Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at måle nasal spændingsforskel i mus. Testen kvantificerer funktion af transmembrane ion transportvirksomheder som cystisk fibrose transmembrane ledningsevne regulator og epitelial natrium-kanal. Det er værdifuldt at evaluere effekten af nye terapier for cystisk fibrose.
Abstract
Den nasale potentielle forskel test har været brugt i næsten tre årtier til at bistå ved diagnosticeringen af cystisk fibrose (CF). Det har vist sig at være nyttige i tilfælde af svækket, oligo - eller mono-symptomatisk former for CF normalt diagnosticeres senere i livet, og CF-relaterede lidelser som medfødt bilaterale fravær af sædlederen, idiopatisk kronisk pancreatitis, allergiske Bronchopulmonary aspergillose, og bronchiectasis. I både kliniske og prækliniske indstillinger, har prøven været brugt som en biomarkør at kvantificere svar til målrettede terapeutiske strategier jf. tilpasning test til en mus er udfordrende og kan medføre en tilhørende dødelighed. Dette papir beskriver den passende dybde af anæstesi forpligtet til at opretholde et tilstoppet kateter i situ for kontinuerlig perfusion. Det viser en liste over foranstaltninger for at undgå bronchopneumoni-aspiration af løsninger perfunderet i næsen. Det beskriver også de dyrs pleje i slutningen af testen, herunder administration af en kombination af modgift af de bedøvende stoffer, fører til hurtigt vende anæstesi med fuld tilbagebetaling af dyrene. Repræsentative data indhentet fra en CF og et wild-type mus viser, at testen forskelsbehandler CF og ikke-CF. Helt, protokollen beskrevet her giver pålidelige målinger af den funktionelle status af trans-epitelial chlorid og natrium transportvirksomheder i spontant vejrtrækning mus samt flere tests i de samme dyr samtidig reducere test-relaterede dødelighed.
Introduction
For næsten tre årtier, blev elektriske potentielle forskel (PD) målinger benyttet til at evaluere den funktionelle status af transmembrane ion transportvirksomheder givet udtryk for på næseslimhinden, som repræsentant for den distale airways1. Som en omstændelig dynamisk test2,3, nasal PD tillader funktionel dissektion af cystisk fibrose Transmembrane ledningsevne Regulator (CFTR) og epitelial natrium kanalen (ENaC) aktivitet, lokaliseret både på de apikale membraner af epitelceller og øve afgørende roller i luftvejene overflade hydrering. Den store klinisk anvendelse af den nasale PD test er at bistå ved diagnosticeringen af CF, den mest almindelige fatal genetisk sygdom i kaukasiske populationer med en gennemsnitlige incidens af 1 ud af 2.500 levendefødte i europæiske lande. Testen har længe vist sig nyttigt ved diagnosticering af svækkede, oligo - eller mono-symptomatisk former for CF normalt diagnosticeres senere i livet, og CF-relaterede lidelser som medfødt bilaterale fravær af sædlederen, idiopatisk kronisk pancreatitis, allergiske Bronchopulmonary aspergillose, og bronchiectasis4. For nylig, clinometric evaluering af den terapeutiske graduering af den grundlæggende CFTR defekt5,6,7,8,9,10,11 ,12,13,14,15,16 har gjort brug af den nasale PD i kliniske forsøg med nye CF behandlingsformer. I indstillingen prækliniske er testen blevet tilpasset til musen17 at tillade undersøgelse af bioactivity af nye CF target terapier18,19,20,21. I mus er teknikken delikat, baseret på arter-relaterede anatomiske forskelle i størrelsen af det nasale området mellem gnavere og mennesker, og især på den vigtige rolle af sensoriske input fra nasofacial-regionen i gnavere. Det kræver uddannede og dygtige erhvervsdrivende, dedikeret udstyr og forsyninger.
CF er en multi systemisk sygdom i eksokrine kirtler, i hvilke kronisk respiratorisk sygdom dominerer det kliniske billede. Sygdommen er forårsaget af mutationer i det gen, der koder for cyklisk adenosin fra (cAMP)-reguleret CFTR klorid-kanal22. Til dato, har mere end 2.000 CFTR mutationer været identificeret23. Den mest almindelige mutation24,25, fundet i næsten 90% af CF alleler, svarer til en sletning af fenylalanin i polypeptid kæde af protein (F508del-CFTR) stilling 508. CFTR protein er en rent ohmske lille konduktans klorid-kanal. Der er også betydelige beviser at CFTR regulerer andre transportmekanismer, navnlig ENaC26,27. Defekte elektrolyt transport, herunder reduceret CFTR-afhængige chlorid ledningsevne og øget ENaC-afhængige natrium ledningsevne, er kendetegnende for CF epitheler. Den tidligere defekt afspejles af en nedsat eller afskaffet repolarisering svar på både en elektrokemisk gradient favorisere chlorid efflux og tilsætning af isoprenaline (en β-adrenerge agonist, der øger intracellulære cAMP) eller forskolin (en adenylate cyclase agonist, ikke godkendt til klinisk brug). Den sidstnævnte defekt afspejles af en basal hyperpolarisering næseslimhinden (en mere negativ PD) og en øget respons på amilorid, et vanddrivende lægemiddel, der blokerer ENaC28.
CF musemodeller har været hyppigt anvendt i CF forskning og har været uvurderlige i dissekere CF patologi. I dag, har mindst femten modeller været beskrevet29, hvoraf tre er homozygote for den mest klinisk relevante F508del mutation30,31,32. En af disse tre stammer30, udviklet på Erasmus universitetet i Rotterdam, har været brugt i næsten 20 år i Université catholique de Louvain (UCL) laboratorium. Cftrtm1Eur model30 har vist sig for at være meget nyttige til at studere den multiorgan Patofysiologi af CF sygdom og teste effekten af nye terapeutiske strategier18,19,20, 21. Mange problemer kan opstå under eller tidlig efter (< 24 h) den nasale PD test i mus. I dette papir, den passende dybde af anæstesi kræves for at holde et tilstoppet kateter i situ for kontinuerlig perfusion og foranstaltninger til at undgå bronchopneumoni-aspiration af løsninger perfunderet i næsen er beskrevet. Dyrs pleje i slutningen af testen er også beskrevet, herunder administration af en kombination af modgift af bedøvende stoffer, fører til hurtigt vende anæstesi med fuldstændig genopretning af dyrene. Helt, disse procedurer giver mulighed for pålidelige målinger i spontant vejrtrækning mus, reduceret test-relaterede dødelighed og gentage testen i samme dyr. Repræsentative data indhentet fra den nasale PD test i en CF og i en wild-type mus er vist og diskuteret.
Murine nasal PD forsøgsprotokollen er rapporteret i tre sessioner: vurdering og styring før, under og efter testen. I den præ-test vurdering og forvaltning, er forberedelse af dobbelt lumen nasale kateteret og løsninger, der anvendes til løbende nasal perfusion-protokollen beskrevet i detaljer. Under den vurdering og forvaltning af dele af prøven, er eksperimentel opsætning og håndtering af musen minutiøst dissekeret. Endelig, forvaltning af dyr ved testens afslutning er beskrevet for at forbedre fuld animalske opsving.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Undersøgelser og procedurer blev godkendt af en etisk komité for animalsk forskning af UCL (2017/UCL/MD/015) og i overensstemmelse med Fællesskabets regler for brug af dyr i forskning (CEE n ° 86/609). Efterforskere er kvalificerede til dyreforsøg efter direktiv 2010/63/EU af Europa-Parlamentet og Rådet af 22 September 2010 om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål.
1. før test vurdering og styring af
- Udarbejde dobbelt lumen nasale kateteret.
Bemærk: En nasale kateteret er lavet som en dobbelt lumen kapillarrør, én lumen anvendes til den løbende perfusion af løsninger, og den anden en som en måling kanal.- Varme op den centrale del af et stykke, ca. 20 cm lang, af polyethylen rør (2,0 mm indre diameter, 3.0 mm ydre diameter; Figur 1 en) i flammen af en gasbrænder, indtil det er blødt nok til at trække (10-15 s).
- Træk de to ender fra hinanden for at opnå en meget tynd kapillarrør i passende længde (~ 15 cm) og ydre diameter (~0.1 mm) for nasal sonden (figur 1b).
- Rengør og affedt to sådanne kapillærer med ren ethanol, slutte sig til dem med tape (figur 1c) og lime dem sammen ved hjælp af ren lim.
- Skære væk overskydende længden af sonder med et barberblad eller en skalpel til at opnå en optimal længde af dobbelt lumen kateteret ca 8 cm (fig. 1d).
- Injicere vand gennem begge lumen til at efterprøve gennemtrængelige.
- Anvende en mark på 5 mm afstand fra spidsen.
Bemærk: Sonden er sat op til mærket i næsebor, så at alle målingerne er foretaget på den samme sted inde i næsehulen. - Gemme dobbelt lumen kateter i en tør boks.
Bemærk: Det kan være brugt 6 - 10 gange hvis passende renset umiddelbart efter testen.
- Forbered fløde blanding.
- Bland forsigtigt elektrolyt fløde og mættet 3 M KCl opløsning i forholdet 1:1 (volume/lydstyrke), undgå dannelsen af bittesmå luftbobler.
Bemærk: Creme blandingen er brugt til at bygge elektrode broer for at måle og henvisningen Ag/AgCl elektroder, som illustreret i figur 1.
- Bland forsigtigt elektrolyt fløde og mættet 3 M KCl opløsning i forholdet 1:1 (volume/lydstyrke), undgå dannelsen af bittesmå luftbobler.
Figur 1 : Sonder med elektroder og broer. Figuren illustrerer polyethylen rør før (a) og efter opvarmning og trække (b), de bånd, der forbinder de to kapillær dele (c) af dobbelt lumen kateter (d), silikone slange stik (e) og elektroder (f). Billede klarhed, har stikkene ikke blevet fyldt med fløde blanding. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Løsning etiket | Løsning beskrivelse |
| A | Basal salt bufferopløsning |
| B | Chlorid-fri buffered saltopløsning |
| C | 10-2 M amilorid stamopløsning |
| D | 10-3 M forskolin stamopløsning |
Tabel 1: Materiel løsning for nasal PD testen i mus.
| Salt | mM | Molekylær vægt | g/L |
| Natriumchlorid (NaCl) | 135 | 58.44 | 7,889 |
| Calcium chlorid dihydrat (CaCl2.2H2O) | 2.25 | 147 | 0.331 |
| Magnesiumchlorid hexahydrat (MgCl2.6H2O) | 1.2 | 203.3 | 0.244 |
| Dikalium fosfat (K2HPO4) | 2.4 | 174.2 | 0.418 |
| Monokaliumphosphat fosfat (KH2PO4) | 0,4 | 136.1 | 0,054 |
Tabel 2: Sammensætning af basal buffered saltopløsning (stock opløsning A).
- Forberede løsningerne.
- Forberede de fire stamopløsninger kræves til forsøgsplan (tabel 1).
- Forberede den basale bufferopløsning (stamopløsning A; Tabel 2) og chlorid-fri bufferopløsning (stamopløsning B; Tabel 3) ved at blande salte i rent vand ved stuetemperatur. Justere pH til 7.4 (range 7.0-7,6) ved hjælp af 1 N NaOH til hæve pH, 1 N HCl til lavere pH. Check osmolaritet løsning (275 mOsm/L).
- Butik i mærket glasflasker ved 4 ° C i op til 3 måneder eller frosne i plastflasker i op til 6 måneder.
- Forberede 10-2 M amilorid løsningen (stamopløsning C) ved at tilføje 26,6 mg af amilorid hydrochlorid til 10 mL rent vand. Opvarm blandingen i 5-10 minutter ved 70 ° C. Amilorid er følsomme over for lys, holde løsning C i en mørk beholder. Mærke beholder og opbevares ved 4 ° C i op til 3 måneder.
- Forberede 10-3 M forskolin løsningen (stamopløsning D) ved at føje 10 mg af forskolin til 24.36 mL rent vand. Etiket 0,1 mL alikvoter forskolin stamopløsning og opbevares ved-20 ° C i op til 6 måneder.
- Forberede de fire stamopløsninger kræves til forsøgsplan (tabel 1).
- Forberede frisk løsninger A1, B1 og B2 (tabel 4).
- Forberede frisk løsning A1 (basal salt bufferopløsning plus 10-4 M amilorid) ved at opnå 10 mL af basal saltopløsning (stock opløsning A) og tilføje 0,1 mL af 10-2 M amilorid løsning (stamopløsning C). Etiketten på beholderen og brug inden for 24 timer på forberedelse.
- Forberede frisk løsning B1 (chlorid buffered løsning plus 10-4 M amilorid) ved at opnå 10 mL af chlorid-fri bufferet saltopløsning (stamopløsning B) og tilføje 0,1 mL af 10-2 M amilorid løsning (stamopløsning C). Etiketten på beholderen og brug inden for 24 timer på forberedelse.
- Forberede frisk løsning B2 (chlorid-fri bufferet saltopløsning plus 10-4 M amilorid og 10-5 M forskolin) ved få 10 mL af chlorid-fri bufferet saltopløsning (stamopløsning B) og tilføje 0,1 mL af 10-2 M amilorid løsning (stamopløsning C) og 0,1 mL af 10-3 M forskolin løsning (stamopløsning D). Etiketten på beholderen og brug inden for 2 timer til forberedelse.
| Salt | mM | Molekylær vægt | g/L |
| Natrium gluconat (mononatrium salt) | 135 | 218.1 | 29,444 |
| Calciumglukonat (vandfri pulver) | 2.2 | 430.4 | 0.947 |
| Magnesium-sulfat en (MgCl2.6H2O) | 1.2 | 246.5 | 0.296 |
| Dikalium fosfat (K2HPO4) | 2.4 | 174.2 | 0.418 |
| Monokaliumphosphat fosfat (KH2PO4) | 0,4 | 136.1 | 0,054 |
Tabel 3: Sammensætning af chlorid-fri buffered løsning (stamopløsning B).
Figur 2 : Placeringen af musen under perfusion af næseslimhinden. Figuren illustrerer den hede afrivningsblok (a), voltmeter (b), referenceelektrode indsat i det subkutane rum i en hind lemmer (c), den proksimale (d) og de distale (e) forretninger i den peristaltiske pumpe, den pude (f), og sengen ark (g). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
2. vurdering og styring under prøvningen
- Forberede opsætningen af eksperimenterende.
- For at forhindre hypotermi, under og efter testen, bruge to varmepuder vedligeholdes ved fysiologisk temperatur, én for opsætningen måling (18,8 x 37,5 cm; Figur 2 en), og den anden (15,5 x 15,5 cm) for den boks, hvor dyret vil blive placeret for inddrivelse i slutningen af testen.
- Tænd computeren fyldt med software til datafangst tilsluttet den data hukommelse høje Indgangsimpedans (> 1012Ω) og høj opløsning (0,1 mV) voltmeter (figur 2b).
- Elektroderne tilsluttes voltmeter. Tilslut den positive måling elektrode til det nasale kateteret og negativ referenceelektrode til kateter indsættes i det subkutane rum i en hind lemmer, som vist i figur 2c.
- Dyppe spidsen af elektroder sammen i fløde-mix. Tjek den indledende elektrode forskydningsværdi. Afviser elektroderne, hvis værdien er større end (±) 2 mV (ideelt 0 mV).
- Tænd den peristaltiske pumpe og indsætter holdning, pumpe tube, som illustreret i figur 2.
- Tilslut den proksimale outlet af pumpe tube til hætteglasset indeholdende den valgte løsning for nasal perfusion (figur 2d). Tilslut den distale outlet af pumpe tube til perfusion lumen af nasale kateteret (figur 2e).
- Fyld en lumen af nasale kateteret med elektrolyt creme blandingen gennem en 10 µL pipette tip. Tilpasse kateter til en silikone slange stik (figur 1e), udfylde stikket med fløde blanding og indsætte den positive elektrode i stik (figur 1f). Kontrollere måling elektrode bro forskydningsværdi. Afviser broerne, hvis værdien er større end (±) 2 mV (ideelt 0 mV).
- Fyld den anden lumen af nasale kateteret med den friske løsning A1. Dyppe spidsen af det nasale kateteret i hætteglas indeholdende løsning A. modsatte retning af den peristaltiske pumpe til at fylde en længde af nasale kateteret svarende til 10 s af perfusion.
Bemærk: Dette giver mulighed for optagelse basal PD værdier for 10 s før du anvender amilorid. Dyppe spidsen af det nasale kateteret i creme blandingen inde stik af referenceelektrode (figur 1).
- Begynd håndterer musen.
- Post musen vægt til at beregne den nøjagtige dosis af anæstetika sprøjtes af intraperitoneal (ip) rute17.
- Ved hjælp af en 26G (0,45 x 10 mm) kanyle indsprøjtes præmedicinering intraperitoneal at fremme induktion af anæstesi: en fast dosis af 50 µL af 5 mg/mL midazolam. Vente i 5 min.
- Forberede bedøvelse mix (fentanyl, medetomidine, droperidol i endelige koncentrationer på 0,05, 0,40 og 20 mg/kg kropsvægt henholdsvis, og Clonidin på fast dosis af 0.375 µg) giver mulighed for optimal og stabil dybde af anæstesi (fase III, fly 2)17 . Inject volumen af bedøvelsesmiddel mix intraperitoneal, og derefter indsprøjtes volumen af Clonidin.
Bemærk: Efter 15 min, skal musen være en søvn og anæstesi kan vare i mindst 30 min. - Folde et ark af lydabsorberende væv til at gøre en 3 cm bred 'pude' (figur 2f), der dækker den øverste del af den hede afrivningsblok (figur 2et) som en støtte til musen hovedet.
- Dække varmepude med et ark af lydabsorberende væv ('seng ark'; Figur 2 g). lå musen på ryggen på en varmepude. Tape out lemmer og hale (figur 2).
- Indsæt henvisning intravenøst kateter (figur 1g) i det subkutane rum af en hind lemmer. Fjern nålen og tilpasse silikone slange stik (figur 1e, 2 c).
- Fylde kateteret og stik med fløde blandes og indsætte den negative elektrode i stik (figur 1f).
- Lave kateteret og elektrode med tape som krævet for at forhindre enhver fordrivelse. Efter placering af referenceelektrode og broer, kontrollere måling elektrode bro forskydningsværdi igen ved at dyppe spidsen af nasale kateteret i elektrode fløde blanding inde stik af IV kateter. Optage den stabile offset slutværdien (ideelt set mindre end (±) 2 mV).
- Lave musen ører med "blide" tape på den hede afrivningsblok i en ledig plads mellem de to stykker af lydabsorberende væv ('pude' (figur 2f) og 'seng ark'; (Fig. 2g)). Fix vibrissae (de stive hår vokser i nærheden af næseborene) uden at røre ved øjnene.
- Til at absorbere væske fra mundhulen, flytte den tunge sidelæns (figur 3en) og Indsæt en spids væge filtrerpapir ('rør'; Figur 3 b) ca. 1 cm ind i munden. Til at absorbere væske løb ud af den perfused næsebor, Læg et andet stykke filtrerpapir ('lommetørklæde'; Figur 3 c) afholdt på spidsen af næsen.
- Kontrollere en positiv kontrol værdien af epitel potentialet ved at placere spidsen af det nasale kateteret i kontakt med indersiden af munden.
Bemærk: Læsning bør være stabil og intervallet mellem -10 mV og -20 mV. - Holde den med fine pincet og under god direkte belysning, fint indføre nasale kateteret ind i én næsebor op til 4 - 6 mm fra næse tip.
Bemærk: Den nasale PD kateter er beliggende i den midterste nasal concha på den position, der giver maksimal stabil basislinje PD værdi17,20. - 5 min efter injektion af den bedøvende medicin, vippe forsigtigt den hede afrivningsblok af omkring 30° med animalsk hovedet nedad. Overvåge den maksimale basal PD værdi.
- Når det er stabil over en periode på omkring 30 s, start perfusing næseslimhinden, med en konstant hastighed på 10 µL / min, med de 4 bufferet løsninger (A, A1, B1, B2) i træk. Perfuse den første løsning (trin 1.3.1.1) for 10 s og hver følgende løsning (trin 1.4) i 5 min eller indtil en stabil værdi er nået. Stop perfusing forskolin (B2) når forbigående forskolin svar begynder at gå.
- Vælg en 1 s interval for dataregistrering. Begynde at optage data på tidspunktet af starter perfusion. Viser data som en funktion af tiden på computerskærmen.
- Stop dataregistrering i slutningen af perfusion med løsning B2. Gemme data som en regnearksfil.
- Korrekte data ved at fratrække den endelige forskydningsværdi.
Figur 3 : Position med musen på varmepude med nasale kateteret og filter papirer i sted. Figuren illustrerer tungen sætte sidelæns (a), pipe (b) og lommetørklæde (c). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
3. post test vurdering og styring af
- Slip musen fra den hede afrivningsblok.
- Tørre mus næse med 'seng ark' (fig. 2g).
- Injicere intraperitoneal bedøvelsesmiddel antagonist blanding består af en fast dosis (4 µg) af naloxon, en konkurrencedygtig morfin antagonist, og Atipamezol, en medetomidine specifikke modgift (2 mg/kg legemsvægt).
- Lå musen på den mindre varmepude i boksen opsving indtil fuld helbredelse, der er normalt observeret efter 1 til 2 timer.
Bemærk: I UCL laboratorium, ca. 10% dødelighed, primært relateret til bronchoaspiration af løsninger perfunderet i næsehulen under testen er observeret uanset køn eller genotype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at illustrere karakteristiske ion transport abnormiteter i CF, blev nasal PD målinger udført efter den protokol, der er beskrevet ovenfor i en F508del-CF-mus og et wild-type kontrol over FVB/129 genetiske baggrund fra Bruxelles koloni CFTRtm1Eur mus30. Denne klinisk relevante model, husly det mest almindelige og en af de mest alvorlige F508del-CFTR mutation23,24,25, er bedste foreliggende CF musen model30,31, 32.
Repræsentative nasal PD tracings, fremstillet i en 4 - måneder gamle kvindelige mus homozygot for F508del-CF-mutationen og i en alder - og køn-matchede vildtype littermate, er vist i figur 4. I de to første faser af testen, blev funktionelle status af ENaC undersøgt af perfusing løsninger A og A1, den sidstnævnte indeholdende amilorid. Den funktionelle status af CFTR (og alternative chlorid transportvirksomheder i mangel af forskolin) blev vurderet under de to sidste faser af testen, når bidrag af ENaC forblev blokeret af amilorid.
I F508del-CF musen, en hyperpolarized baseline værdi (en mere negativ PDmax sammenlignet med værdien wild-type mus) sammen med en øget amilorid svar blev observeret; både resultaterne afspejler CFTR-associerede ENaC overaktivitet. Mere konsekvent en drastisk reduceret repolarisering svar på både en elektrokemisk gradient gunstige chlorid efflux og tilsætning af forskolin, benævnt her som samlede chlorid svar, blev observeret. Selv om omfanget af forskolin svar i wild-type mus er små (-3 mV), i CF, svaret er normalt afrundede, overensstemmelse med CFTR tab af funktionen.
Figur 4 -Repræsentant nasal PD tracings. Repræsentative nasal PD tracings fra en homozygot normal mus (A) og en mus homozygot for F508del-CFTR mutation (B), sammen med de enkelte værdier opnået for nasal PD parametre (C og D). PDmax: maksimal grundlinjen stabil værdi. Amilorid svar: forskel mellem værdierne af nasal PD i slutningen og begyndelsen af perfusion af næseslimhinden med basal buffered saltopløsning indeholdende amilorid (løsning A1). Chlorid-fri svar: forskel mellem værdierne af nasal PD i slutningen og begyndelsen af perfusion af næseslimhinden med chlorid-fri buffered saltopløsning plus amilorid (løsning B1). Forskolin svar: forskel mellem værdierne af nasal PD i slutningen og begyndelsen af perfusion af næseslimhinden med chlorid-fri buffered saltopløsning plus forskolin og amilorid (løsning B2). Samlede chlorid svar: summen af de sidste to parametre opnået under nul-chlorid perfusion. Pilene angiver ændringer af løsninger perfunderet i næsebor. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Modgift af anæstetika blev anvendt i slutningen af prøver, dermed reducere varigheden af anæstesi, som kan være op til 45 min efter testen er afsluttet. Som nyttiggørelse af dyrene er sket uden eftervirkninger, blev de testet igen efter et interval på syv dage, når den samme protokol blev anvendt. Den samme næsebor blev udforsket under begge tests. Eksempler af den anden proeve og parret forskelle i hver enkelte nasal PD parameter mellem de to prøver er vist i figur 5. Som tidligere rapporteret35var mellem test forskellene tæt på nul, navnlig for samlede chlorid svar, som afspejler den funktionelle status af CFTR-afhængige chlorid transport, defekt i CF.
Figur 5 -Individuelle værdier af nasal PD parametre. Værdier er fremstillet i en anden test (t2) udført i en homozygot normal mus (A) og en mus homozygot af F508del-CFTR mutation (B), samt de parrede forskellen mellem andet og den første test (t1) for hver tilsvarende parameter. PDmax: maksimal grundlinjen stabil værdi. Amilorid svar: forskel mellem værdierne af nasal PD i slutningen og begyndelsen af perfusion af næseslimhinden med den basale buffered saltopløsning indeholdende amilorid (løsning A1). Chlorid-fri svar: forskel mellem værdierne af nasal PD i slutningen og begyndelsen af perfusion af næseslimhinden med chlorid-fri buffered saltopløsning plus amilorid (løsning B1). Forskolin svar: forskel i værdierne af nasal PD i slutningen og begyndelsen af perfusion af næseslimhinden med chlorid-fri buffered saltopløsning plus forskolin og amilorid (løsning B2). Samlede chlorid svar: summen af de sidste to parametre opnået under nul-chlorid perfusion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Løsning etiket | Løsning beskrivelse |
| A1 | Basal buffered saltopløsning (A) plus 10-4 M amilorid |
| B1 | Chlorid-fri buffered saltopløsning (B) plus 10-4 M amilorid |
| B2 | Chlorid-fri buffered saltopløsning (B) plus 10-4 M amilorid plus 10-5 M forskolin |
Tabel 4: Liste over de friske løsninger til den nasale PD test i mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Formålet med dette papir er at beskrive en passende protokol til måling af nasal PD under kontinuerlig perfusion af løsninger i spontant vejrtrækning mus til en længde af tid, der kræves for at teste integriteten af ion transportvirksomheder, hovedsagelig CFTR og ENaC. Alle trin i protokollen har været grundigt optimeret til at sikre fuld animalske opsving og god kvalitet og reproducerbare data. I særlige, kritisk trin er anæstesi vurdering og styring og tilstrækkelig animalsk holdning og pleje under og efter testen.
Tidligere undersøgelser viste, at flyet 2 fase III af bedøvelsesmiddel eksponering, som kan opnås ved at anvende cocktail blandingen bruges her17, er forbundet med regelmæssig vejrtrækning og med fravær af negative inotrope effekt og blink, pupil og pedal tilbagetrækning reflekser. På dette niveau af bedøvelsesmiddel dybde, kan nasale kateteret holdes i situ for kontinuerlig perfusion af næsehulen til brug som en bro af måling elektrode med gode tolerance. Indføring af kateter i det subkutane rum, der tjener som broen af referenceelektrode, fulgte også, ikke nogen smertefuld reaktion eller tegn på skadelige virkninger. I gnavere, den vigtige rolle af sensoriske input fra nasofacial-regionen i kontrol af adfærd over for en ekstern situation, herunder en trussel, gør tilstrækkelig dybde af anæstesi særligt udfordrende når opererer i næsehulen. Nebulization i stedet for kontinuerlig nasal perfusion er blevet anvendt til at udføre nasal PD test i nogle mus undersøgelser33,34. Men denne metode fører til ikke-pålidelige resultater, på grund af gentagen fjernelse og reinsertions af den nasale sonde. Faktisk, som følge af ikke-homogen fordeling af celletyper i mus næseslimhinden20er repositionering spidsen af sonden på samme sted i næsebor kritisk. Derudover forsvinde svar til ændringer af løsninger, navnlig chlorid-fri løsninger, hurtigt når perfusion afbrydes.
Luftvejs-aspiration af løsninger fører til respirationsstop er en afgørende begrænsning af proceduren og er den største årsag til dødelighed af testen. Flere væsentlige foranstaltninger tager sigte på at forebygge det, herunder en dorsal decubitus position af dyret, let vippe det med hovedet nedad, og absorbere overskydende væske fra mundtlige og nasal hulrum17. En hurtig og reversible niveau af anæstesi med fuldstændig genopretning af dyr sikres ved at anvende modgift af bedøvende stoffer i slutningen af testen. Protokollen præsenteres her tillader pålidelige målinger i spontant vejrtrækning mus og gentage testen i samme dyr. Det påvirker antallet af mus, der kræves for at få Statistisk signifikans35 og overholde 3R (erstatte, finpudse og reducere) regler for dyr brug i eksperimentelle procedurer36. I mennesker som i mus, er de laveste mellem test variabilitet blevet fundet for samlede chlorid svar, tyder på, at det som den mest pålidelige nasal PD parameter at påvise effekten af nye CF terapeutiske strategier. I CF mus, var målefejl samlede chlorid reaktion vist sig at være mindre end ±1.7 mV35. Med andre ord, når evaluering bioactivity af en CFTR-korrigere stof i F508del-CF mus, en forskel mellem samlede chlorid svar i mangel og behandling større end 2 mV angiver 95% chance for en narkotikarelateret bedre effekt.
Data fortolkning af repræsentative tracings illustrerer den nasale PD test evne til at skelne mellem CF og wild-type mus18,19,20,21,35 og viser, at F508del-CF Erasmus musen model30 efterligner den menneskelige næseslimhinden med hensyn til de typiske kliniske ion transport abnormiteter. En resterende chlorid ledningsevne er imidlertid i dyremodel, kan spores, som følge af en resterende F508del-CFTR funktion eller fra et bidrag af alternative ikke-CFTR-afhængige chlorid kanaler. Omsætte resultater fra CF forskning fra prækliniske undersøgelser i klinisk indstillinger indebærer beskæftiger sig med flere store forskelle mellem de to indstillinger. Musen CF fænotype viser en svækket respiratorisk syndrom. Fravær af flere behandlingsformer sammen med det faktum, at musen model har til huse i privilegerede betingelser med hygiejnisk barrierer bidrager også til forskelle37. Protokollen beskrevet her viser en meget lav variabilitet35 , og det er blevet tilpasset til gris38,39 og opspore modeller40. I en tidligere undersøgelse, blev eksperimentelle protokollen ændret ved herunder perfusion af næseslimhinden mus med en hæmmer af alternative chlorid transportvirksomheder, at udforske ikke-CFTR-afhængige calcium-aktiverede kloridkanaler muligt bidrag kanaler18. Testen er også blevet brugt til at studere natrium transport i den β-ENaC overexpressing musen model41, manipuleret til at efterligne CF-lunge sygdom42. I fremtiden, yderligere anvendelser af testen kunne anses at studere andre transportvirksomheder, såsom ATP12A, en CFTR-uafhængig H+-pumpe protein i menneskelige og gris, men fraværende i mus airways43. Helt, protokollen beskrevet her tillader pålidelige målinger af den funktionelle status af transepithelial chlorid og natrium transportvirksomheder i spontant vejrtrækning mus, reduceret test-relaterede dødelighed og flere tests i samme dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takke Prof. J. Lebacq for kritisk redigering håndskriftet. CFTRtm1Eur (homozygote F508del-CFTR (FVB/129) mus blev udviklet af den Erasmus MC, Rotterdam, Nederlandene, med støtte fra EF europæisk koordinering indsats for forskning i cystisk fibrose EU FP6 LHHM-CT-2005-018932.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Portex polyethylene tube | Smiths Medical, Hythe, Kent, England CT21 6JL | Portex 800/100/500;2.0mm ID, 3.0 mmOD | to prepare capillary tubes for nasal probe |
| Electrode cream | Parker, Fairfield, NJ, USA | Redux cream | to build electrode bridges |
| Ag/AgCl electrodes | Biomedical, Clinton Township, MI, USA | JNS BNT131-1,0 | measuring and reference electrodes |
| amiloride hydrochloride | Sigma, St Louis, MI, USA | A7410 | to prepare perfusion solutions |
| forskolin | Sigma, St Louis, MI, USA | F6886 | to prepare perfusion solutions |
| Knick Portamess voltmeter | Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany | Portavo 904 pH | to measure potential difference |
| Paraly SW 112 Software | Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany | Paraly SW112 software | to capture potential difference data |
| midazolam | Mylan, Hoeilaart, Belgium | Dormicum 15mg/3ml | to serve as anaesthetic premedication |
| fentanyl | Janssen Cilag, Berchem, Belgium | Fentanyl-Janssen 0.05 mg/ml | to serve as anaesthetic medication |
| medetomidine | Orion Pharma, Espoo, Finland | Domitor 1 mg/ml | to serve as anaesthetic medication |
| droperidol | Janssen Cilag, Berchem, Belgium | Dehydrobenzperidol 2.5 mg/ml | to serve as anaesthetic medication |
| clonidine | Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germany | Catapressan 0.15 mg/ml, | to serve as anaesthetic medication |
| refernce IV catheter | Becton Dickinson, Sandy, UT, USA | 24 GA x 0.75 IN, BD Insyte-W | to build electrode bridges |
| forceps | Fine science Tools, Heidelberg, Germany | Dumont #5, Fine science Tools | to place the nasal catheter |
| naloxone | Braun Medical, Brussels, Belgium | Narcan, 0.4 mg/ml | to serve as anaesthetic antagonist |
| atipamezole | Zoetis, Bloomberg, Belgium | Antisedan, 5 mg/ml | to serve as a medetomedine specific antidote |
| Heating pads | Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA | 18,8x37,5 cm; 15,5x15,5 cm | to avoid hypothermia during and after the test |
| Peristaltic pump P1 | GE Life Sciences, Uppsala, Sweden | 18111091 | to perfuse solutions in the mouse nose |
| cyanoacrylate glue | Loctite, Henkel, Düsseldorf, Germany | super glue 3 | to glue together two capillary tubes for nasal probe |
| NaCl | Sigma, St Louis, MI, USA | RES0926S-A7 | Pharma-Grade, USP |
| CaCl2.2H2O | Sigma, St Louis, MI, USA | M7304 | Pharma-Grade, USP |
| MgCl2.6H2O | Sigma, St Louis, MI, USA | 1551128 | Pharma-Grade, USP |
| K2HPO4 | Sigma, St Louis, MI, USA | 1551139 | Pharma-Grade, USP |
| Na gluconate | Sigma, St Louis, MI, USA | S2054 | Pharma-Grade, USP |
| Ca gluconate | Sigma, St Louis, MI, USA | C8231 | Pharma-Grade, USP |
| MgSO4.7H2O | Sigma, St Louis, MI, USA | RES0089M-A7 | Pharma-Grade, USP |
| BD needle | Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA | BD 26G (0.45x10 mm) | intraperitoneal injection |
References
- Knowles, M., Gatzy, J., Boucher, R. Increased bioelectric potential difference across respiratory epithelia in cystic fibrosis. New England Journal of Medicine. 305 (25), 1489-1495 (1981).
- Middleton, P. G., Geddes, D. M., Alton, E. F. W. Protocols for in vivo measurement of the ion transport defects in cystic fibrosis nasal epithelium. European Respiratory Journal. 7 (11), 2050-2056 (1994).
- Knowles, M. R., Paradiso, A. M., Boucher, R. C. In vivo nasal potential difference: techniques and protocols for assessing efficacy of gene transfer in cystic fibrosis. Human Gene Therapy. 6 (4), 445-455 (1995).
- Paranjape, S. M., Zeitlin, P. L. Atypical cystic fibrosis and CFTR-related disorders. Clinical Reviews in Allergy & Immunology. 35 (3), 116-123 (2008).
- Wilschanski, M., et al. A pilot study of the effect of gentamicin on nasal potential difference measurements in CF patients carrying stop mutations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (3), Pt 1 860-865 (2000).
- Clancy, J. P., et al. Evidence that systemic gentamicin suppresses premature stop mutations in patients with CF. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163 (7), 1683-1692 (2001).
- Wilschanski, M., et al. Gentamicin-induced correction of CFTR function in patients with CF and CFTR stop mutations. New England Journal of Medicine. 349 (15), 1433-1441 (2003).
- Sermet-Gaudelus, I., et al. In vitro prediction of stop-codon suppression by intravenous gentamicin in patients with CF: a pilot study. BMC Medicine. 5, 5 (2007).
- Clancy, J. P., et al. No detectable improvements in CF transmembrane conductance regulator by nasal aminoglycosides in patients with CF with stop mutations. American Journal of Respiratory and Cell Molecular Biology. 37 (1), 57-66 (2007).
- Kerem, E., et al. Effectiveness of PTC124 treatment of CF caused by nonsensemutations: a prospective phase II trial. Lancet. 372 (9640), 719-727 (2008).
- Sermet-Gaudelus, I., et al. Ataluren (PTC124) induces CF transmembrane conductance regulator protein expression and activity in children with nonsense mutation CF. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 182 (10), 1262-1272 (2010).
- Wilschanski, M., et al. Chronic ataluren (PTC124) treatment of nonsense mutation cystic fibrosis. European Respiratory Journal. 38 (1), 59-69 (2011).
- Accurso, F. J., et al. Effect of VX-770 in persons with CF and the G551D-CFTR mutation. New England Journal of Medicine. 363 (21), 1991-2003 (2010).
- Clancy, J. P., et al. Results of a phase IIa study of VX-809, an investigational CFTR corrector compound, in subjects with cystic fibrosis homozygous for the F508del-CFTR mutation. Thorax. 67 (1), 12-18 (2012).
- Leonard, A., Lebecque, P., Dingemanse, J., Leal, T. A randomized placebo-controlled trial of miglustat in cystic fibrosis based on nasal potential difference. Journal of Cystic Fibrosis. 11 (3), 231-236 (2012).
- De Boeck, K., et al. CFTR biomarkers: time for promotion to surrogate end-point. European Respiratory Journal. 41, 203-216 (2013).
- Leal, T., et al. Successful protocol of anaesthesia for measuring transepithelial nasal potential difference in spontaneously breathing mice. Laboratory Animals. 40 (1), 43-52 (2006).
- Lubamba, B., et al. Preclinical evidence that sildenafil and vardenafil activate chloride transport in cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (5), 506-515 (2008).
- Lubamba, B., et al. Airway delivery of low-dose miglustat normalizes nasal potential difference in F508del cystic fibrosis mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 179 (11), 1022-1028 (2009).
- Lubamba, B., et al. Inhaled PDE5 inhibitors restore chloride transport in cystic fibrosis mice. European Respiratory Journal. 37 (1), 72-78 (2011).
- Vidovic, D., et al. rAAV-CFTRΔR Rescues the Cystic Fibrosis Phenotype in Human Intestinal Organoids and Cystic Fibrosis Mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 288-298 (2016).
- Stutts, M. J., et al. CFTR as a cAMP-dependent regulator of sodium channels. Science. 269 (5225), 847-850 (1995).
- Lubamba, B., Dhooghe, B., Noel, S., Leal, T. Cystic fibrosis: insight into CFTR pathophysiology and pharmacotherapy. Clinical Biochemistry. 45 (15), 1132-1144 (2012).
- Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
- Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245 (4925), 1066-1073 (1989).
- Stutts, M. J., Rossier, B. C., Boucher, R. C. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inverts protein kinase A-mediated regulation of epithelial sodium channel single channel kinetics. Journal of Biological Chemistry. 272 (22), 14037-14040 (1997).
- Ismailov, I. I., et al. Regulation of epithelial sodium channels by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Biological Chemistry. 271 (9), 4725-4732 (1996).
- Althaus, M. ENaC inhibitors and airway re-hydration in cystic fibrosis: state of the art. Current Molecular Pharmacology. 6 (1), 3-12 (2013).
- Wilke, M., et al. Mouse models of cystic fibrosis: phenotypic analysis and research applications. Journal of Cystic Fibrosis. 10, Suppl 2 152-171 (2011).
- Van Doorninck, J. H., et al. A mouse model for the cystic fibrosis delta F508 mutation. The EMBO Journal. 14 (18), 4403-4411 (1995).
- Colledge, W. H., et al. Generation and characterization of a delta F508 cystic fibrosis mouse model. Nature Genetics. 10 (4), 445-452 (1995).
- Zeiher, B. G., et al. A mouse model for the delta F508 allele of cystic fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 96 (4), 2051-2064 (1995).
- Ghosal, S., Taylor, C. J., McGray, J. Modification of the nasal membrane potential difference with inhaled amiloride and loperamide in the cystic fibrosis (CF) mouse. Thorax. 51 (12), 1229-1232 (1996).
- Ghosal, S., Taylor, C. J., Colledge, W. H., Ratcliff, R., Evans, M. J. Sodium channel blockers and uridine triphosphate: effects on nasal potential difference in cystic fibrosis mice. European Respiratory Journal. 15 (1), 146-150 (2000).
- Leonard, A., et al. Comparative Variability of Nasal Potential Difference Measurements in Human and Mice. Open Journal of Respiratory Disease. 2, 43-56 (2012).
- Tannenbaum, J., Bennett, B. T. Russell and Burch's 3Rs then and now: the need for clarity in definition and purpose. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 120-132 (2015).
- Pritchett-Corning, K. R., et al. AALAS/FELASA Working Group on Health Monitoring of rodents for animal transfer. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (6), 633-640 (2014).
- Salinas, D. B., et al. CFTR involvement in nasal potential differences in mice and pigs studied using a thiazolidinone CFTR inhibitor. American Journal of Physiology. Lung Cell Molecular Physiology. 287 (5), 936-943 (2004).
- Fisher, J. T., et al. Comparative processing and function of human and ferret cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Journal of Biological Chemistry. 287 (26), 21673-21685 (2012).
- Kaza, N., et al. Use of ferrets for electrophysiologic monitoring of ion transport. PLoS One. 12 (10), 0186984 (2017).
- Leal, T., Beka, M., Panin, N., Mall, M. A., Noel, S. Nasal potential difference in βENaC-overexpressing mouse reveals pH-sensitive channel hyperactivity and shift of subunits stoichiometry. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (S1), 72 (2017).
- Mall, M., Grubb, B. R., Harkema, J. R., O'Neal, W. K., Boucher, R. C. Increased airway epithelial Na+ absorption produces cystic fibrosis-like lung disease in mice. Nature Medicine. 10 (5), 487-493 (2004).
- Shah, V. S., et al. Airway acidification initiates host defense abnormalities in cystic fibrosis mice. Science. 351 (6272), 503-507 (2016).
