Summary
Vit fettväv (WAT) har allvarliga brister i sin nuvarande primära kultur modeller, hindrar farmakologisk utveckling och metabola studier. Här presenterar vi ett protokoll för att producera ett fett microphysiological system av sandwiching WAT mellan ark stromaceller. Denna konstruktion ger en stabil och flexibel plattform för primära WAT kultur.
Abstract
Vit fettväv (WAT) spelar en avgörande roll i regleringen av vikt och vardagliga hälsa. Fortfarande finns det betydande begränsningar till tillgängliga primära kultur modeller, varav alla har misslyckats att troget recapitulate det fett närmiljön eller förlänga WAT lönsamhet längre än två veckor. Bristen på en tillförlitlig primärkulturen modell hindrar allvarligt forskning i WAT metabolism och läkemedelsutveckling. För detta ändamål har vi utnyttjat NIHs normer för ett microphysiologic system för att utveckla en ny plattform för WAT primära kultur kallas 'SWAT' (inklämt vit fettvävnad). Vi övervinna naturliga flytkraften från adipocyter av sandwiching malet WAT kluster mellan ark adipose-derived stromaceller. I denna konstruktion är WAT prover livskraftig över åtta veckor i kultur. SWAT upprätthåller intakt ECM, cell-till-cell kontakter och fysiska påfrestningar i vivo WAT villkor; Dessutom upprätthåller SWAT en robust transkriptionell profil, känslighet för exogena kemisk signalering och hela vävnad funktion. SWAT representerar en enkel, reproducerbar och effektiv metod för primära fett kultur. Eventuellt är det en allmänt tillämplig plattform för forskning i WAT fysiologi, patofysiologi, ämnesomsättning och läkemedelsutveckling.
Introduction
Fettvävnad är det primära orgeln av fetma, som bär direkta årliga sjukvårdskostnader mellan 147 miljarder dollar och $210 miljarder i US1. Ansamling av fettvävnad bidrar också till andra ledande dödsorsakerna som hjärtsjukdomar, typ II-diabetes och vissa typer av cancer2. In vitro kultur modeller är väsentliga för metabola studier och läkemedelsutveckling, men aktuell forskningsmodeller av fettvävnad har stora brister. Adipocyter är bräckliga, flytande och terminalt differentierade celler som inte följer cell kultur plast, och därför inte kan vara odlade med konventionella cell kultur metoder. Sedan 1970-talet, har flera metoder använts i försök för att övervinna dessa hinder, inklusive användning av glas coverslips, taket kultur, suspension kultur och extracellulära matriser3,4,5, 6 , 7. dock dessa metoder har präglats av celldöd och Dedifferentiering och de används vanligtvis inte mer än en två veckors studieperiod. Dessutom, dessa modeller försök inte sammanfatta den infödda fett närmiljön som de inte upprätthåller intakt ECM, interaktioner mellan adipocyter och stromal stödja celler, inte heller de kontraktila styrkor cellerna utövar på varandra i i vivo WAT.
I avsaknad av en guld-standard primära fett kultur metod, har fett forskning åberopat primärt differentierade före adipocyter (diffAds). DiffAds är multilocular, vidhäftande och metaboliskt aktiva. Däremot primära vit adipocyter är unilocular, nonadherent, och visar relativt låg ämnesomsättning. Nuvarande fett kultur modellernas misslyckande att recapitulate physiologyen av friska mogna fettvävnad är sannolikt en viktig faktor i avsaknad av FDA-godkända läkemedel som är direkt riktade adipocyter. I själva verket är avsaknaden av fysiologiska in vitro- orgel modeller ett stort problem i de flesta organ och sjukdom.
I dess position paper tillkännage bildandet av dess Microphysiological system (MPS) program rapporterade på National Institutes of Health (NIH) att 2013 framgång över alla farmaceutiska kliniska prövningar var endast 18% för fas II och 50% för fas III kliniska prövningar8. MPS programmet är utformat för att direkt ta itu med in vitro- monokultur oförmåga att modell människans fysiologi. NIH definierar MPSs som kultur system består av mänskliga primär eller stamceller i flercelliga 3D konstruktioner som recapitulate orgel funktion. Till skillnad från reduktionistiska modeller av homogen, förevigade cellkulturer, bör MPSs exakt modell cell-cell, drog-cell, läkemedel och orgel-drogen interaktioner9. Till skillnad från kortsiktiga primärkulturen metoder diktera NIH standarder MPS hållbarhet under 4 veckor i kultur8. Ytterligare detaljer för MPS programmet kan hittas på NIH'S RFAs (#RFA-TR-18-001)10.
Vi har utvecklat en enkel, roman, anpassningsbar, och billig fett MPS kallas ”inklämt vit fettvävnad” (SWAT)11. Vi övervinna naturliga flytkraften från adipocyter av ”sandwiching” malet primära fettvävnad mellan ark adipose-derived stromaceller (ADSCs) (figur 1). Den resulterande 3D bygga recapitulates cell cell kontakten och de infödda fett närmiljön genom att omge mogen adipocyter med en naturlig fettceller stöd cell befolkning. SWAT har validerats genom att Visa 8-veckors livskraft, svar på yttre signalering, adipokine sekretion och engraftment i en djurmodell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla aktiviteter utfördes i anslutning till protokoll #8759 och #9189, som godkänts av den IRB kontor av LSUHSC-NO. Alla djur arbetet utförs i anslutning till protokollet #3285 godkänts av IACUC kontoret på LSUHSC-nr.
1. sådd av Sandwiching Cell ark
Obs: Se figur 1.
- Frö ADSCs på cirka 80% konfluens i vävnadsodling plattor (6 cm eller 6 brunnar). För varje brunn av SWAT önskas, utsäde 1 vävnadsodling med konventionella väl och 1 väl av motsvarande storlek på poly(N-isopropylacrylamide (pNIPAAm)-belagda vävnadsodling plastplatta.
Obs: Med detta, en 6-well platta av SWAT kommer att kräva sådd celler på en 6-väl standard vävnadsodling tallrik (underställ) och en 6-väl pNIPAAm-belagda vävnadsodling pläterar (övre skiktet). pNIPAAm-belagda plattor kan köpas kommersiellt eller produceras i-lab12,13,14. - Upprätthålla ADSCs vid 37 ° C och 5% CO2 i Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) kompletteras med 10% FBS och 1 x Penicillin/Streptomycin. Ändra media varje 2 dagar.
- Tillåta celler sammanfalla tills de blir 100% konfluenta och ta på en tvärstrimmig mönster (cirka 6 – 8 dagar).
Obs: Dessa celler kommer att behöva fungera som ett enda intakt cell ark för att stabilisera buoyant fettvävnaden. Otillräckligt konfluenta celler fragmenterar vid sådd med WAT.
2. beredning av SWAT leveranser
- Förbereda flera 10 mL alikvoter av 1 x Hank's Balanced Salt lösning (HBSS); förbereda nog för önskat antal plattor med volym att avvara.
-
Förbereda kolven apparaten för SWAT sådd. Konstruera kolven med hjälp av enkla akryl plast, består av en stam som bifogas en rund disk. Säkerställa att den passar inom omkretsen av vävnadsodling brunnarna (diameter: < 6 cm för 6 cm skålen, < 3,5 cm för 6-well plate; ungefärlig vikt: 6,7 g för en 6 cm maträtt, 5,1 g för en 6-well platta).
- Laga extra kolvar att säkerställa att förfarandet kommer att löpa smidigt i fall det finns ett problem med några enskilda kolven.
- Linda lab tejp runt kanten av kolven disken, minst 2 x, att förhindra läckage av gelatin lösningen.
- Spraya en biosäkerhet skåp (BSC) med 70% EtOH. Spraya ner en 15 mL koniska tube rack inuti BSC med tomma, icke-utjämnade 15 mL koniska rör; rören kommer att skydda placeringen av gelatin kolvarna.
- Spraya varje band-inslaget kolven noggrant med 70% EtOH och plats i en 15mL koniska rör på sträckbänken. Spray metall brickor (ungefärlig vikt 6,3 g) och placera dem på hyllan tillsammans med ett par hooked tången; brickor lägger till vikt kolvarna under SWAT sådd.
- Stäng BSC skärp och slå på UV ljus för att underlätta torkning och sterilisering.
Obs: Helst genomföra detta steg 24 h före SWAT sådd. Alternativt kan genomföra processen på dagen för vävnad samling/SWAT sådd; i detta fall Tillåt dock 15 – 45 min för UV torkning/sterilisering.
3. beredning av Gelatin kolvar — ansökan till övre cellen ark
- Värm ett vattenbad till 75 ° C.
-
Förbereda gelatin lösningen genom att lägga till 0,75 g gelatin pulver i 10 mL lager av 1 x HBSS. Tillsätt 100 µL av 1 M NaOH att balansera pH-värdet i lösningen under ett dragskåp.
- Tillsätt 10 mL bestånden till vattenbadet och skaka kraftigt varje 5 min tills pulvret upplöses i lösning. Syfte att upplösa pulveriserad gelatin snart efter att lägga till det uppvärmda vattenbadet.
- Slå på BSC fläkten, stänga av UV-ljus och höja bågen. Spraya ytan BSC och förbereda filtret leveranser (5 mL luer-lock sprutor och 0,2 µm spruta filter). Förbereda flera filter för att effektivt stam tillräckliga volymer av gelatin att tillämpa på kolvarna.
- När gelatin lösningen når en homogen konsistens, filtrera lösningen och tillämpa den på kolvarna. Fyll sprutan med gelatin. Gälla plast kolvarna gelatinet genom sprutan filtret (~2.5 mL till en 6-well platta, ~4.5 mL för en 6 cm skålen) och låt stelna (~ 20 min).
- När gelatinet är solid, packa tejpen från kanten av kolvarna. Med hooked pincett, ta bort gelatin från den yttre kanten av kolven (dvs, de upphöjda kanterna av menisken). Säkerställa att de återstående gelatinet i mitten av kolven är helt plana att maximera kontakt med ADSC ark.
- När överflödigt gelatin avlägsnas, Applicera försiktigt gelatin kolvarna till pNIPAAm-belagda ADSC pläterar. Använd de metall brickorna för att väga ner kolven. Inte skeva cell ark samtidigt som kolvarna.
-
Lämna kolvarna på cell ark för 1,5 h i rumstemperatur. Inkubera plattorna/kolvar i en ice vattenbad för 1.5 h att slutföra dissociation av cellagret från pNIPAAm-belagda platta ytan.
- Iaktta försiktighet när de ruvar i isbadet; Tillåt inte isbadet kan förorena cell media under inkubation.
- Efter avslutad inkubation, ren botten av pNIPAAm-belagda plattorna att ta bort icke-sterilt vatten.
4. vit fettvävnad bearbetning
- När du samlar in mänsklig fettvävnad från operationssalen, hålla alla prover i en steril behållare som är på is tills SWAT är att vara seedad. Lägga till sterila underhållsmassmedia, till exempel fosfatbuffrad saltlösning (PBS), fettvävnad behållare för vävnad stabilitet.
- Tillsätt kall cellodlingsmedium 1,5 mL mikrocentrifug rör för varje brunn/skålen vara seedad (100 µL för en 6-well platta, 200 µL för en 6 cm maträtt).
-
Finhacka fettvävnaden.
- För fasta fettvävnad segment, gör följande.
- Tvätta stora segment av fettvävnad 3 x i steril fosfatbuffrad Koksaltlösning och ta bort så mycket PBS som möjligt.
- Grovmalen färs vävnad med peang och sterilt razor och ta bort så mycket vaskulatur och fascia som möjligt (se diskussion för mer information).
- Fint finhacka fett med rakkniv tills malet vävnad tar på tjock, flytande konsistens.
Obs: Idealiskt vävnad visas homogen med inga synliga enskilda segment av WAT även om detta inte är alltid möjligt.
- Bearbeta lipoaspirate enligt följande.
- Under BSC, tejpa steril gasbinda över toppen av en bägare och placera denna bägare i en större bägare att samla in överflödig vätska.
- Med 25 mL serologiska pipett rita så mycket lipoaspirate som behövs och tillämpa den på ytan av steril gasväv. PBS direkt gälla denna yta att tvätta lipoaspirated fett och ta bort överflödigt blod och lipid rester.
- Använda pincett för att återställa avrunna vävnad, överföra den till en steril mincing yta och finhacka lipoaspirate.
- För fasta fettvävnad segment, gör följande.
- Använd en steril rakhyvel för att skära av den distala änden av p1000 pipettspetsar överföra malet vävnad; Detta minimerar skjuvning stress som kan leda till fettceller lysis. När en ordentlig vävnad konsistens uppnås över önskad volym av malet vävnad till varje 1,5 mL tub (300 – 400 µL för 6-well plate, 500 – 600 µL för 6 cm maträtt). Blanda köttfärs WAT och media kort i rören.
-
Ta de ADSC Basplattor och Dekantera/aspirera media. Byt ut materialet med WAT/media blandningen från varje 1,5 mL tub.
- Försiktigt bort gelatin kolvarna från pNIPAAm-belagda plattorna och tillämpa dem på WAT blandningen på bas ADSC plattorna. Undersöka enskiktslager av pNIPAAm-belagda plattorna under ett mikroskop för att bekräfta cellulära avlossning.
- Ange ett värme block till ungefär 37 – 40 ° C under BSC. Med kolvarna på plats, flytta plattorna värme blockets yta. Tillsätt 2 – 3 mL värmde kultur media att Inkubera cellerna och underlätta gelatin smältning.
- Efter ~ 30 min, ta försiktigt bort kolvarna från den platta ytan. Ersätta locken på bas vävnadsodling plattorna och flytta till en cell kultur inkubator. När gelatinet har helt kondenserad vid 37 ° C, aspirera och ersätta cell kulturmassmedia.
- Bibehålla SWAT vid 37 ° C och 5% CO2 i fenolrött-fri M199 medium med 7 µM insulin, 30 µM dexametason, 1 x Penicillin/Streptomycin. Underhåll i ca 2 mL media för 6-väl tallrikar och 3 mL för 6 cm rätter. Ändra media varje 2 dagar.
5. SWAT skörd
- Förbereda kollagenas (0,5 mg/mL kollagenas, 500 nM adenosin, i PBS) alikvoter i 15 mL koniska rör (ungefärlig volym på 10 mL). Frysa rören och lagra dem vid-20 ° C.
- Aspirera någon odlingsmedium från celler, tvätta 1 x med PBS och sedan aspirera PBS. Prep i kollagenas alikvoter av upptining dem i 37 ° C vattenbad.
Obs: Helst kollagenas lösningen når 37 ° C; omedelbart därefter lägga till vävnad. -
Lägg till alla vävnad från SWAT plattan till de enskilda alikvoter. Skörda SWAT med hjälp av en steril cell scrapper och överföra den till kollagenas alikvoter med en cut-off p1000 pipettspetsen. Lägga till vävnad direkt 15 mL koniska rören som innehåller kollagenas lösning.
- Alternativt, inkubera vävnad/kollagenas blandningen i en 50 mL konisk tub; den öka ytan kommer att ytterligare underlätta enzymatisk nedbrytning.
- Placera provrör i orbitalskak ruvade i 45° vinkel. Inkubera vid 200 rpm, vid 37 ° C i 30 – 60 min.
- Plats en 250 µm mesh filter till en ny 15 mL koniska rör för samling. Häll över smält fettceller lösningen genom filtret.
Obs: Detta gör att alla celler passera medan filtrera bort fibrös vävnad. - Tillåt genomflöde att sitta i 5 minuter vid rumstemperatur för fasseparation.
Obs: Adipocyter kommer att flyta till toppen av lösningen medan de fett stromaceller (ASCs) kommer att bosätta sig i lägre faser. Centrifugering i 5 minuter vid 500 x g kan även maximera cellseparation eller skörden kring ADSCs i pelleten. -
Använda en cut-off p1000 pipettspetsen, överföra adipocyter (det flytande lagret på toppen av kollagenas lösning) till en 1,5 mL mikrocentrifug collection tube. Tar ~ 250 µL i taget, pipett långsamt längs kanten av röret till samla adipocyter.
- Vrid röret sakta samtidigt samla de fettceller för att maximera återvinning av celler som ansluter sig till insidan. Hålla Rita fler celler tills 1,5 mL mikrocentrifug röret är full.
- Ta bort överflödig vätska från de isolerade adipocyter med en spruta som bifogas en nål (~ 21 G). Sänk ner nålen under flytande fettceller lager. Agitera nålen kort för att få bort de celler som ansluter sig till nål axeln, och sedan vänta på de rubbas adipocyter att flyta till toppen.
- Långsamt dra av överflödig vätska, vara noga med att undvika oavsiktlig borttagning av adipocyter. Använda mikrocentrifug rör graderingar konsekvent isolera provvolymer (t.ex.,. 0,1 mL för varje prov).
- Använda de isolerade cellerna för DNA/RNA-extraktion, glukos upptag assay, lipolys assay, m.m.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lönsamhet av SWAT bedömdes initialt genom seriell brightfield avbildning av enskilda WAT kluster (n = 12) över cirka 7,6 veckor. Kluster återstod säkrade på plats på enskiktslager under hela denna tid. Liten morfologiska förändringar observerades med enskilda adipocyter skevhet något eller skiftande positioner. Dock adipocyter bli varken multilocular med tiden, som anger brist på Dedifferentiering, inte heller gjorde de uppvisar synliga tecken på celldöd som cellulära blebbing, Lys eller fragmentering (figur 2). Fettceller identitet av kluster bekräftades den två veckor gamla SWAT med lipid fläck Nile röd (NR). Tydlig NR färgning av unilocular fettceller kluster visade att dessa verkligen adipocyter med oskadade hinnor, snarare än artefakt, cystor eller döda adipocyter. Avsaknad av NR färgning i omgivande ADSC arken visar att dessa celler inte ackumulerar lipider och därför inte skilja mot en adipogena härstamning sig (figur 3a). Propidium jodid färgning utfördes på 53 dagar gamla SWAT. Uteslutandet av fläcken inom fettceller kluster vid avancerade tidpunkter visar en brist på celldöd (figur 3b). Olja-röd-O (ORO) fläcken utfördes på 51 dagar gamla SWAT med den lipid fläcken lokalisera inom de fasta fettceller kluster, vilket indikerar att SWAT adipocyter upprätthålla lönsamhet med intakt adipocyter även vid avancerad tidpunkter (figur 3 c).
Immuncytokemi (ICC) utfördes för att visa beräknade proteinuttryck och lokalisering av mogna fettceller markörer inom SWAT. Intakt SWAT plattor var målat med antikroppar mot perilipin (ab3526, spädning 1: 200), PPARγ2 (sc-166731, 1: 100 utspädning), och FABP4 (ab92501, 1:1,000 utspädning). Confocal bilder av 12 dagar gamla SWAT visat förväntade lokalisering av perilipin runt lipid droplet ytan (figur 4a). Fluorescensmikroskopi av 3 dagar gamla SWAT med lipid counter fläcken BODIPY visade FABP4 lokalisering inom cytoplasman (figur 4b), och överlappande signal från PPARG och DAPI färgning visat PPARG lokalisering till kärnan ( Figur 4 c).
SWAT transkriptionell profil utvärderades i vävnad seedade från flera försökspersoner (n = 4 givare). Vid samling användes en del av fettvävnad för en baseline RNA-extraktion (d0), medan resten användes till utsäde SWAT plattor. Dessa plåtar skördades då på 24 h, 14 dagar och 28 dagar i SWAT kultur. Polymeraskedjereaktion i One-Step kvantitativa omvänd Transkription (RT-qPCR) utfördes för att fastställa transkription nivåer. Sex viktiga fettceller gener undersöktes: PPARG, FABP4, LPL, CEBPA, HSL och ADIPOQ (figur 5). ACTB användes som intern kontroll och transkriptionell nivåer uttrycktes i procent av ämnet-matchade baslinjen (d0) uttryck. Alla gener visade robust transkription i SWAT, även om nivåerna trend nedåt över tiden. Vi anser som observeras transkriptionell profiler kan förbättras med ytterligare media optimering som vi utarbeta i diskussionsavsnittet.
Basala endokrina funktion utvärderades på samma kulturer till transkriptionell profilen. Supernatanten samlades från SWAT plåtar och leptin nivåer uppmättes utnyttja enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (ab100581). SWAT visas basala leptin sekretion dagar 1, 14 och 28 (figur 6a). ADSC ark kvarstod parallellt med SWAT plattor som en kontroll (dvs ADSC ark utan inklämt WAT). Utsöndrade leptin kunde inte detekteras i dessa kontroller (inga data anges).
För att avgöra huruvida SWAT kunde upprätthålla kapacitet för ett inducerbara svar tiden, lipolys undersöktes (n = 4). Utvärdera inducerbara lipolytisk kapacitet, en del av nyligen uppsamlat WAT (d0) var malet och adipocyter isolerades enzymatiskt (liknar SWAT skörd i protokollet avsnitt 5), medan resten användes till utsäde SWAT plattor. Isolerade adipocyter inkuberades för 3 h vid 37 ° C i 300 µL 2% fettsyror-syrafritt bovint serum albumin i HBSS med antingen 100 µM forskolin, 1 µM epinefrin eller kontroll buffert. Glycerol nivåer i insamlade media mättes med gratis Glycerol reagens. SWAT skördades då dagar 1 och 5 och lipolytisk kapacitet utvärderades på samma sätt. Kemisk stimulering ökade glycerol release betydligt på alla tre tidpunkter (figur 6b): glycerol frisläppandet av behandlade adipocyter i höjdes d0 WAT 82 ± 46% (p = 0,01), 1-dagars SWAT 577 ± 387% (p = 0,02), och fem dagars SWAT 348 ± 343% (p = 0,03). menar glycerol nivåer i stimulerad adipocyter var mycket lika över alla tre tidpunkter: primära WAT 5,2 ± 0,8, 1-dagars SWAT 4,4 ± 1,9 och 5-dagars SWAT 4,8 ± 1,8 µg glycerol/mg totalprotein. Genomsnittlig glycerol var kontroll (dvs. basal lipolys) relativt hög i nyligen uppsamlat WAT (d0) jämfört med SWAT-skördade celler. Detta kan bero på den ökade belastningen till WAT vävnaden vid d0 under kirurgisk excision, transport till lab och malning. Dessa experiment visar dock ingen försvagning i lipolytisk kapacitet i SWAT på antingen 1 eller 5 dagar jämfört med nyligen uppsamlat WAT.
SWAT påvisades för att kunna transplantation och återhämtning i en musmodell (n = 4) som en demonstration av komplexa, hela vävnad funktion. Det är också en eventuell tillämpning av plattformen bör forskaren vill utnyttja SWAT för att manipulera WAT i vitro innan omplantering vävnad i en djurmodell. SWAT var odlade i 10 dagar och skördas använder standardprotokollet; isolerade adipocyter från SWAT plåtar lästes sedan i en 1 mL spruta (utan nål). Ett snitt gjordes under huden på ryggsidan av en immunkomprometterade andra-uttryckande möss (nicka. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl Tg(CAG-EGFP)1Osb/SzJ). Detta skapade en liten dorsala subkutan ficka som i SWAT-odlade adipocyter injicerades med sprutan och fickan var sedan sys stängd. Efter 10 dagar efter transplantation offrades möss. Transplantation var klart synliga och lätt återvinnas (figur 7a). Både de återvunna transplantation och en mus kontralaterala fett depå fastställdes, paraffin inbäddade, och sektioneras. Immunohistokemi utfördes på sektionerad bilderna med primära antikroppar mot GFP (A10262, 1: 100 utspädning) och mänskliga PLIN (sc-390169, 1: 100 utspädning). Den valda anti-PLIN antikroppen validerades experimentellt för att färga människors PLIN men inte musen. Adipocyter från återvunna transplantation var cirka 50 – 120 µm i storlek, som är det förväntade intervallet för mänskliga fettceller, och var helt negativ för god Jordbrukarsed (figur 7b). Cirka 31% av adipocyter var dock positivt för människors PLIN, som visar framgångsrik engraftment in värden. Adipocyter i mus fett depåer var storlek 20 – 40 µm, vilket är förenligt med musen adipocyter, medan färgning helt positiva för god Jordbrukarsed och helt negativt för mänskliga PLIN (figur 7 c). ADSC ark (med ingen inklämt WAT) var skrapade från cell kultur rätter och transplanteras i möss som kontroll. Dock ger dessa inte någon ersättningsgilla vävnad (inga data anges). Detta visade att de återvunna adipocyter från de mogna odlade SWAT, och inte ett resultat av differentierade mänskliga ADSCs.
Figur 1: The SWAT metod. (en) Schematisk av SWAT visar överföring av ett blad av andra-märkt ASCs från en pNIPAAm-belagda vävnadsodling maträtt på en sekund, utan etikett ark ASCs odlas på en standard vävnadsodling maträtt. Malet, primära mänskliga WAT är inklämt mellan de 2 ASCs ark. (b), Fluorescence mikroskopi visar Brightfield, GFP och sammanslagna kanaler av en SWAT skapad av den teknik som beskrivs i (a). Skalstapeln = 100 µm. (c) Digital fotografi av en representant, 5 dagar gamla SWAT odlade i en standard 6-bra platta. Den stora volymen av WAT är stabilt säkrad till botten av brunnen. Figuren är modifierad från Lau et al. 11 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: SWAT förblir livskraftig vid 8 veckor i kultur. Seriella brightfield avbildning av ett kluster SWAT över 55 dagar visar inga morphologic ändringar förenlig med celldöd. Skala barer = 100 µm. figur ändras från Lau et al. 11 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: SWAT förblir livskraftig på mer än 50 dagar. (en) Nile röd färgning visar färgning begränsning till SWAT odlade i 15 dagar, som visar levande livskraftig adipocyter. Kring stromaceller inte fläckar. Siffran är på 40 X förstoring och skalstapeln = 100 µm. (b) Propidium jodid (PI) färgning av SWAT odlade för 53 dagar avslöjar slutföra PI utslagning, som anger inga fettceller död; Skalstapeln = 100 µm. (c), olja-röd-O färgning av en 51 dagar gamla SWAT visar begränsning av neutrala lipider till adipocyter, som anger långsiktig stabilitet av fettceller cellmembran. Figuren är modifierad från Lau et al. 11 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: immuncytokemi visar att SWAT fläckar positivt för mogna fettceller cell markörer med förväntade localization. (en) Confocal microscopy av 2 veckor gamla SWAT avslöjade mänskliga PLIN + unilocular celler med lokalisering till lipid droplet yta. Skalstapeln = 100 µm. (b) fluorescerande mikroskopi av 3 dagar gamla SWAT avslöjade mänskliga FABP4 + celler med lokalisering i cytoplasman och (c) PPARγ + celler med lokalisering till cellkärnan. Skalstapeln = 100 µm. figur ändras från Lau o.a. 11 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: SWAT upprätthåller viktiga fettceller identitet genuttryck. SWAT kluster var kollagenas rötas efter 1, 14 och 28 dagar i kultur och genuttryck bestäms av RT-qPCR. RT-qPCR visar att 1-dag-gammal och 14 dagar gamla SWAT bevara höga nivåer av (en) PPARG, (b), FABP, (c), HSL, (d), CbEBPA, (e), LPL och (f), ADIPOQ. ACTB användes som Referensgenen. Felstaplar = standard fel. Figuren är modifierad från Lau et al. 11. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 6: SWAT basally utsöndrar adipokines och fysiologiskt besvarar katekolamin stimulering. (en) ELISA kvantifiering av 24 h basala leptin sekretion visar ingen signifikant förändring efter 28 dagar i kultur. (b), adrenerg stimulering med adrenalin och forskolin genererar en betydande glycolytic svar i nyskördade primära WAT (1,7 x) och ämne-matchade SWAT 1 och 5 dagar i kultur. Dag 1 SWAT svarade katekolamin stimulus med en 6.3-fold ökning över basal glykolys medan dag 5 SWAT visat en 3.3-fold ökning över basal glykolys. Stimulerad glykolys skiljde sig inte nämnvärt i SWAT jämfört med matchade friska WAT (p = 0,53, n = 4). Felstaplar = standard fel. Figuren är modifierad Lau o.a. 11. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 7: SWAT kan vara reimplanted i vivo, visar bevaras hela vävnad funktion. (en) SWAT var lätt visualiseras 10 dagar efter transplantation in en immunkomprometterade musen (asterisk). Hade SWAT inte framgångsrikt implanteras, av 10 dagar skulle nekrotisk SWAT har varit flytande. (b) avsnitt av återvunna SWAT visat stor, unilocular adipocyter (diametrar 50 till 120 µm) som var andra-. 31,3% av adipocyter var mänskliga PLIN +. De mänskliga PLIN + adipocyter tenderade att vara mindre, som skulle passa med kliniska observationer av fett ympning hos människor där mindre adipocyter är mer benägna att överleva överföringen. Skalstapeln = 100 µm, 200 X förstoring. (c), kontralaterala fett kuddar tas från samma möss visat mycket mindre adipocyter (20 – 40 µm) och var mänskliga PLIN-. Skalstapeln = 100 µm, 200 X förstoring. Figuren är modifierad från Lau o.a. 11. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll Detaljer bruket av ADSCs till smörgås mänskliga vit fettvävnad; mänskliga ADSC cellinjer kan isoleras via väletablerade protokoll15. Dock kan systemet anpassas för individualiserad forskningsbehov (till exempel med 3T3L-1 celler till smörgås mus WAT). Denna process omfattar hantering av primär mänsklig vävnad. Elementära säkerhetsåtgärder bör användas; hantera mänskliga vävnader som BSL-2 patogener (t.ex. HIV, HepC). Endast hantera vävnad direkt under en BSC. Bära alla lämpliga PPE som dikteras av institutionella säkerhetsstandarder – dubbla handskar rekommenderas. Desinficera korrekt alla leveranser och avfall med 10% blekmedel eller 70% etanol lösningen före återanvändning eller bortskaffande.
Ett första viktigt steg i SWAT kultur koppleri och underhålla pNIPAAm-belagda vävnadsodling plattor. Sådana plattor finns kommersiellt, eller de kan produceras genom etablerade metoder12,13,14. Dessa plattor är temperatur-lyhörd cellytan kultur. Ovanför den kritiska temperaturen (~ 32 ° C), ytan är hydrofoba och celler följer, liknar andra behandlade plaster för vävnadsodling. Men under denna kritiska temperaturen, ytan blir hydrofil och cellerna kommer att separera från den plastiska yta16. As a result, försiktighet bör iakttas att upprätta: 1) hur snabbt en viss celltyp kommer att separera från enskiktslager innan den når full konfluens (dvs. under normala media ändringar) och (2) tid som behövs för att sänka temperaturen med gelatin kolven tillämpas på pNIPPAm-belagda plattan, för att säkerställa att hela cellagret dissocierar. Byte av media ska utföras med media värmas till 37 ° C; om cellerna är benägna att snabb dissociation, utföra media ändringar på en värme block anges till 37 ° C under BSC.
Den andra kritiska steget är bearbetning fettvävnaden att förbereda för SWAT sådd. Vi genomförde vår karakterisering av malning WAT med steriliserad pincett och steriliserad rakhyvlar. Dock kan inte mänskliga fascia kapas enkelt med en rakhyvel. Att maximera fettceller-till-fascia förhållandet är viktigt att behålla så mycket fettvävnad inom SWAT som möjligt över en lång period. Stora bitar av intakt fascia förhindrar cell cell kontakt mellan ADSCs och adipocyter, som är nödvändig för att hålla SWAT tillsammans. Stora mängder av fascia kan också ha en ”dra på en tråd” effekt. Medan ett enda WAT-kluster kan ta avstånd från en platta utan att påverka de neighboring kluster, kan flera kluster ansluten av fascian dra tillräckligt kluster av en enskiktslager att göra en SWAT väl obrukbart. Fettsugning, vilket innebär den mekaniserade malning av WAT, kan kringgå det här problemet som fascia är finhackat under operation. Dock under fettsugning behandlas patienter rutinmässigt med höga doser av adrenalin; de möjliga konsekvenserna av denna behandling på vävnad (och efterföljande experiment) måste redovisas under en studie.
Det sista viktiga steget i SWAT kultur är att välja en experimentell kultur media. Vi utförde vår första karakterisering experiment utnyttjar en standard cell kultur formulering (10% FBS, 1 x Penicillin/Streptomycin i DMEM). Baserat på tillgänglig litteratur angående maximera fettceller transkription, vi använde en specialiserad formulering (7 µM insulin, 30 µM dexametason, 1 x Penicillin/Streptomycin i M199 media)17. Denna formulering förbättrades de tidiga nivåerna av transkription, men nivåer minskat över tid. Vi tror att detta beror på att kroppen, adipocyter utsätts för en mängd olika kemiska signaler, ofta cykling mellan fed och utsvultna stater under loppet av en dag. Således bör det vara möjligt att förbättra den observerade transkriptionell profilen över tid genom att ytterligare optimera tillägg till vår cell kultur media.
SWAT skörd (Protocol, avsnitt 5) isolerar adipocyter från kulturen, minskar provvolymen och tar bort störningar från de omgivande ADSC arken. Detta kan föregå fettceller homogenisering (vilket är nödvändigt för protein eller nukleinsyra isolering) eller funktionella analyser av intakt adipocyter (såsom glykolys eller glukos upptag analyser). Alternativt, intakt SWAT plattan kan skördas immunocytochemical färgning, som tillåter ADSC arken att säkra WAT klustren till enskiktslager genom färgning processen. I det här fallet aspirera kultur media och fixa hela kulturen via standardprotokoll. Vi rekommenderar dock att lägga ett täckglas innan imaging för att platta de 3D fettceller kluster och förbättra resulterande bildkvaliteten.
Vi tror SWAT har stor potential som en drog som screening plattform. Tekniken är enkel, reproducerbar och utnyttjar konventionella vävnadsodling plattor. Drug screening experiment är därför körbar genom att lägga till en farmakologiskt aktiv förening odlingssubstratet. Adipocyter kan sedan skördas för att undersöka effekten av föreningen på genuttryck, epigenetiska profil, insulinkänslighet, etc. tillägg av miljögifter till odlingsmediet kan på samma sätt användas för att undersöka deras effekter på adipocyter. Eftersom SWAT gör det möjligt för forskaren att spåra enskilda fettceller kluster över tid, är det unikt lämpade att utvärdera en behandling som gör en synlig fenotypisk förändring till adipocyter. Ett framstående exempel skulle vara mänskliga fettceller ”browning”, vari en vit, lipid-lagra fettceller blir ”brynt” eller liknande till en termogena, multilocular bruna fettceller18. Detta är ett fenomen av potentiellt större klinisk relevans som har visats i musmodeller, men aldrig i en människa. Tillsammans odlade varianter på SWAT har också enorm forskning potential. SWAT är ett naturligt samarbete kultur-system som använder standard cell kultur brunnar. Man kan därför upprätthålla adipocyter bland andra kliniskt relevanta celltyper genom att ändra sandwiching celler eller genom att utnyttja vävnadsodling membran skär. Hepatocyter kan till exempel fungera som övre sandwiching cellagret att skärmen en drog som filtreras genom levern innan de når fettvävnaden. Jämväl, cancerceller kan odlas på ett membran skär över SWAT att undersöka hur adipocyter bidra till cancer patologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna det institutionella stödet från LSU Health Sciences Center, som finansierade projektet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x HBSS | Thermofisher | 14185052 | |
| Gelatin | Sigma-aldrich | G9391 | |
| Collagenase | Sigma-aldrich | C5138 | |
| Adenosine | Sigma-aldrich | A9251 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995065 | |
| M199 Media | Thermofisher | 11043023 | Phenol red-free |
| 250 µm Mesh Filter | Pierce | 87791 | |
| 0.2 µm Syringe Filter | Celltreat | 229747 | |
| 5 mL Luer-Lok syringes | BD | 309646 | |
| Metal Washers | These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3 g | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heated Equipment | |||
| Incubated Orbital Shaker | VWR | 10020-988 | Samples should be pitched at 45° angle to facilitate collagenase digestion |
| Heat Block | Set to 37-40 °C and placed under Biosafety Cabinet | ||
| Water Bath | Set to ~75 °C | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Specialized Plastics | |||
| Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell | Nunc | 174902 or 174901 | These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: <6 cm for 6 cm dish, <3.5 cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6 cm dish, 5.1 g for 6-well plate |
| Plastic Plunger Apparatus | These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics |
References
- Cawley, J., Meyerhoefer, C. The medical costs of obesity: An instrumental variables approach. Journal of Health Economics. 31 (1), 219-230 (2012).
- Pi-Sunyer, X.
- Smith, U. Morphologic studies of human subcutaneous adipose tissue in vitro. Anatomical Record. 169 (1), 97-104 (1971).
- Sugihara, H., Yonemitsu, N., Miyabara, S., Yun, K. Primary cultures of unilocular fat cells: characteristics of growth in vitro and changes in differentiation properties. Differentiation. 31 (1), 42-49 (1986).
- Sugihara, H., Yonemitsu, N., Toda, S., Miyabara, S., Funatsumaru, S., Matsumoto, T. Unilocular fat cells in three-dimensional collagen gel matrix culture. The Journal of Lipid Research. 29, 691-697 (1988).
- Hazen, S. A., Rowe, W. A., Lynch, C. J. Monolayer cell culture of freshly isolated adipocytes using extracellular basement membrane components. The Journal of Lipid Research. 36, 868-875 (1995).
- Fried, S. K., Kral, J. G. Sex differences in regional distribution of fat cell size and lipoprotein lipase activity in morbidly obese patients. International Journal of Obesity. 11 (2), 129-140 (1987).
- Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. The National Institutes of Health. Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline. Stem Cell Research and Therapy. 4, (2013).
- Wikswo, J. P. The relevance and potential roles of microphysiological systems in biology and medicine. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1061-1072 (2014).
- National Institutes of Health. NIH-CASIS Coordinated Microphysiological Systems Program for Translational Research in Space (#RFA-TR-18-001). , Available from: https://grants.nih.gov/grants/guide/rfa-files/RFA-TR-18-001.html (2017).
- Lau, F. H., Vogel, K., Luckett, J. P., Hunt, M., Meyer, A., Rogers, C. L., Tessler, O., Dupin, C. L., St Hilaire, H., Islam, K. N., Frazier, T., Gimble, J. M., Scahill, S. Sandwiched White Adipose Tissue: A Microphysiological System of Primary Human Adipose Tissue. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (3), (2018).
- Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and 'smart' polymers. Radiation Physics and Chemistry. 76, 1409-1413 (2007).
- Lin, J. B., Isenberg, B. C., Shen, Y., Schorsch, K., Sazonova, O. V., Wong, J. Y. Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).
- Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets. Journal of Visualized Experiments. (92), e51044 (2014).
- Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
- Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control. Langmuir. 20 (13), 5506-5511 (2004).
- Fried, S. K., Russell, C. D., Grauso, N. L., Brolin, R. E. Lipoprotein lipase regulation by insulin and glucocorticoid in subcutaneous and omental adipose tissues of obese women and men. Journal of Clinical Investigation. 92 (5), 2191-2198 (1993).
- Keipert, S., Jastroch, M. Brite/beige fat and UCP1 - is it thermogenesis? Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (7), 1075-1082 (2014).
