Summary
Tessuto adiposo bianco (WAT) ha gravi lacune nei suoi modelli di cultura primaria corrente, ostacolando lo sviluppo farmacologico e gli studi metabolici. Qui, presentiamo un protocollo per produrre un sistema adiposo microphysiological di WAT sandwiching tra fogli di cellule stromali. Questo costrutto fornisce una piattaforma stabile e adattabile per colture primarie di WAT.
Abstract
Tessuto adiposo bianco (WAT) svolge un ruolo cruciale nella regolazione della salute peso e tutti i giorni. Ancora, esistono limitazioni significative ai modelli disponibili colture primarie, i quali hanno fallito fedelmente ricapitolare il microambiente adiposo o estendere la vitalità WAT oltre due settimane. La mancanza di un modello affidabile coltura primaria ostacola gravemente ricerca nel WAT metabolismo e lo sviluppo di farmaci. A tal fine abbiamo utilizzato gli standard di NIH di un sistema di microphysiologic per sviluppare una nuova piattaforma per coltura primaria WAT chiamato 'SWAT' (Sandwich tessuto adiposo bianco). Superiamo la galleggiabilità naturale degli adipociti di interposizione macinate WAT cluster tra fogli di adiposo-ha derivato le cellule stromal. In questo costrutto, campioni WAT sono vitali oltre otto settimane nella cultura. SWAT mantiene l'ECM intatto, contatti cellula-cellula e pressioni fisiche delle condizioni in vivo WAT; Inoltre, SWAT mantiene un robusto profilo trascrizionale, sensibilità ai segnali chimici esogeni e funzione del tessuto intero. SWAT rappresenta un metodo semplice, riproducibile ed efficace della cultura adiposo primario. Potenzialmente, è una piattaforma ampiamente applicabile per la ricerca in fisiologia, fisiopatologia, metabolismo e sviluppo farmaceutico WAT.
Introduction
Il tessuto adiposo è l'organo primario dell'obesità, che trasporta annuali costi medici diretti tra $ 147 miliardi e $ 210 miliardi a US1. L'accumulo di tessuto adiposo contribuisce anche ad altre cause conducenti della morte come malattie cardiache, diabete di tipo II e alcuni tipi di cancro2. Modelli di coltura in vitro sono essenziali per gli studi metabolici e lo sviluppo di farmaci, ma i modelli attuali di ricerca di tessuto adiposo hanno carenze principali. Adipociti sono fragile, capace di galleggiare e cellule che non aderiranno alla plastica di coltura delle cellule e pertanto non possono essere coltivate utilizzando metodi di coltura cellulare convenzionale terminalmente differenziano. Dal 1970, diversi metodi sono stati utilizzati nei tentativi di superare queste barriere, compreso l'uso di vetrini coprioggetti, soffitto cultura, coltura di sospensione e matrici extracellulari3,4,5, 6 , 7. Tuttavia, questi metodi sono stati segnati da cellule morte e dedifferenziazione e vengono in genere utilizzati per non più di un periodo di studio di due settimane. Inoltre, questi modelli non tentare ricapitolare il microambiente adiposo nativo come non mantengono intatto ECM, le interazioni tra adipociti e stromal cellule di supporto, né le cellule contrattili forze esercitano sulla vicenda in in vivo WAT.
In assenza di un metodo di cultura adiposa primaria oro-standard, ricerca adiposa si affida principalmente differenziati pre-adipociti (diffAds). DiffAds sono multilocular, aderente e metabolicamente attivo. Al contrario, primari adipociti bianchi sono unilocular, nonadherent e dimostrano relativamente basso metabolismo. Il fallimento degli attuali modelli di cultura adiposa di ricapitolare la fisiologia del tessuto adiposo maturo sano è probabilmente un fattore importante in assenza di farmaci approvati dalla FDA che incidono direttamente adipocytes. Infatti, la mancanza di modelli di organo fisiologico in vitro è un grave problema in tutta la maggior parte dei organi e malattia.
Nel suo documento di posizione che annuncia la creazione del suo programma di Microphysiological Systems (MPS), il National Institutes of Health (NIH) ha riferito che il tasso di successo 2013 attraverso tutti gli studi clinici farmaceutici umani era solo 18% per la fase II e 50% per la fase III studi clinici8. Il programma MPS è progettato per affrontare direttamente l'incapacità di monocoltura in vitro di fisiologia umana modello. Il NIH definisce MPSs come sistemi di coltura composto umano primario o cellule staminali in costrutti 3D multicellulari che ricapitolano il funzionamento dell'organo. A differenza dei modelli riduzionisti di colture cellulari immortalizzate, omogenea, MPSs dovrebbe modellano accuratamente cellula-cellula, cellula farmaco, farmaco-farmaco e organo-droga interazioni9. A differenza dei metodi di coltura primaria a breve termine, NIH standard impongono sostenibilità MPS per 4 settimane in cultura8. Ulteriori dettagli del programma MPS possono essere trovati alla RFAs (#RFA-TR-18-001)10 di NIH.
Abbiamo sviluppato un semplice, romanzo, adattabile, e poco costoso MPS adiposo definito "Sandwich tessuto adiposo bianco" (SWAT)11. Superiamo la galleggiabilità naturale degli adipociti di "sandwiching" macinato primario del tessuto adiposo tra fogli di adiposo-ha derivato le cellule stromale (CSTA) (Figura 1). Il costrutto 3D risultante ricapitola il contatto cellula-cellula e il microambiente adiposo nativo circondando adipocytes maturi con una popolazione di cellule di supporto del adipocyte naturale. SWAT è stato convalidato da dimostrare 8-settimana sostenibilità, risposta alla segnalazione esogeno, secrezione di adipokine e attecchimento in un modello animale.
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Protocol
Tutte le attività sono state effettuate in aderenza ai protocolli 8759 # e #9189, approvato dall'ufficio di LSUHSC-NO. IRB Tutto il lavoro animale è stato eseguito in aderenza al protocollo #3285 approvato dall'ufficio IACUC LSUHSC n.
1. semina di interposizione di strati delle cellule
Nota: Vedere la Figura 1.
- CSTA seme al circa il 80% confluency in piastre di coltura tissutale (6cm o piastre da 6 pozzetti). Per ogni pozzetto di SWAT desiderato, seme 1 coltura convenzionale ben e 1 Pozzo di dimensione corrispondente sulla piastra di plastica rivestita con poly(N-isopropylacrylamide (pNIPAAm) di coltura del tessuto.
Nota: Di conseguenza, una piastra a 6 pozzetti di SWAT richiederà semina di cellule su una piastra di coltura di tessuti standard da 6 pozzetti (strato di base) e una piastra 6 pozzetti rivestite di pNIPAAm coltura tissutale (strato superiore). piastre rivestite con pNIPAAm possono essere acquistati in commercio o prodotti in laboratorio12,13,14. - Mantenere CSTA a 37 ° C e 5% CO2 in di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) completati con 10% FBS e 1 x penicillina/streptomicina. Cambiare supporto ogni 2 giorni.
- Permettono che le cellule a fondersi fino a quando non diventano 100% confluenti e prendere su un reticolo striato (circa 6 – 8 giorni).
Nota: Queste cellule dovrà funzionare come un foglio di singola cellula intatta al fine di stabilizzare il tessuto adiposo capace di galleggiare. Al momento di semina con WAT saranno frammento cellule insufficientemente confluenti.
2. preparazione della SWAT forniture
- Preparare diverse aliquote di 10 mL di 1 x matassa equilibrato sale soluzione (HBSS); preparare abbastanza per il numero di piastre con volume di ricambio desiderato.
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Preparare l'apparato di stantuffo per la semina di SWAT. Costruire lo stantuffo con semplice plastica acrilica composta da uno stelo collegato a un disco rotondo. Assicurarsi che si inserisce all'interno della circonferenza dei pozzi di coltura del tessuto (diametro: < 6 cm per piatto di 6cm, < 3,5 cm per piastra a 6 pozzetti; massa approssimativa: 6,7 g per un piatto di 6 cm, 5,1 g su una piastra a 6 pozzetti).
- Preparare i tuffatori supplementare per garantire che la procedura verrà eseguito senza problemi in caso che c'è un problema con qualsiasi stantuffo individuo.
- Avvolgere nastro di laboratorio intorno al bordo del disco lo stantuffo, almeno 2 x, per impedire la fuoriuscita della soluzione di gelatina.
- Spruzzare un armadio di sicurezza biologica (BSC) con 70% EtOH. Spray giù un rack di tubo conico da 15 mL all'interno il BSC con provette coniche da vuoto, scoperchiata 15ml; tubi per proteggere il posizionamento dei tuffatori gelatina.
- Spruzzare ogni stantuffo nastro avvolto accuratamente con 70% EtOH e posto in una provetta conica da 15mL sulla cremagliera. Spruzzare le rondelle di metallo (massa approssimativa 6,3 g) e metterli sul rack insieme ad un paio di pinze uncinate; le rondelle aggiungerà peso per i tuffatori durante la semina di SWAT.
- Chiudere il battente BSC e accendere il UV luce per facilitare l'asciugatura e sterilizzazione.
Nota: Idealmente, condurre questo passaggio 24 h prima della semina di SWAT. In alternativa, eseguire il processo il giorno di tessuto collezione/SWAT semina; in questo caso, tuttavia, consentire 15 – 45 min per asciugatura e sterilizzazione UV.
3. preparazione della gelatina tuffatori — applicazione per fogli di cellula superiore
- Riscaldare un bagno di acqua a 75 ° C.
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Preparare la soluzione di gelatina aggiungendo 0,75 g di gelatina in polvere per 10 mL di brodo di 1 x HBSS. Sotto cappa aspirante aggiungere 100 µ l di 1 M NaOH per equilibrare il pH della soluzione.
- Aggiungere le scorte di 10 mL per il bagno di acqua e agitare vigorosamente ogni 5 min fino a quando la polvere si scioglie in soluzione. Mirano a sciogliere la gelatina in polvere presto dopo l'aggiunta al bagno d'acqua riscaldata.
- Accendere il ventilatore BSC, spegnere la luce UV e sollevare il telaio. Spruzzare la superficie BSC e preparare il filtro forniture (siringhe luer-lock 5ml e filtri per siringa 0,2 µm). Preparare più filtri per la tensione in modo efficiente sufficienti volumi di gelatina per applicare a stantuffi.
- Quando la soluzione di gelatina non raggiunge una consistenza omogenea, filtrare la soluzione e applicarlo per i tuffatori. Caricare la siringa con gelatina. Applicare la gelatina per i tuffatori di plastica attraverso il filtro della siringa (~2.5 mL per una piastra a 6 pozzetti, ~4.5 mL per un piatto di 6 cm) e lasciare per solidificare (~ 20 min).
- Una volta che la gelatina è solida, scartare il nastro dal bordo dei tuffatori. Con il forcipe uncinato, rimuovere la gelatina dal bordo esterno del pistone (cioè, i bordi sollevati del menisco). Assicurarsi che la gelatina restante nel centro dello stantuffo sia completamente a livello per massimizzare il contatto con lo strato ADSC.
- Una volta che la gelatina in eccesso viene rimosso, applicare delicatamente i tuffatori di gelatina alle piastre rivestite con pNIPAAm ADSC. Utilizzare le rondelle di metallo per pesare giù lungo lo stantuffo. Non tosare strati delle cellule durante l'applicazione i tuffatori.
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Lasciare i tuffatori sui fogli delle cellule per 1,5 h a temperatura ambiente. Incubare le piastre/stantuffi in un bagno di acqua ghiacciata per 1,5 h per completare la dissociazione dello strato di cellule dalla superficie della placca pNIPAAm-rivestito.
- Prestare attenzione durante l'incubazione in bagno di ghiaccio; non lasciare che il bagno di ghiaccio contaminare il media delle cellule durante l'incubazione.
- Al termine dell'incubazione, pulire il fondo delle piastre rivestite con pNIPAAm per rimuovere l'acqua non sterile.
4. elaborazione del tessuto adiposo bianco
- Quando si raccolgono tessuto adiposo umano dalla sala operatoria, è possibile mantenere tutti i campioni in un contenitore sterile che è il ghiaccio fino a SWAT è quello di essere seminato. Aggiungere mezzi di manutenzione sterile, ad esempio tampone fosfato salino (PBS), contenitore di tessuto adiposo per la stabilità dei tessuti.
- Aggiungere cella fredda di coltura per provette per microcentrifuga da 1,5 mL per ogni pozzo/piatto di essere seminato (100 µ l per una piastra a 6 pozzetti, 200 µ l per un piatto di 6 cm).
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Tritare il tessuto adiposo.
- Per segmenti di tessuto adiposo solido, procedere come segue.
- Lavare grandi segmenti del tessuto adiposo 3 x in PBS sterile e rimuovere quanto più PBS come possibile.
- Grossolanamente tritate tessuto con forcipe e rasoio sterile e rimuovere quanto più sistema vascolare e la fascia come possibile (vedi discussione per maggiori dettagli).
- Tritare finemente il grasso con il rasoio fino a quando macinata tessuto assume consistenza liquida.
Nota: Idealmente tessuto apparirà omogeneo con nessun visibili singoli segmenti di WAT anche se questo non è sempre possibile.
- Processo eseguito come segue.
- Sotto il BSC, nastro di garza sterile sulla cima di un becher e porre questo Becher in un bicchiere più grande per raccogliere il liquido in eccesso.
- Utilizzando una pipetta sierologica di 25 mL, disegnare tanto lipoaspirato come necessario e applicarlo alla superficie della garza sterile. Applicare PBS direttamente a questa superficie per lavare lipoaspirated grasso e rimuovere il sangue in eccesso e dei residui del lipido.
- Utilizzare pinze per recuperare dei tessuti drenati, trasferirlo in una superficie di macinazione sterile e tritare il lipoaspirato.
- Per segmenti di tessuto adiposo solido, procedere come segue.
- Utilizzare un rasoio sterile per tagliare l'estremità distale del p1000 puntali per trasferire macinato tessuto; Questo ridurrà la sollecitazione di taglio che può portare a lisi degli adipociti. Una volta raggiunta una consistenza adeguata del tessuto è possibile trasferire il volume desiderato del tessuto macinato per ogni provetta da 1,5 mL (300 – 400 µ l per piastra a 6 pozzetti, 500 – 600 µ l per piatto 6 cm). Mix tritato WAT e media brevemente nei tubi.
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Prendere le piastre di base ADSC e decantare/aspirare i media. Sostituire il supporto con la miscela di WAT/media da ogni provetta da 1,5 mL.
- Rimuovere i tuffatori di gelatina dalle piastre rivestite con pNIPAAm delicatamente e applicarli alla miscela WAT sulle piastre ADSC base. Esaminare il monostrato delle piastre rivestite con pNIPAAm sotto un microscopio per confermare la separazione cellulare.
- Impostare un blocco di calore a circa 37-40 ° C sotto il BSC. Con i tuffatori ancora al suo posto, è possibile spostare le piastre alla superficie del blocco termico. Aggiungere 2 – 3 mL di terreni di coltura riscaldato per incubare le cellule e facilitare la fusione della gelatina.
- Dopo circa 30 min, rimuovere delicatamente i tuffatori dalla superficie della placca. Sostituire i coperchi delle piastre di coltura del tessuto base e spostare in un'incubatrice di coltura cellulare. Una volta che la gelatina ha completamente liquefatto a 37 ° C, aspirare e sostituire mezzi di coltura delle cellule.
- Mantenere la SWAT a 37 ° C e 5% di CO2 nel medium M199 rosso fenolo-senza con insulina di 7 µM, 30 µM desametasone, 1x penicillina/streptomicina. Mantenere circa media di 2 mL per piastre da 6 pozzetti e 3 mL per piatti di 6 cm. Cambiare supporto ogni 2 giorni.
5. SWAT Harvest
- Preparare la collagenosi (0,5 mg/mL collagenosi, 500 adenosina nM, in PBS) aliquote in provette coniche da 15 mL (volume approssimativo di 10 mL). I tubi di congelare e conservare a-20 ° C.
- Qualsiasi terreno di coltura dalle cellule di aspirare, lavare 1x con PBS e quindi aspirare PBS. Preparare le aliquote di collagenasi di loro scongelamento in bagnomaria a 37 ° C.
Nota: Idealmente, la soluzione di collagenasi raggiungerà 37 ° C; subito dopo, aggiungere del tessuto. -
Aggiungere tutto il tessuto dalla piastra SWAT le aliquote individuali. SWAT utilizzando una scrapper sterile cella di raccolta e trasferirlo alle aliquote della collagenosi con una punta di pipetta p1000 di cut-off. Aggiungere tessuto direttamente le provette coniche da 15 mL contenente soluzione della collagenosi.
- In alternativa, incubare la miscela di tessuto/collagenasi in una provetta conica da 50 mL; alla superficie maggiore faciliterà ulteriormente la digestione enzimatica.
- Inserire le provette campione in un agitatore orbitale incubato in un angolo di 45°. Incubare a 200 giri/min, a 37 ° C per 30 – 60 min.
- Posto a 250 µm filtro a rete in una nuova provetta conica 15 mL per raccolta. Versare la soluzione del adipocyte digerito attraverso il filtro.
Nota: Questo permetterà tutte le celle di passare attraverso mentre filtrando il tessuto fibroso. - Consentire il flusso-attraverso a riposare per 5 min a temperatura ambiente per consentire per separazione di fase.
Nota: Gli adipociti galleggerà verso l'alto della soluzione, mentre le cellule stromale adipose (ASCs) si depositerà nelle fasi più bassa. Centrifugazione per 5 min a 500 x g può anche massimizzare la separazione cellulare o raccolto che circondano CSTA nel pellet. -
Utilizzando un puntale di cut-off p1000, trasferire gli adipociti (il livello fluttuante nella superiore della soluzione della collagenosi) in una provetta di raccolta microcentrifuga da 1,5 mL. Prendere ~ 250 µ l in un momento, pipettare lentamente lungo il bordo della provetta per raccogliere gli adipociti.
- Ruotare lentamente il tubo mentre raccoglieva gli adipociti per massimizzare il recupero delle cellule aderenti all'interno. Tenere disegno più cellule fino a quando il tubo per microcentrifuga da 1,5 mL è completo.
- Rimuovere il liquido in eccesso da adipociti isolati utilizzando una siringa collegata ad un ago (~ 21). Immergere l'ago sotto il livello del adipocyte fluttuante. Agitare l'ago brevemente per rimuovere eventuali cellule aderenti all'albero dell'ago e quindi attendere che gli adipociti sloggiati a galleggiare verso l'alto.
- Disegnare lentamente il liquido in eccesso, facendo attenzione ad evitare la rimozione involontaria degli adipociti. Utilizzare graduazioni di tubo del microcentrifuge per isolare costantemente i volumi di campione (ad esempio,. 0,1 mL per ogni campione).
- Utilizzare le cellule isolate per estrazione DNA/RNA, analisi di assorbimento del glucosio, dosaggio di lipolisi, ecc.
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Representative Results
Attuabilità della SWAT inizialmente è stata valutata da formazione immagine seriale campo chiaro di singoli WAT cluster (n = 12) circa 7,6 settimane. Cluster è rimasto protetti in posto su monostrato in tutto questo tempo. Lievi cambiamenti morfologici sono stati osservati con singoli adipociti orditura leggermente o posizioni di spostamento. Tuttavia, adipociti né diventano multilocular nel corso del tempo, che indica una mancanza di dedifferentiation, né fatto essi presentano segni visibili di morte delle cellule come blebbing cellulare, Lisi o frammentazione (Figura 2). Identità del adipocyte di cluster è stata confermata su due-settimana-vecchio SWAT con macchia del lipido Nilo rosso (NR). Chiara NR macchiatura dei cluster del adipocyte unilocular hanno indicato che questi erano infatti adipociti con membrane intatte, anziché artefatto, cisti o adipociti morti. L'assenza di macchiatura NR nei fogli ADSC circostanti indica che queste cellule non sono accumulo dei lipidi e pertanto non differenziandosi verso un lignaggio adipogenico (Figura 3a). Ioduro di propidio è stato effettuato su 53 giorno-vecchio SWAT. Esclusione della macchia all'interno dei cluster del adipocyte avanzata timepoints dimostra una mancanza di morte delle cellule (Figura 3b). Macchia di olio-Red-O (ORO) è stato effettuato su 51 giorno-vecchio SWAT con la localizzazione di macchia del lipido all'interno dei cluster del adipocyte fisso, indicando che SWAT adipocytes mantenere vitalità con adipociti intatti anche a timepoints avanzate (Figura 3C).
Immunocitochimica (ICC) è stato effettuato per dimostrare l'espressione della proteina previsto e localizzazione dei marcatori adipocita maturo all'interno di SWAT. Intatto SWAT piastre erano macchiate con gli anticorpi contro perilipina (ab3526, diluizione 1: 200), Ppary2 (sc-166731, diluizione di 1: 100) e FABP4 (ab92501, 1:1,000 diluizione). Immagini confocal di 12 giorno-vecchio SWAT ha dimostrato previsto localizzazione della perilipina sulla superficie della gocciolina del lipido (Figura 4a). Microscopia di fluorescenza di 3 giorno-vecchio SWAT con la macchia di contatore del lipido BODIPY dimostrato FABP4 localizzazione all'interno del citoplasma (Figura 4b), e sovrapposizione di segnale da PPARG e DAPI macchiatura dimostrata localizzazione PPARG al nucleo ( Figura 4c).
Profilo trascrizionale SWAT è stato valutato in tessuto seminato da più soggetti (n = 4 donatori). Al momento della raccolta, una parte del tessuto adiposo è stata utilizzata per una previsione estrazione del RNA (d0), mentre il resto è stato usato per piastre di SWAT di seme. Queste tavole sono state poi raccolte a 24 h, 14 giorni e 28 giorni in SWAT cultura. One-Step trascrizione d'inversione quantitativa reazione a catena della polimerasi (RT-qPCR) è stato effettuato per determinare i livelli di trascrizione. Sei geni chiave degli adipociti sono stati esaminati: PPARG, FABP4, LPL, CEBPA, HSL e ADIPOQ (Figura 5). ACTB è stato utilizzato come controllo interno e livelli trascrizionali sono stati espressi come percentuale di espressione basale pari soggetto (d0). Tutti i geni hanno dimostrato robusta trascrizione nello SWAT, sebbene livelli ha fatto tendenza verso il basso nel corso del tempo. Noi crediamo che osservato profili trascrizionali potrebbero essere migliorati con ulteriore ottimizzazione dei media come elaboriamo nella sezione discussione.
Funzione endocrina basale è stata valutata sulle culture stesse utilizzate per il profilo trascrizionale. Surnatante è stato raccolto da piastre di SWAT e i livelli di leptina sono stati misurati utilizzando analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) (ab100581). SWAT visualizzata la secrezione di leptina basale ai giorni 1, 14 e 28 (Figura 6a). Fogli di ADSC erano tenute in parallelo con SWAT piastre come controllo (cioè, fogli di ADSC senza intramezzato WAT). Secrezione di leptina non potrebbe essere rilevata in questi controlli (dati non mostrati).
Per determinare se SWAT potrebbe mantenere la capacità di risposta viscoelastica nel corso del tempo, è stata esaminata la lipolisi (n = 4). Per valutare la capacità lipolitica inducibile, una parte del raccolto di recente WAT (d0) è stata macinata e adipociti sono stati isolati enzimaticamente (simili a SWAT raccolto nel protocollo sezione 5), mentre il resto è stato utilizzato per SWAT piastre del seme. Adipociti isolati sono state incubate per 3 h a 37 ° C a 300 µ l di 2% albumina di siero bovino priva di acidi grassi in HBSS con 100 µM forskolin, epinefrina 1 µM o buffer di controllo. Livelli di glicerolo nei media raccolti è stata misurata con il reagente di glicerolo libero. SWAT è stato poi raccolto in giorni 1 e 5 e lipolitica capacità sono stati valutati nello stesso modo. Stimolazione chimica aumentato rilascio di glicerolo punti temporali significativamente in tutti e tre (Figura 6b): rilascio di glicerolo di adipociti trattati è stata incrementata in d0 WAT 82 ± 46% (p = 0,01), 1-giorno SWAT di 577 ± 387% (p = 0,02) e cinque giorni SWAT di 348 ± 343% (p = 0,03). glicerolo livelli medi nei adipocytes stimolati erano molto simili in tutti e tre punti temporali: primario WAT 5.2 ± 0,8, 1 giorno SWAT 4.4 ± 1,9 e 5 giorni SWAT 4.8 ± 1,8 µ g Glicerolo/mg proteina totale. Livelli medi di glicerolo nel controllo (cioè, lipolisi basale) erano relativamente alti in WAT appena raccolti (d0) rispetto alle cellule di SWAT-raccolto. Questo può essere dovuto lo sforzo aumentato al tessuto WAT a d0 durante l'asportazione chirurgica, il trasporto al laboratorio e tritare. Tuttavia, questi esperimenti non dimostrano alcuna diminuzione nella capacità lipolitica in SWAT a 1 o 5 giorni rispetto al WAT appena raccolti.
SWAT è stato dimostrato per essere in grado di trapianto e il ripristino in un modello murino (n = 4) come una dimostrazione della funzione del tessuto complesso, tutto. È anche una possibile applicazione della piattaforma dovrebbe un ricercatore vuole utilizzare SWAT per manipolare WAT in vitro prima del trapianto del tessuto in un modello animale. SWAT è stato coltivato per 10 giorni e raccolte utilizzando il protocollo standard; adipociti isolati dalle piastre di SWAT sono stati quindi caricati in una siringa da 1 mL (senza ago). Un'incisione è stata fatta sotto la pelle dal lato dorsale di un topi che esprimono eGFP immunocompromessi (cenno del capo. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl Tg(CAG-EGFP)1Osb/SzJ). Questo ha creato una piccola tasca sottocutanea dorsale in cui gli adipociti SWAT-coltivati sono stati iniettati con la siringa e la tasca è stata suturata poi chiuso. Dopo il post-trapianto di 10 giorni, i topi sono stati sacrificati. I trapianti erano chiaramente visibili e prontamente recupero (Figura 7a). Sia il trapianto recuperato e un deposito di grasso controlaterale del mouse sono stati fissati, paraffina incorporato e sezionato. Immunohistochemistry è stato effettuato sugli scivoli sezionati con anticorpi primari di GFP (A10262, diluizione 1: 100) e umana PLIN (sc-390169, diluizione 1: 100). L'anticorpo anti-PLIN selezionato è stato validato sperimentalmente per macchiare PLIN umana ma non il mouse. Adipociti dal trapianto recuperato erano circa 50 – 120 µm in dimensione, che è l'intervallo previsto per adipocytes umani, ed erano completamente negative per GFP (Figura 7b). Tuttavia, circa il 31% degli adipociti erano positive per PLIN umana, che indica successo attecchimento nell'ospite. Gli adipociti nei depositi di grasso del mouse erano dimensioni 20 – 40 µm, che è coerente con adipociti del mouse, mentre la colorazione completamente positivo per GFP e completamente negativo per PLIN umano (Figura 7C). ADSC lenzuola (con nessun WAT intramezzato) erano raschiati da piastre di coltura delle cellule e trapiantate in topi come controllo. Tuttavia, questi non ha dato alcun tessuto recuperabile (dati non mostrati). Questo ha indicato che gli adipociti recuperati erano dal maturo SWAT coltivate e non il risultato di CSTA umano differenziato.
Figura 1: Metodo SWAT The. (un) schematico di SWAT mostrando il trasferimento di un foglio di ASCs eGFP-contrassegnati da una cultura di tessuto rivestito pNIPAAm piatto su un foglio in secondo luogo, senza etichetta di ASCs coltivate su un piatto di coltura di tessuti standard. Macinate, primaria umana WAT è inserita tra i 2 fogli di ASC. (b), fluorescenza microscopia dimostrando campo chiaro, GFP e unite canali di un SWAT creato dalla tecnica descritta in (a). Barra della scala = 100 µm. (c) fotografia digitale di un rappresentante, 5 giorno-vecchio SWAT, coltivate in una piastra a 6 pozzetti standard. Il grande volume di WAT è stabilmente fissato al fondo del pozzo. Nella figura viene modificata da Lau et al. 11 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: SWAT rimane vitale a 8 settimane nella cultura. Campo chiaro seriale imaging di un singolo cluster SWAT oltre 55 giorni non dimostra nessun cambiamenti morfologici costanti con la morte delle cellule. Scala bar = 100 µm. figura viene modificato da Lau et al. 11 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: SWAT rimane vitale a più maggior di 50 giorni. (un) Nilo rosso colorazione dimostra colorazione restrizione a SWAT coltivate per 15 giorni, indicando adipociti vitali dal vivo. Cellule stromali circostanti non hanno macchiato. Nella figura sono al 40 X ingrandimento e la barra della scala = 100 µm. (b) propidio ioduro (PI) colorazione della SWAT coltivate per 53 giorni rivela completa esclusione di PI, che indica nessuna morte degli adipociti; Barra della scala = 100 µm. (c) Oil-Red-O colorazione di un 51 giorno-vecchio SWAT dimostra restrizione dei lipidi neutri per gli adipociti, che indica la stabilità a lungo termine delle membrane cellulari degli adipociti. Nella figura viene modificata da Lau et al. 11 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: immunocitochimica dimostra che SWAT macchie positivamente per gli indicatori a cellula adipocita maturo con localizzazione previsto. (un) confocale microscopia di 2 settimana-vecchio SWAT ha rivelato cellule uniloculare PLIN + umane con localizzazione alla superficie della gocciolina del lipido. Barra della scala = 100 µm. (b) microscopia fluorescente di 3 giorno-vecchio SWAT ha rivelato FABP4 + cellule umane con la localizzazione per il citoplasma e (c) cellule PPARγ + con localizzazione al nucleo delle cellule. Barra della scala = 100 µm. figura è stato modificato da Lau et al. 11 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: SWAT mantiene l'espressione genica adipocyte chiave identità. SWAT mazzi erano collagenosi digerita dopo 1, 14 e 28 giorni nella cultura e nell'espressione genica determinata dalla RT-qPCR. RT-qPCR dimostra che SWAT 1-giorno-vecchio e 14-giorno-vecchio mantenere alti livelli di (un) PPARG, (b) FABP, (c), HSL, (d) CbEBPA, (e), LPL e (f), ADIPOQ. ACTB è stato utilizzato come gene di riferimento. Barre di errore = errore standard. Nella figura viene modificata da Lau et al.. 11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: SWAT basalmente secerne adipochine che fisiologicamente risponde alla stimolazione della catecolammina. (un) ELISA quantificazione 24h basale della secrezione di leptina non mostra alcun cambiamento significativo dopo 28 giorni nella cultura. (b) la stimolazione adrenergica con epinefrina e forskolin genera una risposta significativa glicolitica in WAT primario appena raccolte (1.7 x) e soggetto-abbinati SWAT a 1 e 5 giorni nella cultura. Giorno 1 SWAT ha risposto allo stimolo delle catecolamine con un 6.3-fold aumento sopra basale glicolisi mentre giorno 5 SWAT ha dimostrato un 3.3-fold aumento sopra glicolisi basale. Glicolisi stimolata non era significativamente differente in SWAT rispetto al WAT fresco abbinati (p = 0,53, n = 4). Barre di errore = errore standard. Figura è modificate Lau et al. 11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: SWAT può essere reimpiantati in vivo, dimostrando l'intero tessuto funzione conservata. (un) SWAT è stato prontamente visualizzati 10 giorni dopo il trapianto in un topo immunocompromessi (asterisco). SWAT aveva impiantato non con successo, entro 10 giorni la SWAT necrotica sarebbe stato liquefatto. (b) le sezioni di SWAT recuperati hanno dimostrato grande adipocytes unilocular (diametri da 50 a 120 µm) che erano eGFP-. 31,3% degli adipociti erano umano PLIN +. Il PLIN + adipocytes umani hanno teso ad essere più piccoli, che si adatterebbe con le osservazioni cliniche di innesto grasso in esseri umani dove adipociti più piccoli sono più probabilità di sopravvivere il trasferimento. Barra della scala = 100 µm, ingrandimento X 200. (c), grasso controlaterale pastiglie prelevate da stessi topi ha dimostrato molto più piccoli adipocytes (20 – 40 µm) ed erano umano PLIN-. Barra della scala = 100 µm, ingrandimento X 200. Nella figura è stata modificata da Lau et al. 11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo dettaglia l'uso di CSTA panino la maggior parte del tessuto adiposo umano bianco; linee cellulari umane di ADSC possono essere isolate tramite protocolli ben stabiliti15. Tuttavia, il sistema può essere adattato per esigenze di ricerca individualizzata (ad esempio utilizzando cellule di 3T3L-1 al mouse panino WAT). Questo processo comporta la manipolazione del tessuto umano primario. Precauzioni di sicurezza standard dovrebbero essere impiegati; gestire tessuti umani come agenti patogeni BSL-2 (ad es., HIV, HepC). Gestire solo tessuto direttamente sotto un BSC. Indossare tutti gli appropriati PPE come dettato dalle norme di sicurezza istituzionale — doppie guanti sono altamente raccomandati. Disinfettare correttamente tutte le forniture e rifiuti con 10% di candeggina soluzione o soluzione di etanolo al 70% prima di riutilizzo o smaltimento.
Il primo passo fondamentale nella cultura SWAT è procurare e mantenere piastre rivestite con pNIPAAm coltura del tessuto. Tali piastre sono commercialmente disponibili, o possono essere prodotti attraverso metodi consolidati12,13,14. Queste piastre sono superfici di coltura delle cellule termosensibile. Sopra la temperatura critica (~ 32 ° C), la superficie è idrofobica e cellule aderirà, simile a altra plastica trattata per coltura del tessuto. Tuttavia, sotto questa temperatura critica, la superficie diventa idrofila e le cellule dissocierà dalla superficie plastica16. Di conseguenza, si dovrebbe prestare attenzione a stabilire: 1) quanto velocemente un tipo dato delle cellule dissocierà da strato monomolecolare prima di raggiungere la piena confluency di (cioè, durante i cambi di media normale) e 2) il tempo necessario per abbassare la temperatura con la gelatina stantuffo applicato alla piastra rivestita con pNIPPAm, per garantire che il foglio di intera cella si dissocia. Le modifiche di supporto devono essere eseguite con media riscaldato a 37 ° C; Se le cellule sono inclini alla dissociazione rapida, è possibile eseguire modifiche di supporto su un blocco di calore impostato a 37 ° C sotto il BSC.
Il secondo passaggio critico sta elaborando il tessuto adiposo per preparare per la semina di SWAT. Abbiamo effettuato la nostra caratterizzazione tritacarne WAT con forcipe sterilizzato e rasoi sterilizzati. Tuttavia, fascia umana non può essere tagliato facilmente con un rasoio. Massimizzando il rapporto del adipocyte-a-fascia è importante per mantenere quanto più tessuto adiposo all'interno SWAT come possibile per un periodo a lungo termine. Grandi pezzi della fascia intatto impedirà contatto cellula-cellula tra CSTA e adipociti, che è essenziale a mantenere SWAT insieme. Quantità eccessive della fascia può anche avere un effetto "tirando su un thread". Considerando che un singolo cluster WAT possibile dissociare da un piatto senza intaccare i cluster vicini, più cluster collegati dalla fascia può tirare abbastanza cluster fuori un monostrato per rendere un SWAT bene inutilizzabile. Liposuzione, che coinvolge le mezzelune meccanizzata di WAT, può eludere questo problema come fascia è finemente tritato durante la chirurgia. Tuttavia, durante la liposuzione, i pazienti sono ordinariamente trattati con alte dosi di adrenalina; le possibili conseguenze di questo trattamento sui tessuti (ed esperimenti successivi) devono essere contabilizzate durante lo studio.
Il passaggio finale critico nella cultura SWAT sta selezionando una media cultura sperimentale. Abbiamo eseguito i nostri esperimenti di caratterizzazione iniziale utilizzando una formulazione di cultura cella standard (10% FBS, 1 x penicillina/streptomicina in DMEM). Tuttavia, basato sulla letteratura disponibile per quanto riguarda massimizzando la trascrizione del adipocyte, abbiamo usato una formulazione specializzata (insulina di 7 µM, 30 µM desametasone, 1x penicillina/streptomicina M199 Media)17. Questa formulazione migliorata i primi livelli di trascrizione, ma i livelli sono diminuito nel corso del tempo. Crediamo che questo sia perché nel corpo, adipociti sono esposti a una vasta gamma di segnali chimici, spesso tra stati nutriti e affamati nel corso di una giornata in bicicletta. Così, dovrebbe essere possibile migliorare il profilo trascrizionale osservato nel corso del tempo ottimizzando ulteriormente i supplementi per i nostri terreni di coltura delle cellule.
SWAT raccolto (protocollo, sezione 5) isolati adipocytes dalla cultura, riduce il volume del campione e rimuovendo le interferenze dai fogli ADSC circostanti. Questo può essere preceduto da omogeneizzazione degli adipociti (che è necessario per l'isolamento di proteine o acidi nucleici), o saggi funzionali di intatto adipociti (ad esempio di analisi di assorbimento di glicolisi o glucosio). In alternativa, la piastra SWAT intatta può essere raccolto per macchiatura immunocytochemical, che permette i fogli ADSC garantire ai grappoli WAT di strato monomolecolare durante tutto il processo di colorazione. In questo caso, aspirare i terreni di coltura e difficoltà tutta la cultura tramite protocolli standard. Tuttavia, si consiglia di aggiungere un coprioggetto in vetro prima dell'imaging per appiattire i cluster del adipocyte 3D e migliorare la qualità dell'immagine risultante.
Crediamo che la SWAT ha grande potenziale come una piattaforma di screening di stupefacenti. La tecnica è semplice, riproducibile e utilizza piastre di coltura di tessuti convenzionali. Pertanto, gli esperimenti di screening droga sono eseguibili aggiungendo un composto farmacologicamente attivo al terreno di coltura. Adipociti possono quindi essere raccolte per esaminare l'effetto del composto su espressione genica, profilo epigenetico, sensibilità all'insulina, ecc. , che l'aggiunta di tossine ambientali al terreno di coltura allo stesso modo può essere utilizzato per esaminare i loro effetti sugli adipociti. Perché SWAT consente al ricercatore di monitorare i cluster del adipocyte individuali nel tempo, è in grado di valutare un trattamento che rende un cambiamento fenotipico visibile ai adipocytes. Un esempio prominente sarebbe degli adipociti umani "browning", in cui un adipocita bianco, lipido-memorizzazione diventa "rosolato" o simile ad un termogenico, multilocular del adipocyte marrone18. Si tratta di un fenomeno potenzialmente maggiore rilevanza clinica che è stata dimostrata in modelli murini, ma mai in un essere umano. Co-coltivate variazioni su SWAT anche tengono ricerca tremendo potenziale. SWAT è un sistema di co-coltura naturale che utilizza pozzi cultura cella standard. Di conseguenza, uno può mantenere gli adipociti tra altri tipi di cellule clinicamente rilevanti modificando le cellule sandwiching o utilizzando inserti di membrana di coltura del tessuto. Ad esempio, gli epatociti potrebbero funzionare come strato di cellule sandwiching superiore allo schermo di un farmaco che viene filtrato attraverso il fegato prima di raggiungere il tessuto adiposo. Allo stesso modo, le cellule tumorali potrebbero essere coltivate su un inserto di membrana sopra SWAT per esaminare come adipocytes contribuire alla patologia del cancro.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori si desidera ringraziare il supporto istituzionale fornito da LSU Health Sciences Center, che ha finanziato il progetto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x HBSS | Thermofisher | 14185052 | |
| Gelatin | Sigma-aldrich | G9391 | |
| Collagenase | Sigma-aldrich | C5138 | |
| Adenosine | Sigma-aldrich | A9251 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995065 | |
| M199 Media | Thermofisher | 11043023 | Phenol red-free |
| 250 µm Mesh Filter | Pierce | 87791 | |
| 0.2 µm Syringe Filter | Celltreat | 229747 | |
| 5 mL Luer-Lok syringes | BD | 309646 | |
| Metal Washers | These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3 g | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heated Equipment | |||
| Incubated Orbital Shaker | VWR | 10020-988 | Samples should be pitched at 45° angle to facilitate collagenase digestion |
| Heat Block | Set to 37-40 °C and placed under Biosafety Cabinet | ||
| Water Bath | Set to ~75 °C | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Specialized Plastics | |||
| Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell | Nunc | 174902 or 174901 | These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: <6 cm for 6 cm dish, <3.5 cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6 cm dish, 5.1 g for 6-well plate |
| Plastic Plunger Apparatus | These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics |
References
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