultura de tecidos. No entanto, abaixo desta temperatura crítica, a superfície se torna hidrofílica e as células irão dissociar a superfície plástica16. As a Result, cuidado deve ser tomado para estabelecer: 1) quão rapidamente um tipo de determinada célula irá dissociar a monocamada antes de alcançar a plena confluência (ou seja, durante as mudanças de mídia normal) e 2) o tempo necessário para abaixar a temperatura com a gelatina atuador aplicado à placa pNIPPAm-revestido, para garantir que a folha toda a célula se dissocia. Alterações de mídia devem ser realizadas com mídia aquecida a 37 ° C; Se as células são propensas a dissociação rápida, execute alterações de mídia em um bloco de calor definido a 37 ° C sob o BSC.

A segunda etapa crítica está processando o tecido adiposo para se preparar para a propagação da SWAT. Realizamos nossa caracterização por picagem WAT com Pinças esterilizadas e lâminas de barbear esterilizadas. No entanto, fáscia humana não pode ser cortada facilmente com uma lâmina de barbear. Maximizar o rácio dos adipócitos-para-fáscia é importante guardar tanto tecido adiposo dentro da SWAT quanto possível ao longo de um período a longo prazo. Pedaços grandes de fáscia intacta impedirá contato celular entre o ADSCs e adipócitos, que é essencial para manter a SWAT juntos. Quantidades excessivas de fáscia também podem ter um efeito "puxando em um thread". Considerando que um único cluster WAT pode dissociar-se um prato sem afetar os clusters vizinhos, vários clusters ligados pela fáscia podem puxar bastante aglomerados fora um monolayer para processar uma SWAT bem inutilizável. Lipoaspiração, que envolve a picagem mecanizada de WAT, pode contornar este problema, como fáscia é finamente picada durante a cirurgia. No entanto, durante a lipoaspiração, pacientes são rotineiramente tratados com altas doses de adrenalina; as possíveis consequências deste tratamento sobre o tecido (e experiências subsequentes) devem ser contabilizadas durante um estudo.

A última etapa crítica na cultura SWAT está selecionando um media de cultura experimental. Realizamos nossos experimentos de caracterização inicial utilizando uma formulação de cultura de célula padrão (10% FBS, 1 x penicilina/estreptomicina em DMEM). No entanto, com base na literatura disponível sobre maximizando a transcrição dos adipócitos, usamos uma formulação especializada (7 insulina µM, 30 dexametasona µM, 1x penicilina/estreptomicina em mídia M199)17. Esta formulação melhorada os primeiros níveis de transcrição, mas níveis diminuiu ao longo do tempo. Acreditamos que isso é porque no corpo, os adipócitos são expostos a uma grande variedade de sinais químicos, muitas vezes ciclismo entre Estados esfomeados e alimentados ao longo de um dia. Assim, é possível melhorar o perfil transcricional observado ao longo do tempo, otimizando ainda mais os suplementos de nossos meios de cultura de células.

Colheita da SWAT (protocolo, seção 5) isola adipócitos da cultura, reduz o volume de amostra e remove a interferência dos lençóis ADSC circundantes. Isto pode preceder a homogeneização dos adipócitos (que é necessária para o isolamento de proteínas ou ácidos nucleicos), ou ensaios funcionais de intacta adipócitos (tais como ensaios de absorção de glicólise ou glicose). Alternativamente, a placa SWAT intacta pode ser colhida para coloração de immunocytochemical, que permite que as folhas ADSC fixar os clusters WAT para a monocamada durante todo o processo de coloração. Neste caso, os meios de cultura, Aspire e consertar toda a cultura através de protocolos padrão. No entanto, recomendamos a adição de uma lamela de vidro antes da imagem latente para achatar os clusters 3D dos adipócitos e melhorar a qualidade da imagem resultante.

Acreditamos que a SWAT tem grande potencial como uma plataforma de despistagem de drogas. A técnica é simples, reprodutíveis e utiliza placas de cultura de tecido convencional. Portanto, experiências de despistagem de drogas são executáveis, adicionando um composto farmacologicamente ativo para o meio de cultura. Adipócitos, em seguida, podem ser colhidos para examinar o efeito do composto na expressão gênica, perfil epigenético, sensibilidade à insulina, etc. , que a adição de toxinas ambientais ao meio de cultura da mesma forma pode ser usada para examinar seus efeitos nos adipócitos. Porque SWAT permite ao pesquisador controlar clusters de adipócitos individuais ao longo do tempo, ele é especialmente adequado para avaliar um tratamento que faz uma visível mudança fenotípica de adipócitos. Um exemplo proeminente seria humano adipócito "tostado", no qual torna-se um branco, armazenamento lipídico dos adipócitos "bronzeados" ou semelhantes a um termogênico, multilocular dos adipócitos marrons18. Este é um fenômeno de relevância clínica potencialmente importante que tem sido demonstrado em modelos do rato, mas nunca em um ser humano. Variações co cultivadas na SWAT também têm potencial de pesquisa tremenda. SWAT é um sistema de co-cultura natural que utiliza poços de cultura de célula padrão. Portanto, um pode manter os adipócitos entre outros tipos de células clinicamente relevantes, alterando as células imprensar ou utilizando pastilhas de membrana de cultura de tecidos. Por exemplo, os hepatócitos poderiam funcionar como superior imprensar camada de células para a tela uma droga que é filtrada através do fígado antes de atingir o tecido adiposo. Da mesma forma, as células cancerosas poderiam ser cultivadas em um membrana inserir sobre SWAT para examinar como adipócitos contribuem para a patologia do câncer.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Os autores gostaria de reconhecer o apoio institucional fornecido pelo centro de Ciências da saúde da LSU, que financiou o projeto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x HBSS Thermofisher 14185052
Gelatin Sigma-aldrich G9391
Collagenase Sigma-aldrich C5138
Adenosine Sigma-aldrich A9251
DMEM Thermofisher 11995065
M199 Media Thermofisher 11043023 Phenol red-free 
250 µm Mesh Filter Pierce 87791
0.2 µm Syringe Filter Celltreat 229747
5 mL Luer-Lok syringes  BD 309646
Metal Washers These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3 g 
Name Company Catalog Number Comments
Heated Equipment
Incubated Orbital Shaker VWR 10020-988 Samples should be pitched at 45° angle to facilitate collagenase digestion
Heat Block Set to 37-40 °C and placed under Biosafety Cabinet
Water Bath Set to ~75 °C
Name Company Catalog Number Comments
Specialized Plastics
Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell Nunc 174902  or 174901 These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: <6 cm for 6 cm dish, <3.5 cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6 cm dish, 5.1 g for 6-well plate
Plastic Plunger Apparatus These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics

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References

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Comportamento edição 138 tecido adiposo adipócitos obesidade microphysiological sistemas órgãos em fichas triagem de drogas desenvolvimento de drogas toxicidade ambiental cultura primária diabetes metabolismo
Uma plataforma de Microphysiologic para gordura humana: imprensado tecido adiposo branco
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Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. L., Lau, F. H. A Microphysiologic Platform for Human Fat: Sandwiched White Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (138), e57909, doi:10.3791/57909 (2018).

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