Här presenterar vi ett protokoll för att använda O-formade fartyg, specialiserade för suspension kulturer av cellulära aggregat, med orbital skakar. HEK293 cellerna odlas i denna väska bilda mer homogent aggregat än de som odlas i konventionella odlingskärl.
Suspension kulturer av däggdjursceller aggregat krävs för olika applikationer i medicinska och biotekniska områden. Disponibel påse-baserade metoden är en av de enklaste teknikerna för massproduktion av cellulära aggregat, men det skyddar inte kulturerna mot alltför aggregering, som uppstår när de samlas längst ned i mitten av kultur fartyget. För att lösa problemet, utvecklat vi en O-formade maträtt och en O-formad påse, varken som innehåller en central region. Aggregat som odlas i antingen O-formade kultur fartyget var märkbart mer enhetlig i storlek än aggregat odlas i konventionella fartyg. Histologiska analyser visade som aggregerar i konventionella kultur rätter innehöll nekrotisk kärnor mest troligt orsakat av en dålig syretillförsel. Aggregat som odlades i O-formad påse, även de med liknande diametrar aggregat i konventionella kultur rätter, visade däremot inte nekrotisk kärnor. Dessa resultat tyder på att O-formade påsen ger tillräckligt med syre till aggregaten på grund av syre permeabiliteten i påsen materialet. Därför föreslår vi, att denna roman gas-permeable O-formade kultur väska är lämplig för massproduktion av enhetliga aggregat som är nödvändiga i olika biotekniska områden.
Suspension cellkultur spelar en viktig roll i den cellproduktionen för regenerativ medicin1 och rekombinant protein produktion2 eftersom det är lätt att skala upp och uppnå hög cell tätheter, ibland upp till mer än 107 celler / mL5. Från kinesisk hamster (CHO) celler3 mänskliga embryonala njure celler 293 (HEK293)4 har odlats i suspension kultur och mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs) har nyligen odlats i kultur upphängningssystem för regenerativ terapier1,6,7. Användning av suspension kulturer förväntas öka i framtiden.
I suspension kultur, vissa cellinjer kan inte växa som enstaka celler och därför måste bilda aggregat. Till exempel kan inte hPSCs överleva i suspension förhållanden utan att bilda aggregat. Detta krav för aggregerad tillväxt presenterar emellertid svårigheter för enhetlig suspension kulturer. En svårighet är bildandet av enhetliga aggregat i tidig sortperioden av kultur, som bestämmer effektiviteten av suspension kultur8. En annan svårighet är Massöverföringen av näringsämnen in i aggregat. I synnerhet syretillförseln begränsar den maximala storleken på aggregat och en dålig syretillförsel orsakar nekros i mitten av aggregat9. Följaktligen, suspension kulturer av cell aggregat är svårare att få än konventionell fjädring kulturer. Suspension kulturer är dock avgörande för biomedicinsk och biotekniska tillämpningar.
Orbital skakningar fartyg är en av de enklaste kultur fjädringssystem som uppnå odlingsmedium blandningar utan pumphjulet agitation. Skjuvspänningen från impellern och dynamiska medium flödet är det stora problemet med fjädring kultur eftersom det orsakar cellskador och differentiering. För att uppnå agitation med en lägre skjuvspänning, har forskare och industrier utvecklat en mängd orbital skakningar fartyget system2,10.
Konventionella odlingskärl är dock inte utformade för orbital skakar kulturer. I orbitalen skaka fartyg, dras celler mot center-botten av fartyg av en typ av medium flöde kallas ”Einsteins te blad paradox”11, som orsakar inhomogena sammanläggning av celler. Cirkulära flödet, orsakas av en centrifugalkraft och en friktion mellan odlingssubstrat och ett fartyg, sveper celler i den center11,12. Dessutom är konventionella kultur väskor för masskultur fyrkantig, som inte är lämplig för orbital skakning.
I denna studie har vi utvecklat en ny kultur påse lämplig för orbital skakar kulturer. Nyhet av denna väska är O-formen som inte har en center-region, så cellerna är förhindrade samling vid regionen nedre center. Vi har också visat hanteringen av dessa fartyg med en HEK293 kultur att demonstrera möjligheten att dessa väskor för biotekniska tillämpningar.
I denna studie vi utvecklade O-formade fartyg och utfört en HEK293 suspension kultur i dem för en enhetlig aggregat bildandet och expansion. I konventionella kultur skålen producerade en orbital skakar kultur två olika diametrar av aggregat, medan vi observerade enhetliga aggregat i de O-formade kärl (figur 1). Enligt observation av fördelningen av färgade pärlor i orbital skakningar förhållanden samla pärlor i center-botten av en konventionell kultur maträtt. Att samla orsakade förmodligen skillnaden i cell densiteten leder till olika storlekar av aggregat. Alternativt, distribuerades pärlor i O-formade skålen som inte har regionen center-botten (kompletterande Figur1). Denna fördelning orsakar förmodligen enhetligt medelstora aggregaten i O-formade fartyg. En annan — utbredda — metod för att producera enhetliga aggregat är odling i mikrobrunnar, men detta tillvägagångssätt har vissa problem, som leverera ett odlingsmedium utan aggregat hoppar av mikrobrunnarna13. När det gäller O-formade fartyg, kan enhetlig aggregat produceras i en enkel upphängning kultur.
Orbitalen skakar kultur är en populär kultur system utnyttjas för däggdjursceller. Det finns olika kultur metoder för massproduktion av däggdjursceller, såsom stirred tank bioreaktor14våg-vinkade väskor15, och roterande flaskor. Orbital skakningar kulturer inkluderar inte en inre impeller för omrörning mediet, till skillnad från den stirred tanken bioreaktor gör. Den här funktionen liknar den våg-vinkade väskor och roterande flaskor. Dessa impeller-fri kultur system kan undvika cellulära skador från tvärkraften kring Fläkthjulen och inse låg skjuvspänning i suspension kultur. Särskilt, är orbital skakningar kultur system effektiva för massproduktion av ljuskänsliga celler såsom däggdjursceller för sin hög skalbarhet och låg skjuvspänning.
O-formade fartyg kan förbättra det återstående problemet med orbital skakningar kultur i bildandet av aggregat. I orbitalen skakar kultur system, migrera flytande celler till center och botten av fartyget, som är känd som ”Einsteins te blad paradox”11. Denna migration orsakar inhomogena sammanläggning och icke-enhetlig samlade produktionen i konventionella orbital skaka fartyg. I denna studie förhindrade O-formade fartyg koncentrationen av celler i center-botten av fartygen, som spekuleras som orsak av enhetliga aggregation i orbital skakar O-formade fartyg.
Histologiska analyser visade att aggregaten i den konventionella maträtt innehöll denucleated celler (figur 2a). Däremot denucleated celler visas inte i aggregaten från O-formade fartyg (figur 2b och 2 c). Det är möjligt att dessa denucleated celler orsakades av en brist på substrat såsom glukos, glutamin och syre9. Enligt storlek mätning hade aggregat i O-formade fartyg homogen diametrar lägre än 400 µm. Däremot i en konventionell maträtt, vissa aggregat hade en diameter större än 400 µm, och dessa aggregat med denucleated celler. Detta resultat tyder på att skapa homogena och medelstora aggregat i O-formade fartyg är effektiva i att kontrollera kvaliteten på aggregat. Dessutom, spekuleras det även att syresättningen genom gas-permeable polyetylenfilm förhindrat tillkomsten av denucleated celler i O-formade påse.
Dessa experiment visade möjligheten att dessa O-formade fartyg som ett enkelt system för att producera enhetliga aggregat. Även andra kultur väskor för suspension kultur varit utvecklade15, är dessa kultur-väskor fyrkantig, som förhindrar kulturen att få effektivt blandas i orbital skakar. Väskan i denna studie har en roman runda form passar orbital skakar för att producera aggregat med en homogen storlek. Detta kännetecken av fartyg är viktigt för att kontrollera villkoren och hög reproducerbarhet av celler i massproduktion. Eventuell tillämpning av O-formade fartyget är utbredd. Det kan användas vid framställning av rekombinanta proteiner från celler och regenerativ medicin när det gäller stamceller.
Sammanfattningsvis har vi utvecklat en roman O-formade påse lämplig för att producera enhetliga cell aggregat med en orbital skakningar kultur. Väskan visar möjligheter för olika biomedicinska tillämpningar såsom inom regenerativ medicin.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöds av ett samarbete med FUKOKU, CO., Ltd. Takao Yoshida från FUKOKU, CO., Ltd. som idén om O-formade kultur påsen. Takamasa Sato från FUKOKU, CO., Ltd. stöds denna forskning när det gäller en computational simulering för att utveckla O-formade kultur påsen. Vi skulle vilja uppskatta motsvarande upphovsmannens nuvarande tillhörighet, Osaka University, möjligt för oss att arbeta på publikationen.
HEK293 | RIKEN Bio resorce centre | RCB1637 | |
DMEM, high glucose, pyruvate | GIBCO | 11995040 | |
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | GIBCO | 10437-028 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | GIBCO | 11140050 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO | 25200056 | |
Dulbecco's PBS (–) | Cell Science & Technology Institute | 1102P05 | |
Cell Strainer 40µm | CORNING | 352340 | |
50 mL Syringe | TERUMO | SS-50ESZ | |
Shaker | AS ONE | 2-1987-02 | |
Centrifuge Tube 50 mL | AS ONE | 1-3500-02 | |
Automated cell counter | BioRad | TC20 |