Summary
在这里, 我们提出了一个使用 o 型容器的协议, 专门用于悬浮培养的细胞集料, 轨道晃动。在这个袋子里生长的 hek293 细胞形成比传统培养容器中生长的细胞更均匀的聚集物。
Abstract
哺乳动物细胞集料的悬浮培养是医疗和生物技术领域的各种应用所必需的。一次性袋基方法是细胞集料批量生产的最简单的技术之一, 但它并不能保护培养物免受过度聚集的影响, 过度聚集发生在培养容器的底部中心。为了解决这个问题, 我们开发了一个 o 形盘子和一个 o 形的袋子, 这两个都不包含一个中心区域。无论哪种 o 型培养容器中生长的集料, 其尺寸明显比传统容器中生长的集料均匀。组织学分析表明, 传统培养皿中的聚集体含有坏死核心, 很可能是由于氧气供应不足造成的。相反, 在 o 形袋中生长的集料, 即使是那些直径与传统培养皿中的聚集体相似的集料, 也没有显示坏死。这些结果表明, o 形袋提供足够的氧气的集料由于氧气渗透性的袋子材料。因此, 我们认为这种新型的透气 o 形培养袋适用于各种生物技术领域所需的均匀集料的批量生产。
Introduction
悬浮细胞培养在再生医学1和重组蛋白生产2的细胞生产中发挥着重要作用, 因为它很容易扩大规模, 实现高细胞密度, 有时高达 107个细胞/ml5。中国仓鼠卵巢 (cho) 细胞3和人类胚胎肾细胞 293 (hek293)4已在悬浮培养中生长, 人类多能干细胞 (hpsc) 最近在悬浮培养系统中生长, 以促进再生治疗1,6,7。预计今后暂停文化的使用将增加。
在悬浮培养中, 一些细胞系不能作为单个细胞生长, 因此必须形成聚集体。例如, 如果不形成聚集体, hpsc 就无法在悬浮条件下生存。然而, 对综合增长的这一要求给统一的悬浮文化带来了困难。一个困难是在文化早期形成了均匀的集料, 这决定了悬浮培养的效率.另一个困难是营养物质的大量转移转化为集料。特别是氧气供应限制了集料的最大大小, 氧气供应不足导致集料中心9 处坏死。因此, 细胞聚集物的悬浮培养比传统的悬浮培养物更难获得。然而, 悬浮培养对于生物医学和生物技术的应用至关重要。
轨道晃动容器是最简单的悬浮培养系统之一, 可实现培养基混合物, 而不需要叶轮搅拌。叶轮的剪切应力和动态介质流动是悬浮培养的主要问题, 因为它导致细胞损伤和分化。为了实现较低剪切应力的搅拌, 研究人员和行业开发了各种轨道晃动容器系统2,10.
然而, 传统的养殖船并不是为轨道晃动培养而设计的。在轨道晃动的容器中, 细胞被一种称为 "爱因斯坦的茶叶悖论"的介质流吸引到血管的中心底部, 这种流动导致细胞的不均匀聚集。由离心力和培养基与容器之间的摩擦引起的圆形流动将细胞扫入中心11,12。此外, 大众文化的传统文化袋是方形的, 不适合轨道晃动。
在本研究中, 我们开发了一种适用于轨道晃动培养的新型培养袋。这个袋子的新颖性是它的 o 形, 没有中心区域, 所以细胞被阻止聚集在底部的中心区域。我们还展示了这些具有 hek293 培养的船只的处理方法, 以证明这些袋子在生物技术应用中的可能性。
Protocol
1. 细胞和材料的制备
- 在 dulbecco 的改良鹰培养基中培养 hek293 细胞, 并提供10% 的胎儿牛血清 (fbs) 和1% 的非必需氨基酸。将培养基的 ph 值调整为6.8-7.6。
- 在培养5至7d 后, 用0.25% 的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸溶液 (胰蛋白酶-edta) 分离细胞, 并将细胞重新播种在 5000-10000 cellssscm 2.
2. 在 o 形袋子中播种细胞
- 如步骤1.2 所述, 将细胞分离, 并在培养基的2-5 毫升中重新悬浮。
- 通过细胞过滤器 (40μm) 过滤细胞悬浮液, 以收集单个细胞悬浮液。
- 用色氨酸蓝染色和自动细胞计数器计数细胞数量, 然后制备20毫升的细胞悬浮液 (2.0 x10 5 细胞)。
- 将 o 形袋 (图 1a) 的入口连接到没有柱塞的夹紧的 50 ml 注射器上。
图 1: o 形容器的原理图图像和图像.(1)这是一个 o 形袋子的示意图。(2)这是一张 o 形袋子的照片。(b1)这是一个 o 形盘子的示意图。(b2)这是一张 o 形盘子的图片。o 形袋的外径和内径分别为90毫米和20毫米。请点击这里查看此图的较大版本.
- 将准备好的细胞通过夹紧的注射器悬浮到 o 形袋子中。
- 将第一个夹紧注射器更换为干净的注射器。通过清洁注射器加入55毫升的清洁空气, 以完全展开袋子。
- 夹紧进管, 然后关闭进气道。最后, 从管子上取下夹子。
- 在37°c 和 5% co2 条件下, 以45转/分的速度晃动 o 形袋中的细胞, 对细胞进行培养。
3. 中变化 (可选)
- 将细胞悬浮液通过入口转移到50毫升管中。
- 在室温下以 200 x 克的温度离心 2分钟, 然后吸吸上清液。
- 加入20毫升培养基, 重新悬浮细胞。
- 按照步骤 2.4-2.7 将重新悬浮的细胞添加到 o 形袋子中。
- 在37°c 和 5% co2 条件下, 以45转/分的速度晃动 o 形袋中的细胞, 对细胞进行培养。
4. 从袋子中收集细胞
- 将细胞悬浮液通过入口转移到50毫升管中。
- 用20毫升的钙/无镁磷酸盐缓冲盐水清洗袋子内部 [pbs (-), ph 值 = 7.4-7.6], 然后将里面的水排出试管, 从袋子中收集剩余的细胞。
- 在室温下将收集到的细胞悬浮液在 200 x 克离心 3分钟, 然后吸吸上清液。
- 加入10毫升的 pbs (-) 并清洗聚合。
- 在室温下将其离心 3分钟, 然后吸吸上清液收集集料。
- 加入4毫升的 pbs 和1毫升的胰蛋白酶, 并在37°c 下与聚集体孵育 10分钟, 以分离细胞进行计数 (可选)。
5. o 形盘式的准备 (可选)
注: 有关 o 形盘的示意图图像, 请参见图 1b 。
- 用热刀切下60毫米或35毫米的盘子底部, 并将其作为内盘使用。
- 把60毫米的菜倒置在100毫米菜的中心。
注: 导板可以帮助确定60毫米菜的位置。 - 如果需要, 从60毫米菜体内将粘度调整的环己酮放在食环素上。
- 将 o 形盘擦干几天, 并用伽马射线或环氧乙烷气体对其进行灭菌。
Representative Results
根据我们的测量, 在传统的盘子中生长的集料在 5 d 轨道晃动后具有不同的直径。相反, 在5d 型容器中生长的集料直径要均匀得多。传统的菜肴培养体显示有小的集料 (50-200μm), 而 o 形容器中的培养物不包含任何小的集料 (图 2a)。根据基于图像的尺寸测量, 传统的菜文化显示了两个不同的峰值 (图 2b1), 表明了骨料尺寸的大偏差。这一结果表明, 在同一培养条件下, 常规菜中的聚集体生长在两种不同的条件下, 可能导致异质细胞质量。另一方面, o 型容器中的集料比传统的盘状容器显示出单一的峰值, 直径偏差较小 (图 2b2和2b3), 这表明此类集料的质量可能更为均匀。
图 2: 在各种容器中生长的集料的形态和直径.这些面板显示 (a) 明亮场图像和 (b) 在传统菜品 (a1和b1) 中生长的聚集体的直方图, (a2和b1) 是 o 形菜, 或 (a3和b1) o 形袋。请点击这里查看此图的较大版本.
血氧西林和 eosin 染色的集料横截面表明, 在常规菜中生长的集料有一些脱核细胞和坏死核 (图 3a)。然而, 在 o 型容器中生长的集料没有显示任何坏死核心 (图 3b和3b)。特别是, 在 o 形袋中生长的集料与传统菜品中的集料一样大, 但没有任何坏死 (图 3c)。这些结果表明, 透气袋提供了足够的氧气培养。
图 3: 各种容器中集料的横截面.横截面厚度为12微米, 是用冷冻样品制备的。这些部分被血红素和 eosin 染色, 以显示细胞。(a) 在常规悬浮培养中生长的细胞集合体显示坏死。细胞聚集体生长在 (b) o 形盘或 (c) o 形袋显示很少坏死在他们的核心。请点击这里查看此图的较大版本.
细胞计数显示, 85% 以上的细胞在每个血管中存活了5d 悬浮培养 (图 4a)。最终细胞密度约为 1.5-2.0 x10 6 细胞。虽然没有显著差异, 但 o 形袋的生长率高于其他容器 (图 4b)。常规盘中、o 形盘和 o 形袋中细胞的特异性生长速率分别为0.018、0.018 和 0.018h-1。
图 4: 细胞活力和生长.这些面板显示 (a) 在培养 2 (第2天) 和培养 5 d (第5天) 之后, 各种培养容器中 hek293 细胞的细胞活力和 (b) 细胞密度。所显示的值代表了3个独立实验结果的平均值。每个实验的值都是根据色氨酸蓝染色细胞计算的, 用自动细胞计数器计算。误差线表示标准偏差。请点击这里查看此图的较大版本.
补充图 1: 在不同的晃动条件下, 2 种不同的菜式的珠子分布.该面板显示了传统和 o 形盘在各种晃动条件下 (30、40和45转/分) 的珠子分布情况。请点击此处下载此文件.
Discussion
在这项研究中, 我们开发了 o 型容器, 并在其中进行了 hek293 悬浮培养, 以形成和扩大均匀的集料。在传统的培养皿中, 轨道晃动培养产生了两种不同直径的集料, 而我们观察到 o 形容器中的均匀集料 (图 1)。根据对染色珠子在轨道晃动条件下的分布的观察, 珠子聚集在传统培养盘的中底。这种聚集大概导致了细胞密度的差异, 导致了不同大小的聚集体。或者, 珠子分布在 o 形的盘子中, 没有中间底部区域 (补充图 1)。这种分布可能会导致 o 型容器中的聚集体尺寸均匀。另一种广泛使用的生产均匀集料的方法是微孔培养, 但这种方法存在一些问题, 例如在提供培养基时没有从微孔13中退出的聚集物。在 o 型容器的情况下, 可以在简单的悬浮培养中产生均匀的集料。
轨道晃动培养是一种常用的哺乳动物细胞培养系统。哺乳动物细胞的批量生产有多种培养方法, 如搅拌罐生物反应器14、波动袋15、旋转瓶.轨道晃动培养不包括用于搅拌介质的内叶轮, 与搅拌罐生物反应器不同。此功能类似于波浪形袋和旋转瓶。这些无叶轮培养系统可以避免叶轮周围剪切力对细胞的破坏, 实现悬浮培养中的低剪切应力。特别是轨道晃动培养系统具有高可扩展性和低剪切应力的优点, 对哺乳动物细胞等敏感细胞的大规模生产是有效的。
o 型容器可以改善集料形成过程中剩余的轨道晃动培养问题。在轨道晃动培养系统中, 漂浮的细胞迁移到容器的中心和底部, 这被称为 "爱因斯坦的茶叶悖论"11。这种迁移导致常规轨道晃动容器中的聚集不均匀和集料生产不均匀。在这项研究中, o 形血管防止细胞浓度进入血管的中心底部, 这被推测为轨道晃动 o 形血管均匀聚集的原因。
组织学分析显示, 常规菜中的聚集体含有脱核细胞 (图 2a)。相反, 脱核细胞并没有出现在 o 型血管的集料中 (图 2b和2b)。这些脱核细胞可能是由葡萄糖、谷氨酰胺和氧气等底物缺乏引起的.根据尺寸测量, o 形容器中的集料直径均相低于400μm。相反, 在传统的盘子中, 一些集料的直径大于 400μm, 而这些集料包括脱核细胞。这一结果表明, 在 o 型血管中建立均匀规模的集料是控制集料质量的有效方法。此外, 还推测通过透气聚乙烯薄膜进行氧合, 防止了 o 形袋中脱核细胞的出现。
这些实验表明, 这些 o 形容器有可能成为生产均匀集料的简单系统。虽然其他悬浮文化文化的文化袋已经开发了1 5个, 但这些文化袋是方形的, 这使得文化无法有效地融入轨道晃动。本研究中的包具有一种新的圆形, 适用于轨道晃动, 以产生大小均匀的集料。这种容器的特性对于控制大批量生产中的条件和细胞的高重现性非常重要。o 型容器的可能应用是广泛的。它可用于从细胞中产生重组蛋白, 也可用于干细胞处理的再生医学。
总之, 我们开发了一种新型的 o 形袋, 适用于生产具有轨道晃动培养的均匀细胞集料。该袋显示了各种生物医学应用的可能性, 如再生医学。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了福口株式会社福口株式会社合作的支持, 福库公司的高尾吉田高一提供了 o 形培养袋的理念。来自福口株式会社的佐藤隆正 (takamasa sato) 在开发 o 型培养袋的计算模拟方面为这项研究提供了支持。我们要感谢相应作者目前的隶属关系, 大阪大学, 让我们从事出版工作。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK293 | RIKEN Bio resorce centre | RCB1637 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | GIBCO | 11995040 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | GIBCO | 10437-028 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | GIBCO | 11140050 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056 | |
| Dulbecco's PBS (–) | Cell Science & Technology Institute | 1102P05 | |
| Cell Strainer 40µm | CORNING | 352340 | |
| 50 mL Syringe | TERUMO | SS-50ESZ | |
| Shaker | AS ONE | 2-1987-02 | |
| Centrifuge Tube 50 mL | AS ONE | 1-3500-02 | |
| Automated cell counter | BioRad | TC20 |
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