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Behavior

Eine Microphysiologic Plattform für menschliches Fett: weißen Fettgewebe eingeklemmt

Published: August 15, 2018 doi: 10.3791/57909
Automatic Translation
1, 2, 2, 2
1Department of Pharmacology, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Surgery, Louisiana State University Health Sciences Center

Summary

Weißen Fettgewebe (WAT) hat kritische Mängel in seiner aktuellen Primärkultur Modelle, pharmakologischen Entwicklung und metabolische Studien zu behindern. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine adipöse Microphysiological System durch sandwichartig WAT zwischen den Blättern der Stromazellen Zellen zu produzieren. Diese Konstruktion bietet eine stabile und flexible Plattform für WAT Primärkultur.

Abstract

Weißen Fettgewebe (WAT) spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Gesundheit Gewicht und jeden Tag. Dennoch gibt es erhebliche Einschränkungen verfügbar Primärkultur Modelle, die versäumt haben, treu der adipösen Mikroumgebung rekapitulieren oder WAT Lebensfähigkeit über zwei Wochen hinaus zu verlängern. Das Fehlen eines verlässlichen Primärkultur Modells behindert stark Forschung in WAT Stoffwechsel und Arzneimittelentwicklung. Zu diesem Zweck haben wir NIH Normen eines Microphysiologic-Systems zur Entwicklung einer neuartigen Plattform für WAT Primärkultur genannt "SWAT" (Sandwich weißen Fettgewebe) genutzt. Wir überwinden den natürlichen Auftrieb der Adipozyten durch sandwiching Hackfleisch / WAT Cluster zwischen den Blättern von Fettgewebe abgeleitet Stromazellen Zellen. In diesem Konstrukt sind WAT Proben tragfähige über acht Wochen in der Kultur. SWAT unterhält die intakte ECM, Zell-Zell Kontakte und physischen Druck der in Vivo WAT Bedingungen; Darüber hinaus unterhält SWAT eine robuste transkriptionelle Profil, Sensibilität für exogene chemische Signal- und ganze Gewebefunktion. SWAT stellt eine einfache, reproduzierbare und effektive Methode der adipösen Primärkultur. Möglicherweise ist es eine breit anwendbar Plattform für Forschung im WAT-Physiologie, Pathophysiologie, Stoffwechsel und pharmazeutischen Entwicklung.

Introduction

Fettgewebe ist das primäre Organ von Fettleibigkeit, die direkte jährlichen medizinische Kosten zwischen $ 147 Milliarden und $ 210 Milliarden in die US-1trägt. Die Ansammlung von Fettgewebe trägt auch zu anderen führenden Todesursachen wie Herz-Kreislauferkrankungen, Diabetes Typ II und bestimmte Arten von Krebs2. In-vitro- Kultur-Modelle sind essentiell für metabolische Studien und Entwicklung von Medikamenten, aber aktueller Forschungsmodelle von Fettgewebe haben erhebliche Mängel. Adipozyten sind zerbrechlich, lebhaft und unheilbar differenzierte Zellen, die Zelle Kultur Kunststoffe nicht halten, und daher können nicht gezüchtet werden mit konventionellen Zelle Kulturmethoden. Seit den 1970er Jahren wurden mehrere Methoden Versuche zur Überwindung dieser Hindernisse, einschließlich der Verwendung von extrazellulären Matrizen3,4,5, , Glasdeckgläser, Decke Kultur und SUSPENSIONSKULTUR 6 , 7. jedoch diese Methoden durch Zelltod und Entdifferenzierung markiert wurden, und sie sind in der Regel für nicht mehr als einen zweiwöchigen Studienaufenthalt verwendet. Darüber hinaus versuchen diese Modelle nicht die native adipösen Mikroumgebung zu rekapitulieren, wie sie nicht intakte ECM pflegen, die Interaktionen zwischen Adipozyten und Stromazellen Zellen unterstützen, noch die kontraktilen Kräften Zellen auf einander in in-vivo ausüben WAT.

In Ermangelung einer adipösen Primärkultur Goldstandard Methode hat adipösen Forschung in erster Linie auf differenzierte Pre Adipozyten (DiffAds) verlassen. DiffAds sind multilocular, Anhänger und metabolisch aktiv. Im Gegensatz dazu primäre weiße Fettzellen sind unilokuläre, nonadherent und relativ niedrigen Stoffwechsel zu demonstrieren. Das Versagen der aktuellen adipösen Kultur Modelle zu rekapitulieren die Physiologie des gesunden Reifen Fettgewebe ist wahrscheinlich ein wichtiger Faktor in der Abwesenheit von FDA-zugelassene Medikamente, die Fettzellen gezielt ansprechen. In der Tat ist das Fehlen der physiologischen in-vitro- Orgel-Modelle ein großes Problem in den meisten Organen und Krankheiten.

In seiner Positionspapier über die Erstellung des Programms Microphysiological Systeme (MPS) berichtet der National Institute of Health (NIH), dass die 2013 Erfolgsquote über alle klinischen Studien am Menschen pharmazeutischen nur 18 % für Phase II und Phase III 50 war % klinische Studien-8. Das MPS-Programm soll die Unfähigkeit der in-vitro- Monokultur, Modell Humanphysiologie direkt anzusprechen. Die NIH definiert MPSs als Kultur-Systeme bestehend aus menschlichen Grund- oder Stammzellen in mehrzelligen 3D Konstrukte, die Orgel funktionieren rekapitulieren. Im Gegensatz zu reduktionistische Modelle von homogenen, verewigt Zellkulturen sollten MPSs genau modellieren, Zell-Zell, Droge-Zelle, Medikamenten und Orgel-medikamentöse Interaktionen9. Im Gegensatz zu kurzfristigen Primärkultur Methoden diktieren NIH Standards MPS Nachhaltigkeit mehr als 4 Wochen in Kultur8. Weitere Einzelheiten zu den MPS-Programm finden Sie auf der NIH RFAs (#RFA-TR-18-001)10.

Haben wir einen einfachen, Roman, anpassungsfähig, und preiswerte adipösen MPS bezeichnet "weißen Fettgewebe eingeklemmt" (SWAT)11. Wir überwinden den natürlichen Auftrieb der Adipozyten durch "sandwichartig" Hackfleisch / primäre Fettgewebe zwischen den Blättern von Fettgewebe abgeleitet Stromazellen Zellen (ADSCs) (Abbildung 1). Die daraus resultierenden 3D Konstrukt rekapituliert der Zell-Zell-Kontakt und der native adipösen Mikroumgebung von umliegenden Reifen Adipozyten mit einer natürlichen Adipocyte Unterstützung Zellpopulation. SWAT ist durch den Nachweis von 8 Wochen Lebensfähigkeit, Reaktion auf exogene Signalisierung, Adipokine Sekretion und Engraftment in einem Tiermodell validiert worden.

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Protocol

Alle Aufgaben wurden in Einhaltung der Protokolle #8759 "und" #9189 durchgeführt, wie von der IRB Office LSUHSC-NO. genehmigt Alle tierische Arbeit erfolgte unter Einhaltung Protokoll #3285 genehmigt vom Büro IACUC in LSUHSC-Nr.

(1) Aussaat von Sandwiching Zelle Blätter

Hinweis: Siehe Abbildung 1.

  1. Samen ADSCs bei ca. 80 % Konfluenz in Gewebekultur Platten (6 cm oder 6-Well Platten). Für jede Vertiefung von SWAT gewünscht, Saatgut, 1 konventionelle Gewebekultur gut und 1 gut von entsprechender Größe auf Poly(N-isopropylacrylamide (pNIPAAm)-beschichtete Gewebe-Kultur Kunststoffplatte.
    Anmerkung: Entsprechend, eine 6-Well-Platte von SWAT benötigen Aussaat Zellen auf einer standard 6-Well Gewebekultur Platte (Grundschicht) und einer Gewebekultur 6-gut pNIPAAm-beschichtete Platte (obere Schicht). pNIPAAm-beschichteten Platten können im Handel gekauft werden oder im Labor12,13,14hergestellt.
  2. Pflegen ADSCs bei 37 ° C und 5 % CO2 in Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 10 % FBS und 1 x Penicillin/Streptomycin. Wechseln Sie Medium alle 2 Tage.
  3. Zellen zu verschmelzen, bis sie 100 % Zusammenfluss und auf einem gekerbten Muster (ca. 6 – 8 Tage nehmen) zu ermöglichen.
    Hinweis: Diese Zellen müssen als einzige intakte Zelle Plan funktionieren, um das lebhafte Fettgewebe zu stabilisieren. Nur unzureichend konfluierende Zellen werden bei der Aussaat mit WAT fragment.

2. Vorbereitung des SWAT-Lieferungen

  1. Bereiten Sie mehrere Aliquote in 10 mL von 1 X Hank ausgewogen Salz Lösung (HBSS); bereiten Sie genug für die gewünschte Anzahl von Platten mit Volumen zu ersparen.
  2. Bereiten Sie den Kolben-Apparat für die Aussaat von SWAT. Konstruieren Sie den Kolben mit einfachen Acryl Kunststoffe, bestehend aus einem Stiel, eine runde Scheibe befestigt. Stellen Sie sicher, dass es in den Umfang der Gewebekultur Brunnen passt (Durchmesser: < 6 cm 6 cm Schüssel < 3,5 cm für 6-Well-Platte; ungefähre Masse: 6,7 g für eine 6 cm Schüssel, 5,1 g für eine 6-Well-Platte).
    1. Bereiten Sie zusätzliche Kolben um sicherzustellen, dass das Verfahren einen reibungslosen Ablauf im Fall, dass es ein Problem mit jedem einzelnen Kolben.
    2. Wickeln Sie Lab-Band rund um den Rand der Kolben-Platte, mindestens 2 X, Auslaufen von Gelatine-Lösung zu verhindern.
    3. Sprühen Sie ein Biosafety-Kabinett (BSC) mit 70 % EtOH. Sprühen Sie unten eine 15 mL konische Rohr Gestell innerhalb der BSC mit leeren, unbeschränkt 15 mL konische Röhrchen; Röhren werden dazu beitragen, die Platzierung der Gelatine Kolben zu sichern.
    4. Sprühen Sie jedes Klebeband umwickelt Kolben gründlich mit 70 % EtOH und Ort in ein 15mL konische Röhrchen auf dem Gestell. Sprühen Sie Metallscheiben (ungefähre Masse 6,3 g) und legen Sie sie auf das Gestell zusammen mit ein paar Haken Zange; die Unterlegscheiben werden die Kolben in SWAT Aussaat Gewicht hinzufügen.
    5. Schließen Sie die BSC-Schärpe und biegen Sie auf die UV-Licht, Trocknung und Sterilisation zu erleichtern.
      Hinweis: Im Idealfall führen Sie diesen Schritt 24 h vor der Aussaat SWAT. Alternativ führen Sie den Prozess am Tag der Gewebe Sammlung/SWAT Aussaat; in diesem Fall können Sie jedoch 15 – 45 min für die UV-Trocknung/Sterilisation.

3. Vorbereitung der Gelatine Kolben-Anwendung zur oberen Zelle Blätter

  1. Ein Wasserbad auf 75 ° c erhitzen
  2. Bereiten Sie die Gelatinelösung durch Zugabe von 0,75 g Gelatine-Pulver, 10 mL Brühe von 1 X HBSS. Fügen Sie unter einer Abzugshaube 100 µL 1 M NaOH, der pH-Wert der Lösung auszugleichen.
    1. Das Wasserbad fügen Sie 10 mL Aktien hinzu und schütteln Sie kräftig alle 5 min, bis sich das Pulver aufgelöst in Lösung. Die pulverisierte Gelatine auflösen, bald nach dem beheizten Wasserbad hinzufügen wollen.
    2. Das BSC-Gebläse schalten Sie, schalten Sie das UV-Licht und erhöhen Sie Flügel zu. Besprühen Sie die Oberfläche der BSC und bereiten Sie den Filter Lieferungen (5 mL Luer-Lock Spritzen und 0,2 µm Spritze Filter). Bereiten Sie mehrere Filter effizient Belastung ausreichende Mengen an Gelatine Kolben zuweisen.
  3. Wenn die Gelatine-Lösung eine homogene Konsistenz erreicht, Filtern Sie die Lösung und wenden Sie es auf den Kolben. Laden Sie die Spritze mit der Gelatine. Wenden Sie die Gelatine auf die Kunststoff Kolben durch die Spritze-Filter (~2.5 mL für eine 6-Well-Platte, ~4.5 mL für eine 6 cm Schüssel an) und lassen Sie (~ 20 min) zu festigen.
  4. Sobald die Gelatine fest ist, packen Sie das Klebeband von der Kante der Kolben. Mit der gebogenen Pinzette entfernen die Gelatine vom äußeren Rand des Kolbens (d. h. die hochgezogenen Kanten des Meniskus). Sicherzustellen, dass die restlichen Gelatine in der Mitte des Kolbens völlig eben ist, Kontakt mit ADSC Blatt zu maximieren.
  5. Nach dem entfernen überschüssige Gelatine tragen Sie sanft die Gelatine-Kolben an den pNIPAAm-beschichtete ADSC-Platten auf. Verwenden Sie die Metallscheiben, die Kolben Wiegen. Scheren Sie Zelle Blätter nicht während der Anwendung der Kolben.
  6. Lassen Sie die Kolben auf die Zelle Datenblätter für 1,5 h bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie Platten/Kolben in ein Eis-Wasserbad für 1,5 h Dissoziation der Zelle Blatt aus der pNIPAAm-beschichtete Plattenoberfläche abschließen.
    1. Seien Sie vorsichtig, während der Inkubation in das Eisbad; lassen Sie sich nicht das Eisbad um die Zelle Medien während der Inkubation zu verunreinigen.
    2. Reinigen Sie nach Abschluss der Inkubation die Unterseite der pNIPAAm-beschichtete Platten, unsteril Wasser zu entfernen.

(4) weißen Fettgewebe Verarbeitung

  1. Beim Sammeln von menschlichen Fettgewebe aus dem OP zu halten alle Proben in einen sterilen Behälter, die auf Eis bis SWAT ist gesät werden. Fettgewebe Container für Gewebestabilität sterile Wartung Medien wie Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), hinzufügen.
  2. Fügen Sie kalt Zellkulturmedium, 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen für jedes gut/Gericht sein ausgesät (100 µL für eine 6-Well-Platte, 200 µL für eine 6 cm Schüssel).
  3. Zerkleinere das Fettgewebe.
    1. Gehen Sie für feste Fettgewebe Segmente wie folgt vor.
      1. Waschen Sie große Teile des Fettgewebes 3 X in sterilen PBS und soviel PBS wie möglich zu entfernen.
      2. Grob hacken Gewebe mit Zange und sterilen Rasierklinge und soviel Gefäßsystem und Faszie wie möglich zu entfernen (siehe Diskussion für mehr Detail).
      3. Hacken Sie fein Fett mit Rasiermesser bis Hackfleisch / Gewebe dick, flüssige Konsistenz annimmt.
        Hinweis: Im Idealfall Gewebe homogen mit keine sichtbaren einzelne Segmente des WAT erscheint obwohl dies nicht immer möglich ist.
    2. Lipoaspirate wie folgt zu verarbeiten.
      1. Unter der BSC sterilen Gaze über den oberen Rand ein Becherglas mit Klebeband und stellen diese Becher in ein größeres Becherglas, überschüssige Flüssigkeit zu sammeln.
      2. Mit einer serologischen 25-mL-Pipette, so viel Lipoaspirate nach Bedarf zu zeichnen und auf die Oberfläche der sterile Gaze auftragen. Gelten Sie PBS direkt an dieser Oberfläche, Lipoaspirated Fett zu waschen und um überschüssiges Blut und Lipid-Rückstände zu entfernen.
      3. Verwenden Sie Zange wiederherstellen durchlässigen Gewebe, übertragen Sie es auf eine sterile affektierten Oberfläche und Zerkleinern der Lipoaspirate.
  4. Verwenden einer sterilen Rasierklinge abgeschnitten das distale Ende des p1000 Pipettenspitzen, Hackfleisch / Gewebe zu übertragen; Dies minimiert Schubspannung, die Adipocyte Lyse führen kann. Sobald eine richtige Gewebe Konsistenz erreicht ist übertragen Sie die gewünschte Lautstärke von Hackfleisch / Gewebe auf jede 1,5 mL Tube (300 – 400 µL für 6-Well-Platte, 500 – 600 µL für 6 cm Schüssel). Mischen Sie Hackfleisch / WAT und Medien in die Rohre kurz.
  5. Nehmen Sie die Grundplatten ADSC und Dekantieren/Absaugen der Medien. Ersetzen Sie die Medien mit der WAT/Medien-Mischung von jeweils 1,5 mL-Tube.
    1. Sanft die Gelatine-Kolben von den pNIPAAm-beschichtete Platten zu entfernen und auf der WAT-Mischung auf die Grundplatten ADSC anzuwenden. Prüfen der Monoschicht der pNIPAAm-beschichtete Platten unter dem Mikroskop, zelluläre Loslösung zu bestätigen.
  6. Legen Sie einen Heizblock auf ca. 37 – 40 ° C unter der BSC. Mit den Kolben noch in Kraft wechseln Sie die Platten an den Heizblock Oberfläche Fügen Sie 2 – 3 mL erwärmten Nährmedien zu inkubieren der Zellen und zu erleichtern, Gelatine schmelzen.
  7. Entfernen Sie nach ~ 30 min vorsichtig die Kolben aus der Plattenoberfläche. Ersetzen Sie die Deckel der Basis Gewebekultur Platten und bewegen Sie in eine Zelle Kultur Inkubator. Sobald die Gelatine vollständig bei 37 ° C verflüssigt hat, Aspirieren und Zellkulturmedien ersetzen.
  8. Pflegen Sie SWAT bei 37 ° C und 5 % CO2 an Phenol rotfrei-M199 Medium mit 7 µM Insulin, 30 µM Dexamethason, 1 X Penicillin/Streptomycin. Halten Sie in etwa 2 mL Medien für 6-Well-Platten und 3 mL für 6 cm Gerichte. Wechseln Sie Medium alle 2 Tage.

(5) SWAT-Ernte

  1. Kollagenase (0,5 mg/mL Kollagenase, 500 nM Adenosin in PBS) bereiten Aliquote in 15 mL konische Röhrchen (ungefähre Volumen von 10 mL). Die Rohre Einfrieren und lagern bei-20 ° C.
  2. Aspirieren Sie jede Kulturmedium aus Zellen, waschen Sie 1 X mit PBS und dann Aspirieren Sie PBS. Vorbereitung der Kollagenase Aliquote von ihnen in einem 37 ° C Wasserbad Auftauen.
    Hinweis: Im Idealfall wird die Kollagenase Lösung 37 ° C erreichen; Fügen Sie unmittelbar danach Gewebe.
  3. Die einzelnen Aliquote alle Gewebe aus der SWAT-Platte hinzufügen. Ernte mit einem sterilen Zelle Scrapper SWAT und überträgt es auf die Kollagenase Aliquote mit einem Cut-Off p1000 PIPETTENSPITZE. Fügen Sie Gewebe direkt in das 15 mL konische Röhrchen mit Kollagenase Lösung.
    1. Inkubieren Sie alternativ die Gewebe/Kollagenase-Mischung in einem 50 mL konische Röhrchen; die vergrößerte Oberfläche wird weiter enzymatische Verdauung erleichtern.
  4. Ein inkubierten Orbitalschüttler in einem 45°-Winkel entgegenbringen Sie Probenröhrchen. Bei 200 u/min bei 37 ° C für 30 – 60 min inkubieren.
  5. Platz 250 µm mesh-Filter in ein neues 15 mL konische Röhrchen für Sammlung. Füllen Sie die verdaute Adipocyte Lösung durch den Filter.
    Hinweis: Dies ermöglicht alle Zellen durchlaufen beim herausfiltern von Bindegewebe.
  6. Durchfluss für 5 min bei Raumtemperatur ermöglicht Phasentrennung sitzen lassen.
    Hinweis: Die Adipozyten schweben an die Spitze der Lösung während Stromazellen Fettzellen (ASC) in die unteren Phasen niederlassen werden. Zentrifugation für 5 min bei 500 X g kann auch Zellseparation oder Ernte rund um ADSCs im Pellet maximieren.
  7. Mit eine Cut-Off p1000 PIPETTENSPITZE übertragen Sie Adipozyten (schwimmende Schicht an Spitze der Kollagenase-Lösung), ein 1,5 mL Microcentrifuge sammelröhrchen. Unter ~ 250 µL zu einem Zeitpunkt, pipette langsam entlang der Kante des Rohres, die Fettzellen zu sammeln.
    1. Drehen Sie das Rohr langsam beim Sammeln der Fettzellen um die Erholung der Zellen, die an der Innenseite zu maximieren. Halten Sie mehr Zellen zeichnen, bis 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch voll ist.
  8. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus dem isolierten Fettzellen mit einer Spritze mit einer Nadel (~ 21) verbunden. Versenken Sie die Nadel unter der schwimmenden Adipocyte Schicht. Rühren Sie die Nadel kurz, um alle Zellen an der Nadel-Welle zu verdrängen, und warten Sie, bis die verdrängt Adipozyten nach oben zu schweben.
  9. Ziehen Sie langsam die überschüssige Flüssigkeit, dabei darauf achten, die unbeabsichtigte Entfernung von Fettzellen zu vermeiden. Microcentrifuge Schlauch Promotionen zu verwenden, um konsequent Probenvolumina isolieren (z. B.. 0,1 mL für jede Probe).
  10. Verwenden Sie die isolierten Zellen für DNA/RNA Extraktion, Glukose-Aufnahme-Assay, Lipolyse-Assay, etc.

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Representative Results

Lebensfähigkeit des SWAT wurde zunächst durch serielle Hellfeld Darstellung der einzelnen WAT Cluster beurteilt (n = 12) über ca. 7,6 Wochen. Cluster blieb auf der Monolage während dieser Zeit gesichert. Leichte morphologische Veränderungen beobachtet mit einzelnen Adipozyten leicht verziehen oder Positionen verschieben. Jedoch Adipozyten weder zu multilocular im Laufe der Zeit, zeigt einen Mangel an Entdifferenzierung, noch haben sie weisen keine sichtbaren Zeichen des Zelltods wie zelluläre Blebbing, Lyse oder Fragmentierung (Abbildung 2). Adipocyte Identität von Clustern wurde auf zwei Wochen altes Baby SWAT mit Lipid Fleck Nil rot (NR) bestätigt. Klar NR Färbung unilokuläre Adipocyte Cluster angegeben, dass diese waren in der Tat Adipozyten mit intakten Membranen, anstatt Artefakt, Zysten oder tot Adipozyten. Das Fehlen der NR Färbung in den umliegenden ADSC Blättern zeigt, dass diese Zellen sind keine Anhäufung von Lipid und daher nicht in Richtung einer adipogenen Abstammung sich (Abbildung 3a differenzieren). Propidium Jodid Färbung erfolgte auf 53 Tage alten SWAT. Ausschluss des Flecks in Adipocyte Haufen an fortgeschrittene Zeitpunkten zeigt einen Mangel an Zelltod (Abb. 3 b). Öl-Rot-O (ORO) Fleck erfolgte auf 51 Tage alten SWAT mit Lipid Fleck Lokalisierung innerhalb der festen Adipocyte Cluster, darauf hinweist, dass SWAT Adipozyten Lebensfähigkeit mit intakten Adipozyten auch bei fortgeschrittenen Zeitpunkte (Abb. 3 c) zu erhalten.

Immunocytochemistry (ICC) wurde durchgeführt, um die erwarteten Proteinexpression und Lokalisierung von Reifen Adipocyte Marker in SWAT zu demonstrieren. Intakte SWAT-Platten waren voller Flecken mit Antikörpern gegen Perilipin (ab3526, Verdünnung 1: 200), PPARγ2 (sc-166731, 1: 100 Verdünnung) und FABP4 (ab92501, 1:1,000 Verdünnung). Konfokale Bilder von 12 Tage alte SWAT gezeigt erwartete Lokalisierung von Perilipin um Lipid Droplet Oberfläche (Abb. 4a). Fluoreszenzmikroskopie von 3 Tage alten SWAT mit den Lipid-Zähler-Fleck BODIPY demonstriert FABP4 Lokalisierung innerhalb des Zytoplasmas (Abbildung 4 b) und überlappende Signal von PPARG und DAPI Färbung PPARG Lokalisierung in den Zellkern ( gezeigt Abbildung 4 c).

SWAT transkriptionellen Profil wurde im Gewebe, die aus mehreren Fächern ausgesät ausgewertet (n = 4 Geber). Bei der Abholung wurde ein Teil des Fettgewebes zur für eine Basislinie RNA-Extraktion (d0), während der Rest diente Saatgut SWAT-Platten. Diese Platten wurden dann bei 24 h, 14 und 28 Tage in SWAT Kultur geerntet. Einstufige quantitative reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) wurde durchgeführt, um die Transkription Ebenen bestimmen. Sechs wichtige Adipocyte Gene wurden untersucht: PPARG, FABP4, LPL, CEBPA, HSL und ADIPOQ (Abbildung 5). ACTB diente als interne Kontrolle und transcriptional Niveaus wurden ausgedrückt als Prozentsatz des Thema abgestimmt Grundlinie (d0) Ausdruck. Alle Gene gezeigt robuste Transkription im Swat-Tal, obwohl Ebenen im Laufe der Zeit Abwärtstrend. Wir glauben, dass das beobachtete transcriptional Profile mit weiteren Medien Optimierung verbessert werden könnte, wie wir im Abschnitt Diskussion zu erarbeiten.

Basalen endokrine Funktion wurde auf den gleichen Kulturen verwendet für die transkriptionelle Profil bewertet. Überstand wurde von SWAT Platten gesammelt und Leptin-Spiegel gemessen unter Verwendung Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) (ab100581). SWAT angezeigt basale Leptin Sekretion an den Tagen 1, 14 und 28 (Abb. 6a). ADSC Blätter wurden parallel mit SWAT-Platten als ein Steuerelement (z. B. ADSC Blätter ohne Sandwich WAT) beibehalten. Sekretierten Leptin konnte nicht in dieser Steuerelemente (Daten nicht gezeigt) nachgewiesen werden.

Um festzustellen, ob SWAT Kapazität für eine induzierbaren Reaktion im Laufe der Zeit halten konnte, wurde geprüft, Lipolyse (n = 4). Um induzierbaren lipolytische Kapazität zu bewerten, eine Portion frisch gesammelten WAT (d0) wurde gehackt und Adipozyten wurden enzymatisch (ähnlich wie SWAT Ernte im Protokoll Abschnitt 5), isoliert, während der Rest zu SWAT Platten Saatgut verwendet wurde. Isolierte Adipozyten wurden für 3 h bei 37 ° C in 300 µL 2 % Fettsäure-säurefrei Rinderserumalbumin in HBSS mit 100 µM Forskolin, 1 µM Epinephrin oder Kontrolle Puffer inkubiert. Glycerin in gesammelten Medien wurde gemessen mit kostenlosen Glycerin Reagenz. SWAT geerntet wurde dann am Tage 1 und 5 und lipolytische Kapazitäten wurden auf die gleiche Weise ausgewertet. Chemischen Stimulation erhöht Glycerin Version deutlich an allen drei Zeitpunkten (Abb. 6 b): Glycerin Freigabe der behandelten Fettzellen wurde in d0 WAT um 82 ± 46 % erhöht (p = 0,01), 1-Tages SWAT von 577 ± 387 % (p = 0,02), und fünf Tage SWAT von 348 ± 343 % (p = 0.03). meine Glycerin Ebenen angeregt Adipozyten waren sehr ähnlich in allen drei Zeitpunkten: primäre WAT 5,2 ± 0.8, 1-Tages SWAT 4,4 ± 1,9 und 5-Tages SWAT 4,8 ± 1,8 µg Glycerin/mg Gesamt-Protein. Mittlere Glycerin waren Kontrolle (z.B. basale Lipolyse) relativ hoch in frisch gesammelten WAT (d0) im Vergleich zu SWAT geerntet Zellen. Dies kann durch die erhöhte Belastung an WAT Gewebe an d0 während chirurgische Exzision, Transport zum Labor und hacken sein. Diese Experimente zeigen jedoch keine Minderung in lipolytische Kapazität im Swat-Tal entweder 1 oder 5 Tage im Vergleich zu frisch gesammelten WAT.

SWAT, zeigte sich der Transplantation und Erholung in einem Mausmodell zu (n = 4) als eine Demonstration der komplexen, ganze Gewebefunktion. Es ist auch eine mögliche Anwendung der Plattform Forscher wollen SWAT um WAT in Vitro zu manipulieren, vor der Verpflanzung von Gewebe in einem Tiermodell nutzen sollte. SWAT war für 10 Tage kultiviert und geerntet, unter Verwendung der standard-Protokoll; isolierte Fettzellen von SWAT-Platten wurden dann in eine 1 mL Spritze (ohne Nadel) geladen. Ein Einschnitt erfolgte unter der Haut auf der Dorsalseite des immungeschwächten eGFP exprimierenden Mäuse (nicken. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl Tg(CAG-EGFP)1Osb/SzJ). Dies führte zu eine kleine dorsale subkutane Tasche in die SWAT-kultivierte Adipozyten wurden mit der Spritze injiziert, und die Tasche war dann vernäht geschlossen. Nach 10 Tagen nach Transplantation wurden Mäuse geopfert. Transplantationen waren deutlich sichtbar und leicht erholt (Abb. 7a). Die wiederhergestellten Transplantation und eine Maus kontralateralen Fett Depot wurden behoben, Paraffin eingebettet und geschnitten. Immunohistochemistry wurde auf den geschnittenen Folien mit primären Antikörper gegen GFP (A10262, 1: 100 Verdünnung) und menschliche PLIN (sc-390169, 1: 100 Verdünnung) durchgeführt. Der ausgewählte Anti-PLIN Antikörper wurde experimentell validiert, um menschliche PLIN aber nicht Maus Fleck. Adipozyten aus der wiederhergestellten Transplantation waren ca. 50 – 120 µm Größe, die der erwarteten Bandbreite für menschliche Adipozyten, und völlig negativ für GFP (Abb. 7 b). Allerdings waren rund 31 % der Adipozyten positiv für menschliche PLIN, erfolgreiche Engraftment in die Host-Angabe. Die Adipozyten in der Maus Fettdepots wurden 20 – 40 µm, die Maus Adipozyten, entspricht zwar durchweg positiv für GLP und vollständig Färbung negativ für menschliche PLIN (Abb. 7 c) Größe. ADSC Blätter (mit kein Sandwich WAT) waren aus Zelle Kultur Gerichte geschabt und als Steuerelement in Mäusen verpflanzt. Jedoch diese nicht wiederherstellbar Gewebe (Daten nicht gezeigt) erzielen. Dies zeigten die wiederhergestellten Adipozyten aus den Reifen kultivierten SWAT und nicht das Ergebnis einer differenzierten menschlichen ADSCs.

Figure 1
Abbildung 1: The SWAT Methode. (ein) der schematischen SWAT zeigt die Übertragung eines Blattes eGFP beschriftet ASC aus der pNIPAAm-beschichtete Gewebe-Kulturschale auf ein zweites, unbeschriftete Blatt ASC auf einem standard Gewebe Kulturschale angebaut. Hackfleisch, primären menschlichen WAT ist eingeklemmt zwischen 2 ASC-Blatt. (b) Fluoreszenz-Mikroskopie demonstrieren Hellfeld, GLP und verbundene Kanäle von einem SWAT erstellt durch die beschriebene Technik (a). Maßstabsleiste = 100 µm. (c) Digital Foto eines Vertreters, 5 Tage alte SWAT in einer standard 6-Well-Platte kultiviert. Das große Volumen des WAT ist stabil auf den Boden des Brunnens gesichert. Abbildung von Lau Et al.geändert. 11 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: SWAT bleibt 8 Wochen in der Kultur tragfähige. Serielle Hellfeld imaging von einem einzigen SWAT-Cluster über 55 Tage zeigt keine morphologischen Änderungen konsistent mit Zelltod. Skalieren von Balken = 100 µm. Abbildung von Lau Et al.geändert wird. 11 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: SWAT bleibt bei mehr als 50 Tage lebensfähig. (ein) Nil rote Färbung zeigt Färbung Beschränkung auf SWAT kultiviert 15 Tage lang live tragfähige Adipozyten angibt. Umgebenden Stromazellen Zellen keine Flecken. Abbildung sind bei 40 X Vergrößerung und Maßstabsleiste = 100 µm. (b) Propidium Jodid (PI) Färbung von SWAT kultiviert für 53 Tage zeigt PI Ausgrenzung, komplette Angabe kein Adipocyte Tod; Maßstabsleiste = 100 µm. (c) Öl-Rot-O Färbung von 51 Tage alten SWAT zeigt Einschränkung von neutralen Lipiden, die Adipozyten Langzeitstabilität des Adipocyte Zellmembranen angibt. Abbildung von Lau Et al.geändert. 11 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Immunocytochemistry zeigt, dass SWAT positiv für Reife Adipocyte Zelle Marker mit der erwarteten Lokalisierung Flecken. (ein) Confocal Mikroskopie von 2 Wochen altes Baby SWAT offenbart menschliche PLIN + unilokuläre Zellen mit der Lokalisierung zu Lipid Droplet Oberfläche. Maßstabsleiste = 100 µm. (b) Fluoreszenz-Mikroskopie von 3 Tage alten SWAT offenbart menschliche FABP4 + Zellen mit der Lokalisierung der Zytoplasma und (c) PPARγ + Zellen mit der Lokalisierung, Zellkern. Maßstabsleiste = 100 µm. Abbildung wird geändert von Lau Et Al. 11 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: SWAT unterhält wichtige Adipocyte Identität Genexpression. SWAT-Cluster wurden Kollagenase verdaut nach 1, 14 und 28 Tage in Kultur und die Genexpression von RT-qPCR bestimmt. RT-qPCR zeigt, dass 1-Tag-alt und 14 Tage alte SWAT erhalten hohe Konzentrationen von (einem) PPARG, (b) FABP, (c) HSL, (d) CbEBPA, (e) LPL und (f) ADIPOQ. ACTB diente als Referenz-gen. Fehlerbalken = Standardfehler. Abbildung wird von Lau Et Al. geändert. 11. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: SWAT basaler sondert Adipokine und physiologisch Katecholamin Stimulation reagiert. (ein) ELISA Quantifizierung des 24 h-basale Leptin-Sekretion zeigt keine signifikante Veränderung nach 28 Tagen in Kultur. (b) adrenerge Stimulation mit Adrenalin und Forskolin erzeugt eine signifikante Glykolytische Antwort in frisch geernteten primäre WAT (1,7 X) und Thema passende SWAT auf 1 bis 5 Tage in Kultur. Tag 1 SWAT reagierte auf Katecholamin Reiz mit einer Erhöhung der 6.3-fold über basale Glykolyse während Tag 5 SWAT eine Erhöhung der 3.3-fold in basalen Glykolyse unter Beweis gestellt. Stimulierte Glykolyse war nicht signifikant unterschiedlich im Swat-Tal im Vergleich zu übereinstimmenden frische WAT (p = 0,53, n = 4). Fehlerbalken = Standardfehler. Abbildung ist modifizierte Lau Et al. 11. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7: SWAT kann sein traditionsausdruck in Vivo, zeigen ganze Gewebefunktion erhalten. (ein) SWAT war leicht visualisierte 10 Tage nach der Transplantation in einem immungeschwächten Maus (Sternchen). SWAT nicht erfolgreich implantiert hatte, um 10 Tage würde die nekrotische SWAT verflüssigt wurde haben. (b) Teile der wiederhergestellten SWAT zeigte große, unilokuläre Adipozyten (Durchmesser 50 bis 120 µm), die eGFP - waren. 31,3 % der den Adipozyten wurden menschliche PLIN +. Die menschlichen PLIN + Adipozyten tendenziell kleiner, die mit klinischen Beobachtungen von Fett Pfropfung beim Menschen passen würde, wo sind kleinere Adipozyten eher um die Übertragung zu überleben. Maßstabsleiste = 100 µm, 200 X Vergrößerung. (c) kontralateralen Fett Pads genommen von den gleichen Mäusen zeigte viel kleinere Adipozyten (20 – 40 µm) und wurden menschliche PLIN-. Maßstabsleiste = 100 µm, 200 X Vergrößerung. Abbildung wird von Lau Et Al. geändert. 11. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz von ADSCs zu Sandwich menschlichen weißen Fettgewebe; menschlichen ADSC-Zell-Linien können über gut etablierte Protokolle15isoliert werden. Jedoch kann das System für individuelle Forschungsanforderungen (z. B. mit 3T3L-1-Zellen, Sandwich Maus WAT) angepasst werden. Dieser Prozess beinhaltet Umgang mit primären menschlichen Gewebes. Standard-Sicherheitsvorkehrungen sollten eingesetzt werden; menschliche Gewebe als BSL-2 Krankheitserreger (z. B. HIV, HCV) zu behandeln. Nur Griff Gewebe direkt unter einer BSC. Alle geeigneten PSA zu tragen, da durch institutionelle Sicherheitsstandards vorgeschrieben – doppelte Handschuhe sind sehr zu empfehlen. Alle Lieferungen ordnungsgemäß desinfizieren und Abfälle mit 10 % Bleichmittel oder 70 % igem Ethanol Lösung vor Wiederverwendung oder Entsorgung.

Der erste wichtige Schritt in der SWAT-Kultur ist Erwerb und die Wartung der Gewebekultur pNIPAAm-beschichtete Platten. Solche Platten sind im Handel erhältlich, oder sie können durch etablierte Methoden12,13,14erzeugt werden. Diese Platten sind Temperatur reagierende Zelloberflächen Kultur. Oberhalb der kritischen Temperatur (~ 32 ° C) die Oberfläche ist hydrophob und Zellen haften, ähnlich wie andere behandelte Kunststoffe für Gewebekultur. Jedoch unterhalb dieser kritischen Temperatur, wird die Oberfläche hydrophil und die Zellen werden aus dem Kunststoff Oberfläche16distanzieren. So, sollte darauf geachtet werden, zu etablieren: (1) wie schnell ein bestimmten Zelltyp wird von der Monolage distanzieren, vor Erreichen der vollen Konfluenz (d. h. während der normalen Medien Änderungen) und (2) die notwendige Zeit für die Absenkung der Temperatur mit der Gelatine Kolben auf der pNIPPAm-beschichtete Platte angewendet, um sicherzustellen, dass die gesamte Zelle Blatt distanziert. Medien-Änderungen sollte mit Medien auf 37 ° C erwärmt durchgeführt werden; Wenn Zellen anfällig für schnelle Dissoziation sind, führen Sie Medien Änderungen auf einem Heizblock, eingestellt auf 37 ° C unter der BSC.

Der zweite wichtige Schritt wird das Fettgewebe zur Vorbereitung der Aussaat SWAT verarbeitet. Wir haben unsere Charakterisierung von WAT mit sterilisierten Pinzette und sterilisierten Rasierklingen hacken durchgeführt. Jedoch kann nicht menschliche Faszie leicht mit einem Rasiermesser geschnitten werden. Das Adipocyte-Faszien-Verhältnis zu maximieren ist wichtig, so viel Fettgewebe in SWAT möglichst über einen langen Zeitraum zu erhalten. Große Stücke von intakten Faszie werden verhindert, dass Zell-Zell-Kontakt zwischen ADSCs und Adipozyten, das zum Zusammenhalten von SWAT wesentlich ist. Übermäßige Mengen von Faszie können auch eine "ziehen an einem Faden" Wirkung haben. Während ein einzigen WAT-Cluster aus einer Platte ohne Auswirkungen auf den benachbarten Clustern distanzieren kann, können mehrere Cluster durch Faszien verbunden genug Cluster aus einem monomolekularen Film, ein SWAT gut unbrauchbar machen ziehen. Fettabsaugung, die mechanisierten Zerkleinern von WAT miteinbezieht, kann dieses Problem umgehen, wie Faszie intraoperativ fein gehackt ist. Allerdings werden während der Fettabsaugung, Patienten routinemäßig mit hohen Dosen von Epinephrin behandelt; die möglichen Auswirkungen dieser Behandlung auf das Gewebe (und spätere Experimente) müssen während einer Studie berücksichtigt werden.

Der letzte entscheidende Schritt im SWAT-Kultur ist eine experimentelle Kultur Medien auswählen. Wir führten unsere ersten Charakterisierung Experimente unter Verwendung einer Standardzelle Kultur Formulierung (10 % FBS, 1 x Penicillin/Streptomycin in DMEM). Aber anhand der verfügbaren Literatur bezüglich Adipocyte Transkription zu maximieren, verwendeten wir eine spezielle Formulierung (7 µM Insulin, 30 µM Dexamethason, 1 X Penicillin/Streptomycin in M199 Medien)17. Diese Formulierung verbessert den frühen Stufen der Transkription, aber Ebenen im Laufe der Zeit verringert. Wir glauben deshalb, weil im Körper, eine Vielzahl von chemischen Signalen Adipozyten ausgesetzt sind oft Radfahren zwischen gefüttert und ausgehungert Staaten im Laufe eines Tages. So sollte die beobachteten transkriptionelle Profil im Laufe der Zeit zu verbessern, durch die weitere Optimierung der Ergänzungen zu unseren Zellkulturmedien möglich.

SWAT-Ernte (Protokoll, Abschnitt 5) isoliert Adipozyten aus der Kultur, verringert das Probenvolumen und Störungen aus den umliegenden ADSC-Blätter entfernt. Dies kann vorausgehen Adipocyte Homogenisierung (die für Protein oder Nukleinsäure-Isolierung notwendig ist), oder funktionelle Tests der intakt Adipozyten (z. B. Glykolyse oder Glukose-Aufnahme-Assays). Alternativ kann die intakte SWAT-Platte geerntet werden für Immunocytochemical Färbung, wodurch die ADSC-Blätter, die WAT-Cluster, der Monolage Verlauf der Färbung zu sichern. In diesem Fall Aspirieren Sie die Kultur, Medien und beheben Sie die gesamte Kultur über Standardprotokolle zu. Wir empfehlen jedoch, Hinzufügen von einem Glas deckgläschen vor imaging zu glätten die 3D Adipocyte Cluster und die resultierende Bildqualität verbessern.

Wir glauben, dass SWAT hat großes Potenzial als ein Drogen-screening-Plattform. Die Technik ist einfach, reproduzierbar und konventionellen Gewebekultur Platten nutzt. Drug Screening Experimente sind daher, indem eine pharmakologisch wirksame Substanz zu dem Kulturmedium ausführbar. Adipozyten können dann geerntet werden, um die Wirkung der Verbindung auf Genexpression, epigenetische Profil, Insulin-Empfindlichkeit, etc. , die der Zusatz von Umweltgiften zu Kulturmedium ähnlich verwendet werden kann, zu prüfen, deren Auswirkungen auf die Adipozyten zu untersuchen. Da SWAT die Forscher einzelne Adipocyte Cluster im Laufe der Zeit verfolgen kann, eignet es sich eindeutig um eine Behandlung zu bewerten, die eine sichtbare phänotypische Veränderung zu Adipozyten macht. Ein prominentes Beispiel wäre menschlichen Adipocyte "browning", wobei ein weißes, Lipid-Speicherung Adipocyte "braun" oder ähnlich wie eine thermogene, multilocular braun Adipocyte18wird. Dies ist ein Phänomen der potenziell wichtigen klinischen Relevanz, der in Mausmodellen, aber noch nie bei einem Menschen nachgewiesen wurde. Co kultivierte Variationen über SWAT halten auch enorme Forschung mögliche. SWAT ist eine natürliche Kokulturen-System, die Standardzelle Kultur Brunnen nutzt. Daher kann eine Adipozyten unter andere klinisch relevante Zelltypen durch Ändern der sandwichartig Zellen oder durch die Verwendung von Gewebekultur Membran Einsätze pflegen. Beispielsweise könnte Hepatozyten fungieren als das obere sandwichartig Zelle Blatt eine Droge, die durch die Leber gefiltert wird, bevor man das Fettgewebe auf den Bildschirm. Ebenso könnten Krebszellen angebaut werden auf eine Membran einfügen über SWAT zu prüfen, wie die Adipozyten zu Krebs Pathologie beitragen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Autoren möchten bestätigen die institutionelle Unterstützung durch LSU Health Sciences Center, die das Projekt finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x HBSS Thermofisher 14185052
Gelatin Sigma-aldrich G9391
Collagenase Sigma-aldrich C5138
Adenosine Sigma-aldrich A9251
DMEM Thermofisher 11995065
M199 Media Thermofisher 11043023 Phenol red-free 
250 µm Mesh Filter Pierce 87791
0.2 µm Syringe Filter Celltreat 229747
5 mL Luer-Lok syringes  BD 309646
Metal Washers These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3 g 
Name Company Catalog Number Comments
Heated Equipment
Incubated Orbital Shaker VWR 10020-988 Samples should be pitched at 45° angle to facilitate collagenase digestion
Heat Block Set to 37-40 °C and placed under Biosafety Cabinet
Water Bath Set to ~75 °C
Name Company Catalog Number Comments
Specialized Plastics
Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell Nunc 174902  or 174901 These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: <6 cm for 6 cm dish, <3.5 cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6 cm dish, 5.1 g for 6-well plate
Plastic Plunger Apparatus These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics

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References

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Tags

Verhalten Ausgabe 138 Fettgewebe Adipozyten Fettleibigkeit Microphysiological Systeme Organe auf Chips Drogen-Screening Medikamentenentwicklung Umwelttoxizität Primärkultur Diabetes Stoffwechsel
Eine Microphysiologic Plattform für menschliches Fett: weißen Fettgewebe eingeklemmt
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Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. L., Lau, F. H. A Microphysiologic Platform for Human Fat: Sandwiched White Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (138), e57909, doi:10.3791/57909 (2018).

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