Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Nanosensors til å oppdage Protease aktivitet i Vivo Noninvasive diagnostikk

Published: July 16, 2018 doi: 10.3791/57937
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3,4,5
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Tech College of Engineering and Emory School of Medicine, 2Parker H. Petit Institute of Bioengineering and Bioscience, 3Institute for Electronics and Nanotechnology, Georgia Tech, 4Integrated Cancer Research Center, Georgia Tech, 5The Georgia Immunoengineering Consortium, Emory University and Georgia Tech

Summary

Proteaser er strengt regulert enzymer som er involvert i grunnleggende biologiske prosesser og dysregulated protease aktivitet stasjoner progresjon av komplekse sykdommer som kreft. Denne metoden mål er å skape nanosensors som måler protease aktivitet i vivo ved å produsere en cleavage signal som er synlig fra verten urin og diskriminerer sykdom.

Abstract

Proteaser er multi-funksjonelle enzymer som spesialiserer seg på hydrolyse av peptid-obligasjoner og kontrollere bred biologiske prosesser inkludert homeostase og kunnskap. Videre dysregulated protease aktivitet stasjoner patogenesen og er en funksjonell biomarkør av sykdommer som kreft; Derfor oppgir muligheten til å oppdage protease aktivitet i vivo klinisk relevant informasjon for biomedisinsk diagnostikk. Målet med denne protokollen er å opprette nanosensors som probe protease aktivitet i vivo ved å produsere et kvantifiserbare signal i urinen. Disse protease nanosensors består av to komponenter: en hydrogenion og underlaget. Funksjonene hydrogenion å øke sirkulasjonen half-life og underlaget levering til sykdom målområder. Underlaget er en kort peptid sekvens (6-8 AA), som er utformet for å være spesifikke for en mål protease eller proteaser. Underlaget er konjugert til overflaten av hydrogenion og avbrytes av en journalist, som en fluorescerende markør, for gjenkjenning. Som dysregulated proteaser cleave peptid underlaget, filtreres reporteren i urin for kvantifisering som en biomarkør protease aktivitet. Her beskriver vi byggingen av en nanosensor for matrise metalloproteinase 9 (MMP9), som er forbundet med svulst progresjon og metastasering, deteksjon av kolorektal kreft i en musemodell.

Introduction

Proteaser er multi-funksjonelle enzymer som spesialiserer seg på hydrolyse av peptid-obligasjoner og har betydelig kontroll over mange biologiske prosesser, herunder homeostase, kunnskap og sykdom1. En meditativ tilstand protease aktivitet er forbundet til en rekke sykdommer, inkludert kreft og hjerte-og karsykdommer, gjør proteaser attraktive kandidater for utvikling i klinisk biomarkers2,3. Videre er protease aktivitet funksjonelt knyttet til forskjellige pathogeneses, pasientens utfall og prognosen for sykdom4. Forstand, biosensors er utviklet for å oppdage ulike biologiske fenomener og sykdommer som kreft, nevrodegenerative sykdommer og elektron overføring behandler5,6,7,8 , 9. mer spesifikt, substrat-baserte protease sensorer er utviklet for å oppdage protease aktivitet, og inkluderer fluorogenic sonder for diagnostic imaging10 og isotopically merket peptid substrater for i vitro gjenkjenning av massespektrometri11. I tillegg er aktivitetsbaserte sonder utviklet, som inneholder substrat som regioner som binder eller endre målet protease12. Med denne metoden hemmes irreversibelt målet protease når det aktive området er endret, og analyse krever høsting av vev, som begrenser i vivo programmer. Imidlertid er det viktig å kjenne protease aktivitet i vivo, fordi regulering av protease aktivitet er sterkt avhengig av andre biologiske aktiviteter som tilstedeværelsen av endogene hemmere.

Målet med dette arbeidet er å beskrive utformingen av aktivitetsbaserte nanosensors som oppdager protease aktivitet i vivo ved å produsere en målbar signal i urinen. Denne plattformen er brukt som en noninvasive diagnose for å diskriminere komplekse sykdommer som kreft med dysregulated protease aktivitet som en funksjonell biomarkør. Vår nanosensor består av jernoksid nanopartikler (IONP) konjugert til protease underlag. Disse underlag er avsluttet av en fluorescerende som frigjøres når proteaser cleave underlaget. Disse IONPs sirkulere i vivo, lokalisere til sykdom nettsteder og avdekke underlag til aktive sykdomsassosierte proteaser. Etter cleavage, fluorescerende journalister er utgitt og på grunn av sin lille størrelse, er filtrert i urin, mens uncleaved underlag på IONP forbli i kroppen. Derfor vil en økning i protease aktiviteter i vivo resultere i høyere konsentrasjoner av reporteren i urin (figur 1). Siden vår plattform er en urinprøve, kreves ingen tenkelig plattform og diagnostiske signaler er beriket i urinen.

Denne plattformen kan bli konstruert for å oppdage en rekke sykdommer, inkludert kreft, fibrose og blodpropp13,14. Her beskriver vi utformingen av nanosensors å oppdage høyder i matrise metallopeptidase 9 (MMP9) aktivitet som en biomarkør for tykktarmskreft. Tykktarmskreft er den nest største årsaken til kreftdødsfall i USA, med en anslått 136,800 nye tilfeller og 50,300 dødsfall i 2014 alene15. Colorectal kreftceller produsere MMP9, som har vist å kjøre ondartet progresjon, matrix fornedrelse, samt metastasering16. I tillegg identifisert vi en egnet peptid substrat (PLGVRGK) for MMP9 litteratur17. Denne plattformen kan brukes for tidlig påvisning av kreft og rimelig point-of-care diagnostics13,14,18,19,20,21.

Figure 1
Figur 1: skjematisk av Nanosensor aktivitet i vivo. Nanosensors sirkulerer gjennom kroppen og lokalisere områder av sykdom. Deretter cleave sykdom-relaterte proteaser peptid underlag presentert av IONPs. Størrelsen på kløyvde fragmenter gir nedsatt fortolling, forårsaker dem til å lokalisere i urinen. Etter dyret urinates, kan disse peptid fragmentene analyseres av deres reporter molekylet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Institusjonelle godkjenning fra institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) på forskerens institusjon er nødvendig å utføre følgende dyreforsøkene. I tillegg er standard dyr omsorg fasiliteter (f.eks boliger kamre, sterile dyr hetter, isofluorane kamre for anesthetization og CO2 kamre for etisk endepunkt euthanization) nødvendig for å riktig utføre disse eksperimenter. Spesiell opplæring og hjelp med disse fasilitetene kan gis av fysiologiske Research Laboratory (PRL) ved en institusjon. Alle dyr arbeid ble godkjent av IACUC på Georgia Tech (protokoll: A14100).

1. jernoksid hydrogenion (IONP) syntese

Merk: Sikkerhet: hele jernoksid hydrogenion syntese bør utføres med personlig verneutstyr og under en kjemisk fume hette.

  1. I en 15 mL konisk tube, chill 1 mL av 30% ammonium hydroxide i en isen bøtte for 30 min.
  2. Vask en 250 mL Erlenmeyer flasken deionisert vann og tilsett 10 mL dobbel destillert vann (ddH2O). Senk utsiden av flasken i en isbadet hviler på en rør/varme plate. Bruke en plastikk pipe å flyt N2 gass i ddH2O i flasken. Boble i 15 minutter med N2 til deoxygenate.
  3. Veie 224 µmol (4,5 gram) av dekstran (molekylvekt (MW) = 20 kDa) i et 50 mL konisk rør. Legge til H2O slik at det siste bindet av blandingen, inkludert dekstran, 20 mL. Vortex kraftig å oppløse dekstran.
  4. Veie 290 µmol (78,5 gram) av iron(III) chloride hexahydrate, legge til dekstran løsning og vortex å oppløse.
  5. Filtrere den resulterende løsningen gjennom filtere 0,2 µm.
  6. Overføre 1 mL kjølt ammonium hydroksid til 9 mL deoxygenated vann. Gå tilbake til 4 ° C.
  7. Veie 367 µmol (73,0 gram) av iron(II) chloride tetrahydrate, oppløses i 1 mL av oksygenfri ddH2O og filtrere gjennom filtere 0,2 µm.
  8. Overføre dextran-iron(III) løsningen til 250 mL Erlenmeyer kolbe og deoxygenate med N2 i 15 minutter på is. Bland med en magnetic røre bar spinning på 1600 rpm.
  9. Hvis du vil opprette en homogen nitrogen atmosfære, cap flasken med en gummi septum. Punktering septum med en 18 gauge nål flyt N2 i flasken. Sett inn en egen 18 gauge nål som en flyt utløp.
  10. Legge 467 µL iron(II) løsningen til dextran-iron(III) løsningen med en 1 mL sprøyte, røring med magnetic røre bar på 1600 rpm. Dette forholdet mellom iron(II) til iron(III) resulterer i en balansert reaksjon som vil produsere magnetitt eller Fe3O4.
  11. Legg den kjølt fortynne ammonium hydroksid dropwise i jern (II) - jern (III) - dekstran løsningen å starte nucleation prosessen21. Kontroller at hver dråpe blander godt før slippe en annen. Fullføre reaksjon etter tillegg av 1-2 mL ammonium hydroksid.
  12. Stoppe flyten av N2 og fjerne den gummi septum. Fjerne isbadet og erstatte med et bad av varmt vann, mens du fortsetter å røre løsningen. Kontroller at temperaturen i løsningen når 75 ° C og ruge 75 minutter.
  13. Fjern flasken fra rør/varm plate og dobbelt filtrere løsningen gjennom 0,2 µm deretter 0,1 µm filtre fjerner grov partikler.
  14. Buffer exchange partiklene i ddH2O, bruker 100 kDa molekylvekt kuttet (m.w.c.o.) konsentratorer fjerne overflødig dekstran fra løsningen, som er svært tyktflytende. Erstatte filtre hvis flyten gjennom mørke selv etter 2-3 spinner, som indikerer at filteret kan ha brutt.
    1. Buffer exchange med spin filtre, sentrifuge på 4 ° C på 4800 X g i 15 minutter, forkaste gjennomflytsenhet, og legge til nye bufferen til IONP løsning. Gjenta 3 - 5 ganger.
  15. Bestemme konsentrasjonen av nanopartikler som bruker et spektrofotometer/plate reader. Ta absorbansen målinger på 400 nm og bruk molar absorptivity av IONP på denne bølgelengde (ε = 2,07 x 106 cm-1 M-1) å bestemme konsentrasjonen av IO partikler.
  16. Resuspend IONPs til 10 mg/mL i ddH2O (vanligvis totale volumet er ~ 3 mL) og bruk polypropylen rør for dette trinnet for kjemiske kompatibilitet. Legge til 1,6 mengder 5 M NaOH, deretter legge 0,65 mengder epichlorohydrin. Grundig blande på en plate shaker i romtemperatur i 12 timer til krysskobling dekstran.
  17. Bruke en 20 mL sprøyte med en 18-gauge nål for å overføre IONP løsningen i 50 kDa m.w.c.o. dialyse membranen. Plasser dialyse membranen i 4 L ddH2O og erstatte H2O noen ganger (hver 2-3 timer). Ruge over natten.
  18. Måle konsentrasjonen og få IONPs til 5 mg/mL (se trinn 1.15). Legg ammonium hydroksid å nå 20% (v/v) og riste ved romtemperatur for > 12 timer å aminate overflaten av IONPs. Bufferen utveksling ved hjelp av 30 kDa m.w.c.o. filtre (se 1.14).
  19. Juster volumet ned 2,5-3,5 mL før siste rensing av rask Protein flytende kromatografi (FPLC, se Tabellen for materiale for gel filtrering kolonne).
  20. Bruk dynamisk lysspredning (DLS) å bestemme etter radiusen for IONPs (forventet område 10-100 nm, gjennomsnittlig størrelse 40-50 nm). Gjør dette ved aliquoting 1 mL av 100 X utvannet IONP prøve i søppel, plasser i maskinen, og bruke produsentens programvare til å ta måling.
    Merk: Den totale befolkningen i IONPs vil være mellom 10 og 100 nm ved DLS målinger, men flertallet av befolkningen er rundt gjennomsnittlig diameter, som spenner fra 40-50 nm. Hvis man ønsker å begrense størrelsen, kan man kan bruke størrelse utelukkelse kromatografi ytterligere isolere fraksjoner med forskjellige diametere. IONPs bør lagres på 4 ° C.

2. peptid Design, Bøyning IONP og In Vitro validering

  1. Syntetisere et peptid substrat (f.eks en kjerne anlegget eller kommersielt) for et mål protease med en N-terminal fluorescerende reporter som Fluorescein isothiocyanate (FITC) og en C terminal cystein rester for å la thiol-mediert kopling.
    Merk: I denne studien for MMP9 peptid brukt var FITC-PLGVRGK-C, med kkatten/Km ~ 2.0 x 105 M-1s-1.
  2. Aliquot 0,5 mg IONP (ved 1 mg/mL) og buffer exchange inn kopling buffer (50 mM natriumborat med 1 mM EDTA, pH = 8.5) bruker en 10 kDa m.w.c.o. spin filtrere (se trinn 1.14).
  3. Oppløse Succinimidyl iodoacetate (SIA) i vannistedenfor (DMF) å nå en konsentrasjon av ~ 30 mg/mL, og Legg til SIA IONP i muldvarp forholdet 500 SIA:IONP.
    Merk: SIA er en heterobifunctional på tvers av linker som formidler koblingen av aminer på IONPs i sulfhydryl-grupper på peptid underlaget.
  4. Inkuber for 1-2 timer ved romtemperatur i mørket. Hvis forlater over natten, ruge på 4 ° C.
  5. Bufre exchange bruke filtere 10 kDa m.w.c.o. spinn inn kopling buffer til å fjerne Ureagert SIA (se trinn 1.14).
  6. Bringe det endelige produkt løsningen 1 mg/mL (0,5 mL løsning). Bland peptid rundt i molar forholdet 90:1 (peptid: IONP) med 20 kDa thiol slutter polyetylenglykol (PEG) i molar forholdet 20:1 (pinne: IONP). Bland peptid-pinne løsningen med IONP.
  7. Ruge over natten i romtemperatur på en plate shaker på høyeste hastighet, dekker rør i folie å hindre photobleaching av fluorescerende molekyler.
  8. Legge til L-cystein molar forholdet 500: 1 (C:IONP) å nøytralisere alle Ureagert SIA molekyler. Inkuber i 1 time ved 25 ° C i en shaker på høyeste hastighet ved romtemperatur.
  9. Rense via FPLC (se 1.1.19). Bruk et spektrofotometer å måle absorbansen prøve løsningen og beregne peptid: IONP forholdet etter følgende. Etter rensing, lagre produktet på 1 mg/mL på 4 ° C i PBS.
    1. Bruker et spektrofotometer måle absorbansen prøve løsningen på 400 nm (enprøve, 400) og bølgelengden til maksimal absorbansen for fluorophore brukes, som er 488 nm for FITC (enprøve, 488). Måle absorbansen på lager Amin IONP løsning på samme to bølgelengdene (400 nm og 488 nm), som er henholdsvis representert som enNP, 400 og enNP, 488.
    2. Bruke formler 1 og 2 til å beregne den normaliserte A400 og en488 verdier.
      Equation 1Formel 1
      Equation 2Ligning 2
    3. En400 og en488 representerer de normaliserte verdiene av utvalget. Bruk disse verdiene til å beregne forholdet mellom peptid: IONP med formel 3.
      Equation 3Formel 3
    4. Der Equation 4 og Equation 5 er de molar absorptivities IONP og fluorophore, henholdsvis. For disse partiklene Equation 4 = 2,06 x 106 M-1cm-1 og FITC Equation 5 = 72 000 M-1cm-1, så verdien av Equation 6 skal 28.75. Typisk peptid: IONP forhold bør være i størrelsesorden 20:1 til 50:1.
  10. Validere funksjonaliteten til sonder ved å utføre i vitro cleavage analysen.
    1. Med PBS (1% BSA), gjør et 18 µL hydrogenion løsning med en 200 nM konsentrasjon av peptid. Bland med 2 µL av protease rundt (MMP9; 0,1 - 1 mg/mL).
    2. Inkuber i en plate leser på 37 ° C i 1 time, tar fluorescens målinger (bruker den riktige eksitasjon og utslipp bølgelengder, som er 485 nm og 528 nm for FITC, henholdsvis) hver 1-2 minutter å overvåke cleavage.

3. administrasjon av Nanosensors og urin påvisning av kreft

Merk: Mer om eksempel modellen, se vår forrige rapport13.

  1. Opprette en metabolsk bur for urin samling ved å sikre en sylindrisk ermet til toppen av en 96 godt plate. Under urin samling, plass musen inne i ermet og dekk med en Petriskål dekselet for å hindre rømning av dyret.
  2. Forbered en injeksjon løsning (200 µL maksimalt volum) som inneholder nanosensors i en konsentrasjon av 3000 mg/kg (~ 50 µmol) ved peptid i sterilt saltvann.
  3. I kvinnelig, naken og 8 - uke gamle mus bærer xenograft LS174T colorectal svulster på en byrde ~ 100-300 mm3, noe som skulle skje på omtrent dag 10, administrere nanosensor løsning via hale blodåre injeksjon. Umiddelbart etter injeksjon, plasser mus metabolske bur og oppmerksom på tidspunktet for injeksjon for hver musen.
  4. 60-90 minutter etter injeksjon, Fjern sylindriske ermet fra 96-brønns plate. Holde musen og legge litt press på blæren å indusere mus til å annullere eventuelle gjenværende urin på platen. Samle alle urin (200-500 µL).
  5. Analysere urinprøver ved immunoprecipitation å rense FITC fra urine og øke følsomhet. Bruk magnetiske perler kombinert med anti-FITC antistoffer.
    1. Først vaske 25 mg av magnetiske perler 3 ganger med belegg buffer, og bringe det siste bindet til 225 µL.
      Merk: Det er viktig å gjøre belegg buffer (0.1 M natriumborat, pH 9,5), blokkerer buffer (PBS 0,5% BSA 0,05% Tween-20, pH 7.4), og vaske bufferen (PBS 0,1% BSA 0,05% Tween-20, pH 7.4) fersk hver gang, og ca 20 mL av hver er nødvendig.
    2. Legge til 200 µL av anti-FITC (5 mg/mL) og 200 µL av ammonium sulfate (3 M). Inkuber 16-24 timer på 37 C på et rotator.
    3. Legge løsningen til magnetisk skilletegn, fjerne nedbryting, erstatte med 625 Equation 7 Λ blokkerer buffer og ruge 37 c over natten. Deretter vaske 3 ganger med vaskebuffer og lagre i 1,25 mL vaskebuffer.
    4. Inkuber 2 µL av urin med 5 µL av magnetiske perler (20 mg/mL) og føre til et samlet volum til 50 µL med PBS (0,01% mellom 20). Inkuber for 60 min.
    5. Vask to ganger med 50 µL PBS (0,01% mellom 20) bruker magnetisk skilletegn for å samle magnetiske perler etter hver vask.
    6. Elute to ganger med 32,5 µL 5% iseddik. Nøytralisere gruppert elueringsrør (70 µL) med 35 µL av 2 M Tris å oppnå en siste pH av ~ 7.
    7. Lese på en plate leser (se Tabell for materiale) på aktuelle eksitasjon og utslipp bølgelengder å kvantifisere urin fluorescens. Beregn konsentrasjonen fluorescerende reporter mot en stige av kjente konsentrasjoner av gratis fluorophore.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Flertallet av befolkningen i IONPs er rundt gjennomsnittlig diameter, som spenner fra 40-50 nm. Etter pegylation, denne størrelse utvalg har en sirkulasjon halveringstid av ca 6 timer13 i vivo (se figur 2a). Hvis man ønsker å velge for en bestemt størrelse utvalg, kan man bruke størrelse utelukkelse kromatografi isolere IONP fraksjoner med forskjellige diametere. Nanopartikler av TEM vises som individuelle sfærisk jernoksid nanopartikler krysskoblet sammen av et ytre lag av dekstran. 13  En løsning av IONPs vises gjennomsiktig med ingen overilte og lys brun i fargen. Etter vellykket peptid Bøyning avdekker spectral absorbansen analyse en distinkt absorbansen peak på maksimal eksitasjon Bølgelengden av fluorescerende reporteren. Når det gjelder FITC, vil dette være sentrert rundt 488 nm (se figur 2b). En typisk peptid Bøyning reaksjon vil resultere i et peptid IONP molar forholdet mellom 20-50 etter FPLC rensing. For å teste muligheten for at proben følelse protease aktivitet, kan en aliquot av nanosensors inkubert med rekombinant proteaser og overvåket av fluorimetry. Kløv aktivitet vil medføre utgivelsen av fluorescerende journalister - som ellers homoquenched på overflaten av hydrogenion - løsning og øke eksempel fluorescens. Det er vanlig å observere substrat cleavage hastigheter som følger Michaelis-Menten kinetics (se figur 2 c).

Figure 2
Figur 2: Validere strukturen og funksjonen til Nanosensors i vitro. (a) en DLS grafen representerer størrelsesDistribusjon av en IONP populasjon etter syntese. (b) absorbansen spekteret av IONPs etter Bøyning med FITC-merket MMP-9 underlag. (c) i vitro cleavage analysen viser at MMP9 stadig kløyver peptid presentert av nanosensor i løpet av en time. En protease konsentrasjon på 0,5 mg/mL ble brukt i PBS (1% BSA) buffer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Hvis du vil bruke denne plattformen på musen modeller av kreft, er det vanlig å bruke nanosensors belagt med nær-infrarøde fluorescerende reporter for å tillate visualisering av farmakokinetikken av hele-dyr fluorescerende imaging (figur 3a). I mus med LS174T tykk svulster, vil et lysstoffrør signal lokalisere i urinen 60-90 minutter etter intravenøs administrasjon av nanosensors på grunn av MMP9 spalting av peptid underlag på nanosensors. Derimot vil det være lavere fluorescerende signaler i blæren kontroll gruppe mus (se figur 3a). Det bør bemerkes at signalet i leveren oppstår fordi partikler er slutt scavenged av monocytter og makrofager i reticuloendothelial systemet, som er ofte funnet i leveren, milten og lymfeknutene. Derfor skyldes signalet fra leveren i figur 3a rydding av nanopartikler. 13 da kvantifisere urin fluorescens av immunoprecipitation, en betydelig opphøyet signal vil bli observert i mus bærer LS174T svulster i forhold til sunn kontroller (se figur 3b).

Figure 3
Figur 3: oppdage tykktarmskreft i en musemodell. (a) i vivo bilder av svulsten og kontroll gruppe mus, observere IONP lokalisering til områder av sykdommen, samt urin lokalisering på grunn av svulst progresjon. (b) urin fluorescens kvantifisering av svulst i kontroll mus i LS174T svulst modellen. Feilfelt tegnes som standardavvik (*p < 0,05 to-tailed parvise t-test). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne metoden beskriver utviklingen av aktivitetsbaserte nanosensors bestående av protease underlag konjugert til en hydrogenion kjerne. Hendelsen proteolytisk cleavage er kalt "farmakokinetiske bryteren", fordi kløyvde peptid produkter er mindre enn den nyre størrelse filtrering av 5 nm23 og filter i urin å produsere en noninvasive signal. Derfor er det viktig å bruke nanopartikler eller operatører med en etter radius som er større enn 5 nm, som noe mindre fjernes raskt ved nyrene og forvirre urin signaler. Vi bruker pegylert IONPs fordi de er FDA-godkjent, godt tolerert, og har en sirkulerende halveringstid 3-5 timer. 13 er en annen viktig faktor i å formulere nanosensors PINNEN peptid substrat molar forhold. 24 , 25 øke forholdet vil redusere ikke-spesifikk spalting av off-målet proteaser gjennom steric skjerming peptider26, men potensielt redusere på målet aktivitet også. Derimot vil en lavere PEG peptid forhold øke protease tilgjengelighet og spalting av peptider som vil forsterke oppdagelsen signaler, men kan også øke bakgrunnsstøy. I vivo, kan en lavere overflaten konsentrasjon av PEG også øke nanosensor opptak av reticuloendothelial system (RES) og redusere sirkulasjon tid.

Hvis du vil bruke denne teknologien til å diagnostisere andre sykdommer, skal proteaser som er upregulated i en sykdom-tilstand være identifisert litteratur17. Discovery innsats bør fokusere på ekstracellulære proteaser fordi disse nanosensors ikke er utformet for å trenge celler følelse intracellulær aktivitet. Disse nanosensors er også konstruert til fornuftig endoproteases som cleave midt peptid, som gir mange kandidat sykdommer å målrette. Vi har utviklet diagnostikk for leveren fibrosis, flere typer kreft og blodpropp13,19,20,21av målretting ekstracellulære endoproteases alene. Denne plattformen kan utformes ytterligere å undersøke exoprotease aktivitet etter endoprotease cleavage i forbindelse med sykdom26,27. Det er også viktig å designe et peptid substrat som er spesifikk for protease rundt. Dette kan oppnås ved screening kandidat peptid sekvenser med i vitro cleavage analysen (trinn 2.10-2.11). Potensielle uspesifisert protease cleavage bør også testes under peptid design. For eksempel i MMP9 testet vi substrat spesifisitet med trombin, et koagulering protease på høye konsentrasjoner i blodet. Vil bruke aktivitet nanosensors i vivo, bør optimal urin samling tid fastsettes ved å overvåke kinetics signal produksjon av avbildning eller diskrete utvalg av urin etter administrasjon av nanosensors. Mus kan også være fylt med bakteriefri saline overhydrate dyr og øker urin produksjon. Praktisk talt, kan denne teknologien utbygget å sykdom med upregulated eller downregulated ekstracellulære protease aktivitet. En styrke på denne plattformen er at det tillater forsterkningen på målet protease signalet, så selv om bare en brøkdel av sykdom-site protease befolkningen er kartlagt, en betydelig lese-out kan måles. Gjeldende plattform er utviklet til følelse ekstracellulære endoproteases. Når du bruker denne plattformen på andre sykdommer, må man identifisere protease biologi som sykdom, slik at denne plattformen kan være innstilt til følelse proteaser rundt.

Denne kjerneteknologien kan videre integreres med cleavage journalister som kan oppdages med forskjellige analytiske plattformer å øke antall programmer. For eksempel kan spalting journalister som inneholder ligander for antistoff bindingen oppdages av papir tester for lav pris point-of-care diagnostics19. I tillegg gir merking underlag med masse journalister flere proteaser kan oppdages samtidig fra urinen av massespektrometri13. I konklusjonen, beskriver denne metoden formulere aktivitetsbaserte nanosensors å forstand protease aktivitet i vivo som en noninvasive urin biomarkør sykdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr. Kwong er medgrunnlegger og fungerer som konsulent for Glympse Bio, som utvikler produkter knyttet til forskning beskrevet i dette dokumentet. Denne studien kan påvirke hans personlige finansielle status. Vilkårene i denne ordningen har blitt vurdert og godkjent av Georgia Tech i samsvar med sin interessekonflikt politikk

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av en NIH nye innovatør regiprisen (Award nr. DP2HD091793). Q.D.M. støttes av NSF Graduate forskning stipend programmet (Grant nr. DGE-1650044). B.A.H støttes av nasjonale institutter for helse GT BioMAT trening stipendet under prisen nummer 5T32EB006343 samt Georgia Tech presidentens fellesskap. G.A.K. holder en Career-pris på vitenskapelige grensesnittet fra Burroughs velkommen fondet. Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm syringe filters VWR 4652
18G needle VWR 89134-024
15 mL conicals VWR 89039-670
250 mL Erlenmeyer flask VWR 89000-362
Stir bar VWR 58949-006
Hot Plate/Magnetic Stirrer VWR 97042-634
Glacial acetic acid VWR 97064-482
Albumin from Bovine Serum (BSA) Thermo Fisher A13100
Iron (III) chloride hexahydrate Sigma 236489
Iron (II) chloride tetrahydrate Sigma 44939
Epichlorohydrin Sigma 45340-500ML-F
DMF Sigma D4551
Ammonium Hydroxide Sigma 320145-500ML
Sodium Hydroxide pellets Sigma 221465-500G
EDTA Sigma E9884
Sodium Borate Sigma B9876
L-Cysteine Sigma 168149-100G
Tris-HCl Sigma T5941
Tris base Sigma T6066
PBS tablets Sigma P4417
Dextran Pharmacosmos 5510 0020 9006
Amicon 15 mL 10k filters, 24 pk Millipore UFC901024
Amicon 15 mL 30k filters, 24 pk Millipore UFC903024
Amicon 15 mL 100k filters, 24 pk Millipore UFC910024
Zetasizer Nano ZS Malvern Panalytical NanoZS
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette LifeTech 66130
Dynabeads MyOne Tosylactivated LifeTech 65501
SIA Life Tech 22349
PEG 20k Laysan Bio MPEG-SH-20K-1g
Fluorescein Antibody [2A3] GeneTex GTX10257
Hiload 16/600 superdex 200 GE Healthcare 45-002-490
Plate Reader Fisher BTCYT5M
BD Insulin Syringes Fisher NC0872854

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lopez-Otin, C., Bond, J. S. Proteases: Multifunctional enzymes in life and disease. Journal of Biological Chemistry. 283 (45), 30433-30437 (2008).
  2. Hua, Y., Nair, S. Proteases in cardiometabolic diseases: Pathophysiology, molecular mechanisms and clinical applications. Biochimica et Biophysica Acta. 1852 (2), 195-208 (2015).
  3. Koblinski, J. E., Ahram, M., Sloane, B. F. Unraveling the role of proteases in cancer. Clinica Chimica Acta. 291 (2), 113-135 (2000).
  4. Lilja, H., Vickers, A., Scardino, P. Measurements of proteases or protease system components in blood to enhance prediction of disease risk or outcome in possible cancer. Journal of Clinical Oncology. 25 (4), 347-348 (2007).
  5. Jin, H., et al. Flexible surface acoustic wave resonators built on disposable plastic film for electronics and lab-on-a-chip applications. Scientific Reports. 3, 2140 (2013).
  6. Ma, W., Liu, H. -T., Long, Y. -T. Monitoring dopamine quinone-induced dopaminergic neurotoxicity using dopamine functionalized quantum dots. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (26), 14352-14358 (2015).
  7. Zhang, W. -H., Ma, W., Long, Y. -T. Redox-mediated indirect fluorescence immunoassay for the detection of disease biomarkers using dopamine-functionalized quantum dots. Analytical Chemistry. 88 (10), 5131-5136 (2016).
  8. Ma, W., et al. Investigating electron-transfer processes using a biomimetic hybrid bilayer membrane system. Nature Protocols. 8 (3), 439-450 (2013).
  9. Holt, B. A., et al. Fc microparticles can modulate the physical extent and magnitude of complement activity. Biomaterials science . 5, 463-474 (2017).
  10. Edgington, L. E., Verdoes, M., Bogyo, M. Functional imaging of proteases: Recent advances in the design and application of substrate-based and activity-based probes. Current Opinion in Chemical Biology. 15 (6), 798-805 (2011).
  11. Kleifeld, O., et al. Identifying and quantifying proteolytic events and the natural N terminome by terminal amine isotopic labeling of substrates. Nature Protocols. 6 (10), 1578-1611 (2011).
  12. Sanman, L. E., Bogyo, M. Activity-based profiling of proteases. Annual Review of Biochemistry. 83 (1), 249-273 (2014).
  13. Kwong, G. A., et al. Mass-encoded synthetic biomarkers for multiplexed urinary monitoring of disease. Nature Biotechnology. 31 (1), 63-70 (2013).
  14. Dudani, J. S., Buss, C. G., Akana, R. T. K., Kwong, G. A., Bhatia, S. N. Sustained-release synthetic biomarkers for monitoring thrombosis and inflammation using point-of-care compatible readouts. Advanced Functional Materials. 26 (17), 2919-2928 (2016).
  15. Meester, R. G. S., et al. Public health impact of achieving 80% colorectal cancer screening rates in the United States by 2018. Cancer. 121 (13), 2281-2285 (2015).
  16. Mehner, C., et al. Tumor cell-produced matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) drives malignant progression and metastasis of basal-like triple negative breast cancer. Oncotarget. 5 (9), 2736-2749 (2014).
  17. Bremer, C., Tung, C. H., Weissleder, R. In vivo molecular target assessment of matrix metalloproteinase inhibition. Nature Medicine. 7 (6), 743-748 (2001).
  18. Warren, A. D., et al. Disease detection by ultrasensitive quantification of microdosed synthetic urinary biomarkers. Journal of the American Chemical Society. 136 (39), 13709-13714 (2014).
  19. Warren, A. D., Kwong, G. A., Wood, D. K., Lin, K. Y., Bhatia, S. N. Point-of-care diagnostics for noncommunicable diseases using synthetic urinary biomarkers and paper microfluidics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), 3671-3676 (2014).
  20. Kwong, G. A., et al. Mathematical framework for activity-based cancer biomarkers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (41), 12627-12632 (2015).
  21. Dudani, J. S., Jain, P. K., Kwong, G. A., Stevens, K. R., Bhatia, S. N. Photoactivated spatiotemporally-responsive nanosensors of in vivo protease activity. ACS Nano. 9 (12), 11708-11717 (2015).
  22. Palmacci, S., Josephson, L. AMAG Pharmaceuticals Inc. Synthesis of polysaccharide covered superparamagnetic oxide colloids. US patent. , 5,262,176 (1991).
  23. Choi, H. S., et al. Renal clearance of nanoparticles. Nature Biotechnology. 25 (10), 1165-1170 (2007).
  24. Harris, T. J., von Maltzahn, G., Derfus, A. M., Ruoslahti, E., Bhatia, S. N. Proteolytic actuation of nanoparticle self-assembly. Angewandte Chemie (International edition in English). 45 (19), 3161-3165 (2006).
  25. Kwon, E. J., Dudani, J. S., Bhatia, S. N. Ultrasensitive tumour-penetrating nanosensors of protease activity. Nature Biomedical Engineering. 1, (2017).
  26. Villanueva, J., Nazarian, A., Lawlor, K., Tempst, P. Monitoring Peptidase activities in complex proteomes by MALDI-TOF mass spectrometry. Nature Protocols. 4 (8), 1167-1183 (2009).
  27. Villanueva, J., et al. Differential exoprotease activities confer tumor-specific serum peptidome patterns. The Journal of Clinical Investigation. 116 (1), 271-284 (2006).

Tags

Bioteknologi problemet 137 syntetiske biomarkers aktivitetsbaserte sonder proteaser nanosensors nanopartikler urinen Nettverksdiagnose
Nanosensors til å oppdage Protease aktivitet <em>i Vivo</em> Noninvasive diagnostikk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Holt, B. A., Mac, Q. D., Kwong, G.… More

Holt, B. A., Mac, Q. D., Kwong, G. A. Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics. J. Vis. Exp. (137), e57937, doi:10.3791/57937 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter