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Bioengineering

Nano-capteurs pour détecter l’activité protéase In Vivo pour le diagnostic non invasif

Published: July 16, 2018 doi: 10.3791/57937
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3,4,5
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Tech College of Engineering and Emory School of Medicine, 2Parker H. Petit Institute of Bioengineering and Bioscience, 3Institute for Electronics and Nanotechnology, Georgia Tech, 4Integrated Cancer Research Center, Georgia Tech, 5The Georgia Immunoengineering Consortium, Emory University and Georgia Tech

Summary

Protéases sont étroitement réglementées des enzymes impliquées dans les processus biologiques fondamentaux et la dysrégulation protéase activité disques progression des maladies complexes telles que le cancer. Objectif de cette méthode consiste à créer des nano-capteurs qui mesurent l’activité protéase dans vivo en produisant un signal de clivage qui est détectable dans l’urine de l’hôte et la maladie est discriminatoire.

Abstract

Protéases sont des enzymes multifonctionnels qui se spécialisent dans l’hydrolyse des liaisons peptidiques et contrôlent les processus biologiques larges incluant l’homéostasie et allostasie. En outre, dysrégulation de l’activité protéase disques pathogenèse et est un biomarqueur fonctionnel des maladies comme le cancer ; par conséquent, la capacité de détecter l’activité protéase dans vivo peut fournir des renseignements cliniquement pertinents pour le diagnostic biomédical. Le but du présent protocole est de créer des nano-capteurs qui sonde de protéase activité in vivo en produisant un signal quantifiable dans l’urine. Ces Nano-capteurs de protéase se composent de deux éléments : une NANOPARTICULE et le substrat. Les fonctions de nanoparticules pour augmenter le débit Half-Life et substrat de circulation sur les sites de maladies cibles. Le substrat est une séquence de peptide court (6-8, AA), qui est conçue pour être spécifique à un groupe de protéases ou de protéase de la cible. Le substrat est conjugué à la surface de la NANOPARTICULE et se termine par un journaliste, comme un marqueur fluorescent, pour la détection. Comme dysrégulation protéases cleave le substrat de peptide, le journaliste est filtré dans l’urine pour la quantification comme biomarqueurs de l’activité de la protéase. Dans les présentes, nous décrivons la construction d’un NANOCAPTEUR pour métalloprotéinase matricielle 9 (MMP9), qui est lié à la progression tumorale et les métastases, pour le dépistage du cancer colorectal dans un modèle murin.

Introduction

Protéases sont des enzymes multifonctionnels qui se spécialisent dans l’hydrolyse des liaisons peptidiques et ont un contrôle important sur nombreux processus biologiques, y compris l’homéostasie, allostasie et maladie1. Une altération de l’état d’activité de la protéase a été corrélée à une variété de maladies, notamment le cancer et les maladies cardiovasculaires, rendant les candidats attrayants protéases pour le développement en biomarqueurs cliniques2,3. En outre, une activité protéase est pathogenèse fonctionnellement lié à distinctes, des patients et le pronostic de la maladie4. De façon générale, biocapteurs ont été développés pour détecter différents phénomènes biologiques et d’autres maladies comme le cancer, des maladies neurodégénératives et transfert d’électron processus5,6,7,8 , 9. plus précisément, les capteurs de protéase axée sur le substrat ont été mis au point pour détecter l’activité de la protéase et incluent des sondes fluorogéniques pour diagnostic imaging10 et isotopiquement étiquetés substrats peptidiques de in vitro détection par spectrométrie de masse à11. En outre, fondé sur l’activité des sondes ont été développés, qui contiennent des régions comme substrat qui lient ou modifient la cible protéase12. Avec cette méthode, la protéase cible est irréversiblement inhibée lorsque le site actif est modifié et analyse nécessite la récolte de tissus, ce qui limite les applications in vivo . Toutefois, il est important de détecter l’activité protéase dans vivo, parce que la régulation de l’activité de la protéase est fortement tributaire du cadre d’autres activités biologiques telles que la présence d’inhibiteurs endogènes.

L’objectif de ce travail est de décrire la formulation de nano-capteurs basés sur les activités qui détectent l’activité protéase dans vivo en produisant un signal mesurable dans l’urine. Cette plateforme est utilisée comme diagnostic non invasif de discriminer les maladies complexes telles que le cancer à l’aide de dysrégulation de l’activité protéase comme biomarqueur fonctionnel. Notre plateforme NANOCAPTEUR se compose des nanoparticules d’oxyde de fer (IONP) conjugués à des substrats de protéase. Ces substrats sont terminées par un journaliste fluorescent qui s’échappe lorsque protéases clivent le substrat. Ces IONPs circulent en vivo, localiser les sites de la maladie et exposent les substrats aux protéases d’associés à la maladie actives. Après clivage, reporters fluorescents sont libérés et, en raison de leur petite taille, sont filtrés dans l’urine, tandis que les substrats clivés sur le IONP restent dans le corps. Par conséquent, une augmentation des activités de protéase en vivo se traduira par des concentrations plus élevées de journaliste dans l’urine (Figure 1). Notre plate-forme étant une analyse d’urine, aucune plateforme d’imagerie n’est nécessaire et signaux de diagnostic sont enrichies dans l’urine.

Cette plate-forme peut être conçue pour détecter une variété de maladies dont le cancer, la fibrose et thrombose13,14. Nous décrivons ici la conception de nano-capteurs pour détecter les altitudes dans la matrice metallopeptidase 9 (MMP9) activité comme biomarqueur du cancer colorectal. Le cancer colorectal est la deuxième cause de décès par cancer aux États-Unis, avec environ 136 800 nouveaux cas et 50 300 décès en 2014 seulement15. Les cellules tumorales colorectal produisent MMP9, qui s’est avérée pour piloter la progression maligne, dégradation de la matrice, ainsi que16de la métastase. En outre, nous avons identifié un substrat adapté de peptide (PLGVRGK) pour MMP9 de la littérature17. Cette plate-forme peut être utilisée pour la détection précoce du cancer et de faible coût point-of-care diagnostic13,14,18,19,20,21.

Figure 1
Figure 1 : schéma de NANOCAPTEUR activité In vivo. Nano-capteurs circulent dans le corps et localiser les sites de la maladie. Ensuite, liée à la maladie des protéases clivent substrats peptidiques présentés par IONPs. La taille des fragments clivées permet la clairance rénale, obligeant à localiser dans l’urine. Après que l’animal urine, ces fragments peptidiques peuvent être analysés par leur molécule de journaliste. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Protocol

Approbation institutionnelle Institutional Animal Care et utilisation Comité (IACUC) à l’établissement du chercheur est nécessaire de procéder à l’expérimentation animale suivantes. En outre, les installations standard de soins aux animaux (p. ex., abritant des chambres, cagoules animaux stériles, chambres d’isofluorane pour anesthetization et CO2 chambres pour euthanasie éthique de point de terminaison) sont nécessaires pour réaliser ces expériences. Spéciaux de formation et d’assistance avec ces installations peuvent être fournis par le laboratoire de recherche physiologique (CTR) dans son établissement. Tous les travaux d’animaux a été approuvé par IACUC à Georgia Tech (protocole : A14100).

1. synthèse de nanoparticules (IONP) d’oxyde de fer

Remarque : Sécurité : la synthèse de nanoparticules d’oxyde de fer complète doit être effectuée à l’aide d’équipements de protection individuelle et sous un produit chimique fumées hotte.

  1. Dans un tube conique de 15 mL, refroidir 1 mL d’hydroxyde d’ammonium 30 % dans un seau à glace pendant 30 min.
  2. Laver une fiole d’Erlenmeyer avec de l’eau désionisée de 250 mL et ajouter 10 mL d’eau distillée double (ddH2O). Immergez l’extérieur de la fiole dans un bain de glace reposant sur une plaque de remuer/chaleur. Utiliser une pipette en plastique pour débit N2 du gaz dans le ddH2O dans le ballon. Bulle de 15 minutes avec N2 à désoxygéner.
  3. Pèsent 224 µmol (4,5 grammes) de dextran (poids moléculaire (MW) = 20 kDa) dans un tube conique de 50 mL. Ajouter H2O tel que le volume final du mélange, y compris le dextran, soit 20 mL. Vortex vigoureusement pour dissoudre le dextran.
  4. Pèsent 290 µmol (78,5 g) de chlorure de fer (III) hexahydrate, ajoutez à la solution de dextran et vortex de dissoudre.
  5. Filtrer la solution obtenue à travers un filtre de 0,2 µm.
  6. Transférer 1 mL réfrigéré d’hydroxyde d’ammonium dans 9 mL de l’eau désoxygénée. Retour à 4 ° C.
  7. Peser les 367 µmol (73,0 grammes) de fer (II) chlorure tétrahydraté, dissoudre dans 1 mL de ddH sans oxygène2O et filtrer à travers un filtre de 0,2 µm.
  8. Transférer la solution dextran-iron(III) dans l’erlenmeyer de 250 mL et désoxygéner avec N2 pendant 15 minutes sur la glace. Mélanger avec une agitation magnétique bar tournant à 1 600 tr/min.
  9. Pour créer une atmosphère d’azote homogène, cap le ballon avec un septum en caoutchouc. Perforation de la cloison avec une 18 aiguille à flux N2 de calibre dans le ballon. Insérer une aiguille de 18 calibre séparé comme une prise de courant.
  10. Ajoutez 467 µL de la solution de fer (II) à la solution de dextran-iron(III) avec une seringue de 1 mL, en remuant avec une barre magnétique remuer à 1600 tr/min. Ce ratio de fer (II) de fer (III) se traduit par une réaction équilibrée qui produira la magnétite ou Fe3O4.
  11. Ajouter que le réfrigéré diluer le hydroxyde d’ammonium goutte à goutte dans la solution de dextran de fer (II) - fer (III) - pour amorcer le processus de nucléation21. Assurez-vous que chaque gouttelette se mélange bien avant de tomber dans un autre. Terminer la réaction après l’addition de 1 à 2 mL d’hydroxyde d’ammonium.
  12. Arrêter l’écoulement du N2 et retirer le bouchon en caoutchouc. Retirer la baignoire de glace et le remplacer par un bain d’eau chaude, tout en continuant de remuer la solution. S’assurer que la température de la solution atteint 75 ° C et laisser incuber pendant 75 minutes.
  13. Enlever le ballon de la plaque chaude/remuer et doublement filtrer la solution sur 0,2 µm puis 0,1 µm filtres pour enlever les particules grossières.
  14. Echange de tampon les particules en FD2O, à l’aide de 100 kDa moléculaire poids coupés de concentrateurs (m.w.c.o.) pour supprimer les excès dextran de la solution, qui devrait être très visqueuse. Remplacer les filtres si le débit reste sombre même après 2-3 tours, ce qui indique que le filtre peut-être avoir enfreint.
    1. Échange de la mémoire tampon avec des filtres de spin, centrifuger à 4 ° C à 4800 X g pendant 15 minutes, jeter le cheminement, et ajouter nouveau tampon à la solution IONP. Répétez 3 à 5 fois.
  15. Déterminer la concentration de nanoparticules à l’aide d’un spectrophotomètre/lecteur. Prendre mesures d’absorbance à 400 nm et l’utilisation de l’absorptivité molaire de IONP à cette longueur d’onde (ε = 2,07 x 106 cm-1 M-1) pour déterminer la concentration des particules de IO.
  16. Resuspendre les IONPs à 10 mg/mL dans ddH2O (habituellement volume total est d’environ 3 mL) et assurez-vous d’utiliser des tubes en polypropylène pour cette étape pour la compatibilité chimique. Ajouter 1,6 volumes de 5 M NaOH, puis ajouter 0,65 volumes de l’épichlorhydrine. Rigoureusement mélanger sur un agitateur de plaque à température ambiante pendant 12 heures pour relier dextran.
  17. Utiliser une seringue de 20 mL avec une aiguille de calibre 18 pour transférer la solution IONP dans la membrane de dialyse de m.w.c.o. de 50 kDa. Placer la membrane de dialyse dans 4 L FD2O et remplacer des H2O quelques fois (toutes les 2-3 heures). Incuber pendant la nuit.
  18. Mesure de la concentration et porter IONPs à 5 mg/mL (voir étape 1.15). Ajouter hydroxyde d’ammonium pour atteindre 20 % (v/v) et agiter à température ambiante pendant 12 heures > à aminate la surface du IONPs. Echange de tampon à l’aide de filtres de m.w.c.o. de 30 kDa (voir 1.14).
  19. Réglez le volume jusqu'à 2,5 à 3,5 mL avant la purification finale par Fast protéine chromatographie en phase liquide (FPLC ; voir Table des matières pour colonne de gel filtration).
  20. Diffusion dynamique de la lumière (DLS) permet de déterminer le rayon hydrodynamique de IONPs (attendus entre 10 à 100 nm, taille moyenne 40 à 50 nm). Pour ce faire aliquotage 1 mL de 100 X échantillon IONP dilué dans une cuvette, placer dans la machine et utiliser le logiciel du fabricant pour prendre la mesure.
    Remarque : La population totale de IONPs se situera entre 10 et 100 nm par des mesures de DLS, mais la majorité de la population est d’environ le diamètre moyen, qui varie de 40 à 50 nm. Si l'on veut limiter la plage de taille, on peut encore utiliser chromatographie d’exclusion afin d’isoler les fractions avec différents diamètres. IONPs doivent être conservés à 4 ° C.

2. peptide Design, conjugaison à IONP et In Vitro de Validation

  1. Synthétiser un substrat de peptide (par exemple, par une installation de base ou dans le commerce) pour une protéase de la cible avec un journaliste fluorescent N-terminaux tels que l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) et un résidu de cystéine terminale C pour permettre le couplage thiol-médiée.
    Remarque : Dans le cas de cette étude pour MMP9, le peptide utilisé était FITC-PLGVRGK-C, avec kchat/km ~ 2,0 x 105 M-1s-1.
  2. Aliquote 0,5 mg de IONP (à 1 mg/mL) et l’échange de mémoire tampon dans la mémoire tampon de couplage (50 mM le Borate de Sodium avec EDTA 1 mM, pH = 8,5) en utilisant un spin de m.w.c.o. 10 kDa du filtre (Voir l’étape 1.14).
  3. Dissoudre Succinimidyl iodoacétate (SIA) dans le diméthylformamide (DMF) pour atteindre une concentration de ~ 30 mg/mL et ajouter SIA à IONP à un rapport molaire de 500 SIA:IONP.
    Remarque : Le SIA est un hétérobifonctionnel Croix linker qui intervient dans le couplage des amines sur IONPs pour les groupes sulfhydryles sur le substrat de peptide.
  4. Incuber pendant 1 à 2 heures à température ambiante dans l’obscurité. Si quitter du jour au lendemain, incuber à 4 ° C.
  5. Exchange à l’aide d’un filtre de spin m.w.c.o. 10 kDa dans le tampon de couplage pour supprimer SIA n’a pas réagi de la mémoire tampon (voir étape 1.14).
  6. Amener la solution du produit final à 1 mg/mL (0,5 mL de solution). Mélanger le peptide d’intérêt à un rapport molaire de 90 : 1 (peptide : IONP) avec 20 kDa se terminant par thiol polyéthylène glycol (PEG) dans un rapport molaire de 20:1 (PEG : IONP). Cette solution de peptide-PEG se mêlent IONP.
  7. Incuber une nuit à température ambiante sur un agitateur de plaque sur la vitesse la plus élevée, couvrant les tubes en aluminium pour éviter le photoblanchiment de molécules fluorescentes.
  8. Ajouter L-cystéine dans un rapport molaire de 500 : 1 (C:IONP) pour neutraliser toutes les molécules de SIA n’a pas réagis. Incuber pendant 1 heure à 25 ° C dans un agitateur à vitesse plus élevée à la température ambiante.
  9. Purifier par FPLC (voir 1.1.19). Utilisez un spectrophotomètre pour mesurer l’absorbance de la solution de l’échantillon et calculer le rapport de Peptide : IONP selon ce qui suit. Après purification, stocker le produit à 1 mg/mL à 4 ° C dans du PBS.
    1. Utilisez un spectrophotomètre pour mesurer l’absorbance de la solution échantillon à 400 nm (unéchantillon, 400) et la longueur d’onde d’absorbance maximale pour le fluorophore utilisé, qui est 488 nm pour FITC (unéchantillon, 488). Mesurer l’absorbance d’une solution IONP stock amine aux mêmes deux longueurs d’onde (400 nm et 488 nm), qui sont respectivement représentés comme uneNP, 400 et uneNP, 488.
    2. Utiliser les équations 1 et 2 pour calculer le normalisée A400 et une valeurs488 .
      Equation 1Équation 1
      Equation 2Équation 2
    3. Une400 et une488 représentent les valeurs normalisées de l’échantillon. Utilisez ces valeurs pour calculer le taux de Peptide : IONP avec l’équation 3.
      Equation 3Équation 3
    4. Où Equation 4 et Equation 5 sont les absorptivités molaires de la IONP et le fluorophore, respectivement. Pour ces particules Equation 4 = 2,06 x 106 M-1cm-1 et pour FITC Equation 5 = 72 000 M-1cm-1, alors la valeur de Equation 6 devrait être 28,75. Les taux de Peptide : IONP typique devraient être dans la gamme de 20:1 à 50 : 1.
  10. Valider les fonctionnalités des sondes en effectuant un essai in vitro clivage avec.
    1. Avec du PBS (1 % de BSA), une solution de nanoparticules 18 µL avec une concentration de 200 nM de peptide. Mélanger avec 2 µL de protéase d’intérêt (MMP9 ; 0,1 - 1 mg/mL).
    2. Incuber dans un lecteur de plaques à 37 ° C pendant 1 heure, en prenant des mesures de fluorescence (en utilisant l’excitation appropriée et les longueurs d’onde d’émission, qui sont 485 nm et 528 nm pour FITC, respectivement) toutes les 1-2 minutes pour surveiller le clivage.

3. administration de nano-capteurs et Urine de dépistage du Cancer

Remarque : Pour plus de détails sur le modèle de l’exemple, consultez notre précédent rapport13.

  1. Créer une cage métabolique pour prélèvement d’urine en obtenant un manchon cylindrique au sommet d’une plaque 96 puits. Pendant la collecte de l’urine, placez une souris à l’intérieur de la douille et couvrir avec un couvercle de boîte de Pétri pour empêcher la fuite de l’animal.
  2. Préparer une solution injectable (volume maximum de 200 µL) contenant des nano-capteurs à une concentration de 3 000 mg/kg (~ 50 µmol) de peptide dans du sérum physiologique stérile.
  3. Chez les souris femelles, 8 - semaine vieux, nues, portant xénogreffe LS174T Tumeurs colorectales à un fardeau de ~ 100-300 mm3, qui devrait avoir lieu sur environ jour 10, administrer NANOCAPTEUR solution par injection dans la veine queue. Immédiatement après l’injection, placez les souris dans les cages métaboliques et noter le temps d’injection pour chaque souris.
  4. À 60-90 minutes après l’injection, retirez le manchon cylindrique de plaque à 96 puits. Empêcher les souris et appliquez une légère pression sur la vessie pour induire la souris pour annuler toute urine restant dans l’assiette. Recueillir toutes les urines (200-500 µL).
  5. Analyser les échantillons d’urine par immunoprécipitation de purifier FITC de l’urine et d’augmenter la sensibilité. Utilisation de billes magnétiques couplées à l’anticorps anti-FITC.
    1. Tout d’abord, laver 25 mg de billes magnétiques 3 fois avec le tampon de l’enduit et porter le volume final à 225 µL.
      Remarque : Il est important de faire le tampon de revêtement (borate de sodium 0,1 M, pH 9,5), tampon de blocage (PBS, 0,5 % de BSA, 0,05 % de Tween-20, pH 7,4) et tampon de lavage (PBS, 0,1 % de BSA, 0,05 % de Tween-20, pH 7,4) frais à que chaque fois et environ 20 mL de chacun soient nécessaire.
    2. Ajouter 200 µL d’anti-FITC (5 mg/mL) et 200 µL de sulfate d’ammonium (3 M). Incuber pendant 16 à 24 heures à 37 ° C sur un agitateur.
    3. Ajouter la solution d’un séparateur magnétique, retirez le surnageant, remplacer par 625 Equation 7 Λ blocage de la mémoire tampon et incuber à 37 ° C pendant la nuit. Puis laver 3 fois avec le tampon de lavage et stocker dans 1,25 mL de tampon de lavage.
    4. Incuber 2 µL d’urine 5 µl de billes magnétiques (20 mg/mL) et porter à un volume total de 50 µL avec du PBS (0,01 % Tween 20). Incuber pendant 60 min.
    5. Laver deux fois avec 50 µL PBS (0,01 % Tween 20) à l’aide d’un séparateur magnétique de recueillir des billes magnétiques après chaque lavage.
    6. Éluer deux fois avec 32,5 µL d’acide acétique 5 %. Neutraliser l’élution regroupée (70 µL) 35 µl de 2 M Tris pour atteindre un pH final de ~ 7.
    7. Lire sur un lecteur de plaque (voir Table des matières) à approprié longueurs d’onde d’excitation et d’émission de fluorescence de l’urine de quantifier. Calculer la concentration de journaliste fluorescent contre une échelle de concentrations connues de fluorophore gratuit.

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Representative Results

La majorité de la population des IONPs est autour du diamètre moyen, qui varie de 40 à 50 nm. Après pegylation, cette gamme de taille a une demi-vie de circulation d’environ 6 heures13 in vivo (voir la Figure 2 a). Si l'on veut choisir pour une grandeur particulière, on peut utiliser la chromatographie d’exclusion pour isoler les fractions IONP avec différents diamètres. Les nanoparticules de TEM apparaîtra comme individuels d’oxyde de fer sphérique nanoparticules réticulé ensemble par une couche externe de dextran. 13  Une solution de IONPs apparaît translucide avec aucun précipité et brun clair en couleurs. Après conjugaison réussie de peptide, analyse spectrale absorbance révélera un pic distinct d’absorbance à la longueur d’onde d’excitation maximale du reporter fluorescent. Dans le cas de la FITC, cela sera centré autour de 488 nm (voir la Figure 2 b). Une réaction de conjugaison de peptide typique se traduira par un peptide à rapport molaire IONP de 20-50 après purification des FPLC. Pour tester la capacité de la sonde à l’activité de la protéase sens, une partie aliquote de nano-capteurs peut être incubée avec des protéases recombinantes et surveillée par fluorimétrie. Activité de clivage se traduira par la libération des journalistes fluorescents - qui sont autrement homoquenched sur la surface de la NANOPARTICULE - en solution et augmenter la fluorescence de l’échantillon. Il est courant d’observer le substrat des vitesses de clivage qui suivent une cinétique de Michaelis-Menten (voir Figure 2 c).

Figure 2
Figure 2 : Validation de la Structure et la fonction des nano-capteurs In vitro. () A DLS graphique représentant la distribution de la taille d’un post-synthèse de population IONP. (b) le spectre d’absorption de IONPs après conjugaison avec des substrats marqués au FITC MMP-9. (c) l’essai in vitro clivage avec montrant que MMP9 fend régulièrement le peptide présenté par le NANOCAPTEUR au cours d’une heure. A été utiliser une concentration de protéase de 0,5 mg/mL dans du PBS (1 % de BSA) tampon. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Pour appliquer cette plate-forme dans des modèles murins de cancer, il est typique d’utiliser nanodétecteurs enduit avec un journaliste fluorescent proche infrarouge pour permettre la visualisation de la pharmacocinétique par fluorescent animaux entiers d’imagerie (Figure 3 a). Dans des souris porteuses de tumeurs colorectales LS174T, un signal fluorescent localiserez dans l’urine dans les 60 à 90 minutes après l’administration intraveineuse de nano-capteurs en raison du clivage MMP9 de substrats peptidiques sur la nano-capteurs. En revanche, il y aura des signaux fluorescents bas dans la vessie des souris de groupe de contrôle (voir Figure 3 a). Il est à noter que le signaux observé dans le foie se pose parce que les particules sont par la suite au nettoyage par les monocytes et les macrophages dans le système réticulo-endothélial, qui se trouvent généralement dans le foie, la rate et des ganglions. Le signal venant du foie dans la Figure 3 a est donc, en raison du dégagement des nanoparticules. 13 lors de la quantification par fluorescence urine par immunoprécipitation, un signal significativement élevé sera observé dans les souris porteuses de tumeurs LS174T par rapport aux témoins sains (voir la Figure 3 b).

Figure 3
Figure 3 : détection du Cancer Colorectal dans un modèle murin. (a) images In vivo de tumeur et contrôle souris groupe, observant la localisation IONP vers des sites de la maladie, mais aussi de localisation d’urine en raison de la progression tumorale. (b) Urine fluorescence quantification des tumeurs chez les souris témoins dans le modèle de tumeur LS174T. Barres d’erreur sont pointés comme écart-type (*p < 0,05 par deux-test t apparié à queue). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Cette méthode décrit le développement de nano-capteurs basés sur les activités consistant en protéase substrats conjugués à un noyau de nanoparticules. L’événement de clivage protéolytique est surnommé le « switch pharmacocinétique », parce que produits peptidiques clivées sont plus petites que la taille de filtration rénale de 5 nm23 et filtre dans l’urine pour produire un signal non invasif. Par conséquent, il est important d’utiliser des nanoparticules ou transporteurs avec un rayon hydrodynamique qui est supérieur à 5 nm, comme quelque chose de plus petit va être rapidement éliminé par les reins et confondre les signaux de l’urine. Nous utilisons IONPs pégylé parce qu’ils sont approuvés par la FDA, bien toléré et ont une demi-vie circulante de 3 à 5 heures. 13 une autre considération importante dans la formulation de nano-capteurs est le PEG ratio molaire de peptide substrat. 24 , 25 augmenter le ratio va réduire le clivage non spécifique par des protéases hors cible à travers un blindage stériques des peptides26, mais potentiellement diminuer ainsi l’activité sur la cible. A l’inverse, une plus faible PEG ratio de peptide augmentera accessibilité protéase et le clivage des peptides, qui va amplifier les signaux de détection, mais peut aussi augmenter le bruit de fond. In vivo, une concentration plus faible surface de PEG peut également augmenter NANOCAPTEUR absorption par le système réticulo-endothélial (RES) et diminuer le temps de circulation.

Pour appliquer cette technologie afin de diagnostiquer d’autres maladies, protéases qui sont surexprimés dans un état de maladie doivent être identifiés de la littérature17. Découverte efforts devraient se concentrer sur les protéases extracellulaires car ces nano-capteurs ne sont pas conçus pour pénétrer dans les cellules à activité intracellulaire de sens. Ces Nano-capteurs sont également conçus à sens endoprotéases qui coupent au milieu de peptide, qui fournit de nombreuses maladies candidat à cibler. En ciblant les endoprotéases extracellulaire seul, nous avons développé des diagnostiques de la fibrose hépatique, plusieurs types de cancer et thrombose13,19,20,21. Cette plate-forme peut être davantage conçue pour détecter les exoprotease activité après clivage endoprotéase dans le contexte de maladie26,27. Il est également important de concevoir un substrat de peptide spécifique de la protéase d’intérêt. Ceci pourrait être accompli par le dépistage des séquences peptidiques candidat avec le test de clivage in vitro (étapes 2.10-2.11). Clivage potentiels de protéase non spécifique doit également être testé lors de la conception de peptide. Par exemple, dans le cas de MMP9, nous avons testé la spécificité de substrat avec la thrombine, une protéase de la coagulation à fortes concentrations dans le sang. Pour utiliser l’activité nanodétecteurs in vivo, le temps de collecte urine optimale doit être déterminé par suivi cinétique de la production du signal par imagerie ou d’échantillonnage discret de l’urine après l’administration de nano-capteurs. Souris peuvent aussi être perfusés avec du sérum physiologique stérile d’overhydrate des animaux et d’augmenter la production d’urine. En pratique, cette technologie peut être étendue à n’importe quelle maladie avec l’activité des protéases extracellulaires augmentée ou diminuée. Une force de cette plate-forme est qu’elle permet l’amplification du signal de cible de protéase, donc même si seule une fraction de la population de protéase maladie-site est recensée, une lecture importante peut être mesurée. La plateforme actuelle est conçue au sens endoprotéases extracellulaire. Lorsque vous appliquez cette plateforme à d’autres maladies, il faut identifier la biologie de la protéase de cette maladie, telle que cette plateforme peut être ajustée aux protéases de sens d’intérêt.

Cette technologie de base peut être davantage conçue avec des journalistes de clivage qui peuvent être détectés avec différentes plateformes analytiques pour augmenter le nombre de demandes. Par exemple, reporters de clivage qui contiennent des ligands pour la liaison de l’anticorps peuvent être détectées par des tests de papier à faible coût diagnostics point-of-care19. En outre, étiquetage des substrats avec journalistes de massives permet plusieurs protéases à être simultanément détectées dans l’urine par spectrométrie de masse13. En conclusion, la présente méthode décrit formulation basée sur l’activité nano-capteurs pour détecter l’activité protéase dans vivo comme biomarqueur urinaire non invasif de la maladie.

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Disclosures

Le Dr Kwong est co-fondateur et sert de conseiller à Glympse Bio, qui développe des produits liés à la recherche décrite dans cet article. Cette étude pourrait influer sur sa situation financière personnelle. Les conditions de cette entente ont été examinées et approuvées par Georgia Tech conformément à sa politique de conflit d’intérêts

Acknowledgments

Ce travail a été financé par un directeur de NIH New Innovator Award (prix no DP2HD091793). Q.D.M. est pris en charge par le programme de bourses de recherche recherche supérieures de NSF (Grant No. DGE-1650044). B.A.H est pris en charge par les instituts nationaux de santé GT BioMAT formation Grant sous attribution numéro 5T32EB006343 ainsi que du Président Georgia Tech Fellowship. G.A.K. est titulaire d’une bourse de carrière à l’Interface scientifiques du fonds Burroughs Bienvenue. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm syringe filters VWR 4652
18G needle VWR 89134-024
15 mL conicals VWR 89039-670
250 mL Erlenmeyer flask VWR 89000-362
Stir bar VWR 58949-006
Hot Plate/Magnetic Stirrer VWR 97042-634
Glacial acetic acid VWR 97064-482
Albumin from Bovine Serum (BSA) Thermo Fisher A13100
Iron (III) chloride hexahydrate Sigma 236489
Iron (II) chloride tetrahydrate Sigma 44939
Epichlorohydrin Sigma 45340-500ML-F
DMF Sigma D4551
Ammonium Hydroxide Sigma 320145-500ML
Sodium Hydroxide pellets Sigma 221465-500G
EDTA Sigma E9884
Sodium Borate Sigma B9876
L-Cysteine Sigma 168149-100G
Tris-HCl Sigma T5941
Tris base Sigma T6066
PBS tablets Sigma P4417
Dextran Pharmacosmos 5510 0020 9006
Amicon 15 mL 10k filters, 24 pk Millipore UFC901024
Amicon 15 mL 30k filters, 24 pk Millipore UFC903024
Amicon 15 mL 100k filters, 24 pk Millipore UFC910024
Zetasizer Nano ZS Malvern Panalytical NanoZS
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette LifeTech 66130
Dynabeads MyOne Tosylactivated LifeTech 65501
SIA Life Tech 22349
PEG 20k Laysan Bio MPEG-SH-20K-1g
Fluorescein Antibody [2A3] GeneTex GTX10257
Hiload 16/600 superdex 200 GE Healthcare 45-002-490
Plate Reader Fisher BTCYT5M
BD Insulin Syringes Fisher NC0872854

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References

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Biomarqueurs synthétique bioingénierie numéro 137 fondé sur l’activité des sondes protéases nanoparticules nano-capteurs et diagnostics de l’urine
Nano-capteurs pour détecter l’activité protéase <em>In Vivo</em> pour le diagnostic non invasif
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Holt, B. A., Mac, Q. D., Kwong, G.… More

Holt, B. A., Mac, Q. D., Kwong, G. A. Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics. J. Vis. Exp. (137), e57937, doi:10.3791/57937 (2018).

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