Summary
프로 테아 제는 기본적인 생물학 과정 및 암과 같은 복잡 한 질병의 dysregulated 프로 테아 제 활동 드라이브 진행에 관련 된 단단히 규제 효소. 이 방법의이 목표 호스트 소변에서 감지 하 고 질병을 차별 분열 신호를 생산 하 여 효소 활동에서 vivo에서 측정 하는 nanosensors를 만드는 것입니다.
Abstract
프로 테아 제는 다기능 효소 펩 티 드 결합의 가수분해에서 전문 및 항상성 등 allostasis 광범위 한 생물 학적 과정을 제어. 또한, dysregulated 프로 테아 제 활동 pathogenesis 드라이브 이며 암;과 같은 질병의 기능 바이오 마커 따라서, 효소 활동에서 vivo에서 감지 하는 능력은 생물 의학 진단에 대 한 임상 관련 정보를 제공할 수 있습니다. 이 프로토콜의 목표 조사 효소 활동에서 vivo에서 소변에서 정량 신호를 생산 하 여 nanosensors를 만드는 것입니다. 이러한 효소 nanosensors의 두 가지 구성 요소 구성: 나노 및 기판. 대상 질병 사이트에 순환 반감기 및 기판 납품 증가를 나노 기능. 기판은 짧은 펩 티 드 순서 (6-8 AA), 대상 효소 또는 프로 테아의 그룹에 구체적으로 설계 된입니다. 기판은 나노 입자의 표면에 활용 하 고 탐지를 위한 형광 표식 같은 기자에 의해 종료 됩니다. Dysregulated 프로 테아 제 펩 티 드 기질 다니엘로 기자 프로 테아 제 활동의 한 biomarker로 정량화에 대 한 소변으로 필터링 됩니다. 여기는 매트릭스 metalloproteinase 9 (MMP9), 종양 진행 및 전이, 대 장 암 마우스 모델에서의 검출에 대 한 관련 된에 대 한 nanosensor의 건설에 설명 합니다.
Introduction
프로 테아 제 펩 티 드 결합의 가수분해를 전문화 하 고 항상성, 질병1, allostasis, 등 많은 생물 학적 과정을 중요 한 통제가 다기능 효소는. 프로 테아 제 활동의 변경된 상태 질병, 암 및 심장 혈관 질병, 프로 테아 제 임상 생체2,3으로 개발을 위한 매력적인 후보자를 만드는 등의 다양 한 상관 되었다. 또한, 프로 테아 제 활동은 별개에 기능적으로 연결 된 pathogeneses, 환자 결과 및4질병 예 후. 넓게, 바이오 센서 개발 되었습니다 다양 한 생물 학적 현상을 감지 하 고 질병, 암, 신경 질환, 전자 등 처리5,6,,78 , 9. 좀 더 구체적으로, 기판 기반 효소 센서 프로 테아 제 활동을 감지 하 여 진단 이미징10 fluorogenic 프로브 포함 개발 되었고 isotopically 펩 티 드 기질에 시험관 에 대 한 표시 질량 분석11탐지입니다. 또한, 활동 기반 프로브 개발 되었습니다, 바인딩하거나 대상 프로 테아 제12수정 기판 같은 영역을 포함 하는. 이 방법으로 활성 사이트 수정 하며 분석 조직, vivo에서 응용 프로그램을 제한의 수확 때 대상 효소 저해 irreversibly는. 그러나, 효소 활동의 규칙은 내 생 억제제의 존재와 같은 다른 생물 학적 활동의 문맥에 크게 의존 하기 때문에 효소 활동을 vivo에서, 감각을 중요 하다.
이 작품의 목표는 소변에서 측정 신호를 생산 하 여 효소 활동에서 vivo에서 검색 활동 기반 nanosensors의 공식 설명. 이 플랫폼 기능 biomarker로 dysregulated 프로 테아 제 활동을 사용 하 여 암과 같은 복잡 한 질병을 판별 하는 비 침범 성 진단으로 사용 됩니다. 산화 철 나노 입자 (IONP) 효소 기질에 활용 된 nanosensor 플랫폼에 의하여 이루어져 있다. 이러한 기판 프로 테아 제 쪼개 기판 때 출시 되는 형광 기자에 의해 종료 됩니다. 이러한 IONPs vivo에서순환, 질병 사이트, 지역화 및 기판 활성 질병 관련 된 프로 테아 제에 노출. 분열, 후 형광 기자 출시 되 고, 그들의 작은 크기로 인해 필터링 됩니다 소변에는 IONP에 uncleaved 기판 시체에 남아 있는 동안. 따라서, 효소 활동에서 vivo에서 증가 소변 (그림 1)에서 리포터의 높은 농도 발생 합니다. 우리의 플랫폼 소변 검사 이기 때문에, 아무 이미징 플랫폼 필수 이며 진단 신호는 소변에서 풍성 하 게.
이 플랫폼은 다양 한 질병 암, 섬유 증, 혈전 증13,14등을 감지 하 설계 될 수 있다. 여기 우리가 설명 하는 매트릭스 metallopeptidase 9 (MMP9)에서 고도 검색 하기 위해 nanosensors의 디자인 활동으로 대 장 암의 바이오 마커. 대 장 암은 약된 136,800 새로운 사례와 2014 혼자1550,300 죽음, 미국에서 암 사망의 두 번째 주요 원인이. 대 장 종양 세포 생성 MMP9 전이16뿐만 아니라 악성 진행, 매트릭스 저하, 운전 표시 되었습니다. 또한, 우리 문학17에서 MMP9에 대 한 적합 한 펩 티 드 기질 (PLGVRGK) 확인. 조기 암 발견 및 저가 포인트의 케어 진단13,,1418,19,20,21이 플랫폼을 사용할 수 있습니다.
그림 1: Nanosensor 활동 비보의 도식. Nanosensors는 본문을 통해 순환 하 고 질병의 사이트 지역화. 다음, 질병 관련 된 프로 테아 제 펩 티 드 기질 IONPs를 제시한 다니엘. 쪼개진된 파편의 크기 신장 클리어런스, 그들이 소변에서 지역화 하는 원인에 대 한 수 있습니다. 동물 소변 후 그들의 기자 분자에 의해이 펩 티 드 파편을 분석할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Protocol
연구원의 교육 기관에서 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에서 기관 승인 다음 동물 실험을 수행 하는 데 필요한입니다. 또한, 표준 동물 보호 시설 (예를 들어, 챔버, 무 균 동물 후드, anesthetization, isofluorane 챔버 및 윤리적인 끝점 euthanization에 대 한 공동2 챔버)는이 제대로 수행 하는 데 필요한 실험입니다. 특별 한 교육 및 이러한 시설 지원 하나의 기관에 생리 연구 실험실 (PRL) 하 여 제공할 수 있습니다. 모든 동물 일 조지아 공대에 IACUC에 의해 승인 되었다 (프로토콜: A14100).
1. 산화 철 나노 입자 (IONP) 합성
참고: 안전: 전체 산화 철 나노 입자 합성 개인 보호 장비를 사용 하 여 수행 해야 합니다 및 아래 화학 증기 두건.
- 15 mL 원뿔 튜브에 1 mL의 30%는 30 분 동안 얼음 양동이에 수산화 암모늄을 진정.
- 250 mL 삼각 플라스 크 이온된 수로 세척 하 고 10 mL 두 배 증류수 (ddH2O) 추가. 볶음/열 접시에 얼음 목욕에서 플라스 크의 외부 잠수함 DdH2O는 플라스 크에 흐름 N2 가스에 플라스틱 피 펫을 사용 합니다. N2 deoxygenate 15 분간 거품이 있다.
- Dextran의 224 µmol (4.5 그램) 무게 (분자량 (MW) = 20 kDa) 50 mL 원뿔 튜브로. Dextran를 포함 하 여 혼합물의 최종 볼륨은 20 mL를 h 조2O를 추가 합니다. 소용돌이 dextran을 해산 하기 위해 적극적 으로입니다.
- Iron(III) 염화 물 hexahydrate의 290 µmol (78.5 그램) 무게를 다 십시오, dextran 솔루션 및 분해 하는 소용돌이를 추가 합니다.
- 0.2 µ m 필터를 통해 결과 솔루션을 필터링 합니다.
- Deoxygenated 물 9 mL에 1 mL 냉장 수산화 암모늄을 전송 합니다. 4 ° c.에 반환
- 산소 무료 ddH2O의 1 mL에 용 해 그리고 0.2 µ m 필터를 통해 필터링, iron(II) 염화 물 tetrahydrate의 367 µmol (73.0 그램) 무게.
- 250 mL 삼각 플라스 크에 dextran-iron(III) 솔루션을 전송 하 고 얼음에 15 분 동안 N2 와 deoxygenate. 1600 rpm 회전 막대 자석 저 어 혼합.
- 균질 성 질소 분위기를 만들려면 고무 격 막으로 플라스 크 모자. 펑크는 18와 심장 플라스 크에 흐름 N2 바늘 게이지. 흐름 콘센트로 별도 18 게이지 바늘을 삽입 합니다.
- 1 mL 주사기, 1600 rpm에서 자기 저 어 바 교 반 dextran-iron(III) 솔루션 iron(II) 솔루션의 467 µ L를 추가 합니다. Iron(III) iron(II)의이 비율 결과 균형된 반응 자 철 광, 또는 Fe3O4를 생산할 예정 이다.
- 냉장 희석 수산화 암모늄 dropwise nucleation 과정21시작 하 철 (II)-철 (III)-dextran 솔루션에 추가 합니다. 있는지 확인 하십시오 각 방울 다른 놓기 전에 잘 섞는다. 수산화 암모늄의 1-2 mL의 추가 후 반응 완료.
- N2 의 흐름을 중지 하 고 제거 고무 격 막. 얼음 목욕을 제거 하 고 솔루션을 저 어 하면서 따뜻한 물 목욕을 바꿉니다. 솔루션의 온도가 75 ° C에 도달 하면 확인 하 고 75 분 동안 품 어.
- 볶음/핫 플레이트에서 플라스 크를 제거 하 고 이중 거친 입자를 제거 하 0.2 µ m 다음 0.1 µ m 필터를 통해 솔루션을 필터링 합니다.
- 버퍼는 ddH2O, 초과 dextran 매우 점성 해야 솔루션에서 제거 하려면 100 kDa 분자량 차단 (m.w.c.o.) 집중 장치를 사용 하 여 입자를 교환 합니다. 통해 흐름 여전히 어두운 이후에 2-3 회전, 필터 수 있습니다 깨진 있다 나타내는 경우 필터를 교체 합니다.
- 에 스핀 필터와 exchange를 버퍼링 하 고, 4800 X g에서 4 ° C에서 15 분간 원심 하 고 흐름을 통해 삭제 한 IONP 솔루션에 새 버퍼를 추가할. 3-5 회 반복 합니다.
- 분 광 광도 계/플레이트 리더를 사용 하 여 나노 입자의 농도 결정 합니다. 받아 400 nm 및 사용이이 파장에 IONP의 어 금 니 absorptivity에서 흡 광도 측정 (ε = 2.07 × 106 c m-1 M-1) IO 입자의 농도 결정 하.
- DdH2O (일반적으로 전체 볼륨은 3 mL) 10 mg/ml IONPs resuspend 그리고 화학 호환성에 대 한이 단계에 대 한 폴 리 프로필 렌 튜브를 사용할 수 있는지 확인. 1.6 볼륨 5 M NaOH의 추가 다음 epichlorohydrin의 0.65 볼륨을 추가 합니다. 엄격 하 게 crosslink dextran 12 시간 동안 실내 온도에 판 통에 혼합.
- 18-게이지 바늘 20 mL 주사기를 사용 하 여 IONP 솔루션 50 kDa m.w.c.o. 투 석 막으로 전송. 4 L ddH2O로 투 석 막 놓고 H2O 몇 시간 (2-3 시간 마다)를 교체 합니다. 밤새 품 어.
- 측정 농도 IONPs 5 mg/mL (1.15 단계 참조). 20% (v/v)에 도달 하는 IONPs의 표면 aminate 하 > 12 시간 동안 실내 온도에 흔들어 수산화 암모늄을 추가 합니다. 버퍼 교환 30 kDa m.w.c.o. 필터 (1.14 참조)를 사용 하 여.
- 2.5-3.5 mL 고속 단백질 액체 착 색 인쇄기 (FPLC, 젤 여과 열에 대 한 재료의 표 참조)에 의해 최종 정화 하기 전에 아래로 볼륨을 조정 합니다.
- 동적 산란 (DL)을 사용 하 여 IONPs (예상된 범위 10-100 nm, 평균 크기 40-50 nm)의 유체역학 반지름을 결정. Aliquoting는 베트에 희석된 IONP 샘플 X 100의 1 mL에 의해 이렇게 기계에 놓고 제조업체의 소프트웨어를 사용 하 여 측정을 합니다.
참고: IONPs의 전체 인구는 DL 측정에 의해 10와 100 nm 사이 있을 것입니다 하지만 대부분의 인구는 평균 직경 40-50 nm에서 범위는 주위. 한 크기 범위를 제한 하 고 싶다면, 하나 더 다른 직경을 가진 분수를 분리 크기 배제 크로마토그래피를 사용할 수 있습니다. 4 ° c.에 IONPs는 저장 한다
2. 펩 티 드 디자인, IONP, 및 생체 외에서 유효성 검사를 활용
- Fluorescein isothiocyanate (FITC) 같은 터미널 N 형광 기자와 C 터미널 시스테인 잔류물 thiol 중재 커플링 허용 대상 protease에 대 한 (예를 들어, 핵심 시설 또는 상업적으로) 펩 티 드 기질을 음성 합성.
참고: 경우 MMP9에 대 한이 연구, 사용 펩 티 드는 FITC-PLGVRGK-C, k고양이/Km ~ 105 M-1의-1x 2.0. - 약 0.5 밀리 그램 (1 mg/mL)에서 IONP 및 버퍼를 커플링으로 버퍼 교환 수 (50mm 나트륨 붕 산 염 1 m EDTA, pH = 8.5) 10 kDa m.w.c.o. 스핀 필터링 (단계 1.14 참조)를 사용 하 여.
- Dimethylformamide ~ 30 mg/mL의 농도 도달 (DMF)에서 Succinimidyl iodoacetate (SIA)를 녹이 고 500 SIA:IONP의 몰 비율에 IONP을 SIA를 추가할.
참고: SIA는 한 heterobifunctional 교차 하는 링커 펩 티 드 기질에 sulfhydryl 그룹에 IONPs에 아민의 커플링을 중재 하. - 어둠 속에서 실 온에서 1 ~ 2 시간 품 어. 만약 하룻밤을 떠나, 4 ° c.에 품 어
- Exchange unreacted SIA를 제거 하려면 버퍼를 커플링으로 10 kDa m.w.c.o. 회전 필터를 사용 하 여 버퍼 (단계 1.14 참조).
- 1 mg/mL (0.5 mL 해결책)을 최종 제품 솔루션을가지고. 20 kDa thiol 종료 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) 어 금 니 비율 20:1 (말뚝: IONP)의 90:1 (펩 티 드: IONP)의 어 금 니 비율에 대 한 관심의 펩 티 드 믹스. 이 펩 티 드 못 솔루션 IONP 믹스.
- 최고 속도, 형광 분자의 photobleaching를 방지 하기 위해 호 일에 관을 덮고에 판 통에 실 온에서 하룻밤를 품 어.
- L-시스테인 500: 1 (C:IONP) 어떤 unreacted SIA 분자를 중화의 어 금 니 비율에 추가 합니다. 실 온에서 최고 속도로 통에 25 ° C에서 1 시간 동안 품 어.
- FPLC를 통해 정화 (1.1.19 참조). 분 광 광도 계를 사용 하 여 샘플 솔루션의 흡 광도 측정 하 고 다음에 따라 비율을 펩 티 드: IONP. 정화, 후 PBS에 4 ° C에서 1 mg/mL에서 제품을 저장 합니다.
- 400에서 샘플 용액의 흡 광도 측정 하는 분 광 광도 계를 사용 하 여 (샘플, 400) 및 인 488 fluorophore 사용에 대 한 최대 흡 광도 파장 nm FITC (샘플, 488)에 대 한. 재고 아민 IONP 솔루션 같은 두 파장에서의 흡 광도 측정 (400 nm, 488 nm)는 각각NP, 400와 NP, 488로표시 됩니다.
- 방정식 1과 2는 정규화 된 계산에 A400 488 값을 사용 합니다.
공식 1
공식 2 - 400 와488 샘플의 정규화 된 값을 나타냅니다. 펩 티 드: IONP 방정식 3의 비율을 계산 하기 위해이 값을 사용 합니다.
식 3 - 어디
와 
는 IONP와, fluorophore의 어 금 니 absorptivities는 각각. 이 입자에 대 한 x 106 M-1c m-1 와 FITC 2.06 = = 72000 M-1c m-1, 그래서의 값 
28.75 이어야 한다. 전형적인 펩 티 드: IONP 비율 50: 1 20: 1의 범위에 있어야 합니다.
- 생체 외에서 분열 분석 결과 수행 하 여 시험의 기능을 확인 합니다.
- PBS와 (1 %BSA), 펩 티 드의 200 nM 농도와 18 µ L 나노 솔루션. 관심의 효소의 2 µ L 믹스 (MMP9; 0.1-1 mg/mL).
- 형광 측정 1 시간 동안 37 ° C에서 플레이트 리더에서 품 어 (적절 한 여기 및 방출 파장을 사용 하는 485 nm와 528 nm FITC에 대 한 각각) 분열을 모니터링 하는 데 1-2 분 마다.
공식 1
공식 2
식 3
와 
는 IONP와, fluorophore의 어 금 니 absorptivities는 각각. 이 입자에 대 한 
28.75 이어야 한다. 전형적인 펩 티 드: IONP 비율 50: 1 20: 1의 범위에 있어야 합니다.3. Nanosensors 및 소변 감지 암 관리
참고:에 대 한 자세한 내용은 예제 모델, 우리의 이전 보고서13참조.
- 96 잘 접시의 상단에 원통형 슬리브를 확보 하 여 소변 컬렉션에 대 한 대사 케이지를 만듭니다. 소변 수집 하는 동안 소매와 동물의 탈출을 방지 하기 위해 페 트리 접시 커버 커버 안에 마우스를 놓습니다.
- 멸 균 식 염 수에 펩 티 드에 의해 3000 mg/kg (50 ~ µmol)의 농도에 nanosensors를 포함 하는 주입 솔루션 (200 µ L 최대 볼륨)를 준비 합니다.
- 여성, 8 주 오래 된, 누드 마우스 ~ 100-300의 부담에이 종이 식 LS174T colorectal 종양을 베어링에 m m3, 약 발생 해야 하는 하루 10, 꼬리 정 맥 주입을 통해 nanosensor 솔루션 관리. 주입 직후 대사 케이지로 마우스를 배치 하 고 각 마우스에 대 한 주입의 시간 합니다.
- 주사 후 60-90 분, 96 잘 접시에서 원통형 슬리브를 제거 합니다. 마우스를 억제 하 고 접시에 남아 있는 소변을 무효화 하는 쥐를 유도 하기 위해 방광에 약간의 압력을 적용. 모든 소변 (200-500 µ L)를 수집 합니다.
- Immunoprecipitation 소변에서 FITC를 정화 하 고 감도 증가 하 여 소변 샘플을 분석 합니다. 마그네틱 구슬 안티 FITC 항 체와 결합 하 여 사용 합니다.
- 먼저, 3 회 코팅 버퍼와 자석 구슬의 25 mg을 세척 하 고 225 µ L를 최종 볼륨을가지고.
참고: 각 시간과 각 약 20 mL는 필요한 신선한 코팅 버퍼 (0.1 M 나트륨 붕 산 염, pH 9.5), 블로킹 버퍼 (PBS, BSA는 0.5%, 0.05% 트윈 20, pH 7.4), 그리고 세척 버퍼 (PBS, 0.1 %BSA, 0.05% 트윈 20, pH 7.4)을 만들기 위해 중요 하다. - 안티-FITC (5 mg/mL)의 200 µ L과 황산 암모늄 (3 M)의 200 µ L를 추가 합니다. 회전자에 37 C에서 16-24 시간 동안 품 어.
- 자석 분리기에 솔루션을 추가, 제거는 상쾌한, 625 대체
Λ, 버퍼 및 37 C에서 밤새 품 어. 다음 워시 버퍼와 3 번 세척 하 고 1.25 mL 워시 버퍼에 저장. - 마그네틱 구슬 (20 mg/mL)의 5 µ L와 소변의 2 µ L를 품 어와 총 볼륨 PBS 가진 50 µ L가지고 (0.01% 트윈 20). 60 분 동안 품 어.
- 50 µ L PBS로 두번 세척 (0.01% 트윈 20) 각 세척 후 자기 비즈를 수집 하는 자석 분리기를 사용 하 여.
- 5% 빙 초 산의 32.5 µ L로 두 번 elute. 35 µ L 2 M 트라이앵글 ~ 7의 최종 pH를 달성 하기 위해 함께 풀링된 차입 (70 µ L)를 중화.
- 플레이트 리더에서 읽기 ( 재료의 표참조) 소변 형광 계량에 적합 한 여기 및 방출 파장에. 무료 fluorophore의 알려진된 농도의 사다리에 대 한 형광 기자의 농도 계산 합니다.
- 먼저, 3 회 코팅 버퍼와 자석 구슬의 25 mg을 세척 하 고 225 µ L를 최종 볼륨을가지고.
Λ, 버퍼 및 37 C에서 밤새 품 어. 다음 워시 버퍼와 3 번 세척 하 고 1.25 mL 워시 버퍼에 저장.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
대부분의 인구는 IONPs의 평균 직경 40-50 nm에서 범위는 주위에 이다. Pegylation, 후이 크기 범위는 약 6 시간13 생체 내에서 의 순환 반감기 ( 그림 2a참조). 특정 크기 범위에 대 한 선택 하 고 싶다면 하나 하나 다른 직경을 가진 IONP 분수 분리 하 크기 배제 크로마토그래피를 사용할 수 있습니다. 가장 하 여 나노 입자 dextran의 외부 층에 의해 함께 개별 구형 철 산화물 나노 입자 가교 된으로 표시 됩니다. 13 IONPs의 솔루션 없이 촉진 하 고 가벼운 브라운 컬러로 반투명 표시 됩니다. 성공적인 펩 티 드 활용 후 흡 광도 스펙트럼 분석 형광 기자의 최대 여기 파장에서 독특한 흡 광도 피크를 발표할 예정 이다. FITC, 경우이 것 가운데 약 488 nm ( 그림 2b참조). 전형적인 펩 티 드 활용 반응 펩 티 드 IONP 20-50의 어 금 니 비율 FPLC 정화 후 발생 합니다. 감각 효소 활동에 조사의 기능을 테스트 하려면 nanosensors의 약 수는 재조합 프로 테아 제와 알을 품 고 fluorimetry에 의해 모니터링 될 수 있습니다. 분열 활동 형광 기자-솔루션-나노 입자의 표면에 그렇지 않으면 homoquenched 및 샘플 형광 증가의 석방을 발생 합니다. 일반적으로 관찰 기판 Michaelis Menten 속도 따라 분열 속도 ( 그림 2 c참조).
그림 2: 구조와 기능의 Nanosensors 체 외의 유효성을 검사. (a) A DL IONP 인구 후 합성의 크기 분포를 나타내는 그래프. (b) IONPs 후 활용 FITC 표시 된 MMP 9 기판으로의 흡수도 스펙트럼. (c) 체 외에서 분열 분석 결과 보여주는 MMP9 꾸준히 한 시간에 걸쳐 있는 nanosensor 제시한 펩 티 드를 앞. 효소 농도 0.5 mg/mL의 PBS에서 사용 되었다 (1 %BSA) 버퍼. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
암 마우스 모델에서이 플랫폼을 적용 하려면 전체 동물 형광 이미징 (그림 3a)에 의해 약 동학의 시각화 수 있도록 nanosensors 근 적외선 형광 기자와 코팅을 사용 하 여 일반적입니다. LS174T colorectal 종양 방위 쥐, 형광 신호 펩 티 드 기질에는 nanosensors의 MMP9 분열으로 인해 nanosensors의 정 맥 관리 후 60-90 분 이내 소변으로 지역화 됩니다. 대조적으로, ( 그림 3a참조) 컨트롤 그룹 쥐의 방광에 낮은 형광 신호 됩니다. 입자는 결국 청소 monocytes 그리고 대 식 세포에 의해 reticuloendothelial 시스템에 일반적으로 간, 비장, 림프절에서 발견 되는 때문에 발생 하는 신호 간에 주목 한다. 따라서, 그림 3a 에서 간에서 나오는 신호는 나노 입자의 예정 이다. 13 immunoprecipitation에 의해 소변 형광을 측정 하는 때 훨씬 높은 신호 건강 한 컨트롤 ( 그림 3b참조)에 비해 LS174T 종양 방위 쥐에서 관찰 됩니다.
그림 3: 대 장 암 마우스 모델에서 감지. (a) 생체 내에서 의 이미지 종양 및 제어 그룹 쥐, 질병의 사이트 IONP 지역화 종양 진행으로 인해 소변 지역화 관찰. (b) 소변 형광 LS174T 종양 모델에서 통제 쥐에 있는 종양의 부 량. 오차 막대는 표준 편차로 표시 (* 2로p < 0.05-꼬리 쌍체 t 검정). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 방법은 나노 코어를 활용 하는 프로 테아 제 기판으로 구성 된 활동 기반 nanosensors의 개발을 설명 합니다. 쪼개진된 펩 티 드 제품은 5 nm23 및 비 침 투 적인 신호를 생성 하는 소변으로 필터의 신장 크기 여과 한계 보다 작은 때문에 분해 분열의 이벤트 "pharmacokinetic 스위치", 불리는. 따라서, 그것은 유체역학 반경 5 보다 큰 나노 입자 또는 운반대를 사용 하는 것이 중요, 아무것도 작은 신장으로 빠르게 삭제 됩니다 및 소변 신호를 혼동. 때문에 그들은 FDA 승인, 잘 용납 하 고 3-5 시간 순환 반감기 pegylated IONPs 사용 합니다. 13 nanosensors 공식화에서 또 다른 중요 한 고려 사항은 펩 티 드 기질 어 금 니 비율을 못. 24 , 25 오프 대상 프로 테아 제 펩 티 드26, 입체 차폐를 통해 일반적인 분열 줄일 비율 증가 하지만 잠재적으로 뿐만 아니라 대상에 활동을 감소. 반대로, 펩 티 드 비율 낮은 말뚝 protease 접근성 및 탐지 신호를 증폭 한다 그러나 또한 배경 잡음을 증가 시킬 수 있습니다 펩 티 드의 분열을 증가할 것 이다. Vivo에서 말뚝의 낮은 표면 농도 수 있습니다 또한 reticuloendothelial 시스템 (RES)에 의해 nanosensor 통풍 관을 증가 하 고 순환 시간을 감소.
다른 질병을 진단 하는이 기술을 적용, 프로 테아 제 upregulated 질병 상태에 있는 문학17에서 식별 되어야 합니다. 이 nanosensors는 감각 세포내 활동 세포에 침투 하도록 설계 되지 않았습니다 때문에 발견 노력 extracellular 프로 테아 제에 집중 해야 한다. 이 nanosensors는 또한 많은 후보 질병을 대상으로 제공 하는 펩타이드, 중간 쪼개 감각 endoproteases 하도록 설계 됩니다. 세포 외 endoproteases 혼자를 대상으로 진단 간 섬유 증, 암, 그리고 혈전 증13,19,,2021의 여러 종류에 대 한 개발 했습니다. 이 플랫폼 추가 질병26,27의 맥락에서 endoprotease 분열 후 exoprotease 활동을 설계할 수 있습니다. 그것은 또한 관심의 효소에 대 한 관련 된 펩 티 드 기질을 디자인 하는 것이 중요입니다. 이 후보 펩 티 드 시퀀스를 생체 외에서 분열 분석 결과 (2.10 2.11 단계) 심사 하 여 수행할 수 있습니다. 잠재적인 일반적인 효소 분열 펩 티 드 디자인도 테스트 해야 합니다. 예를 들어 MMP9, 경우 우리는 트 롬 빈, 혈액에 있는 높은 농도에서 발견 응고 효소와 기질 특이성을 테스트 했습니다. 활동 nanosensors에서 vivo에서를 사용 하 여 사용 하려면 이미징 또는 nanosensors의 관리 후 소변의 개별 샘플링 신호 생산의 활동을 모니터링 하 여 최적의 소변 수집 시간을 결정 합니다. 마우스 또한 동물 overhydrate 증가 소변 생산을 메 마른 염 분 함께 들어갈 수 있습니다. 실질적으로,이 기술은 upregulated 또는 downregulated 세포 외 효소 활동으로 어떤 질병에 확장할 수 있습니다. 이 플랫폼의 힘은 대상 효소 신호 증폭에 대 한 수 있습니다 그래서 질병 사이트 protease 모집단의 일부만 조사 하는 경우에 상당한 읽어 측정 될 수 있다. 현재 플랫폼은 감각 세포 외 endoproteases 하도록 설계 됩니다. 다른 질병이 플랫폼을 적용 하는 경우 하나는이 플랫폼의 감각 프로 테아 제에 조정 될 수 있다 질병의 효소 생물학 식별 하 필요 합니다.
이 핵심 기술 응용 프로그램의 수를 늘리기 위해 다른 분석 플랫폼으로 검출 될 수 있는 분열 기자 추가 설계 될 수 있다. 예를 들어 항 체 바인딩 위한 ligands를 포함 하는 분열 기자 저가 포인트의 케어 진단19종이 테스트로 검색할 수 있습니다. 또한, 대량 기자와 기판 라벨 여러 프로 테아를 질량 분석13소변에서 동시에 검색 될 수 있습니다. 결론적으로,이 방법은 질병의 비 침범 성 요도 biomarker로 효소 활동에서 vivo에서 을 공식화 활동 기반 nanosensors 설명 합니다.
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Disclosures
박사 Kwong 공동 설립자 이며 Glympse 바이오, 제품 개발은 컨설턴트가이 문서에서 설명 하는 연구와 관련 된 역할을 한다. 이 연구는 그의 개인 재정 상태에 영향을 수 있습니다. 이 계약 조건 검토 되었고 조지아 공대의 상충 정책에 따라 승인
Acknowledgments
이 작품은 NIH 감독의 새로운 혁신 상 수상 (제에 의해 투자 되었다 DP2HD091793)입니다. NSF 대학원 연구 장학 프로그램 (보조금 번호 Q.D.M.는 지원 DGE-1650044). B.A.H는 국립 연구소의 건강 GT BioMAT 훈련 그랜트 보너스 번호 5T32EB006343에서 조오지 아 기술 대통령의 친교에 의해 지원 됩니다. G.A.K.는 버로우즈 환영 기금에서 과학적인 인터페이스에서 경력 수상을 보유 하고있다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm syringe filters | VWR | 4652 | |
| 18G needle | VWR | 89134-024 | |
| 15 mL conicals | VWR | 89039-670 | |
| 250 mL Erlenmeyer flask | VWR | 89000-362 | |
| Stir bar | VWR | 58949-006 | |
| Hot Plate/Magnetic Stirrer | VWR | 97042-634 | |
| Glacial acetic acid | VWR | 97064-482 | |
| Albumin from Bovine Serum (BSA) | Thermo Fisher | A13100 | |
| Iron (III) chloride hexahydrate | Sigma | 236489 | |
| Iron (II) chloride tetrahydrate | Sigma | 44939 | |
| Epichlorohydrin | Sigma | 45340-500ML-F | |
| DMF | Sigma | D4551 | |
| Ammonium Hydroxide | Sigma | 320145-500ML | |
| Sodium Hydroxide pellets | Sigma | 221465-500G | |
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| Sodium Borate | Sigma | B9876 | |
| L-Cysteine | Sigma | 168149-100G | |
| Tris-HCl | Sigma | T5941 | |
| Tris base | Sigma | T6066 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417 | |
| Dextran | Pharmacosmos | 5510 0020 9006 | |
| Amicon 15 mL 10k filters, 24 pk | Millipore | UFC901024 | |
| Amicon 15 mL 30k filters, 24 pk | Millipore | UFC903024 | |
| Amicon 15 mL 100k filters, 24 pk | Millipore | UFC910024 | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical | NanoZS | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette | LifeTech | 66130 | |
| Dynabeads MyOne Tosylactivated | LifeTech | 65501 | |
| SIA | Life Tech | 22349 | |
| PEG 20k | Laysan Bio | MPEG-SH-20K-1g | |
| Fluorescein Antibody [2A3] | GeneTex | GTX10257 | |
| Hiload 16/600 superdex 200 | GE Healthcare | 45-002-490 | |
| Plate Reader | Fisher | BTCYT5M | |
| BD Insulin Syringes | Fisher | NC0872854 |
References
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