Summary
Modelli di sequestro acuta sono importanti per studiare i meccanismi alla base di eventi epileptiform. Inoltre, la capacità di generare eventi epileptiform su richiesta fornisce un metodo altamente efficiente per studiare l'esatta sequenza degli eventi alla base la loro iniziazione. Qui, descriviamo i modelli di sequestro corticale acuta 4-aminopiridina stabiliti nel tessuto umano e del mouse.
Abstract
Controllo delle crisi epilettiche rimane un problema difficile per la comunità medica. Per compiere progressi, i ricercatori hanno bisogno di un modo ampiamente studiare la dinamica di sequestro e indagare i meccanismi sottostanti. Modelli di sequestro acuta sono convenienti, offrono la possibilità di eseguire registrazioni elettrofisiologiche e possono generare un grande volume di elettrografici grippaggio-come (ictal) eventi. I promettenti risultati da modelli di sequestro acuta possono essere avanzati quindi ai modelli di epilessia cronica e studi clinici. Così, studiando i sequestri in modelli acuti che replicano fedelmente le firme elettrografiche e dinamiche di un grippaggio clinico sarà essenziale per rendere i risultati clinicamente rilevanti. Studiare gli eventi ictal in sequestro acuta modelli preparati dal tessuto umano è anche importante per rendere i risultati che sono clinicamente rilevanti. L'obiettivo fondamentale in questa carta è sul modello 4-AP corticale grazie alla sua versatilità nel generare eventi ictal negli studi sia in vivo che in vitro , così come nel tessuto umano sia il mouse. I metodi in questa carta saranno anche descrivere un metodo alternativo di induzione di sequestro utilizzando il modello Zero-Mg2 + e fornire una panoramica dettagliata dei vantaggi e limiti dell'attività epileptiform-come generati nelle diverse acuta modelli di sequestro. Inoltre, approfittando di optogenetica disponibile in commercio diversi ceppi di topi, un impulso di luce breve (30 ms) utilizzabile per attivare un evento ictal identico a quelle che si verificano spontaneamente. Allo stesso modo, soffi di 30-100 ms di neurotrasmettitori (acido Gamma-Amino butirrico o glutammato) possono essere applicati al tessuto umano per attivare eventi ictal che sono identici a quelli che si verificano spontaneamente. La capacità di innescare eventi ictal su richiesta in modelli acuti sequestro offre la ritrovata capacità di osservare l'esatta sequenza degli eventi che sono alla base della dinamica di iniziazione di sequestro e in modo efficiente valutare potenziali terapie anti-sequestro.
Introduction
Modelli di sequestro acuta è in grado di riprodurre con successo elettrografiche firme ricorda eventi ictal osservati nell'elettroencefalogramma (EEG) di individui che avvertono un attacco epilettico. I ricercatori usano questi eventi ictal-come (di seguito definiti 'ictal eventi') come surrogati per il grippaggio evento1. Clinicamente, eventi ictal servono come un proxy affidabile per gli eventi di sequestro, poiché i sequestri sono un disturbo neurologico che proviene dal cervello. In unità di monitoraggio di epilessia, neurologi si basano sulla rilevazione di eventi ictal per confermare regione epilettogena del cervello e isolarlo per resezione2. In unità di cure intensive, i medici controllano attività ictal per valutare se qualsiasi attività convulsiva persiste in pazienti sedati3. Controllo delle crisi epilettiche rimane per essere un problema impegnativo per la comunità medica, come 30% dei pazienti di epilessia sono farmaco resistenti al farmaco disponibile4,5, e 10% di casi medici che coinvolgono i sequestri di droga-indotto sono non risponde al trattamento standard3. Questo presenta una seria preoccupazione per la società, come 10% della popolazione americana è prospezione per sperimentare un sequestro evento nella loro vita e 3% sono tenuti a sviluppare l'epilessia6.
Studiando i sequestri in modelli di epilessia cronica è costoso, faticoso e spesso impiegano mesi per preparare7. È anche difficile effettuare registrazioni elettrofisiologiche in animali liberi di muoversi. Test clinici umani affrontano problemi simili, come pure ulteriori complessità relative al consenso del paziente, variabilità in ambiti di provenienza dei partecipanti e le considerazioni etiche e morali coinvolti8. Modelli di crisi acuta, d'altra parte, sono favorevole perché sono relativamente conveniente da preparare, costo-efficiente e in grado di generare grandi volumi di eventi ictal per Studio9. Inoltre, il tessuto è fissato in una posizione stabile, quindi le condizioni sono ideali per eseguire le registrazioni elettrofisiologiche necessarie studiare dinamiche di grippaggio e la patofisiologia di fondo correlata. Modelli di acuta crisi restano favorevoli rispetto ai modelli in silico (computer) perché sono basati su materiale biologico composto costituente rete neuronale del cervello con tutti i suoi fattori e connettività sinaptica, che non può essere catturata 10i modelli di computer anche le più dettagliate. Queste caratteristiche rendono modelli acuta sequestro pronte ad per essere efficienti a screening per potenziali terapie anti-sequestro e rendendo i risultati preliminari prima di loro avanzare per ulteriori indagini nei modelli di epilessia cronica e studi clinici.
In genere, modelli di sequestro acuta sono derivati dal tessuto normale del cervello che è stato sottoposto a condizioni di iper-eccitabile. Per indurre gli eventi ictal clinicamente rilevanti nel tessuto cerebrale sano, è importante capire che il cervello funziona in modo ottimale in un stato critico11 dove eccitazione (E) e l'inibizione (I) sono equilibrato12. Una perturbazione del E-ho equilibrio può portare allo stato iper-eccitabile sequestro in cui precipitano eventi ictal. Di conseguenza, all'interno di questo quadro concettuale, esistono due strategie principali per generare eventi ictal nelle fette del cervello (in vitro) o nelle preparazioni del intero-cervello (in vivo): sia diminuita inibizione ("disinibizione") o aumentata eccitazione ("non-disinibizione"). Tuttavia, eventi ictal sono altamente ordinati e sincronizzati gli eventi che richiedono l'influenza di interneuroni GABAergici di orchestrare la rete neurale attività13,14. Per questo motivo, non-disinibizione modelli sono i più efficaci per la generazione di eventi ictal isolato di reti neurali, come in un in vitro cervello affettare15, considerando che in vitro disinibizione modelli comunemente conducono a chiodare l'attività ricorda di interictal-come chiodare. Inoltre, all'interno di questo quadro concettuale, un evento di sincronizzazione momentaneo anche in modo affidabile può innescare un evento ictal16. Infatti, può essere attivato un evento ictal mediante qualsiasi perturbazione minori applicato al sistema neurale17 quando è a un punto di transizione ("biforcazione") stato critico18. Tradizionalmente, queste perturbazioni sono state indotte da stimolazione elettrica. Lo sviluppo recente di optogenetica in neuroscienza, tuttavia, offre ora una strategia più elegante per indurre lo stato critico transizioni16.
I metodi descritti in questo documento viene illustrato come generare eventi ictal su richiesta nei modelli di sequestro acuta sia in vitro (passaggio 1 del protocollo) e in vivo studi (punto 2 del protocollo). Essi comportano la scelta della regione del cervello, metodo di induzione del sequestro, studio tipo e specie; Tuttavia, il focus sarà sulla scelta consigliata di un modello acuto 4-AP corticale sequestro a causa della sua versatilità in un'ampia varietà di tipi di studio. Il modello di 4-AP sequestro acuta in vitro è basato sul protocollo standard per preparare fettine di cervello di alta qualità per registrazioni elettrofisiologiche e formazione immagine studia19. Questi protocolli sono già stati utilizzati per rendere in vitro fette coronali del cervello dalla corteccia somatosensory-motor di topi16,20 e gli esseri umani21. Modifiche per generare eventi ictal in questi tipi di fette del cervello sono state dimostrate in precedenza16 e tutti i dettagli sono descritti nel protocollo sotto. Il modello di 4-AP sequestro corticale acuta in vivo è basato sul protocollo standard per preparare un craniotomy per imaging studies22. La modifica è che nessuna finestra (vetrino) è installata dopo il craniotomy. Invece, agenti proconvulsivante (4-AP) vengono applicati per via topica alla corteccia esposta per indurre eventi ictal mentre l'animale è in anestesia generale. A nostra conoscenza, il nostro gruppo è stato il primo a sviluppare questo modello di grippaggio corticale acuta in vivo in topi16,23. Acuta in vivo 4-AP corticale sequestro modello preparato da topi adulti è stato sviluppato per completare il modello in vitro fetta dal tessuto giovanile. La replica dei risultati del modello di grippaggio adulto in vivo consente di generalizzare i risultati dai modelli di fetta di affrontare le preoccupazioni inerenti per quanto riguarda le condizioni di non-fisiologica di una fetta di cervello 2D (contro un 3-d del intero-cervello struttura) e le differenze fisiologiche tra tessuto giovanile e adulto.
Il metodo di apertura su richiesta evento ictal è dimostrato usando entrambi sbuffi di neurotrasmettitori con un picospritzer o optogenetica strategie. Al meglio della nostra conoscenza, il nostro gruppo è il primo ad avviare eventi ictal nel tessuto umano usando neurotrasmettitori tramite un picospritzer16. Per le strategie di optogenetica, il ceppo di topi C57BL/6 è il ceppo convenzionale utilizzato per esprimere i transgeni. L'espressione di channelrhodopsin-2 (ChR2) in interneuroni GABAergici o cellule piramidali glutamatergic fornirà la possibilità opzionale di generare eventi ictal on-demand con brevi impulsi di luce. Ceppi di topi optogenetica adatto comprendono la variante C57BL/6 disponibile in commercio che esprime la ChR2 in entrambi interneuroni, utilizzando il mouse vescicolare GABA trasportatore promotor (VGAT)24, o cellule piramidali, utilizzando l'antigene delle cellule di timo del mouse 1 Promotor (Thy1)25. Questi topi VGAT-ChR2 e Thy1-ChR2 disponibili in commercio offrono la possibilità di attivare i neuroni GABAergici o neuroni glutamatergici, rispettivamente, nella neocorteccia con blu (470 nm) luce. La capacità di generare gli eventi ictal on demand in modelli di sequestro acuta può offrire nuove opportunità per studiare la dinamica l'inizio di grippaggio e in modo efficiente valutare potenziali terapie anti-sequestro.
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Protocol
Tutte le ricerche che coinvolgono i pazienti è stata effettuata nell'ambito di un protocollo approvato dal Comitato Università salute rete ricerca etica in conformità con la dichiarazione di Helsinki. Procedure che coinvolgono gli animali erano in conformità con le linee guida del Consiglio canadese su Animal Care e approvato dal comitato di cura di Krembil Research Institute animale.
1. protocollo i: acuto In vitro sequestro modello
- Preparazione di soluzioni di dissezione e liquido cerebrospinale artificiale
- Carbogenate acqua ultrapura (che è acqua filtrata con una resistività di MΩ·cm 18,2) con carbogen (95% O25% CO2) per 5 min utilizzando aria diffusori a bolle pietra (aeratori per acquari).
Nota: Pietre dell'aria possono essere collegate per il serbatoio carbogen regolatore tramite standard tubo in silicone. Se pietre dell'aria non sono disponibili, tenuta chiusa l'estremità del tubo in silicone e colpisca i piccoli fori nella guarnizione per consentire al gas di carbogen a bolla fuori e carbogenate la soluzione. - Preparare una soluzione di dissezione sciogliendo i soluti da tabella 1 in acqua ultrapura. Aggiungere CaCl2 a una soluzione che è stata carbogenated per almeno 5 min per aiutarlo a sciogliere.
Nota: In alternativa, aggiungere CaCl2 in primo luogo, modo che può dissolversi facilmente in una soluzione di insatura. La soluzione, in forma liquida, dovrebbe essere 300-320 mOsm/L e un pH di 7,4 dopo essere saturato con carbogen.- Raffreddare la soluzione di dissezione per 0 - 4 ° C. Lasciare la soluzione in frigorifero durante la notte o mettere la soluzione in freezer per 1 h e monitorare continuamente la temperatura.
Nota: La soluzione di dissezione può essere conservata per fino a 3 notti; eliminare in seguito. - Carbogenate la soluzione di dissezione per 5-10 minuti prima dell'uso.
Nota: Idealmente, la soluzione dovrebbe compaiono come fanghiglia o la transizione per granita prima dell'uso.
- Raffreddare la soluzione di dissezione per 0 - 4 ° C. Lasciare la soluzione in frigorifero durante la notte o mettere la soluzione in freezer per 1 h e monitorare continuamente la temperatura.
- Preparate del roditore del liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) sciogliendo i soluti da tabella 2 (o tabella 3 per umano ACSF) in acqua ultrapura. Carbogenate la soluzione ACSF mentre si è in un bagno di acqua riscaldato a 35 ° C fino all'utilizzo. Aggiungere CaCl2 a una soluzione che è stata carbogenated per almeno 5 min per aiutarlo a sciogliere.
Nota: In alternativa, aggiungere CaCl2 primo modo che può dissolversi più facile in una soluzione di insatura. La soluzione, in forma liquida, dovrebbe essere 290-320 mOsm/L e un pH di 7,4 dopo essere saturato con carbogen. Soluzioni dovrebbero essere fatto in volumi 1, 2 o 4 L a seconda della durata degli esperimenti. Fare 4 L per una giornata intera (8h) di esperimenti. Il ACSF dovrebbe essere fatta fresca ogni giorno; Non conservare per più di 1 d.
- Carbogenate acqua ultrapura (che è acqua filtrata con una resistività di MΩ·cm 18,2) con carbogen (95% O25% CO2) per 5 min utilizzando aria diffusori a bolle pietra (aeratori per acquari).
- Dissezione del mouse per raccogliere il tessuto cerebrale
Nota: Per il tessuto umano, procedere al passaggio successivo (passaggio 1.3) sul fare fette del cervello con il vibratome. I blocchi a forma di cubo (1 cm3) del tessuto cerebrale dovrebbero essere ottenuti dal neurochirurgo utilizzando le procedure precedentemente descritte26,27.- Raccogliere tutti gli strumenti e materiali necessari per le dissezioni di animali. Impostare l'area di lavoro per preparare le dissezioni di animali.
- Controllare il serbatoio carbogen (95 %O2/5%CO2) per garantire che non sia vuota. Se c'è meno di 500 psi di pressione residua, sostituire la bombola del gas prima di esperimenti.
- Calibrare il vibratome (vibrazione affettatrice tessuto lama) secondo il manuale di istruzioni del produttore. Regolare del vibratome impostazione per avere un'ampiezza di taglio di 1 mm e una velocità di taglio di 0.12 mm/s.
Nota: Le impostazioni ottimali possono differire per ogni taglierina lama di tessuto di vibrazione individuale; Tuttavia, in generale, l'ampiezza deve essere alta e la velocità di taglio dovrebbe essere bassa. - Riempire la camera di incubazione fetta di cervello (cioè, il custode di fetta di cervello) con ACSF e bubble è con carbogen. Quindi posizionare la camera di incubazione in un bagno di acqua a 35 ° C.
Nota: Utilizzare roditore ACSF per fette del cervello del roditore e umano ACSF per fette di cervello umano.
- Ottenere un mouse giovanile di entrambi i sessi, fra l'età di 13 d (p13) per 21D (p21, dove p0 è la data di nascita).
- Anestetizzare il mouse con un'iniezione intraperitoneale di sodio pentobarbital (55 mg/kg di peso corporeo). Una volta che il mouse è anestetizzato, come indicato dall'assenza del riflesso del pizzico di punta, prontamente di usare uno strumento ghigliottina IFP-approvato per decapitare il mouse in un movimento rapido.
Nota: Preparare l'iniezione di sodio pentobarbital secondo le procedure raccomandate dalle linee guida istituzionali. - Tenere il naso del mouse per stabilizzare la testa decapitata e delicatamente fare un'incisione mediana a partire tra gli occhi del mouse e lungo l'intera lunghezza del cuoio capelluto per esporre il cranio. Garantire che il cranio non è compresso dalla pressione esercitata dal rasoio. Utilizzare l'angolo del bordo del rasoio per aumentare la precisione di taglio.
- Divaricare i lembi di cuoio capelluto del mouse utilizzando le dita per esporre il cranio. Quindi, utilizzare il fresh corner del rasoio per fare un'incisione lungo la linea mediana del cranio; prestare particolare attenzione a evitare il contatto con la corteccia cerebrale.
- Inserisci scheggia forcipe in zoccoli dell'occhio del mouse per stabilizzare la testa decapitata e inserirlo in una capsula di Petri piena di freddo (0 - 4 ° C) soluzione di dissezione. Assicurarsi che la testa è completamente immersa nella soluzione di dissezione.
- Utilizzare un secondo set di pinze scheggia delicatamente staccarsi del cuoio capelluto del mouse, rimuovere l'osso del naso di peeling e rimuovere la parte posteriore (lato caudale) del cranio.
Nota: L'osso del naso dei topi giovanili è molto morbido e facilmente rotto. - Utilizzare una spatola micro per tagliare i nervi ottici, nervi di trigeminal e del midollo spinale. Quindi, usare la spatola micro per separare delicatamente il cervello dal cranio. Lasciare il cervello completamente sommerso in di Petri riempito con soluzione di dissezione.
- Raccogliere tutti gli strumenti e materiali necessari per le dissezioni di animali. Impostare l'area di lavoro per preparare le dissezioni di animali.
- Preparazione di fette corticali dalla corteccia somatosensory-motor
- Riempire la vasca tampone del vibratome con ~ 150 mL di freddo (0 - 4° C) soluzione di dissezione.
Nota: In alternativa, mantenere tampone in freezer fino a quando necessario per mantenere una temperatura bassa durante la procedura di taglio. - Incollare il tessuto cerebrale da mouse o umani sul palco vibratome (titolare/vassoio campioni) utilizzando colla adesiva istantanea. Per topi, tagliare una piccola porzione caudale del cervello (cioè, il cervelletto) affinché esso possa essere facilmente incollato sul portacampioni (consentendo la parte rostrale del cervello per affrontare il soffitto).
Nota: In alternativa, fettine di cervello orizzontale del mouse possono essere preparati incollando il lato dorsale del cervello sul supporto del campione (il lato ventrale del cervello dovrebbe affrontare il soffitto)28. - Posizionare delicatamente il portacampioni (con tessuto cerebrale) in tampone. Garantire che la porzione dorsale del cervello sta affrontando la lama del vibratome.
Nota: È fondamentale per ridurre al minimo la quantità di tempo che il cervello è esposto all'aria.
- Riempire la vasca tampone del vibratome con ~ 150 mL di freddo (0 - 4° C) soluzione di dissezione.
- Taglio del tessuto di cervello e collezione
- Affettare il cervello a 450 μm fette spesse utilizzando il vibratome nella dorsale alla direzione ventrale. Assicurarsi che il cervello rimane completamente ancorato al vassoio del campione mentre tagliarlo.
- Effettuare il primo taglio nel cervello del topo per rimuovere il bulbo olfattivo. Quindi, apportare tagli successivi fino a quando l'area somatosensoriale-motor è osservato (a circa metà strada tra il bulbo olfattivo e bregma).
Nota: Facoltativamente, affettare il cervello in sottili fette (200 μm) fino a che il corpo calloso appare la vista della corona del cervello, che indica che l'area somatosensoriale-motor è vicino.
- Effettuare il primo taglio nel cervello del topo per rimuovere il bulbo olfattivo. Quindi, apportare tagli successivi fino a quando l'area somatosensoriale-motor è osservato (a circa metà strada tra il bulbo olfattivo e bregma).
- Utilizzare una pipetta di trasferimento wide-bore per raccogliere le sezioni coronale (450 μm) che contengono l'area somatosensoriale-motor e li immergere in una piastra Petri contenente freddo (0 - 4 ° C) soluzione di dissezione.
- Utilizzare la lama di un rasoio nuova e tagliare qualsiasi tessuto in eccesso dalle fette. Per le sezioni coronali da topi, eseguire una resezione trasversale appena sotto la commissura neocorticale (cioè, corpo calloso). Non tagliare in un movimento della sega; semplicemente applicare una pressione sulla lama nel tessuto e utilizzare un pennello dettagliare per separare delicatamente il tessuto. Assicurarsi di ridurre al minimo il movimento della sezione corona.
- Uso di una pipetta di trasferimento wide-bore per trasferire la porzione dorsale delle fette della corona che contengono la neo-corteccia (strato 1-6) per un secondo piatto di Petri piena di caldo (35 ° C) ACSF per un momento (~ 1 s). Poi, prontamente trasferire le fette di una camera di incubazione contenente caldo (35 ° C) carbogenated ACSF.
Nota: La finalità del trasferimento nella piastra di Petri con ACSF è quello di ridurre al minimo il trasferimento della soluzione di dissezione alla camera di incubazione durante il trasferimento di fettine di cervello con la pipetta di wide-bore. Utilizzare la camera d'incubazione pozzi multipli per tenere fette differenti del cervello organizzati. - Scartare il resto del cervello e carcassa di animale secondo le linee guida istituzionali.
- Affettare il cervello a 450 μm fette spesse utilizzando il vibratome nella dorsale alla direzione ventrale. Assicurarsi che il cervello rimane completamente ancorato al vassoio del campione mentre tagliarlo.
- Incubazione e manutenzione
- Lasciare le fette di cervello leggermente sommerse nella camera di incubazione a 35 ° C per 30 min. Quindi, rimuovere la camera di incubazione dal bagnomaria e lasciarlo tornare a temperatura ambiente (20-25 ° C). Aspettare 1 ora per le fette di cervello recuperare prima di eseguire registrazioni elettrofisiologiche.
Nota: Assicurarsi che non siano senza bolle d'aria che raccolgono sotto le fette di cervello nella camera di incubazione. Bolle d'aria sono interfacce aria che causano danni ai tessuti. Le fette di cervello del mouse possono essere mantenute per 6-8 h, mentre il tessuto cerebrale umano può essere immagazzinato per fino a 24 h in una camera di incubazione di bene-carbogenated con l'appropriato ACSF.
- Lasciare le fette di cervello leggermente sommerse nella camera di incubazione a 35 ° C per 30 min. Quindi, rimuovere la camera di incubazione dal bagnomaria e lasciarlo tornare a temperatura ambiente (20-25 ° C). Aspettare 1 ora per le fette di cervello recuperare prima di eseguire registrazioni elettrofisiologiche.
- Registrazioni elettrofisiologiche dello strato corticale superficiale
Nota: Gli eventi Ictal sono osservati nelle registrazioni extracellulari campo locale (LFP) potenziali da fettine di cervello. La LFP della fetta del cervello possono essere osservate e registrate con un'interfaccia tipo camera29 o un array di multi-elettrodi sommerso (MEA) sistema16. La procedura è stato descritto in precedenza16 e ulteriori dettagli sono descritti di seguito.- Utilizzare una pipetta di trasferimento wide-bore o un pennello dettagliare per spostare una fetta di cervello su carta pretagliata lente leggermente più grande che si è tenuto in luogo utilizzando una pinzetta dentale. Trasferimento la carta per lenti (che la fetta di cervello sta riposando su) alla camera di registrazione e fissarlo in posizione con uno schermo di arpa.
- Fase calda (35 ° C), carbogenated ACSF perfusato attraverso la camera di registrazione sopra la fetta di cervello a una velocità di 3 mL/min (~ 1 goccia/s). Utilizzare un termometro digitale per garantire che la camera di registrazione è di 33-36° C.
- Tirare gli elettrodi di vetro con un'impedenza di 1-3 MΩ da un tubo di vetro borosilicato (con un diametro esterno di 1.5 mm) utilizzando un estrattore. Recupero informazioni gli elettrodi di vetro con ACSF (~ 10 µ l) utilizzando una siringa Hamilton. Immediatamente scartare l'elettrodo se la punta è danneggiata.
Nota: Bleach il filo d'argento (5 min) e consentire solo una minima parte (cioè, la punta) del filo in argento per essere sommerso gli elettrodi di vetro retro-riempito di ACSF per ridurre al minimo il rumore e la deriva durante le registrazioni. Rimuovere qualsiasi eccesso ACSF dall'elettrodo di vetro con una siringa Hamilton se necessario. - Uso un microscopio stereo 20x accuratamente l'elettrodo di registrazione vetro in superficiale corticale di guida per livello (2/3) mediante manipolatori manuali. Record/vista l'attività elettrica della fetta del cervello in un computer con software standard.
Nota: Fette vitali del cervello (alta qualità) esporrà un robusto potenziale evocato in risposta a stimoli elettrici applicati (100 µs, 30-300 μA) o impulsi di luce (30 ms, 10 mW/mm2) per il tessuto optogenetica.
- Induzione di grippaggio-come attività
- Irrorare ACSF contenente 100 µM 4-aminopyrimidine (4-AP) sopra la fetta di cervello. Sciogliere 80 mg di 4-AP in 8,5 mL di acqua per fare una soluzione stock di 100 mM 4-AP. aggiungere 100 µ l di soluzione di riserva 4-AP 100 mM a 100 mL di ACSF per raggiungere un perfusato ACSF con 100 µM 4-AP.
Nota: In alternativa, utilizzare Zero-Mg2 + ACSF (tabella 4), una soluzione ACSF modificata contenente no aggiunto Mg2 +, per irrorare la fetta di cervello. Per il tessuto umano, è necessario utilizzare una combinazione di 100 µM 4-AP in Zero-Mg2 + umano ACSF (tabella 5) per ottenere risultati ottimali. Il tempo medio per eventi ictal a comparire è di 15 min; Tuttavia, potrebbe richiedere fino a 40 min per alcune fette di cervello.
- Irrorare ACSF contenente 100 µM 4-aminopyrimidine (4-AP) sopra la fetta di cervello. Sciogliere 80 mg di 4-AP in 8,5 mL di acqua per fare una soluzione stock di 100 mM 4-AP. aggiungere 100 µ l di soluzione di riserva 4-AP 100 mM a 100 mL di ACSF per raggiungere un perfusato ACSF con 100 µM 4-AP.
- Generazione di sequestro su richiesta: una strategia di optogenetica per topi optogenetica
- Applicare un impulso breve (30 ms) di blu (470 nm) luce (con un'intensità di uscita minimo 1 mW/mm2 ) per avviare un evento ictal. Utilizzare un manipolatore manuale per posizionare una fibra ottica di 1.000 µm core diametro (0,39 NA) direttamente sopra l'area di registrazione.
Nota: Impostare la velocità della foto-stimolazione per abbinare la velocità desiderata dell'occorrenza dell'evento ictal (cioè, 1 impulso ogni 50 s). Tuttavia, il tasso non può essere eccessivamente esagerato dal tasso intrinseco in cui si verificano eventi ictal.
- Applicare un impulso breve (30 ms) di blu (470 nm) luce (con un'intensità di uscita minimo 1 mW/mm2 ) per avviare un evento ictal. Utilizzare un manipolatore manuale per posizionare una fibra ottica di 1.000 µm core diametro (0,39 NA) direttamente sopra l'area di registrazione.
- Generazione di sequestro su richiesta: una strategia non-optogenetica per tessuto umano
- Posizionare la fetta di cervello in modo che gli strati superficiali sono a Monte, e gli strati profondi sono a valle nel flusso di perfusato attraverso la camera di registrazione.
- Tirare un elettrodo di vetro (lo stesso tipo utilizzato per le registrazioni LFP) e toccare delicatamente la punta con un pulitore delicato compito di creare una piccola apertura. Recupero informazioni l'elettrodo con ~ 25 µ l di 100 mM GABA (disciolto in acqua) e allegarlo alla picospritzer. In alternativa, recupero informazioni l'elettrodo con 200 µM glutammato (disciolto in acqua).
Nota: Per stimare il volume viene soffiato da picospritzer (~ 50 µ l), applicare un soffio di prova su una piastra di plastica (preferibilmente quadrettata). Quindi, applicare una goccia di volumi noti (vale a dire, 10 µ l, 20 µ l, 50 µ l o 100 µ l) con una pipetta per un confronto con il soffio di prova. - Applicare dei soffi del neurotrasmettitore (GABA o glutammato) al tessuto umano con un picospritzer (10-20 psi per 30-100 ms) per avviare un evento ictal. Applicare una sola boccata di 100mm GABA sullo strato profondo (5) del tessuto cerebrale per generare eventi ictal nello strato superficiale (2/3). In alternativa, applicare una sola boccata di 200 µM glutammato direttamente sullo strato superficiale per generare eventi ictal nello strato superficiale.
Nota: Impostare la velocità della picospritzer soffio per abbinare la velocità desiderata dell'occorrenza dell'evento ictal (cioè, 1 impulso ogni 50 s). Tuttavia, il tasso non può essere eccessivamente esagerato dal tasso intrinseco in cui si verificano eventi ictal.
2. protocollo II: Acuta In vivo modello di grippaggio
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Chirurgia e preparazione chirurgica
- Ottenere un topo adulto (p35 - p60) di entrambi i sessi.
- Profondamente anestetizzare mouse con ketamina (95 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg). Eseguire il test di riflesso toe-pizzico per garantire che il mouse è sedato. In alternativa, utilizzare isoflurano (4% per induzione, 1,5-2% per la chirurgia) per anestetizzare il mouse.
Nota: La scelta degli anestetici possa avere un impatto il sequestro attività30,31. - Montare il mouse in una cornice stereotassica proteggendo la testa con le barre di orecchio. Posto un pad riscaldato sotto il mouse per tutta la durata dell'intervento chirurgico.
- Radere la parte superiore della testa del mouse utilizzando un roditore trimmer per esporre il cuoio capelluto. Iniettare 0,3 mL di lidocaina con un 25 5/8 in ago nel periostio per evitare un eccessivo sanguinamento o dolore. Applicare unguento oculare agli occhi del mouse per impedire loro di seccarsi durante l'esperimento.
- Stringere e sollevare il centro del cuoio capelluto del mouse per valutare se i suoi riflessi sono andati. Successivamente, eseguire un orizzontale tagliare per esporre il bregma alla regione di lambda del cranio. Raschiare delicatamente l'intera area esposta del cranio con un tampone di cotone per creare una superficie asciutta.
- Eseguire una craniotomia di 4 mm di diametro a coordinate 2,0 mm lateromedial e-2,00 mm rostrocaudal per esporre la corteccia somatosensoriale. Segnare la posizione con un cerchio (4 mm di diametro) utilizzando un pennarello indelebile. Trapano intorno al cerchio con un martello pneumatico dentale fino a quando lo strato restante dell'osso craniotomia facilmente cede quando spinto verso il basso. Applicare la soluzione salina sullo strato di osso prima di rimuovere il craniotomy con il forcipe di scheggia. Successivamente, applicare la soluzione salina calda nella regione esposta.
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Metodi di registrazione e induzione chimica dei sequestri
- Tirare gli elettrodi di vetro con un'impedenza di 1-3 MΩ da un tubo di vetro borosilicato (con un diametro esterno di 1.5 mm) utilizzando un estrattore. Recupero informazioni gli elettrodi di vetro con ~ 10 µ l di ACSF o soluzione fisiologica utilizzando un Hamilton siringa. Immediatamente scartare l'elettrodo se la punta è danneggiata.
Nota: Bleach il filo d'argento (5 min) e consentire solo una minima parte (cioè, la punta) del filo in argento per essere sommerso gli elettrodi di vetro retro-riempito di ACSF per ridurre al minimo il rumore e la deriva durante le registrazioni. Rimuovere qualsiasi eccesso ACSF dall'elettrodo di vetro con una siringa Hamilton se necessario. - Utilizzare un manipolatore manuale per guidare l'elettrodo di vetro in superficiale corticale strato (2/3) nell'area somatosensoriale-motor. Record/vista l'attività elettrica della fetta del cervello in un computer con software standard.
Nota: Layer 2/3 è di circa 0,3 mm di profondità dalla superficie32. - Applicare topicamente ~0.5 salino di 4-AP mM 1,5 mL sulla corteccia esposta del mouse con una siringa fino a coprire completamente il craniotomy. Sciogliere 14 mg di 4-AP in 100 mL di soluzione fisiologica per rendere una soluzione stock di salino 4-AP 1,5 mM.
Nota: Preparare la soluzione salina 4-AP prima dell'inizio dell'esperimento. In media, eventi ictal appaiono 15-30 min dopo l'applicazione topica.
- Tirare gli elettrodi di vetro con un'impedenza di 1-3 MΩ da un tubo di vetro borosilicato (con un diametro esterno di 1.5 mm) utilizzando un estrattore. Recupero informazioni gli elettrodi di vetro con ~ 10 µ l di ACSF o soluzione fisiologica utilizzando un Hamilton siringa. Immediatamente scartare l'elettrodo se la punta è danneggiata.
-
Su richiesta generazione di sequestri in optogenetica topi
- Applicare un impulso breve (30 ms) di blu (470 nm) luce (con un'intensità di uscita minimo 10 mW/mm2 ) per avviare un evento ictal. Utilizzare un manipolatore manuale per posizionare una fibra ottica di 1.000 µm core diametro (0,39 NA) direttamente sopra l'area di registrazione.
Nota: Impostare la velocità della foto-stimolazione per abbinare la velocità desiderata dell'occorrenza dell'evento ictal (cioè, 1 impulso ogni 300 s). Tuttavia, il tasso non può essere eccessivamente esagerato dal tasso intrinseco in cui si verificano eventi ictal.
- Applicare un impulso breve (30 ms) di blu (470 nm) luce (con un'intensità di uscita minimo 10 mW/mm2 ) per avviare un evento ictal. Utilizzare un manipolatore manuale per posizionare una fibra ottica di 1.000 µm core diametro (0,39 NA) direttamente sopra l'area di registrazione.
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Representative Results
L'applicazione di 100 µM 4-AP a fette del cervello corticale µm e medie di 450 (intatto) buona qualità da un giovanile VGAT-ChR2 mouse affidabile indotto ictal eventi ricorrenti (> 5 s) entro 15 min (Figura 1Ai). L'applicazione di 100 µM 4-AP a fette di scarsa qualità è provocato da eventi di rottura o chiodare l'attività (Figura 1Aii). In media, il 40% delle fette da ogni cervello di topo dissecata generato correttamente eventi ictal. Inoltre, 83% (25/30) dei topi dissecati provocato dalla fetta di almeno un cervello che ha generato con successo eventi ictal. Nelle fette del cervello con spontaneamente che si verificano eventi ictal, l'applicazione di un impulso di luce breve 30 ms sulla fetta di cervello scatta in modo affidabile un evento ictal che era identico nella morfologia (Figura 1Aiii e 1Aiv). Gli stessi risultati sono state fatte nelle fette del cervello dai topi Thy1-ChR2 (Figura 1B). Quindi, indipendentemente dal fatto che un neurone-sottopopolazione è stato attivato, ogni breve sincronizzazione evento nell'isolato rete neurale corticale ha condotto all'insorgenza di un evento ictal. Questi eventi ictal erano costituiti da una sentinella spike (preictal) (Figura 2Aii e 2Bii), tonico-attivazione (Figura 2Aiii e 2Biii), cloniche-come cottura (Figura 2Aiv e 2Biv) e prorompente attività verso la fine (Figura 2Av e 2Bv); erano simili in natura per le firme elettrografiche associate grippaggi clinici33. Inoltre, questi topi giovani erano fisiologicamente adulto-come come l'aggiunta di 10 µM bumetanide (BUM), un bloccante NKCC1, non ha avuto effetto sugli eventi ictal risultanti (Figura 2).
Il modello di 4-AP corticale fetta in vitro attendibilmente generato eventi ictal coerenti per ~ 1 h (Figura 1Ai), mentre il modello Zero-Mg2 + generato in genere eventi ictal per ~ 10 min prima di trasformarsi rapidamente in burst-come attività ( Figura 3A). Tuttavia, se un metodo non-4-AP di induzione di grippaggio è richiesto, il modello Zero-Mg2 + può essere modificato con l'aggiunta di 5-10 µM baclofen (un agonista di recettori GABAB ) per trasformare l'attività scoppio eventi ictal (Figura 3B) . In generale, metodi di non-disinibizione per aumentare eccitabilità (cioè, 4-AP o Zero-Mg2 + ACSF) in modo affidabile riprodotto eventi ictal nelle fette corticali del cervello. Al contrario, metodi di disinibizione [cioè, bicucullina (BMI), un antagonista del recettore GABAA ] provocato chiodare l'attività ricordano interictal attività o di scoppio di attività, piuttosto che eventi ictal (Figura 4A). Allo stesso modo, i modelli di sequestro acuta preparati da fette hippocampal 4-AP-trattata µM 100 generati interictal-spiking attività o status epilepticus di condizione-come condizioni come nella CA3 (Figura 4B). Il modello corticale in vivo 4-AP corrispondentemente generato eventi ictal ricorrenti (> 5 s). Eventi ictal sono stati osservati in superficiale strato (2/3) all'interno di ~ 30 min dell'applicazione topica di 1.5 mM 4-AP sulla corteccia esposta di topi adulti VGAT-ChR2. L'applicazione di un impulso di luce breve 30 ms sulla corteccia esposta in modo affidabile innescato eventi ictal che erano morfologicamente simili a quelli spontaneamente d'avvenimento (Figura 5).
L'applicazione di Zero-Mg2 + umano ACSF con 100 µM 4-AP a fettine di cervello corticale 'non-epilettici' (450 µm) dai pazienti di epilessia del lobo temporale in modo affidabile generati eventi ictal ricorrenti (> 5 s) all'interno di ~ 30 min (Figura 6Ai e 6Bi). Fette di scarsa qualità genera attività chiodando oppure nessuna attività (Figura 1Aii). La redditività delle fette del cervello è stata ritenuta «buona qualità» quando un breve stimolo elettrico (100 µs, 30-300 µA) ha indotto una risposta robusta, evocata in LFP all'inizio dell'esperimento. Una volta che eventi ictal ha cominciato a precipitare, l'applicazione di un breve soffio (75 ms a 20 psi) di 100 mM GABA sulla fetta cervello attivato in modo affidabile gli eventi ictal che erano identici nella morfologia a quelli che accadono spontaneamente (Figura 6Aii e 6Aiii) . Una minore concentrazione di GABA, 100-200 µM, probabilmente sarà efficace anche per in vitro esperimenti34; Tuttavia, una maggiore concentrazione di GABA, 100 mM, è consigliata per in vivo esperimenti35. Le stesse osservazioni sono state riprodotte quando un breve soffio di 200 µM glutammato è stato applicato a fette del cervello umano (Figura 6Bii e 6Biii). Così, indipendentemente da quali recettori post-sinaptici sono stati attivati, un breve evento sincronizzazione della rete neurale corticale umano isolato scatta in modo affidabile un evento ictal.
Figura 1: Acuta in vitro modello di grippaggio corticale 4-AP. Le linee nere rappresentano local field potential (LFP) registrazione; le linee blue rappresentano lo stimolo luminoso. (A) questi pannelli si basano sui risultati di un modello di topo VGAT-ChR2. Esse illustrano gli eventi ictal osservati nella registrazione LFP dello strato superficiale (2/3) di una fetta di cervello corticale alta qualità trattati con 100 µM 4-AP. io) questo pannello mostra una panoramica della registrazione LFP. ii) questi sono esempi di LFP registrazione da fettine di cervello di scarsa qualità. La barra della scala verticale è 0,4 mV, la barra della scala orizzontale è 20 s. iii) si tratta di una visualizzazione ingrandita di un evento ictal luce-attivato. iv) si tratta di una visualizzazione ingrandita di un evento ictal spontaneo. (B) questi pannello si basata sui risultati di un modello murino di Thy1-ChR2. Esse illustrano gli eventi ictal osservati nella registrazione LFP dello strato superficiale (2/3) di una fetta di cervello corticale trattati con 100 µM 4-AP. io) questo pannello mostra una panoramica della registrazione LFP. ii) si tratta di una visualizzazione ingrandita di un evento ictal luce-attivato. iii) si tratta di una visualizzazione ingrandita di un evento ictal spontaneo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: eventi Ictal generata in una fetta di cervello (layer 2/3) da una giovanile (p13) VGAT-ChR2 mouse irrorato con AP-4 e bumetanide (BUM). Le linee nere rappresentano local field potential (LFP) registrazione; le linee blue rappresentano lo stimolo luminoso. (A) questi pannelli mostrano una spontanea evento ictal. io) questo pannello mostra una panoramica dell'intero evento ictal. Visualizza i seguenti pannelli ii) una sentinella spike, iii) attivazione tonica, iv) attivazione cloniche e v) attività di scoppio. (B) questi pannelli mostrano un evento ictal luce-attivato. io) questo pannello mostra una panoramica dell'intero evento ictal. Visualizza i seguenti pannelli ii) un picco di sentinella di luce-innescato dalla sezione stessa registrazione, iii) attivazione tonica, iv) attivazione cloniche e v) attività di scoppio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Acuta in vitro Zero-Mg2 + corticale sequestro modello. Le linee nere rappresentano local field potential (LFP) registrazione; le linee blue rappresentano lo stimolo luminoso. (A) Questi pannelli si basano sui risultati di un modello di topo VGAT-ChR2. io) questo pannello illustra le condizioni di stato epilettico-come osservate nella registrazione LFP dello strato superficiale (2/3) di una fetta di cervello corticale trattati con Zero-Mg2 + ACSF. ii) si tratta di una visualizzazione ingrandita di un evento ictal luce-attivato. iii) si tratta di una visualizzazione ingrandita dell'attività di scoppio del epilepticus di condizione-come lo stato. (B) questi pannelli mostrano la stessa fetta di registrazione con l'aggiunta di baclofen. io) l'applicazione di 5 µM baclofen la Zero-Mg2 + ACSF trasforma l'attività scoppio indietro in distinti, ricorrenti eventi ictal. ii) si tratta di una visualizzazione ingrandita dell'attività allo scoppio. iii) si tratta di una visualizzazione ingrandita dell'evento ictal distinto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Acuta in vitro scoppio/chiodare modelli. Le linee nere rappresentano local field potential (LFP) registrazione; le linee blue rappresentano lo stimolo luminoso. (A) questi pannelli Visualizza i risultati da una porzione corticale da un VGAT-ChR2mouse, che illustra l'attività di rottura osservata in superficiale strato (2/3) dopo l'aggiunta di 10 µM BMI a 100 µM 4AP. io) Questa è una panoramica della registrazione LFP. La linea rossa tratteggiata indica quando il BMI è entrata in vigore. ii) si tratta di una visualizzazione ingrandita di un evento ictal luce-attivato. iii) si tratta di una visualizzazione ingrandita dell'azione rottura spontanea. (B) questi pannelli Visualizza i risultati da una fetta hippocampal da un mouse VGAT-ChR2, illustrando un evento di stato epilettico-come osservato nella zona CA3 dopo l'applicazione di 100 µM 4AP. i) Questa è una panoramica della registrazione LFP. ii) si tratta di una visualizzazione ingrandita di un evento ictal. iii) si tratta di una visualizzazione ingrandita di luce-triggered ed eventi di rottura spontanea. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Acuta in vivo modello di grippaggio corticale 4-AP. Le linee nere rappresentano local field potential (LFP) registrazione; le linee blue rappresentano lo stimolo luminoso. (A) questi pannelli mostrano i risultati di un adulto (p56) VGAT-ChR2 modello del topo con 1.5 mM 4-AP applicato localmente alla corteccia esposta. io) questo pannello illustra un evento ictal ha attivato luce osservato nello strato superficiale (2/3) dell'area somatosensoriale-motor. ii) si tratta di una visualizzazione ingrandita dell'evento ictal luce-attivato dal pannello di Ai. iii) questo è una super zoom-in vista dell'inizio dell'evento ictal luce-attivato (indicato dalla freccia nera). Questa figura è la versione non filtrata di una figura da Chang et al. 16. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Acuta in vitro modello umano sequestro corticale. Le linee nere rappresentano local field potential (LFP) registrazione; le linee marrone rappresentano il soffio di picospritzer. (A) questi pannelli mostrano i risultati di una fetta di corticali del cervello da un paziente di epilessia (MTLE) del lobo temporale mediale, che illustra gli eventi ictal osservati in superficiale strato (2/3) seguendo un'aspersione con 100 µM 4-AP e Zero-Mg2 + ACSF umano . io) Questa è una panoramica della registrazione LFP. I pannelli seguenti Visualizza ii) una visualizzazione ingrandita di un evento ictal di 100mm GABA puff-innescato e iii) una visualizzazione ingrandita di un evento ictal spontaneo. (B) questi pannelli mostrano i risultati di una fetta di cervello corticale da un altro paziente MTLE, che illustra gli eventi ictal osservati in superficiale strato (2/3) seguendo un'aspersione con 100 µM 4-AP e Zero-Mg2 + ACSF umano. io) Questa è una panoramica della registrazione LFP. I pannelli seguenti Visualizza ii) una visualizzazione ingrandita di un 200 µM glutammato puff-innescato ictal evento e iii) una visualizzazione ingrandita di un evento ictal spontaneo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: ricetta per dissezione soluzione. Queste sono le istruzioni per fare volumi 1 L o 2 L. MW = peso molecolare del soluto.
| # | Reagente | Conc. [mM] | MW (g/mol) | 1L (g) | 2L (g) |
| 1 | Saccarosio | 248 | 342,3 | 84.89 | 169.78 |
| 2 | Sodio bicarbonato (NaHCO2) | 26 | 84.01 | 2.18 | 4,37 |
| 3 | Destrosio (D-glucosio) | 10 | 180,16 | 1.8 | 3.6 |
| 4 | Potassio cloruro (KCl) | 2 | 74.55 | 0.15 | 0.3 |
| 5 | Solfato di magnesio (MgSO4·7H2O) | 3 | 246,47 | 0,74 | 1,48 |
| 6 | Sodio fosfato monobasico monoidrato (H2NaPO4· H2O) | 1.25 | 137.99 | 0,17 | 0,34 |
| 7 | Cloruro di calcio (CaCl2·2H2O) | 1 | 147.01 | 0.15 | 0,29 |
Tabella 2: ricetta per il liquido spinale cerebrale artificiale del roditore (ACSF). Queste sono le istruzioni per fare 2 L o L 4 volumi. MW = peso molecolare del soluto.
| # | Reagente | Conc. [mM] | MW (g/mol) | 2L (g) | 4L (g) |
| 1 | Cloruro di sodio (NaCl) | 123 | 58,4 | 14,37 | 28,73 |
| 2 | Sodio bicarbonato (NaHCO2) | 26 | 84.01 | 4,37 | 8.74 |
| 3 | Destrosio (D-glucosio) | 10 | 180,16 | 3.6 | 7.21 |
| 4 | Potassio cloruro (KCl) | 4 | 74.55 | 0.6 | 1.19 |
| 5 | Solfato di magnesio (MgSO4· H2O) | 1.3 | 246,47 | 0,64 | 1.28 |
| 6 | Sodio fosfato monobasico monoidrato (HNaPO4· H2O) | 1.2 | 137.99 | 0,33 | 0,66 |
| 7 | Cloruro di calcio (CaCl2·2H2O) | 1.5 | 147.01 | 0,44 | 0.88 |
Tabella 3: ricetta per umano artificiale cerebrale spinale fluido (umano ACSF). Queste sono le istruzioni per fare 2 L o L 4 volumi. MW = peso molecolare del soluto.
| # | Reagente | Conc. [mM] | MW (g/mol) | 2L (g) | 4L (g) |
| 1 | Cloruro di sodio (NaCl) | 123 | 58,4 | 14,38 | 28,75 |
| 2 | Sodio bicarbonato (NaHCO2) | 25,2 | 84.01 | 4,23 | 8,46 |
| 3 | Destrosio (D-glucosio) | 10 | 180,16 | 3.6 | 7.21 |
| 4 | Potassio cloruro (KCl) | 4 | 74.55 | 0.6 | 1.19 |
| 5 | Solfato di magnesio (MgSO4· H2O) | 1 | 246,47 | 0,49 | 0.99 |
| 6 | Sodio fosfato monobasico monoidrato (HNaPO4· H2O) | 1.2 | 137.99 | 0,33 | 0,66 |
| 7 | Cloruro di calcio (CaCl2·2H2O) | 1 | 147.01 | 0,29 | 0,59 |
Tabella 4: ricetta per Zero-Mg 2 + liquido spinale cerebrale artificiale del roditore (Zero-Mg2 + ACSF). Queste sono le istruzioni per fare 2 L o L 4 volumi. MW = peso molecolare del soluto.
| # | Reagente | Conc. [mM] | MW (g/mol) | 2L (g) | 4L (g) |
| 1 | Cloruro di sodio (NaCl) | 123 | 58,4 | 14,37 | 28,73 |
| 2 | Sodio bicarbonato (NaHCO2) | 26 | 84.01 | 4,37 | 8.74 |
| 3 | Destrosio (D-glucosio) | 10 | 180,16 | 3.6 | 7.21 |
| 4 | Potassio cloruro (KCl) | 4 | 74.55 | 0.6 | 1.19 |
| 5 | Solfato di magnesio (MgSO4· H2O) | Dimensioni nominali gratis | 246,47 | 0 | 0 |
| 6 | Sodio fosfato monobasico monoidrato (HNaPO4· H2O) | 1.2 | 137.99 | 0,33 | 0,66 |
| 7 | Cloruro di calcio (CaCl2·2H2O) | 1.5 | 147.01 | 0,29 | 0,59 |
Tabella 5: ricetta per Zero-Mg 2 + umano artificiale liquido spinale cerebrale (Zero-Mg2 + umano ACSF). Queste sono le istruzioni per fare 2 L o L 4 volumi; MW = peso molecolare del soluto.
| # | Reagente | Conc. [mM] | MW (g/mol) | 2L (g) | 4L (g) |
| 1 | Cloruro di sodio (NaCl) | 123 | 58,4 | 14,38 | 28,75 |
| 2 | Sodio bicarbonato (NaHCO2) | 25,2 | 84.01 | 4,23 | 8,46 |
| 3 | Destrosio (D-glucosio) | 10 | 180,16 | 3.6 | 7.21 |
| 4 | Potassio cloruro (KCl) | 4 | 74.55 | 0.6 | 1.19 |
| 5 | Solfato di magnesio (MgSO4· H2O) | Dimensioni nominali gratis | 246,47 | 0 | 0 |
| 6 | Sodio fosfato monobasico monoidrato (HNaPO4· H2O) | 1.2 | 137.99 | 0,33 | 0,66 |
| 7 | Cloruro di calcio (CaCl2·2H2O) | 1 | 147.01 | 0,29 | 0,59 |
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Discussion
Le fette di cervello sono trattate con un farmaco proconvulsivante o un'alterata perfusato ACSF aumentare eccitabilità della rete neurale e promuovere una precipitazione degli eventi ictal (elettrografici grippaggio-come eventi). Per i topi, le fette della corona preferite dell'area somatosensoriale-motore dovrebbero contenere la corteccia del cingulate, zona 2 (CG), ma non l'area di retrosplenial (RS); Questi marcatori anatomici consentono di identificare la gamma delle fette della corona che sono i migliori per l'induzione di eventi ictal. Una modifica opzionale per il tessuto di topi è di tagliare i due emisferi della fetta del cervello a metà per coppia disegni sperimentali, come i due emisferi sono praticamente identici (unità sperimentali simili). Quando preparare fette di cervello per generare eventi ictal, è indispensabile per mantenere l'integrità della rete neurale e le sue connessioni sinaptiche, poiché gli eventi ictal sono un fenomeno di rete neurale. Tre punti nel passaggio 1 del protocollo che sono critici per la qualità di fetta sono 1) la procedura per affettare, 2) incubazione e 3) ossigenazione. In primo luogo, la procedura di taglio richiede un equilibrio tra velocità e tecnica. È fondamentale per ridurre al minimo il tempo tra la decapitazione (o la resezione chirurgica) e l'incubazione, mentre anche essere attenti con ogni contatto e movimento della fetta del cervello per evitare danni. In secondo luogo, la qualità del tessuto è molto sensibile alla temperatura di incubazione e alla durata. È importante utilizzare un timer e termometro per garantire l'incubazione è a 35 ° C per 30 min. in terzo luogo, che la vitalità del tessuto cerebrale è sensibile all'esposizione a qualcosa di diverso da ossigenato liquido spinale cerebrale (artificiale). La fetta di cervello scadrà se esso non è perfuse con carbogenated ACSF per un periodo prolungato (~ 1 min).
Fette del cervello dai topi invecchiati p13 - p16 offrono la più alta probabilità di generare con successo eventi ictal. Il motivo è che la p16 ≤ topi non richiedono un'aspersione di perfusione prima le dissezioni. Questo efficacemente riduce la probabilità di errori e accelera il processo di dissezione, che è un enorme vantaggio, perché la quantità di tempo tra la decapitazione e l'incubazione è inversamente correlata con vitalità della fetta cervello. Nel frattempo, topi > p13 hanno ridotto la quantità di NKCC1 che sono paragonabili a un adulto36. In generale, juvenile (< p21) il tessuto è più fattibile rispetto a tessuto adulto a causa di un'eccezionale capacità di recuperare dalla procedura per affettare dannosa. Questa finestra di settimana tra p13 e p21 offre la possibilità di sfruttare i topi adulto-come fisiologia e giovanile-come capacità di generare facilmente eventi ictal37,38. Tuttavia, se gli esperimenti richiedono studiare eventi ictal nelle fette del cervello di topi adulti, un ACSF basati su NMDG con HEPES, tiourea e ascorbato contribuirà a promuovere la vitalità del tessuto adulto24,39,40, 41. per tessuto umano, l'aggiunta di antiossidanti, come α-tocoferolo, alla soluzione di dissezione può beneficiare vitalità del tessuto, soprattutto durante il trasporto a lunga distanza (> 30 min) tra la sala operatoria e il laboratorio per affettare8,26. Per tutte le fette del cervello, sono le condizioni favorevoli per generare eventi ictal per registrare da 450 µm spessore fette a 36 ° C. Fette del cervello devono essere almeno 350 µm spessore per contenere abbastanza neuroni della rete neurale per generare l'evento ictal strutturato. Tuttavia, le fette non possono essere più spesse di 500 µm, come che renderà difficile per ossigeno diffondere nel centro del tessuto. Le sezioni sono 450 µm rappresentano uno spessore Ottimo, dove una grande quantità di connettività di rete di un neurone è mantenuta senza ostacolare la perfusione di ossigeno in tutto il tessuto. Infine, la precipitazione degli eventi ictal è ottima a 33-36 ° C; Se la camera di registrazione non è almeno a 33 ° C, sarà difficile per il verificarsi degli eventi ictal.
Una limitazione del modello acuto sequestro è che non generano i grippaggi. Generano solo eventi ictal, che sono la firma elettrografica di un sequestro. Eventi ictal non hanno nessun componenti comportamentali associati, quali la perdita di coscienza o convulsioni motore che definiscono un sequestro. Di conseguenza, modelli di sequestro acuta non possono essere utilizzati per confermare l'efficacia di potenziali candidati di farmaci anti-sequestro o approfondire epilettogenesi; tali domande di ricerca devono essere indirizzate da modelli di epilessia cronica e studi clinici. Modelli di sequestro acuta dovrebbero essere utilizzati solo per lo scopo previsto dello svolgimento degli studi preliminari fondamentali sui meccanismi di sequestro. Solo i risultati più promettenti da modelli di sequestro acuta dovrebbero essere avanzati a modelli superiori che sono più costosi, laborioso da preparare e richiedono molto più complesse considerazioni etiche.
Per fare progressi nella ricerca di epilessia e convulsioni, è indispensabile avere un modello affidabile sequestro acuta che può riprodurre accuratamente l'attività di crisi elettrografica osservata clinicamente in EEG di pazienti di sequestro. Per riprodurre in modo affidabile gli eventi ictal nelle fette del cervello, non-disinibizione metodi per aumentare eccitabilità sono necessari, considerando che i metodi della disinibizione (cioè, l'antagonista del ricevitore di GABAA BMI) in genere provocare chiodare l'attività ricorda l'attività interictal, piuttosto che eventi ictal (Figura 3A). Il metodo preferito di disinibizione non è quello di applicare l'agente proconvulsivante 4-AP, perché in modo affidabile può generare eventi ictal coerenti per 1 h. Al contrario, il modello corticale Zero-Mg2 + genera eventi ictal solo ~ 10 min prima di trasformarsi rapidamente in burst-come attività (Figura 2A). Se si utilizza il modello Zero-Mg2 + , l'aggiunta di 5-10 µM baclofen, un agonista del recettore GABAB , contribuirà a trasformare l'attività scoppio eventi ictal (Figura 2B), come illustrato in precedenza in fette hippocampal42. Inoltre, il modello di grippaggio 4-AP in vitro è comodo, perché risultati da tale modello possono essere replicati nelle relative controparti in vivo , in vivo modello 4-AP sequestro corticale (Figura 4). Non è possibile modificare l'intero liquido spinale cerebrale di un topo adulto live per ricreare l'ambiente acuta in vivo Zero-Mg2 + .
L'applicazione di 4-AP nelle fette del cervello corticale può riprodurre accuratamente l'attività di sequestro osservata clinicamente15,33. Al contrario, 4-AP-trattata fette hippocampal sono predisposti a generare interictal-come chiodando attività43 e stato di male epilettico-come condizioni (Figura 3B). Pertanto, ai fini di studiare i grippaggi, il modello corticale acuta in vitro 4-AP è preferito rispetto al modello hippocampal in vitro 4-AP. Inoltre, non ci sono praticamente nessuna opportunità per registrare da fette hippocampal umane praticabile, non appena hanno resezioni più hippocampal CA1 e CA3 danneggiato21. Al contrario, non-patologico umano tessuto corticale è più facilmente accessibile come quello è il risultato secondario di subcortical procedure neurochirurgiche come chirurgia di epilessia del lobo temporale. Tessuto neocortical non-epilettici 'control' può essere acquisito anche da interventi chirurgici di resezione del tumore. Per questi motivi, la corteccia è il sito consigliato per la modellazione di crisi a causa della sua trasportabilità tra mouse e tessuti umani per confermare la rilevanza clinica. Infine, il ceppo di topi C57BL/6 è preferito perché esprimono prontamente transgeni e optogenetica varianti sono disponibili in commercio. Optogenetica topi modelli consentono l'avvio su richiesta di eventi ictal tramite una mini-invasiva, breve stimolazione luminosa. Questo rende lo studio dei grippaggi incredibilmente efficiente, eliminando i tempi di attesa e consentendo l'attivazione mirata delle sottopopolazioni neuronali. Inoltre, la capacità di innescare i grippaggi on demand consente di nuovi modi per definitivamente delimitano il punto esatto dell'inizio di grippaggio e potenzialmente studiare l'efficacia di candidati farmaci anti-sequestro. Un programma facile da usare basato su MATLAB è stato specificamente sviluppato per rilevare e classificare i vari tipi di epileptiform eventi che si verificano nei modelli in vitro e in vivo sequestro di 4-AP. Questo programma di rilevamento è disponibile per il download dal repository su GitHub del laboratorio Valiante (https://github.com/Valiantelab/ChangValiante2018).
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da istituti canadesi di ricerca sanitaria (MOP 119603 a Peter L. Carlen e Taufik A. Valiante), l'Istituto del cervello di Ontario (a Taufik A. Valiante) e il Mightex Student Research Grant (contro Michael Chang). Vorremmo ringraziare Liam Long per la sua assistenza nella contaminazione il manoscritto dei video. Vorremmo riconoscere Paria Baharikhoob, Abeeshan Selvabaskaran e Shadini Dematagoda per la loro assistenza nella compilazione le figure e le tabelle in questo manoscritto. Figure 1A, 3A, 4Ae 6A sono tutte le figure originali realizzate dai dati pubblicati in Chang et al. 16.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium pentobarbital | N/A | N/A | Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers |
| 1 mm syringe | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| 25G 5/8” sterile needle | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Single edge razor blade (2x) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
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| Sodium Chloride (NaCl) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Sodium Bicarbonate | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Dextrose | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Potassium Chloride (KCl) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Magnesium Sulfate (MgSO4 H2O) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (HNaPO4·H2O) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Calcium Chloride (CaCl2·2H2O) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Sucrose | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
References
- Jefferys, J. G. R. Advances in understanding basic mechanisms of epilepsy and seizures. Seizure. 19 (10), 638-646 (2010).
- Fujiwara, H., et al. Resection of ictal high-frequency oscillations leads to favorable surgical outcome in pediatric epilepsy. Epilepsia. 53 (9), 1607-1617 (2012).
- Chen, H. Y., Albertson, T. E., Olson, K. R. Treatment of drug-induced seizures. British Journal of Clinical Pharmacology. 81 (3), 412-419 (2015).
- Kwan, P., Brodie, M. J. Early Identification of Refractory Epilepsy. New England Journal of Medicine. 342 (5), 314-319 (2000).
- Giussani, G., et al. A population-based study of active and drug-resistant epilepsies in Northern Italy. Epilepsy & Behavior. 55, 30-37 (2016).
- Pellock, J. M. Overview: definitions and classifications of seizure emergencies. Journal of Child Neurology. 22 (5_suppl), 9S-13S (2007).
- Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
- Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2016).
- Castel-Branco, M., Alves, G., Figueiredo, I., Falcão, A., Caramona, M. The maximal electroshock seizure (MES) model in the preclinical assessment of potential new antiepileptic drugs. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 31 (2), 101-106 (2009).
- Wendling, F., Bartolomei, F., Modolo, J. Neocortical/Thalamic In Silico Models of Seizures and Epilepsy. Models of Seizures and Epilepsy. Pitkänen, A., Buckmaster, P., Galanopoulou, A. S., Moshé, S. , Academic Press. London, San Diego (CA), Cambridge (MA), Oxford. 233-246 (2017).
- Cocchi, L., Gollo, L. L., Zalesky, A., Breakspear, M. Criticality in the brain: A synthesis of neurobiology, models and cognition. Progress in Neurobiology. 158, 132-152 (2017).
- Xue, M., Atallah, B. V., Scanziani, M. Equalizing excitation-inhibition ratios across visual cortical neurons. Nature. 511 (7511), 596-600 (2014).
- Engel, J. Seizures and epilepsy. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2013).
- Panuccio, G., Curia, G., Colosimo, A., Cruccu, G., Avoli, M. Epileptiform synchronization in the cingulate cortex. Epilepsia. 50 (3), 521-536 (2009).
- Avoli, M., de Curtis, M. GABAergic synchronization in the limbic system and its role in the generation of epileptiform activity. Progress in Neurobiology. 95 (2), 104-132 (2011).
- Chang, M., et al. Brief activation of GABAergic interneurons initiates the transition to ictal events through post-inhibitory rebound excitation. Neurobiology of Disease. 109, 102-116 (2018).
- Jiruska, P., et al. High-frequency network activity, global increase in neuronal activity, and synchrony expansion precede epileptic seizures in vitro. The Journal of Neuroscience. 30 (16), 5690-5701 (2010).
- Jirsa, V. K., Stacey, W. C., Quilichini, P. P., Ivanov, A. I., Bernard, C. On the nature of seizure dynamics. Brain. 137 (Pt 8), 2210-2230 (2014).
- Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Ion Channels: Methods and Protocols. 337, 117-125 (2006).
- Li, H., Prince, D. A. Synaptic activity in chronically injured, epileptogenic sensory-motor neocortex. Journal of Neurophysiology. 88 (1), 2-12 (2002).
- Köhling, R., Avoli, M. Methodological approaches to exploring epileptic disorders in the human brain in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 1-19 (2006).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), e680 (2008).
- Ritter, L. M., et al. WONOEP appraisal: optogenetic tools to suppress seizures and explore the mechanisms of epileptogenesis. Epilepsia. 55 (11), 1693-1702 (2014).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
- Arenkiel, B. R., et al. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).
- Heinemann, U., et al. Brain slices from human resected tissue. Models of Seizures and Epilepsy. Pitkänen, A., Buckmaster, P., Galanopoulou, A. S., Moshé, S. , Academic Press. London, San Diego (CA), Cambridge (MA), Oxford. 285-299 (2017).
- Florez, C., et al. In vitro recordings of human neocortical oscillations. Cerebral Cortex. 25 (3), 578-597 (2015).
- Lein, P. J., Barnhart, C. D., Pessah, I. N. Acute hippocampal slice preparation and hippocampal slice cultures. Methods in Molecular Biology. , 115-134 (2011).
- Haas, H. L., Schaerer, B., Vosmansky, M. A simple perfusion chamber for the study of nervous tissue slices in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 1 (4), 323-325 (1979).
- Poulton, T. J., Ellingson, R. J. Seizure associated with induction of anesthesia with isoflurane. Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 61 (4), 471-476 (1984).
- Borris, D. J., Bertram, E. H., Kapur, J. Ketamine controls prolonged status epilepticus. Epilepsy Research. 42 (2-3), 117-122 (2000).
- DeFelipe, J., Alonso-Nanclares, L., Arellano, J. I. Microstructure of the neocortex: comparative aspects. Journal of Neurocytology. 31 (3-5), 299-316 (2002).
- Velasco, A. L., Wilson, C. L., Babb, T. L., Engel, J. Functional and anatomic correlates of two frequently observed temporal lobe seizure-onset patterns. Neural Plasticity. 7 (1-2), 49-63 (2000).
- Vlachos, A., Reddy-Alla, S., Papadopoulos, T., Deller, T., Betz, H. Homeostatic regulation of gephyrin scaffolds and synaptic strength at mature hippocampal GABAergic postsynapses. Cerebral Cortex. 23 (11), 2700-2711 (2012).
- Kirmse, K., et al. GABA depolarizes immature neurons and inhibits network activity in the neonatal neocortex in vivo. Nature Communications. 6, 7750 (2015).
- Stein, V., Hermans-Borgmeyer, I., Jentsch, T. J., Hübner, C. A. Expression of the KCl cotransporter KCC2 parallels neuronal maturation and the emergence of low intracellular chloride. Journal of Comparative Neurology. 468 (1), 57-64 (2004).
- Wong, B. Y., Prince, D. A. The lateral spread of ictal discharges in neocortical brain slices. Epilepsy Research. 7 (1), 29-39 (1990).
- Trevelyan, A. J., Sussillo, D., Watson, B. O., Yuste, R. Modular propagation of epileptiform activity: evidence for an inhibitory veto in neocortex. Journal of Neuroscience. 26 (48), 12447-12455 (2006).
- Brahma, B., Forman, R., Stewart, E., Nicholson, C., Rice, M. Ascorbate inhibits edema in brain slices. Journal of Neurochemistry. 74 (3), 1263-1270 (2000).
- MacGregor, D. G., Chesler, M., Rice, M. E. HEPES prevents edema in rat brain slices. Neuroscience Letters. 303 (3), 141-144 (2001).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: Application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Patch-clamp Methods and Protocols. Martina, M., Taverna, S. , Humana Press. New York, NY. 221-242 (2014).
- Swartzwelder, H. S., Lewis, D., Anderson, W., Wilson, W. Seizure-like events in brain slices: suppression by interictal activity. Brain Research. 410 (2), 362-366 (1987).
- Lees, G., Stöhr, T., Errington, A. C. Stereoselective effects of the novel anticonvulsant lacosamide against 4-AP induced epileptiform activity in rat visual cortex in vitro. Neuropharmacology. 50 (1), 98-110 (2006).
