Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Sensorer til at registrere Protease aktivitet In Vivo for invasiv diagnostik

Published: July 16, 2018 doi: 10.3791/57937
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3,4,5
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Tech College of Engineering and Emory School of Medicine, 2Parker H. Petit Institute of Bioengineering and Bioscience, 3Institute for Electronics and Nanotechnology, Georgia Tech, 4Integrated Cancer Research Center, Georgia Tech, 5The Georgia Immunoengineering Consortium, Emory University and Georgia Tech

Summary

Proteaser er stramt regulerede enzymer involveret i grundlæggende biologiske processer og dysregulated protease aktivitet drev progression af komplekse sygdomme som kræft. Denne metode mål er at skabe sensorer, der måler protease aktivitet i vivo ved at producere en spaltning signal, der kan spores fra værten urin og diskriminerer sygdom.

Abstract

Proteaser er multi-funktionelle enzymer, der specialiserer sig i hydrolyse af peptidbindinger og styre bred biologiske processer herunder homøostase og allostasis. Desuden dysregulated protease aktivitet drev patogenese og er en funktionel biomarkør af sygdomme såsom kræft; Derfor kan evnen til at opdage protease aktivitet i vivo give klinisk relevante oplysninger for biomedicinsk diagnostik. Målet med denne protokol er at skabe sensorer, der sonden for protease aktivitet i vivo ved at producere en kvantificerbar signal i urinen. Disse protease sensorer består af to komponenter: en nanopartikel og substrat. Nanopartikel funktioner til at øge omsætning half-life og substrat levering til målwebsteder sygdom. Underlaget er en kort peptid sekvens (6-8 AA), som er designet til at være specifikke for et mål protease eller en gruppe af proteaser. Underlaget er konjugeret til overfladen af nanopartikler og afsluttes af en reporter, såsom fluorescerende markør, for afsløring. Som dysregulated proteaser kløver peptid substrat, filtreret reporter i urin for kvantificering som en biomarkør af protease aktivitet. Heri beskriver vi opførelse af en nanosensor for matrix metalloproteinase 9 (MMP9), som er forbundet med tumor progression og metastase, til påvisning af kolorektal cancer i en musemodel.

Introduction

Proteaser er multi-funktionelle enzymer, der specialiserer sig i hydrolyse af peptidbindinger og har betydelig kontrol over mange biologiske processer, herunder homøostase, allostasis og sygdom1. En meditativ tilstand protease aktivitet er blevet korreleret til en lang række sygdomme, herunder kræft og hjerte-kar-sygdom, hvilket gør proteaser attraktive kandidater til udvikling i kliniske biomarkører2,3. Derudover er protease aktivitet funktionelt forbundet med særskilte pathogeneses, patientens resultater og prognosen for sygdommen4. Bredt, biosensorer er udviklet til at registrere forskellige biologiske fænomener og sygdomme som kræft, neurodegenerativ sygdom og elektron overførsel behandler5,6,7,8 , 9. mere specifikt substrat-baserede protease sensorer er blevet udviklet til at opdage protease aktivitet, og omfatter fluorogenic sonder til diagnostic imaging10 og brændselsfremstilling mærket peptid substrater for in vitro påvisning af massespektrometri11. Derudover er blevet udviklet aktivitetsbaseret sonder, der indeholder substrat-lignende regioner, der binder eller ændre target protease12. Med denne metode, er målet protease uigenkaldeligt hæmmet når det aktive site er ændret, og analyse kræver høst af væv, som begrænser i vivo applikationer. Det er dog vigtigt at fornemme protease aktivitet i vivo, fordi regulering af protease aktivitet er stærkt afhængige af konteksten af andre biologiske aktiviteter såsom tilstedeværelsen af endogene hæmmere.

Målet med dette arbejde er at beskrive formuleringen af aktivitetsbaseret sensorer, der registrerer protease aktivitet i vivo ved at producere en målbar signal i urinen. Denne platform er brugt som en noninvasiv diagnostiske for at diskriminere komplekse sygdomme såsom kræft ved hjælp af dysregulated protease aktivitet som en funktionel biomarkør. Vores nanosensor platform består af jernoxid nanopartikler (IONP)-konjugeret med protease substrater. Disse substrater er afbrudt af en fluorescerende reporter, der frigives når proteaser kløver substratet. Disse IONPs cirkulerer i vivo, lokalisere til sygdom websteder og udsætte substrater til aktiv sygdom-associerede proteaser. Efter kløvningen, fluorescerende journalister er frigivet, og på grund af deres lille størrelse, er filtreret i urin, mens uncleaved substrater på IONP forblive i kroppen. Derfor, en stigning i protease aktiviteter i vivo vil resultere i højere koncentrationer af reporter i urinen (figur 1). Da vores platform er en urintest, ingen billedbehandling platform er påkrævet og diagnosesignaler er beriget med urin.

Denne platform kan være manipuleret til at detektere en række sygdomme, herunder kræft, fibrose og trombose13,14. Her beskriver vi design af sensorer til at registrere stigninger i Matrix metallopeptidase 9 (MMP9) aktivitet som en biomarkør for kolorektal cancer. Kolorektal cancer er den næststørste årsag til kræft død i USA, med en anslået 136,800 nye tilfælde og 50,300 dødsfald i 2014 alene15. Kolorektal tumorceller producerer MMP9, som har vist sig at drive maligne progression samt matrix nedbrydning og metastase16. Desuden, identificeret vi en egnet peptid substrat (PLGVRGK) for MMP9 fra litteratur17. Denne platform kan anvendes til tidlig kræft opdagelse og lavpris-punkt af care diagnostics13,14,18,19,20,21.

Figure 1
Figur 1: skematisk af Nanosensor aktivitet In vivo. Sensorer cirkulerer gennem kroppen og lokalisere til steder af sygdommen. Derefter, sygdomsrelaterede proteaser kløver peptid substrater IONPs har fremlagt. Størrelsen af kløvet fragmenter tillader renal clearance, forårsager dem til at lokalisere i urinen. Når dyret tisser, kan disse peptid fragmenter analyseres af deres reporter molekyle. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Institutionelle godkendelse fra institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på forskerens institution er nødvendige for at udføre de følgende dyreforsøg. Derudover, er standard dyrs plejefaciliteter (f.eks. boligbyggeri kamre, sterile animalske emhætter, isofluorane kamre for anesthetization og CO2 kamre for etiske slutpunkt euthanization) nødvendige til korrekt udføre disse eksperimenter. Særlig uddannelse og bistand med anlæggene kan leveres af fysiologiske forskning laboratorium (PRL) på en institution. Alle dyr arbejde blev godkendt af IACUC på Georgia Tech (protokol: A14100).

1. jernoxid nanopartikel (IONP) syntese

Bemærk: Sikkerhed: hele jernoxid nanopartikel syntese bør udføres ved hjælp af personlige værnemidler og nedenunder en kemisk fume hætte.

  1. I en 15 mL konisk slange, chill 1 mL 30% ammoniumhydroxid i en isspand i 30 min.
  2. Vask en 250 mL Erlenmeyerkolbe med deioniseret vand og tilsæt 10 mL dobbeltdestilleret vand (ddH2O). Dykke ydersiden af kolben i isbad hvilende på et rør/varme plade. Brug en plastik pipette til flow N2 gas ind i ddH2O i kolben. Boble i 15 minutter med N2 til deoxygenate.
  3. Vejer 224 µmol (4.5 gram) af dextran (molekylevægt (MW) = 20 kDa) i en 50 mL konisk slange. Tilføj H2O, således at det endelige rumfang af blandingen, herunder dextran, er 20 mL. Vortex kraftigt til at opløse dextran.
  4. Vejer 290 µmol (78,5 gram) af iron(III) chlorid hexahydrat, tilføje til dextran løsning og vortex at opløse.
  5. Resulterende Opløsningen filtreres gennem et filter, 0,2 µm.
  6. Overføres 1 mL kølet ammoniumhydroxid til 9 mL af deoxygenated vandet. Vende tilbage til 4 ° C.
  7. Vejer 367 µmol (73,0 gram) af Aluminiumacetat chlorid tetrahydrat, opløses i 1 mL ilt-fri ddH2O og filtreres gennem et 0,2 µm filter.
  8. Dextran-iron(III) opløsningen overføres til en 250 mL Erlenmeyerkolbe og deoxygenate med N2 for 15 minutter på is. Bland med en magnetisk røre bar spinning på 1600 rpm.
  9. For at skabe en atmosfære af homogen nitrogen, cap kolben med en gummi septum. Punktering septum med en 18 gauge kanyle til flow N2 i kolben. Indsæt en separat 18 gauge kanyle som en flow outlet.
  10. Tilføje 467 µL af opløsningen Aluminiumacetat til dextran-iron(III) løsning med en 1 mL sprøjte, omrøring med en magnetisk røre bar på 1600 rpm. Dette forhold af Aluminiumacetat til iron(III) resulterer i en afbalanceret reaktion, der vil producere magnetit eller Fe3O4.
  11. Tilføj den kølede fortyndes ammoniumhydroxid dråbevis i jern (II) - jern (III) - dextran løsning at indlede Nukleering proces21. Sørg for hver dråbe blander godt før du smutter i en anden. Afslutte reaktion efter tilsætning af 1-2 mL af ammoniumhydroxid.
  12. Stop strømmen af N2 og fjerne gummi septum. Fjerne iskarret og erstatte med et bad i varmt vand, samtidig med at opløsningen omrøres. Sikre, at temperaturen af løsningen når 75 ° C, og der inkuberes i 75 minutter.
  13. Fjern kolben fra rør/hot pladen og dobbelt Opløsningen filtreres gennem 0,2 µm derefter 0,1 µm filtre til at fjerne grove partikler.
  14. Buffer udveksle partiklerne ind i ddH2O, ved hjælp af 100 kDa molekylvægt afskære koncentratorer (m.w.c.o.) for at fjerne overskydende dextran fra den løsning, som bør være meget tyktflydende. Erstatte filtre, hvis strømmen gennem forbliver mørk selv efter 2-3 spins, som angiver at filteret kan have brudt.
    1. Buffer udveksling med spin filtre, centrifugeres ved 4 ° C på 4800 X g i 15 minutter, kassere gennemstrømnings-og tilføje nye buffer til IONP løsning. Gentag 3 - 5 gange.
  15. Bestemme koncentrationen af nanopartikler bruger et spektrofotometer/pladelæseren. Tage absorbans målinger på 400 nm og brug den molære optagelighed af IONP ved denne bølgelængde (ε = 2.07 x 106 cm-1 M-1) til at bestemme koncentrationen af IO partikler.
  16. Resuspend IONPs til 10 mg/mL i ddH2O (normalt samlede volumen er ~ 3 mL) og sørg for at bruge polypropylen rør til dette skridt for kemiske forenelighed. Tilføje 1,6 bind 5 M NaOH, derefter tilføje 0,65 mængder af epichlorhydrin. Strengt blandes på en plade shaker ved stuetemperatur i 12 timer til bitmapgenkendelse dextran.
  17. Bruge en 20 mL sprøjte med en 18-gauge kanyle til at overføre IONP løsning til 50 kDa m.w.c.o. dialyse membran. Placer dialyse membran i 4 L ddH2O og erstatte H2O et par gange (hver 2-3 timer). Der inkuberes natten over.
  18. Måle koncentrationen og bringe IONPs til 5 mg/mL (Se trin 1,15). Tilføje ammoniumhydroxid for at nå op på 20% (v/v) og omrystes ved stuetemperatur i > 12 timer at aminate overfladen af IONPs. Buffer udveksling ved hjælp af 30 kDa m.w.c.o. filtre (Se 1.14).
  19. Justere lydstyrken ned til 2,5-3,5 mL før endelige rensning af hurtigt Protein væskekromatografi (FPLC, se Tabel af materialer for gel filtrering kolonne).
  20. Bruge dynamisk lysspredning (DLS) til at bestemme den hydrodynamiske radius af IONPs (forventede området 10-100 nm, gennemsnitlige størrelse 40-50 nm). Gøre dette ved at aliquoting 1 mL 100 X fortyndet IONP prøve i en kuvette, læg i maskinen og bruge producentens software til at tage måling.
    Bemærk: Den samlede population af IONPs vil være mellem 10 og 100 nm af DLS målinger, men størstedelen af befolkningen er omkring den gennemsnitlige diameter, som spænder fra 40-50 nm. Hvis man ønsker at begrænse størrelsesområde, kan man yderligere bruge størrelse udstødelse kromatografi for at isolere fraktioner med forskellige diametre. IONPs skal opbevares ved 4 ° C.

2. peptid Design, konjugation til IONP og In Vitro validering

  1. Syntetisere en peptid substrat (f.eks. af en core facilitet eller kommercielt) for en target protease med en N-terminale fluorescerende reporter såsom Fluorescein isothiocyanat (FITC) og C terminal cystein rester at tillade thiol-medieret kobling.
    Bemærk: I forbindelse med denne undersøgelse for MMP9 peptid anvendes var FITC-PLGVRGK-C, med kkatkm ~ 2.0 x 105 M-1s-1.
  2. Alikvot 0,5 mg IONP (på 1 mg/mL), og buffer exchange i kobling buffer (50 mM natriumborat med 1 mM EDTA, pH = 8,5) ved hjælp af en 10 kDa m.w.c.o. spin filtrere (Se trin 1.14).
  3. Opløs Succinimidyl iodoacetate (SIA) i dimethylformamid (DMF) at nå frem til en koncentration af ~ 30 mg/mL, og tilføje SIA til IONP på en muldvarp forholdet mellem 500 SIA:IONP.
    Bemærk: SIA er en heterobifunctional tværs linker, der medierer kobling af aminer på IONPs til sulfhydryl grupper på peptid substrat.
  4. Inkuber i 1-2 timer ved stuetemperatur i mørke. Hvis forlader natten, inkuberes ved 4 ° C.
  5. Buffer udveksling ved hjælp af en 10 kDa m.w.c.o. spin filteret i kobling buffer til at fjerne ureageret SIA (Se trin 1.14).
  6. Bringe den endelige produkt løsning til 1 mg/mL (0,5 mL opløsning). Bland peptid af interesse på en kindtand forholdet mellem 90:1 (peptid: IONP) med 20 kDa thiol-afsluttet polyethylenglycol (PEG) på en kindtand forholdet mellem 20:1 (PEG: IONP). Bland dette peptid-PIND løsning med IONP.
  7. Der inkuberes natten over ved stuetemperatur på en plade shaker på højeste hastighed, der dækker rør i folie for at forhindre photobleaching af fluorescerende molekyler.
  8. Tilføje L-Cystein på en kindtand ratio på 500: 1 (C:IONP) til at neutralisere enhver ureageret SIA molekyler. Inkuber i 1 time ved 25 ° C på en shaker på højeste hastighed ved stuetemperatur.
  9. Rense via FPLC (Se 1.1.19). Brug et spektrofotometer til måling af absorbans af proeveoploesningen og beregne peptid: IONP forholdet efter følgende. Efter rensning, skal du gemme produktet på 1 mg/mL ved 4 ° C i PBS.
    1. Bruger et spektrofotometer til måling af absorbans af proeveoploesningen på 400 nm (enprøve, 400) og bølgelængde af maksimale absorbans for den fluorophore brugt, som er 488 nm for FITC (enprøve, 488). Absorbansen måles af en bestand Amin IONP løsning på de samme to bølgelængder (400 nm og 488 nm), som er henholdsvis repræsenteret som enNP, 400 og enNP, 488.
    2. Brug ligninger 1 og 2 til at beregne den normaliserede A400 og en488 værdier.
      Equation 1Ligning 1
      Equation 2Ligning 2
    3. En400 og en488 repræsenterer de normaliserede værdier af prøven. Brug disse værdier til at beregne forholdet mellem peptid: IONP med ligningen 3.
      Equation 3Ligning 3
    4. Hvor Equation 4 og Equation 5 er de molære absorptivities af IONP og fluorophore, henholdsvis. For disse partikler Equation 4 = 2,06 x 106 M-1cm-1 og for FITC Equation 5 = 72.000 M-1cm-1, så værdien af Equation 6 skal være 28.75. Typiske peptid: IONP nøgletal skal være i intervallet 20:1 til 50: 1.
  10. Validere funktionalitet af sonderne ved at udføre en in vitro- kavalergang assay.
    1. Med PBS (1% BSA), gør en 18 µL nanopartikel løsning med en 200 nM koncentration af peptid. Bland med 2 µL af protease af interesse (MMP9; 0,1 - 1 mg/mL).
    2. Inkuber i et Pladelæser ved 37 ° C i 1 time, fluorescens måltagning (ved hjælp af passende excitation og emission bølgelængder, som er 485 nm og 528 nm for FITC, henholdsvis) hver 1-2 minutter til at overvåge kavalergang.

3. administration af sensorer og urin påvisning af kræft

Bemærk: Yderligere oplysninger om eksempel model, se vores forrige rapport13.

  1. Oprette en metabolisk bur for urinopsamling ved at sikre en cylindrisk ærme til toppen af en 96 godt plade. Under urinopsamling, placere en mus inde i ærmet og dække med en petriskål dækning til at forhindre udslip af dyret.
  2. Forberede en injektion løsning (200 µL maksimal volumen) indeholdende sensorer i en koncentration på 3000 mg/kg (~ 50 µmol) af peptid i sterilt saltvand.
  3. I kvindelige, 8 - uger gammel, nøgen mus bærer xenograft LS174T kolorektal tumorer på en byrde på ~ 100-300 mm3, som bør ske på ca dagen 10, administrere nanosensor løsning via hale vene injektion. Umiddelbart efter injektion, placere mus i metaboliske bure og Bemærk tidspunktet for indsprøjtning af hver mus.
  4. 60-90 minutter efter injektion, fjerne cylindriske ærmet fra 96-brønd plade. Dy mus og lægge mindre pres på blæren til at fremkalde mus til at annullere eventuelle resterende urin på pladen. Indsamle alle urin (200-500 µL).
  5. Analysere urinprøver ved immunoprecipitation at rense FITC fra urin og øge følsomheden. Brug magnetiske perler kombineret med anti-FITC antistoffer.
    1. Først vaske 25 mg af de magnetiske perler 3 gange med coatingbuffer, og bringe den endelige mængden til 225 µL.
      Bemærk: Det er vigtigt at gøre coatingbuffer (0,1 M natriumborat, pH 9.5), blokerende buffer (PBS, 0,5% BSA, 0,05% Tween-20, pH 7,4) og vask buffer (PBS, 0,1% BSA, 0,05% Tween-20, pH 7,4) frisk hver gang og ca 20 mL af hver er nødvendige.
    2. Tilføje 200 µL af anti-FITC (5 mg/mL) og 200 µL af ammonium sulfat (3 M). Ruger i 16-24 timer ved 37 C på en rotator.
    3. Føje løsningen til en magnetisk separator, Fjern supernatanten, erstatte med 625 Equation 7 Λ blokerende buffer, og der inkuberes ved 37 C natten over. Derefter vask 3 gange med wash buffer og gemme i 1,25 mL wash buffer.
    4. Der inkuberes 2 µL af urin med 5 µL af magnetiske perler (20 mg/mL) og bringe til en samlet diskenhed til 50 µL med PBS (0,01% Tween 20). Inkuber i 60 min.
    5. Vaskes to gange med 50 µL PBS (0,01% Tween 20) ved hjælp af en magnetisk separator for at indsamle magnetiske perler efter hver vask.
    6. Elueres to gange med 32,5 µL 5% iseddike. Neutralisere poolede eluering (70 µL) med 35 µL af 2 M Tris at opnå et slut-pH ~ 7.
    7. Læse på en Pladelæser (Se Tabel af materialer) ved passende excitations- og bølgelængder at kvantificere urin fluorescens. Beregne koncentrationen af fluorescerende reporter mod en stige af kendte koncentrationer af frie fluorophore.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fleste af IONPs befolkning er omkring den gennemsnitlige diameter, som spænder fra 40-50 nm. Efter pegylation, denne størrelsesområde har en omsætning halveringstid på ca 6 timer13 i vivo (Se figur 2a). Hvis man ønsker at vælge for en bestemt størrelsesområde, kan man bruge størrelse udstødelse kromatografi for at isolere IONP fraktioner med forskellige diametre. Nanopartikler af TEM vises som individuelle sfæriske jernoxid nanopartikler crosslinked sammen af et ydre lag af dextran. 13  En løsning af IONPs vises gennemsigtigt med ingen forhastede og lys brun farve. Efter vellykket peptid konjugering, vil spektrale absorbans analyse afsløre en særskilt absorbans peak på den maksimale excitation boelgelaengden den fluorescerende reporter. I forbindelse med FITC, dette vil være centreret omkring 488 nm (Se figur 2b). En typisk peptid konjugation reaktion vil resultere i en peptid IONP kindtand forholdet mellem 20-50 efter FPLC rensning. For at teste muligheden for sonden til forstand protease aktivitet, kan en alikvot af sensorer inkuberes med rekombinant proteaser og overvåges af fluorimetry. Kavalergang aktivitet resulterer i frigivelse af fluorescerende journalister - som ellers homoquenched på overfladen af nanopartikler - i løsning og øge prøve fluorescens. Det er typisk at observere substrat kavalergang hastigheder, der følger Michaelis-Menten-ligningen (Se figur 2 c).

Figure 2
Figur 2: Validering af struktur og funktion af sensorer i vitro. (a) A DLS graf der repræsenterer størrelse fordelingen af en IONP befolkning efter syntese. (b) absorbans spektrum af IONPs efter konjugering med FITC-mærket MMP-9 substrater. (c) i vitro kavalergang analysen viser, at MMP9 støt kløver peptid præsenteret af nanosensor i løbet af en time. Protease koncentration på 0,5 mg/mL blev brugt i PBS (1% BSA) buffer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Hvis du vil anvende denne platform i musemodeller af kræft, er det typisk at bruge sensorer belagt med en nær-infrarødt fluorescerende reporter for at tillade visualisering af farmakokinetik af hele dyret fluorescerende imaging (figur 3a). I mus forsynet med LS174T kolorektal tumorer, vil en fluorescerende signal lokalisere i urinen inden for 60-90 minutter efter intravenøs indgift af sensorer på grund af MMP9 spaltning af peptid substrater på sensorer. Der vil derimod være lavere fluorescerende signaler i blære kontrol gruppe mus (Se figur 3a). Det skal bemærkes, at signalet observeret i leveren opstår fordi partikler er i sidste ende scavenged af monocytter og makrofager i Retikuloendoteliale system, som er almindeligt forekommende i lever, milt og lymfeknuder. Det signal, der kommer fra leveren i figur 3a skyldes derfor clearance af nanopartikler. 13 når kvantificere urin fluorescens af immunoprecipitation, en markant forhøjet signal vil observeres i mus forsynet med LS174T tumorer i forhold til raske kontrolpersoner (Se figur 3b).

Figure 3
Figur 3: påvisning af kolorektal Cancer i en musemodel. (a) In vivo billeder af tumor og kontrol gruppe mus, observere IONP lokalisering til websteder af sygdom samt urin lokalisering på grund af tumor progression. (b) urin fluorescens kvantificering af tumor i kontrol mus i LS174T tumor model. Fejllinjer afbildet som standardafvigelse (*p < 0,05 af to-tailed parret t-test). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne metode beskrives udviklingen af aktivitetsbaseret sensorer bestående af protease substrater konjugeret med en nanopartikel kerne. Tilfælde af proteolytiske kavalergang er døbt "farmakokinetiske switch", fordi kløvet peptid produkter er mindre end renale filtration-størrelsesgrænsen 5 nm23 og filter ind i urinen til at producere en noninvasiv signal. Derfor er det vigtigt at bruge nanopartikler eller luftfartsselskaber med en hydrodynamiske radius, der er større end 5 nm, som noget mindre blive hurtigt fjernet af nyrerne og forvirre urin signaler. Vi bruger pegyleret IONPs, fordi de er FDA-godkendt, veltolereret og har en cirkulerende halveringstid på 3-5 timer. 13 en anden vigtig overvejelse i formuleringen sensorer er PIND peptid substrat molære forhold. 24 , 25 stigende forholdet vil reducere uspecifikke spaltning af off-mål proteaser gennem sterisk afskærmning af peptider26, men potentielt mindske på target aktivitet så godt. Omvendt, en lavere PIND til peptid forholdet vil øge protease tilgængelighed og spaltning af peptider, som vil forstærke påvisning signaler, men kan også øge baggrundsstøj. I vivo, kan en lavere overflade koncentration af PIND også øge nanosensor udbredelse af Retikuloendoteliale system (RES) og formindske omsætning tid.

Hvis du vil anvende denne teknologi til at diagnosticere andre sygdomme, bør proteaser, der upregulated i en sygdom-stat identificeres fra litteratur17. Discovery indsats bør fokusere på ekstracellulære proteaser, fordi disse sensorer ikke er designet til at trænge ind celler til forstand intracellulær aktivitet. Disse sensorer er også manipuleret til forstand endoproteases, der kløver i midten af peptid, som giver mange kandidat sygdomme til at målrette. Ved at målrette ekstracellulære endoproteases alene har vi udviklet diagnostik for leverfibrose, flere typer af kræft, og trombose13,19,20,21. Denne platform kan udformes yderligere at sonden for exoprotease aktivitet efter endoprotease spaltning i forbindelse med sygdom26,27. Det er også vigtigt at designe et peptid substrat, der er specifikke for protease af interesse. Dette kunne ske ved screening kandidat peptid sekvenser i vitro kavalergang assay (trin 2.10-2.11). Potentielle ikke-specifik protease kavalergang bør også testes under peptid design. For eksempel, i tilfælde af MMP9 testede vi substrat specificitet med thrombin, et koagulation protease fundet i høje koncentrationer i blodet. Hvis du vil bruge aktivitet sensorer i vivo, bør optimal urin samling tid bestemmes ved overvågning kinetik af signal produktion af imaging eller diskret udsnit af urinen efter indgift af sensorer. Mus kan også være infunderes med sterilt saltvand til overhydrate dyr og øge urinproduktionen. Praktisk, kan denne teknologi udvides til nogen sygdom med upregulated eller downregulated ekstracellulære protease aktivitet. En styrke på denne platform er at det giver mulighed for forstærkning af target protease signal, så selv om kun en brøkdel af sygdom-site protease befolkning er adspurgte, en betydelig udlæsning kan måles. Den aktuelle platform er udviklet til forstand ekstracellulære endoproteases. Når du anvender denne platform til andre sygdomme, skal man identificere protease biologi af denne sygdom, således at denne platform kan være indstillet til forstand proteaser af interesse.

Denne kerneteknologi kan yderligere manipuleret med kavalergang journalister, der kan detekteres med forskellige analytiske platforme til at øge antallet af ansøgninger. For eksempel, kan kavalergang journalister, der indeholder ligander til antistof bindende påvises ved paper test til lav pris punkt af care diagnostics19. Derudover tillader mærkning substrater med masse journalister flere proteaser skal påvises samtidigt fra urin ved massespektrometri13. Afslutningsvis beskrives i denne metode udformningen aktivitetsbaseret sensorer for at fornemme protease aktivitet i vivo som en noninvasiv urin biomarkør for sygdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr. Kwong er medstifter og fungerer som konsulent til Glympse Bio, som er ved at udvikle produkter relateret til den forskning, der er beskrevet i denne hvidbog. Denne undersøgelse kan påvirke sin personlige finansielle status. Vilkårene i denne aftale har gennemgået og godkendt af Georgia Tech i overensstemmelse med dens interessekonflikt politikker

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af en NIH Directors nye Innovator Award (pris nr. DP2HD091793). Q.D.M. understøttes af NSF Graduate Research stipendier Program (Grant nr. DGE-1650044). B.A.H er understøttet af nationale institutter for sundhed GT BioMAT uddannelse tildeling under Award antallet 5T32EB006343 samt Georgia Tech President's Fellowship. G.A.K. holder en karriere Award på den videnskabelige Interface fra fondens Burroughs velkommen. Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm syringe filters VWR 4652
18G needle VWR 89134-024
15 mL conicals VWR 89039-670
250 mL Erlenmeyer flask VWR 89000-362
Stir bar VWR 58949-006
Hot Plate/Magnetic Stirrer VWR 97042-634
Glacial acetic acid VWR 97064-482
Albumin from Bovine Serum (BSA) Thermo Fisher A13100
Iron (III) chloride hexahydrate Sigma 236489
Iron (II) chloride tetrahydrate Sigma 44939
Epichlorohydrin Sigma 45340-500ML-F
DMF Sigma D4551
Ammonium Hydroxide Sigma 320145-500ML
Sodium Hydroxide pellets Sigma 221465-500G
EDTA Sigma E9884
Sodium Borate Sigma B9876
L-Cysteine Sigma 168149-100G
Tris-HCl Sigma T5941
Tris base Sigma T6066
PBS tablets Sigma P4417
Dextran Pharmacosmos 5510 0020 9006
Amicon 15 mL 10k filters, 24 pk Millipore UFC901024
Amicon 15 mL 30k filters, 24 pk Millipore UFC903024
Amicon 15 mL 100k filters, 24 pk Millipore UFC910024
Zetasizer Nano ZS Malvern Panalytical NanoZS
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette LifeTech 66130
Dynabeads MyOne Tosylactivated LifeTech 65501
SIA Life Tech 22349
PEG 20k Laysan Bio MPEG-SH-20K-1g
Fluorescein Antibody [2A3] GeneTex GTX10257
Hiload 16/600 superdex 200 GE Healthcare 45-002-490
Plate Reader Fisher BTCYT5M
BD Insulin Syringes Fisher NC0872854

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lopez-Otin, C., Bond, J. S. Proteases: Multifunctional enzymes in life and disease. Journal of Biological Chemistry. 283 (45), 30433-30437 (2008).
  2. Hua, Y., Nair, S. Proteases in cardiometabolic diseases: Pathophysiology, molecular mechanisms and clinical applications. Biochimica et Biophysica Acta. 1852 (2), 195-208 (2015).
  3. Koblinski, J. E., Ahram, M., Sloane, B. F. Unraveling the role of proteases in cancer. Clinica Chimica Acta. 291 (2), 113-135 (2000).
  4. Lilja, H., Vickers, A., Scardino, P. Measurements of proteases or protease system components in blood to enhance prediction of disease risk or outcome in possible cancer. Journal of Clinical Oncology. 25 (4), 347-348 (2007).
  5. Jin, H., et al. Flexible surface acoustic wave resonators built on disposable plastic film for electronics and lab-on-a-chip applications. Scientific Reports. 3, 2140 (2013).
  6. Ma, W., Liu, H. -T., Long, Y. -T. Monitoring dopamine quinone-induced dopaminergic neurotoxicity using dopamine functionalized quantum dots. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (26), 14352-14358 (2015).
  7. Zhang, W. -H., Ma, W., Long, Y. -T. Redox-mediated indirect fluorescence immunoassay for the detection of disease biomarkers using dopamine-functionalized quantum dots. Analytical Chemistry. 88 (10), 5131-5136 (2016).
  8. Ma, W., et al. Investigating electron-transfer processes using a biomimetic hybrid bilayer membrane system. Nature Protocols. 8 (3), 439-450 (2013).
  9. Holt, B. A., et al. Fc microparticles can modulate the physical extent and magnitude of complement activity. Biomaterials science . 5, 463-474 (2017).
  10. Edgington, L. E., Verdoes, M., Bogyo, M. Functional imaging of proteases: Recent advances in the design and application of substrate-based and activity-based probes. Current Opinion in Chemical Biology. 15 (6), 798-805 (2011).
  11. Kleifeld, O., et al. Identifying and quantifying proteolytic events and the natural N terminome by terminal amine isotopic labeling of substrates. Nature Protocols. 6 (10), 1578-1611 (2011).
  12. Sanman, L. E., Bogyo, M. Activity-based profiling of proteases. Annual Review of Biochemistry. 83 (1), 249-273 (2014).
  13. Kwong, G. A., et al. Mass-encoded synthetic biomarkers for multiplexed urinary monitoring of disease. Nature Biotechnology. 31 (1), 63-70 (2013).
  14. Dudani, J. S., Buss, C. G., Akana, R. T. K., Kwong, G. A., Bhatia, S. N. Sustained-release synthetic biomarkers for monitoring thrombosis and inflammation using point-of-care compatible readouts. Advanced Functional Materials. 26 (17), 2919-2928 (2016).
  15. Meester, R. G. S., et al. Public health impact of achieving 80% colorectal cancer screening rates in the United States by 2018. Cancer. 121 (13), 2281-2285 (2015).
  16. Mehner, C., et al. Tumor cell-produced matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) drives malignant progression and metastasis of basal-like triple negative breast cancer. Oncotarget. 5 (9), 2736-2749 (2014).
  17. Bremer, C., Tung, C. H., Weissleder, R. In vivo molecular target assessment of matrix metalloproteinase inhibition. Nature Medicine. 7 (6), 743-748 (2001).
  18. Warren, A. D., et al. Disease detection by ultrasensitive quantification of microdosed synthetic urinary biomarkers. Journal of the American Chemical Society. 136 (39), 13709-13714 (2014).
  19. Warren, A. D., Kwong, G. A., Wood, D. K., Lin, K. Y., Bhatia, S. N. Point-of-care diagnostics for noncommunicable diseases using synthetic urinary biomarkers and paper microfluidics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), 3671-3676 (2014).
  20. Kwong, G. A., et al. Mathematical framework for activity-based cancer biomarkers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (41), 12627-12632 (2015).
  21. Dudani, J. S., Jain, P. K., Kwong, G. A., Stevens, K. R., Bhatia, S. N. Photoactivated spatiotemporally-responsive nanosensors of in vivo protease activity. ACS Nano. 9 (12), 11708-11717 (2015).
  22. Palmacci, S., Josephson, L. AMAG Pharmaceuticals Inc. Synthesis of polysaccharide covered superparamagnetic oxide colloids. US patent. , 5,262,176 (1991).
  23. Choi, H. S., et al. Renal clearance of nanoparticles. Nature Biotechnology. 25 (10), 1165-1170 (2007).
  24. Harris, T. J., von Maltzahn, G., Derfus, A. M., Ruoslahti, E., Bhatia, S. N. Proteolytic actuation of nanoparticle self-assembly. Angewandte Chemie (International edition in English). 45 (19), 3161-3165 (2006).
  25. Kwon, E. J., Dudani, J. S., Bhatia, S. N. Ultrasensitive tumour-penetrating nanosensors of protease activity. Nature Biomedical Engineering. 1, (2017).
  26. Villanueva, J., Nazarian, A., Lawlor, K., Tempst, P. Monitoring Peptidase activities in complex proteomes by MALDI-TOF mass spectrometry. Nature Protocols. 4 (8), 1167-1183 (2009).
  27. Villanueva, J., et al. Differential exoprotease activities confer tumor-specific serum peptidome patterns. The Journal of Clinical Investigation. 116 (1), 271-284 (2006).

Tags

Bioteknologi sag 137 syntetiske biomarkører aktivitetsbaseret sonder proteaser sensorer nanopartikler urin diagnostik
Sensorer til at registrere Protease aktivitet <em>In Vivo</em> for invasiv diagnostik
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Holt, B. A., Mac, Q. D., Kwong, G.… More

Holt, B. A., Mac, Q. D., Kwong, G. A. Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics. J. Vis. Exp. (137), e57937, doi:10.3791/57937 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter