Her præsenterer vi en protokol for at bruge O-formede fartøjer, specialiserede for suspension kulturer af cellulære aggregater med orbital ryster. De HEK293 celler dyrkes i denne taske danne mere homogene aggregater end dem, der dyrkes i traditionelle kultur fartøjer.
Suspension kulturer af pattedyr celle aggregater er påkrævet for forskellige applikationer i medicinsk og bioteknologisk felter. Den disponible taske-baseret metode er en af de simpleste teknikker for masseproduktion af cellulære aggregater, men det beskytter ikke kulturer mod overdreven sammenlægning, som opstår, når de samles nederst i midten af kultur fartøj. For at løse dette problem, udviklet vi en O-formede parabol og et O-formet taske, som ikke indeholder en central region. Aggregater dyrkes i enten O-formede kultur fartøj var mærkbart mere ensartede i størrelse end aggregater vokset i konventionelle fartøjer. Histologiske analyser viste, at aggregater i konventionelle kultur retter indeholdt nekrotisk kerner sandsynligvis forårsaget af en dårlig iltforsyning. Derimod udviste aggregeringer, der blev dyrket i O-formet taske, selv dem med lignende diametre til aggregater i konventionelle kultur retter, ikke nekrotisk kerner. Disse resultater tyder på, at den O-formet taske giver tilstrækkelig ilt til aggregater på grund af ilt permeabiliteten af posen materiale. Derfor foreslår vi, at denne roman gas-gennemtrængelige O-formede kultur taske er egnet for masseproduktion af uniform aggregeringer, der er nødvendige i forskellige bioteknologiske områder.
Suspension cellekultur spiller en vigtig rolle i celle produktion for regenerativ medicin1 og rekombinant protein produktion2 , fordi det er nemt at skalere op og opnå høje celle tæthed, nogle gange op til mere end 107 celler / mL5. Kinesisk hamster ovarie (CHO) celler3 og menneskelige embryonale nyre celler 293 (HEK293)4 har været dyrket i suspension kultur og humane pluripotente stamceller (hPSCs) har for nylig været dyrket i kultur affjedringssystemer til regenerativ behandlingsformer1,6,7. Brugen af suspension kulturer forventes at stige i fremtiden.
I suspension kultur, nogle cellelinjer kan ikke vokse som enkelt celler og skal derfor danne aggregater. For eksempel, ikke kan hPSCs overleve i suspension betingelser uden at danne aggregater. Men dette krav for samlet vækst præsenterer vanskeligheder for ensartet suspension kulturer. Et problem er dannelsen af uniform aggregeringer i den tidlige periode af den kultur, som bestemmer effektiviteten af suspension kultur8. En anden vanskelighed er den masse overførsel af næringsstoffer i aggregater. Især ilttilførslen begrænser den maksimale størrelse af aggregater, og en dårlig iltforsyning forårsager nekrose i midten af aggregater9. Suspension kulturer af celle aggregater er derfor vanskeligere at opnå end almindeligt affjedringssystem kulturer. Ikke desto mindre suspension kulturer er afgørende for biomedicinske og bioteknologiske applikationer.
Orbital ryster fartøjer er en af de enkleste kultur affjedringssystemer til at opnår næringssubstratet blandinger uden impeller agitation. Shear stress fra løbehjulet og dynamisk medium flow er det store problem med suspension kultur, fordi det medfører celleskader og differentiering. For at opnå agitation med en lavere shear stress, har forskere og industrier udviklet en række forskellige orbital ryster fartøj systemer2,10.
Konventionelle kultur fartøjer er dog ikke beregnet til orbital ryster kulturer. I orbital ryster fartøjer, graviterer celler mod bundafsnit fartoejer af en type af medium flow kendt som “Einsteins te blad paradox”11, som forårsager den inhomogene sammenlægning af celler. Den cirkulære flow, forårsaget af en centrifugalkraft og en friktion mellem substratet og et fartøj, fejer celler i center11,12. Derudover er konventionelle kultur poser til massekultur, firkantet, der er ikke egnet til orbital ryster.
I denne undersøgelse udviklede vi en roman kultur taske egnet til orbital ryster kulturer. Nyhed i denne taske er dens O-form, som ikke har et center område, så celler forhindres indsamling på bunden center region. Vi har også vist håndtering af disse fartøjer med en HEK293 kultur til at demonstrere muligheden for disse poser til bioteknologiske applikationer.
I denne undersøgelse, vi udviklet O-formede fartøjer og udført en HEK293 suspension kultur i dem en uniform aggregeringer dannelse og ekspansion. I konventionelle kultur fad produceret en orbital ryster kultur to forskellige diametre af aggregater, der henviser til, at vi observerede uniform aggregeringer i de O-formede fartøjer (figur 1). Ifølge observation af fordelingen af farvede perler i de orbital ryster betingelser samle perler center-nederst i en konventionel kultur parabol. Indsamlingen formentlig forårsaget forskellen i celle tæthed fører til forskellige størrelser af aggregater. Alternativt, perler blev uddelt i den O-formede fad, som ikke har bundafsnit regionen (supplerende figur 1). Denne fordeling forårsager sandsynligvis ensartet størrelse aggregater i O-formede fartøjer. En anden — udbredte — tilgang til at producere uniform aggregeringer er dyrkning i microwells, men denne tilgang har nogle problemer, som i at levere et dyrkningsmedium uden aggregater dropper ud af microwells13. For O-formede fartøjer, kan uniform aggregeringer fremstilles i en simpel suspension kultur.
Orbital ryster kultur er en populær kultur system udnyttede pattedyrsceller. Der findes forskellige kultur metoder til masseproduktion i pattedyrceller, såsom omrørt tank bioreaktor14, bølge-vinkede poser15, og roterende flasker. Orbital ryster kulturer omfatter ikke en indre impeller til omrøring medium, i modsætning til den omrørt tank bioreaktor ikke. Denne funktion er lig den bølge-vinkede tasker og roterende flasker. Disse løbehjul-fri kultur systemer kan undgå cellulære skader fra shear kraft omkring skovlhjul og realisere lave shear stress i suspension kultur. Især, er orbital ryster kultur systemer effektiv for masseproduktion af følsomme celler såsom pattedyrceller på grund af deres høje skalerbarhed og lave shear stress.
O-formede fartøjer kan forbedre de resterende problem af orbital ryster kultur i dannelsen af aggregater. I orbital ryster kultur systemer, vandrer flydende celler til midten og bunden af det fartøj, der er kendt som “Einsteins te blad paradox”11. Denne migration medfører det inhomogene sammenlægning og uensartet samlede produktion i konventionelle orbital ryster fartøjer. I denne undersøgelse forhindret O-formede fartøjer koncentration af celler ind i center-bunden af fartøjer, som er spekuleret som på grund af ensartet sammenlægning i orbital ryster O-formede fartøjer.
Histologiske analyser viste, at aggregater i den konventionelle parabol indeholdt denucleated celler (figur 2a). Derimod denucleated celler vises ikke i aggregater fra O-formede fartøjer (figur 2b og 2 c). Det er muligt, at disse denucleated celler var forårsaget af en mangel på substrater såsom glucose, Glutamin og ilt9. Ifølge målingen størrelse havde aggregater i de O-formede fartøjer homogene diametre lavere end 400 µm. Derimod i en konventionel parabol, nogle aggregater havde en diameter større end 400 µm, og disse aggregater inkluderet denucleated celler. Dette resultat tyder på, at skabe ensartede mellemstore aggregater i O-formede fartøjer er effektiv i at kontrollere kvaliteten af aggregater. Derudover er det også spekuleret på at iltning gennem den gas-gennemtrængelige polyethylenfilm forhindret fremkomsten af denucleated celler i den O-formet taske.
Disse eksperimenter viste muligheden for disse fartøjer, der er O-formet som et simpelt system til at producere uniform aggregeringer. Selv om andre kultur poser til suspension kultur har været udviklede15, disse kultur poser er firkantet, hvilket forhindrer kulturen i effektivt at få blandet i orbital ryster. Taske i denne undersøgelse har en roman runde form egnet til orbital ryste for at producere aggregater med en homogen størrelse. Denne egenskab af fartøjer, der er vigtige for at kontrollere betingelserne og høj reproducerbarhed af celler i masseproduktion. Eventuel anvendelse af den O-formede fartøj er udbredt. Det kan bruges, når producerer rekombinante proteiner fra celler og for regenerativ medicin, når der beskæftiger sig med stamceller.
Afslutningsvis udviklede vi en roman O-formet taske egnet til fremstilling af ensartet celle aggregater med en orbital ryster kultur. Posen viser muligheder for forskellige biomedicinske anvendelser såsom i regenerativ medicin.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning er understøttet af et samarbejde med FUKOKU, Co, Ltd Takao Yoshida fra FUKOKU, Co, Ltd givet idéen om O-formede kultur taske. Takamasa Sato fra FUKOKU, Co, Ltd støttet denne forskning i form af en beregningsmæssige simulering for at udvikle den O-formede kultur taske. Vi vil gerne påskønne den tilsvarende forfatteren nuværende tilhørsforhold, Osaka University, for at lade os arbejde om offentliggørelse.
HEK293 | RIKEN Bio resorce centre | RCB1637 | |
DMEM, high glucose, pyruvate | GIBCO | 11995040 | |
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | GIBCO | 10437-028 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | GIBCO | 11140050 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056 | |
Dulbecco's PBS (–) | Cell Science & Technology Institute | 1102P05 | |
Cell Strainer 40µm | CORNING | 352340 | |
50 mL Syringe | TERUMO | SS-50ESZ | |
Shaker | AS ONE | 2-1987-02 | |
Centrifuge Tube 50 mL | AS ONE | 1-3500-02 | |
Automated cell counter | BioRad | TC20 |