Summary
Острый захват модели имеют важное значение для изучения механизмов лежащие в основе эпилептиформный события. Кроме того способность генерировать эпилептиформный события по запросу предоставляет весьма эффективный метод для изучения точную последовательность событий, лежащие в основе их начала. Здесь мы описываем модели корковых захват острый 4-aminopyridine, создан в ткани человека и мыши.
Abstract
Контроль изъятий остается сложной проблемой для медицинского сообщества. Чтобы добиться прогресса, исследователи нужен способ широко изучать динамику захват и расследовать его основополагающих механизмов. Острый захват модели удобны, предлагают возможность выполнять электрофизиологических записей и может генерировать большой объем электрографические захват как (во) событий. Многообещающие результаты от острой захват модели можно затем передовые модели хронической эпилепсии и клинических испытаний. Таким образом изучая изъятий в острый модели, которые точно повторяют электрографические и динамические подписи клинических конфискации будет необходимо для изготовления клинически значимых выводов. Изучение во события в моделях острый захват, приготовленный из тканей человека также имеет важное значение для создания результатов, которые клинически значимых. Основное внимание в настоящем документе уделяется корковых модель 4-AP благодаря своей универсальности в генерации противоречивых событий, как в естественных условиях , так и в пробирке исследования, а также в мышь и тканей человека. Методы в этом документе будет также описать альтернативный метод индукции захват с помощью нуль-мг2 + модели и предоставляют подробный обзор преимуществ и ограничений эпилептиформный как деятельности, созданных в различных острых захват модели. Кроме того воспользовавшись коммерчески доступных optogenetic мыши штаммов, Бриф (30 мс) светового импульса может использоваться для запуска противоречивых событий, идентичны тем, которые происходят спонтанно. Аналогичным образом 30-100 мс затяжек нейромедиаторов (гамма-амино-масляная кислота или глутамата) может применяться к человеческой ткани, чтобы спровоцировать приступ события, которые идентичны происходит спонтанно. Возможность вызвать приступ события по требованию в модели острого захват предлагает новообретенным способность соблюдать точную последовательность событий, которые лежат в основе динамики инициации захвата и эффективно оценить потенциальные Антиконфискации терапии.
Introduction
Острый захват модели можно успешно воспроизвести электрографические подписей напоминает противоречивых событий, наблюдаемые в электроэнцефалограммы (ЭЭГ) лиц, испытывающих захват. Исследователи используют эти приступ как события (далее именуемая «приступ события») как суррогаты для захвата событий1. Клинически приступ события служат в качестве надежного прокси для захвата событий после изъятия являются неврологическое расстройство, которое исходит от мозга. В группе контроля эпилепсии неврологи полагаться при обнаружении противоречивых событий для подтверждения эпилептогенных область мозга и изолировать его резекции2. В отделение интенсивной терапии врачи контролировать приступ активность оценить если любой захват активность сохраняется в седативных больных3. Управление изъятий остается сложным вопросом для медицинского сообщества, как 30% больных эпилепсией лекарственно доступных лекарств4,5, и 10% медицинских случаев, связанных с наркотиками индуцированной изъятий не реагируют на стандартное лечение3. Это представляет серьезную озабоченность для общества, как 3% ожидается разработка эпилепсией6и 10% американского населения разведано испытать один захват события в их жизни.
Изучая изъятий в хронической эпилепсии модели дорого, трудоемкий и часто принимают месяцев подготовить7. Это также трудно выполнить электрофизиологических записей в свободно перемещающихся животных. Клинические испытания на человеке сталкиваются с аналогичными вопросами, а также дополнительных сложностей, связанных с согласия пациента, изменчивость в участников стола и нравственные и этические соображения участвуют8. Острый захват модели, с другой стороны, являются благоприятными, потому что они являются относительно удобно готовить, экономически эффективным и способны генерировать большие объемы противоречивых событий для изучения9. Кроме того ткань фиксируется в устойчивом положении, поэтому условия являются идеальными для выполнения электрофизиологических записи, необходимые для изучения динамики захват и соответствующих базовых патофизиологии. Острый захват модели остаются благоприятное течение в silico (компьютер) модели, потому что они основаны на биологический материал, состоящий из мозга составляющих нейронной сети со всеми его присущи факторы и синаптическую подключения, которые не могут быть захвачены даже самые подробные компьютер моделирует10. Эти особенности делают острым захват модели poised для того чтобы быть эффективным на скрининг для потенциальных терапий Антиконфискации и сделать предварительные выводы до продвижения их для дальнейшего расследования в модели хронической эпилепсии и клинические испытания.
Как правило острый захват модели являются производными от нормальной ткани мозга, был подвергнут гипер возбудимых условий. Чтобы побудить клинически значимых приступ события в здоровых мозговой ткани, важно понимать, что мозг функционирует оптимально в критическом состоянии11 где возбуждения (E) и ингибирование (I) являются сбалансированным12. Срыв E-я баланса может привести к гипер возбудимых захват государства, в котором осадок во события. Соответственно, в рамках этой концептуальной основы, существуют две основные стратегии для создания противоречивых событий в срезах головного мозга (в пробирке) или в целом мозг (в естественных условиях) препараты: либо уменьшилась ингибирование («растормаживания») или увеличить возбуждение («не расторможенность»). Однако приступ события высоко приказал и синхронизировать события, которые требуют влияние ГАМК интернейронов оркестровать нейронной сети деятельность13,14. По этой причине не расторможенность модели являются наиболее эффективными для генерации противоречивых событий в изолированных нейронных сетей, таких, как в в vitro мозга ломтик15, тогда как в vitro расторможенность модели обычно приводят к пики активности напоминает межприступная как пики. Кроме того в рамках этой концептуальной основы, мгновенный синхронизации событий также надежно может вызвать приступ событий16. В самом деле приступ события могут быть вызваны любые незначительные возмущения, применяется к нервной системы17 , когда она находится в критическом состоянии перехода («раздвоения») точки18. Традиционно эти возмущения были вызваны электрической стимуляции. Однако, недавнее развитие Оптогенетика в неврологии, теперь предлагает стратегию более элегантный побудить критическое состояние переходов16.
Методы, описанные в этой статье демонстрируют, как генерировать приступ события по требованию в модели острого захват в пробирке (шаг 1 из протокола) и в vivo исследований (шаг 2 из протокола). Они включают в себя выбор области мозга, захват индукционного метода, тип исследования и видов; Однако основное внимание будет уделяться рекомендуется выбор модели острого 4-AP корковых захват из-за своей универсальности в самые разнообразные типы изучения. 4-AP захват острой в vitro модель основана на стандартный протокол подготовить срезы мозга высокого качества для электрофизиологических записей и томографии исследования19. Эти протоколы уже использовались сделать в vitro корональных мозга кусочка от соматосенсорные моторной коры мышей16,людей и20 21. Модификации для создания противоречивых событий в этих типах срезы мозга были ранее продемонстрировали16 и все детали описаны в протоколе ниже. 4-AP корковых захват острой в vivo модель основана на стандартный протокол подготовить краниотомии для изображений исследования22. Модификация является, что окно не (стеклянное скольжение) установлена после краниотомии. Вместо этого proconvulsant агентами (4-AP) местно применяются к воздействию коры побудить противоречивых событий, в то время как животное находится под общей анестезией. Насколько нам известно наша группа была первым, чтобы развивать этот острый в vivo корковых захват модели в мышей16,23. Острой в естественных условиях 4-AP корковых изъятия из взрослых мышей была разработана модель для дополнить модель в vitro фрагментов из несовершеннолетних ткани. Репликации выводов взрослых в vivo захват модели позволяет обобщить результаты срез модели, присущие озабоченностей относительно-физиологических условиях ломтиком 2D мозга (по сравнению с объемной целом мозг структура) и физиологические различия между несовершеннолетних и взрослых ткани.
Метод по требованию противоречивых событий посвящения подтверждается с помощью либо затяжек нейротрансмиттеров с picospritzer или optogenetic стратегии. В меру наших знаний наша группа является первым, чтобы инициировать приступ события в тканях человека с помощью нейротрансмиттеров через picospritzer16. Для optogenetic стратегии штамм мышей C57BL/6 является обычным штамм используется для выражения трансгенов. Выражение channelrhodopsin-2 (ChR2) в ГАМК интернейронов или пирамидальных клеток глутаматергические обеспечит Факультативный способность генерировать противоречивых событий по запросу с кратким световых импульсов. Подходит optogenetic мышей штаммов включают коммерчески доступных вариант C57BL/6, который выражает ChR2 в любом интернейронов, с помощью мыши везикулярного ГАМК транспортер активаторных (VGAT)24, или пирамидальных клеток, с помощью мыши вилочковой железы клетки антиген 1 Promotor (Thy1)25. Эти коммерчески доступных VGAT-ChR2 и Thy1-ChR2 мышей предлагают возможность активации ГАМК нейронов или глутаматергические нейронов, соответственно, в коры головного мозга с синим (470 Нм) свет. Способность генерировать противоречивых событий по требованию в модели острого захват может предложить новые возможности для изучения динамики инициации захвата и эффективно оценить потенциальные Антиконфискации терапии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все исследования, с участием пациентов была выполнена под протоколом, утвержденным Советом университета здравоохранения сети исследований этики, в соответствии с Хельсинкской декларации. Процедуры с участием животных были в соответствии с принципами, Канадского совета по лечению животных и утвержденных Комитетом Krembil исследовательский институт животное уход.
1. Протокол I: острые в vitro захват модель
- Подготовка решений диссекции и искусственных спинномозговой жидкости
- Carbogenate ультрачистая вода (вода фильтруется с удельным сопротивлением 18.2 MΩ·cm) с Карбоген (95% O2/5% CO2) за 5 минут с помощью воздуха камень пузыря диффузоры (аэраторы для аквариумов).
Примечание: Air камней может подключаться к Карбоген танк регулятор через Стандартный Силиконовая трубка. Если воздух камни не доступны, печать закрыть к концу трубки силиконовые и совать небольшие отверстия в уплотнении разрешить Карбоген газ в пузырь и carbogenate решения. - Приготовляют раствор рассечение, растворяя растворенных веществ из таблицы 1 в ультрачистая вода. CaCl2 добавьте в решение, которое было carbogenated по крайней мере 5 минут, чтобы помочь ей раствориться.
Примечание: Кроме того, добавьте CaCl2 первых, так что он может легко растворяются в ненасыщенных решения. Решение, в жидкой форме, должны быть 300-320 мОсм/Л и имеют рН 7,4 после насыщения с Карбоген.- Холод решение рассечение 0 - 4 ° C. Оставьте раствор в холодильнике на ночь или поместите решение в морозилке 1 h и постоянно контролировать температуру.
Примечание: Рассечение раствор может храниться до 3 ночи; После отмены. - Carbogenate вскрытие решение для 5-10 мин перед использованием.
Примечание: В идеале, решение либо должен отображаться как слякоть или переходит в слякоть до использования.
- Холод решение рассечение 0 - 4 ° C. Оставьте раствор в холодильнике на ночь или поместите решение в морозилке 1 h и постоянно контролировать температуру.
- Подготовьте грызунов искусственных спинномозговой жидкости (ФАГО), растворяя растворенных веществ из таблицы 2 (или 3 таблицы для человека фаго) в ультрачистая вода. Carbogenate фаго решение пока он находится в ванне с водой, нагретой до 35 ° C до использования. CaCl2 добавьте в решение, которое было carbogenated по крайней мере 5 минут, чтобы помочь ей раствориться.
Примечание: в качестве альтернативы, сначала добавьте CaCl2 так, что он может распустить легче в ненасыщенных решения. Решение, в жидкой форме, должны быть 290-320 мОсм/Л и имеют рН 7,4 после насыщения с Карбоген. Решения должны производиться в тома 1, 2 или 4 Л в зависимости от продолжительности экспериментов. Сделайте 4 L на полный день (8 h) экспериментов. ФАГО следует включить свежие каждый день; не хранить его для дольше чем 1 d.
- Carbogenate ультрачистая вода (вода фильтруется с удельным сопротивлением 18.2 MΩ·cm) с Карбоген (95% O2/5% CO2) за 5 минут с помощью воздуха камень пузыря диффузоры (аэраторы для аквариумов).
- Рассечение мышь для сбора ткани мозга
Примечание: Для человеческой ткани, переходите к следующему шагу (шаг 1.3) на делать срезы мозга с vibratome. Куб образные блоки (1 см3) мозговой ткани должны быть получены от нейрохирург, с помощью процедуры описано26,27.- Соберите все инструменты и материалы, необходимые для животных вскрытия. Настройка рабочей области для подготовки к анатомирование животных.
- Проверьте танк Карбоген (95 %O2/5%CO2), чтобы убедиться, что он не пуст. Замените газовый баллон перед эксперименты, если есть меньше, чем 500 psi остаточное давление.
- Калибровка vibratome (вибрирующих резки ткани лезвие) согласно инструкции производителя. Отрегулируйте vibratome, установка для резки амплитуда 1 мм и скорости резки 0.12 мм/сек.
Примечание: Оптимальные настройки могут отличаться для каждого индивидуального вибрирующий ткани лезвие резак; Однако в целом, амплитуда должен быть высоким и скорость резки должны быть низкими. - Заполните срез мозга инкубации палата (то есть, хранитель срез мозга) с фаго и пузырь с Карбоген. Затем поместите камеру инкубации в водяной бане на 35 ° C.
Примечание: Используйте грызунов фаго для грызунов мозга ломтиками и человека фаго фрагментов человеческого мозга.
- Получите мышь несовершеннолетних обоего пола, в возрасте 13 d (p13) до 21 d (p21, где Р0 — Дата рождения).
- Анестезировать мыши с внутрибрюшинного введения Пентобарбитал натрия (55 мг/кг веса тела). После того, как мышь глубоко под наркозом, как свидетельствует отсутствие мыс щепотку рефлекс, оперативно используйте инструмент ветеринар утвержденного гильотинные обезглавить мыши одним быстрым движением.
Примечание: Подготовьте инъекции Пентобарбитал натрия согласно процедурам, рекомендованным институциональных руководящих принципов. - Держите нос мыши стабилизировать обезглавленное голову и осторожно сделать срединной линии разреза, начиная между глазами мыши и по всей длине головы, чтобы разоблачить черепа. Убедитесь, что череп не сжимается, давление бритвы. Используйте углу лезвие бритвы для повышения точности резки.
- Раскрывайте закрылки мыши головы с помощью пальцев подвергать черепа. Затем используйте свежие угол лезвие бритвы для надрезают вдоль средней линии черепа; Обратите особое внимание, чтобы избежать каких-либо контактов с коры головного мозга.
- Вставить заноза щипцами в мыши глазницами стабилизировать обезглавленное головы и поместите его в чашку Петри, наполненный холодной (0 - 4 ° C) рассечение решения. Убедитесь, что глава полностью погружен в раствор рассечение.
- Использовать второй набор заноза щипцами осторожно удаляйте мыши волосистой части головы, удалить кости носа, пилинг его и снимите заднюю (хвостовой части) черепа.
Примечание: Кости носа несовершеннолетних мышей очень мягкие и легко ломаются. - Лопаточкой микро вырезать зрительных нервов, тройничного нервов и спинного мозга. Затем используйте микро лопаткой осторожно отделить мозг от черепа. Оставьте мозг, полностью погружен в Петри, заполненные раствором рассечение.
- Соберите все инструменты и материалы, необходимые для животных вскрытия. Настройка рабочей области для подготовки к анатомирование животных.
- Подготовка корковых фрагменты из соматосенсорные моторной коры
- Заполните vibratome буфер лоток с ~ 150 мл холодной (0 - 4° C) рассечение решения.
Примечание: При необходимости, держите лоток буфера в морозильник до тех пор, пока требуется для поддержания низкой температуры во время нарезки процедуры. - Клей ткани мозга от мыши или человека на vibratome сцену (образец держатель/лоток) с помощью мгновенного клея клей. Для мышей отрезать небольшой хвостовой части мозга (то есть, мозжечка) так, что она может быть легко наклеиваются плоский держатель образца (позволяя ростральной стороне мозга грозит потолок).
Примечание: в качестве альтернативы, срезы мозга горизонтальные мыши можно приготовить путем склеивания спинной стороне мозга на держатель образца (вентральной стороне мозга следует лицо потолок)28. - Осторожно поместите держатель образца (с ткани мозга) в панели буфера. Убедитесь, что спинная часть мозга сталкивается с vibratome лезвие.
Примечание: Очень важно, чтобы свести к минимуму количество времени, что мозг подвергается воздействию воздуха.
- Заполните vibratome буфер лоток с ~ 150 мл холодной (0 - 4° C) рассечение решения.
- Секционирование ткани мозга и коллекции
- Срез мозга ломтиками 450 мкм толщиной с использованием vibratome в спинной вентральной направлении. Убедитесь, что мозг остается полностью якорь трей образца при нарезке его.
- Сделайте первый разрез в мозг мыши, чтобы удалить обонятельные луковицы. Затем сделайте последующее сокращение до тех пор, пока соматосенсорные мотор области наблюдается (расположена примерно на полпути между обонятельные луковицы и bregma).
Примечание: При необходимости, срез мозга в тонкие ломтики (200 мкм) до тех пор, пока мозолистого появляется в представлении корональных мозга, который указывает, что области соматосенсорные мотор близко.
- Сделайте первый разрез в мозг мыши, чтобы удалить обонятельные луковицы. Затем сделайте последующее сокращение до тех пор, пока соматосенсорные мотор области наблюдается (расположена примерно на полпути между обонятельные луковицы и bregma).
- Использование пипетки широкий родила передачи для сбора корональные срезы (450 мкм), которые содержат области соматосенсорные мотор и погрузить их в чашке Петри, содержащие холодной (0 - 4 ° C) рассечение решения.
- Используйте новые лезвия бритвы и отрезать любые излишки ткани из кусочков. Для корональные срезы от мышей выполните поперечный, вырезать чуть ниже кортикальное спайки (то есть, мозолистого тела). Не режьте распиловки движения; просто применять давление на лезвии в ткани и использовать подробным кисть осторожно отделить ткани. Убедитесь, что для сведения к минимуму движения корональных фрагмента.
- Использование пипетки широкий родила передачи для передачи спинную часть корональных фрагментов, которые содержат коры головного мозга (слой 1-6) для второй Петри наполнен теплой (35 ° C) фаго на мгновение (~ 1 s). Затем оперативно Перенесите ломтики инкубации камеру, содержащую carbogenated фаго теплой (35 ° C).
Примечание: Перевод на Петри блюдо с фаго предназначен для сведения к минимуму передачи рассечение решения палаты инкубации при передаче срезы мозга с пипеткой широкий родила. Использование инкубации палата организовала несколько скважин держать различные мозга ломтиками. - Отказаться от остальной части мозга и туш животных согласно институциональных руководящих принципов.
- Срез мозга ломтиками 450 мкм толщиной с использованием vibratome в спинной вентральной направлении. Убедитесь, что мозг остается полностью якорь трей образца при нарезке его.
- Инкубация и техническое обслуживание
- Оставьте срезы мозга, слегка погруженным в зале инкубации при 35 ° C за 30 мин. Затем удалите зале инкубации из водяной бани и позволить ей вернуться к комнатной температуре (20-25 ° C). Подождите 1 час на срезах мозга для восстановления перед выполнением электрофизиологических записей.
Примечание: Убедитесь, что нет пузырьков воздуха, которые собирают под срезы мозга в зале инкубации. Пузырьки воздуха, воздуха интерфейсы, которые вызывают повреждение тканей. Срезы мозга мыши может поддерживаться для 6-8 ч, в то время как ткани человеческого мозга может храниться до 24 ч в камере инкубации хорошо carbogenated с соответствующим фаго.
- Оставьте срезы мозга, слегка погруженным в зале инкубации при 35 ° C за 30 мин. Затем удалите зале инкубации из водяной бани и позволить ей вернуться к комнатной температуре (20-25 ° C). Подождите 1 час на срезах мозга для восстановления перед выполнением электрофизиологических записей.
- Электрофизиологические записи поверхностного слоя коры головного мозга
Примечание: Приступ события наблюдаются в внеклеточной местах потенциал (LFP) записи из кусочков мозга. LFP срез мозга может быть наблюдается и записал с интерфейса типа камеры29 или системы глубинного несколькими электродами массив (MEA)16. Процедура была ранее описанных16 и дополнительные детали описаны ниже.- Используйте широкий родила передачи пипетки или подробным кисти для перемещения кусок мозга на немного больше нарезанные объектив бумагу, которая проводится на месте с помощью стоматологический пинцет. Передать запись камеры объектив бумаги (что ломтик мозг отдыхает после) и зафиксируйте её в положении с экраном арфы.
- Выполнения тепло (35 ° C), carbogenated фаго perfusate через запись камеры над срез мозга со скоростью 3 мл/мин (~ 1 поддон/сек). Используйте цифровой термометр, чтобы убедиться, что Камера запись является 33-36 ° C.
- Тянуть стеклянных электродов с импеданс 1-3 MΩ от трубки боросиликатное стекло (с наружным диаметром 1,5 мм) с помощью съемника. Засыпки стеклянных электродов с Фаго (~ 10 мкл) с помощью шприца Гамильтон. Если кончик поврежден немедленно отказаться от электрода.
Примечание: Bleach серебряной проволоки (5 мин) и разрешить только минимальная часть (т.е., кончик) серебряной проволоки в фаго обратно заполнены стеклянных электродов для минимизации шума и дрейф во время записи. Удалите любые излишки фаго из Стеклянный электрод с Гамильтон шприц при необходимости. - Использование 20 X стерео Микроскоп, чтобы точно руководство записи Стеклянный электрод в поверхностных корковых слоев (2/3) с помощью ручного манипуляторов. Запись/вид электрической активности мозга срез на компьютере со стандартным программным обеспечением.
Примечание: Фрагменты жизнеспособных мозга (высокое качество) представят надежные вызванных потенциалов в ответ на прикладной электрические стимулы (100 МКС, 30-300 МКА) или световых импульсов (30 мс, 10 МВт/мм2) для optogenetic ткани.
- Индукция захват подобных мероприятий
- Perfuse фаго, содержащие 100 мкм 4-aminopyrimidine (4-AP) над срез мозга. Растворите 80 мг 4-ап в 8,5 мл воды, чтобы сделать Стоковый раствор 100 мм 4-AP. 100 мкл 100 мм 4-AP Стоковый раствор 100 мл фаго для достижения фаго perfusate с 100 мкм 4-AP.
Примечание: в качестве альтернативы, используйте нуль-мг2 + Фаго (Таблица 4), измененные фаго раствор, содержащий не добавлен мг2 +, чтобы perfuse срез мозга. Для тканей человека используйте комбинацию 100 мкм 4-ап в ноль-Mg2 + человека Фаго (Таблица 5) для достижения оптимальных результатов. Среднее время для противоречивых событий появится составляет 15 мин; Однако это может занять до 40 минут для некоторых срезов мозга.
- Perfuse фаго, содержащие 100 мкм 4-aminopyrimidine (4-AP) над срез мозга. Растворите 80 мг 4-ап в 8,5 мл воды, чтобы сделать Стоковый раствор 100 мм 4-AP. 100 мкл 100 мм 4-AP Стоковый раствор 100 мл фаго для достижения фаго perfusate с 100 мкм 4-AP.
- По требованию захват поколение: стратегия optogenetic для optogenetic мышей
- Применить Бриф (30 мс) пульс синего (470 Нм) свет (с интенсивностью вывода минимум 1 МВт/мм2 ) инициировать событие приступ. Используйте ручной манипулятор для размещения 1000 мкм ядро Диаметр оптического волокна (0.39 NA) непосредственно над регионом записи.
Примечание: Установить скорость фото стимуляции для соответствия желаемой скорости приступ случая (т.е., 1 импульс каждые 50 s). Однако стоимость невозможно переоценить чрезмерно от внутренней скорости, на которой происходят события во.
- Применить Бриф (30 мс) пульс синего (470 Нм) свет (с интенсивностью вывода минимум 1 МВт/мм2 ) инициировать событие приступ. Используйте ручной манипулятор для размещения 1000 мкм ядро Диаметр оптического волокна (0.39 NA) непосредственно над регионом записи.
- По требованию захват поколение: не optogenetic стратегия для тканей человека
- Расположите срез мозга поверхностных слоев вверх по течению, и глубокие слои вниз по течению потока perfusate через запись камеры.
- Вытяните Стеклянный электрод (тот же тип используется для записи LFP) и нежно коснуться его кончик с стеклоочистителя деликатную задачу создать небольшое отверстие. Засыпки электрод с ~ 25 мкл 100 мм ГАМК (растворимые в воде) и прикрепить его к picospritzer. Кроме того засыпки электрод с 200 мкм глутамата (растворимые в воде).
Примечание: Для оценки объема пыхтел от picospritzer (~ 50 мкл), примените слоеного теста на пластиковую пластину (предпочтительно сетчатая). Затем Нанесите капельку известных томов (то есть, 10 мкл, 20 мкл, 50 мкл или 100 мкл) с пипетки для сравнения с слоеного теста. - Применить затяжек нейротрансмиттера (ГАМК или глутамата) к человеческой ткани с picospritzer (10-20 psi для 30-100 мс) инициировать событие во. Применить один слойка 100 мм ГАМК на глубокий слой (5) ткани мозга для создания противоречивых событий в поверхностный слой (2/3). Можно также примените один слойка 200 мкм глутамата непосредственно на поверхностный слой для создания противоречивых событий в поверхностном слое.
Примечание: Установить скорость picospritzer слоеного соответствует желаемой скорости приступ случая (т.е., 1 импульс каждые 50 s). Однако стоимость невозможно переоценить чрезмерно от внутренней скорости, на которой происходят события во.
2. Протокол II: Острый, в естественных условиях изъятия модель
-
Хирургии и хирургической подготовки
- Получите взрослых мышь (p35 - p60) любого пола.
- Глубоко анестезировать мышь с кетамин (95 мг/кг) и ксилазина (5 мг/кг). Выполните мыс щепотка рефлекс тест, чтобы убедиться, что седативные мыши. Кроме того используйте изофлюрановая (4% для индукции, 1,5-2% для хирургии) чтобы анестезировать мыши.
Примечание: Выбор анестетиков может повлиять на захват активность30,31. - Установите мышь в Стереотаксическая рама, обеспечив ее голову с уха баров. Место подогреваемый коврик под мышь на время операции.
- Бритья в верхней части головы мыши с помощью грызунов триммер подвергать кожу головы. Inject 0,3 мл лидокаина с 25 G 5/8 в иглу в надкостницы, чтобы избежать чрезмерного кровотечения или боль. Применять мазь глаз к мыши глаза, чтобы предотвратить их от пересыхания во время эксперимента.
- Пинч и поднимите центр мыши головы, чтобы оценить, если его рефлексы ушли. Впоследствии выполните горизонтальную Вырезать подвергать bregma лямбда регион черепа. Аккуратно почистить весь подвергаются области черепа с ватным тампоном для создания сухой поверхности.
- Выполните краниотомии 4 мм в диаметре на rostrocaudal -2,0 мм и lateromedial координаты 2,0 мм подвергать соматосенсорной коры. Марк местоположение с круга (4 мм в диаметре) с помощью постоянного маркера. Сверло вокруг круга с отбойным молотком зубов до тех пор, пока оставшиеся слой кости краниотомии легко сменяется когда толкнул вниз. Применить физиологический раствор на слой кости перед удалением краниотомии пинцетом заноза. Впоследствии применить теплым физраствором к воздействию региона.
-
Методы записи и химической индукции изъятий
- Тянуть стеклянных электродов с импеданс 1-3 MΩ от трубки боросиликатное стекло (с наружным диаметром 1,5 мм) с помощью съемника. Засыпки стеклянных электродов с ~ 10 мкл фаго или физиологического раствора с помощью Гамильтон шприц. Если кончик поврежден немедленно отказаться от электрода.
Примечание: Bleach серебряной проволоки (5 мин) и разрешить только минимальная часть (т.е., кончик) серебряной проволоки в фаго обратно заполнены стеклянных электродов для минимизации шума и дрейф во время записи. Удалите любые излишки фаго из Стеклянный электрод с Гамильтон шприц при необходимости. - Используйте ручной манипулятор для руководства Стеклянный электрод в поверхностных корковых слоев (2/3) в районе соматосенсорные мотор. Запись/вид электрической активности мозга срез на компьютере со стандартным программным обеспечением.
Примечание: Layer 2/3 составляет примерно 0,3 мм в глубину от поверхности32. - Местно применяют ~0.5 мл 1,5 мм 4-AP saline на подвергается коры мыши с помощью шприца до тех пор, пока она полностью покрывает краниотомии. Растворите 14 мг 4-ап в 100 мл изотонический солевой раствор сделать Стоковый раствор 1,5 мм 4-AP физиологического раствора.
Примечание: Подготовьте 4-AP засолены до начала эксперимента. В среднем приступ события появляются 15-30 мин после местного применения.
- Тянуть стеклянных электродов с импеданс 1-3 MΩ от трубки боросиликатное стекло (с наружным диаметром 1,5 мм) с помощью съемника. Засыпки стеклянных электродов с ~ 10 мкл фаго или физиологического раствора с помощью Гамильтон шприц. Если кончик поврежден немедленно отказаться от электрода.
-
По требованию поколение изъятий в optogenetic мышей
- Применить Бриф (30 мс) пульс синего (470 Нм) свет (с интенсивностью вывода менее 10 МВт/мм2 ) инициировать событие приступ. Используйте ручной манипулятор для размещения 1000 мкм ядро Диаметр оптического волокна (0.39 NA) непосредственно над регионом записи.
Примечание: Установить скорость фото стимуляции для соответствия желаемой скорости приступ случая (т.е., 1 импульс каждые 300 s). Однако стоимость невозможно переоценить чрезмерно от внутренней скорости, на которой происходят события во.
- Применить Бриф (30 мс) пульс синего (470 Нм) свет (с интенсивностью вывода менее 10 МВт/мм2 ) инициировать событие приступ. Используйте ручной манипулятор для размещения 1000 мкм ядро Диаметр оптического волокна (0.39 NA) непосредственно над регионом записи.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Применение 100 мкм 4-AP для хорошего качества (неповрежденные) 450 мкм размера коры мозга фрагменты из несовершеннолетних VGAT-ChR2 надежно индуцированной повторяющихся приступ событий мыши (s > 5) в течение 15 мин (Рисунок 1АИ). Применение 100 мкм 4-AP к фрагментам низкого качества привело к разрывным события или пики активности (Рисунок 1Aii). В среднем 40% кусочков из каждой расчлененных мыши мозга успешно сгенерирован противоречивых событий. Кроме того 83% (25/30) расчлененных мышей привело срез по крайней мере один мозг, успешно созданный противоречивых событий. В срезах головного мозга с спонтанно возникающих во события, применение краткого 30 мс светового импульса на срез мозга надежно вызвать приступ событие, которое было идентично в морфологии (Рисунок 1Aiii и 1Aiv). Же выводы были сделаны в срезах головного мозга от мышей Thy1-ChR2 (рис. 1B). Таким образом независимо от того, какой нейрональных субпопуляция был активирован, любой краткий синхронизации событий в изолированных кортикального слоя нейронной сети привели к наступления события, приступ. Эти события приступ состояли из дозорных Спайк (preictal) (рис. 2Aii и 2Bii), тоник как обжига (рис. 2Aiii и 2Biii), клонические как обжига (рис. 2Aiv и 2Biv) и разрывной деятельности к концу (Рисунок 2Av и 2БВ); они были аналогичными по своему характеру электрографические подписи, связанные с клинических изъятий33. Кроме того эти несовершеннолетних мышей были физиологически взрослого как как добавление 10 мкм bumetanide (бум), NKCC1 окон, не сказалось на результате противоречивых событий (рис. 2).
Модель 4-AP корковых срез в vitro надежно генерируется последовательной приступ события для ~ 1 ч (Рисунок 1АИ), тогда как модель2 + ноль-мг обычно создается приступ события ~ 10 мин до быстро преобразования в всплеска деятельности ( Рис. 3A). Однако если не-4-AP метод захвата индукции требуется, модель2 + ноль-мг может быть изменен с добавлением 5-10 мкм баклофен (агонистом рецепторов ГАМКB ) обратно превратить разрывной действия противоречивых событий (рис. 3B) . В целом методы не расторможенность для повышения возбудимости (то есть, 4-AP или нулевой-Mg2 + фаго) достоверно воспроизводится приступ события в кусочки коры головного мозга. Напротив методы расторможенность [т.е., bicuculline (BMI), антагонист рецепторов ГАМКA ] привели к пики активности напоминает межприступная активности или разрыва деятельность, вместо того, чтобы приступ события (рис. 4A). Аналогичным образом, острый захват модели, приготовленный из 100 мкм 4-AP-лечение гиппокампа фрагментов генерируется межприступная как пики активности или статус эпилептический как условия в CA3 (рис. 4В). В естественных условиях 4-AP корковых модель соответственно созданных повторяющихся приступ события (> 5 сек). Приступ события были замечены в поверхностный слой (2/3) в течение ~ 30 мин местно применять 1,5 мм 4-AP на подвергается коры взрослых мышей VGAT-ChR2. Применения краткого 30 мс светового импульса на подвергается коры надежно срабатывает противоречивых событий, которые аналогичны морфологически спонтанно возникающих (рис. 5).
Применение нулевой-мг2 + человека фаго с 100 мкм 4-AP ломтики «не эпилептический» коры головного мозга (450 мкм) от височной эпилепсии пациентов надежно созданных повторяющихся приступ события (s > 5) в течение ~ 30 минут (рис. 6Ai и 6Bi). Ломтики низкого качества генерируется пики активности или неактивности (Рисунок 1Aii). Жизнеспособность срезы мозга было сочтено «хорошее качество» когда краткий электрические стимул (100 МКС, 30-300 МКА) индуцированной надежные, вызвал ответ в LFP в начале эксперимента. Когда приступ события начали выпадать в осадок, применение краткого слоеного (75 МС на 20 psi) 100 мм ГАМК на срез мозга надежно срабатывает противоречивых событий, которые были идентичны в морфологии происходят спонтанно (рис. 6Aii и 6Aiii) . Более низкой концентрации ГАМК, 100-200 мкм, вероятно, будет эффективно также для в vitro эксперименты34; Однако более высокую концентрацию ГАМК, 100 мм, рекомендуется для в естественных условиях экспериментов35. Такие же замечания были воспроизведены когда краткий слоеного 200 мкм глутамата был применен к срезы мозга человека (Рисунок 6Bii и 6Biii). Таким образом независимо от того, какой пост синаптических рецепторы были активированы, краткий синхронизации событий в изолированных человека кортикального слоя нейронной сети надежно срабатывает событие во.
Рисунок 1: Острый в vitro 4-AP корковых захват модель. Черные линии представляют местные области потенциальных (LFP) записи; синие линии представляют собой легкие стимул. (A) эти панели основаны на результатах от мыши модели VGAT-ChR2. Они иллюстрируют приступ события, наблюдаемые в записи LFP от поверхностного слоя (2/3) кусочком коры мозга высокого качества рассматривается с 100 мкм 4-AP. я) Эта группа показывает обзор LFP записи. ii) они являются примерами LFP, запись от низкого качества мозга ломтиками. Вертикальный масштаб бар-0,4 мВ, горизонтальные линейки – 20 с. iii) это увеличенное представление-срабатывает во события. iv) это увеличенное представление спонтанное приступ события. (B) эти группы основаны на результатах от мыши модели Thy1-ChR2. Они иллюстрируют приступ события, наблюдаемые в записи LFP от поверхностного слоя (2/3) от кусочком коры головного мозга лечение с 100 мкм 4-AP. я) Эта панель показывает обзор LFP записи. ii) это увеличенное представление-срабатывает во события. iii) это увеличенное представление спонтанное приступ события. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: приступ события созданы в срез мозга (слой 2/3) от несовершеннолетнего (p13) VGAT-ChR2 мышь, увлажненную с 4-ап и bumetanide (бум). Черные линии представляют собой местные области потенциальных (LFP) записи; синие линии представляют собой легкие стимул. (A) эти панели показывают, спонтанное противоречивых событий. я) Эта группа показывает обзор всего приступ события. Следующие панели показывают ii) дозорный Спайк, iii) Тоник как огонь, iv) клонические как огонь и v) разрыва деятельность. (B) эти панели показывают-срабатывает противоречивых событий. я) Эта группа показывает обзор всего приступ события. Следующие панели показывают ii)-срабатывает дозорных всплеска от же фрагмента записи, iii) Тоник как огонь, iv) клонические как огонь и v) разрыва деятельность. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Острый в vitro Zero-Mg2 + корковых захват модель. Черные линии представляют собой местные области потенциальных (LFP) записи; синие линии представляют собой легкие стимул. (A) Эти панели основаны на результатах от мыши модели VGAT-ChR2. я) Эта группа показывает статус эпилептический как условия наблюдаются в записи LFP от поверхностного слоя (2/3) рассматривается с нуля-Mg2 + фаго кусочком коры головного мозга. ii) это увеличенное представление-срабатывает во события. iii) это увеличенное представление деятельности разрывной эпилептический как статус. (B) эти панели показывают же фрагмента, запись с добавлением баклофен. я) приложение 5 мкм баклофен Zero-Mg2 + фаго превращает разрывной деятельности обратно в собственный, рецидивирующий противоречивых событий. ii) это детализированное представление разрывной деятельности. iii) это увеличенное представление отдельных приступ события. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Острый в vitro лопаются и пики модели. Черные линии представляют местные области потенциальных (LFP) записи; синие линии представляют собой легкие стимул. (A) эти панели показывают результаты с кусочком коры от VGAT-ChR2mouse, иллюстрирующие разрывной активность наблюдается в поверхностный слой (2/3) следующие добавления 10 мкм BMI до 100 мкм 4AP. я) это обзор LFP записи. Пунктирная красная линия указывает, когда BMI вступила в силу. ii) это увеличенное представление-срабатывает во события. iii) это увеличенное представление разрывной спонтанной активности. (B) эти панели показывают результаты из гиппокампа кусочек от VGAT-ChR2 мышь, иллюстрирующие событие эпилептический как статус, наблюдаемые в районе CA3 после применения 100 мкм 4AP. i) это обзор LFP записи. ii) это увеличенное представление о событии приступ. iii) это детализированное представление света срабатывает и спонтанное разрыва события. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Острый в естественных условиях 4-AP корковых захват модель. Черные линии представляют местные области потенциальных (LFP) записи; синие линии представляют собой легкие стимул. (A) эти панели показывают результаты взрослого (p56) VGAT-ChR2 модель мыши с 1,5 мм 4-AP местно применяется к воздействию коры. я) Эта группа иллюстрирует свет срабатывает противоречивых событий наблюдается в поверхностный слой (2/3) области соматосенсорные мотор. ii) это детализированное представление свет срабатывает во события от группы Ai. iii) это супер увеличенное представление наступления свет срабатывает событие приступ (обозначается черной стрелкой). Эта цифра является нефильтрованное версия фигуры из Чанг et al. 16. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: Острый в vitro человека корковых захват модель. Черные линии представляют собой местные области потенциальных (LFP) записи; коричневые линии представляют слоеного picospritzer. (A) эти панели показывают результаты кусочком коры мозга от медиальной височной эпилепсии (MTLE) пациента, иллюстрирующие приступ события, наблюдаемые в поверхностный слой (2/3) следующие перфузии с 100 мкм 4-AP и нуль-Mg2 + человека фаго . я) это обзор LFP записи. Следующие панели показывают ii) увеличенное представление 100 мм ГАМК слоеного вызвал приступ событий и iii) увеличенное представление спонтанное приступ события. (B) эти панели показывают результаты кусочком коры мозга от другого MTLE пациента, иллюстрирующие приступ события, наблюдаемые в поверхностный слой (2/3) следующие перфузии с 100 мкм 4-AP и нуль-Mg2 + человека фаго. я) это обзор LFP записи. Следующие панели показывают ii) увеличенное представление 200 мкм слоеного срабатывает-глутамата противоречивых событий и iii) увеличенное представление спонтанное приступ события. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Таблица 1: рецепт для решения диссекции. Это инструкции, чтобы сделать томов 1 Л и 2 Л. МВт = молекулярная масса экстракцию.
| # | Реагент | Высококонцентрированные [мм] | МВт (г/моль) | 1 Л (g) | 2 Л (g) |
| 1 | Сахароза | 248 | 342.3 | 84.89 | 169.78 |
| 2 | Бикарбонат натрия (2NaHCO) | 26 | 84.01 | 2.18 | 4.37 |
| 3 | Декстроза (D-глюкоза) | 10 | 180.16 | 1.8 | 3.6 |
| 4 | Хлорид калия (KCl) | 2 | 74.55 | 0,15 | 0,3 |
| 5 | Сульфат магния (MgSO4·7H2O) | 3 | 246.47 | 0.74 | 1.48 |
| 6 | Натрия фосфат монокальций моногидрат (H2Напо4· H2O) | 1.25 | 137.99 | 0.17 | 0,34 |
| 7 | Хлорид кальция (CaCl2·2H2O) | 1 | 147.01 | 0,15 | 0.29 |
Таблица 2: рецепт для грызунов искусственных спинномозговой жидкости (ФАГО). Это инструкции, чтобы сделать тома 2 Л или 4 Л. МВт = молекулярная масса экстракцию.
| # | Реагент | Высококонцентрированные [мм] | МВт (г/моль) | 2 Л (g) | 4 Л (g) |
| 1 | Хлорид натрия (NaCl) | 123 | 58,4 | 14.37 | 28.73 |
| 2 | Бикарбонат натрия (2NaHCO) | 26 | 84.01 | 4.37 | 8.74 |
| 3 | Декстроза (D-глюкоза) | 10 | 180.16 | 3.6 | 7.21 |
| 4 | Хлорид калия (KCl) | 4 | 74.55 | 0.6 | 1.19 |
| 5 | Сульфат магния (MgSO4· H2O) | 1.3 | 246.47 | 0,64 | 1.28 |
| 6 | Натрия фосфат монокальций моногидрат (HNaPO4· H2O) | 1.2 | 137.99 | 0,33 | 0.66 |
| 7 | Хлорид кальция (CaCl2·2H2O) | 1.5 | 147.01 | 0.44 | 0.88 |
Таблица 3: рецепт для человека искусственного мозговой спинномозговой жидкости (человека фаго). Это инструкции, чтобы сделать тома 2 Л или 4 Л. МВт = молекулярная масса экстракцию.
| # | Реагент | Высококонцентрированные [мм] | МВт (г/моль) | 2 Л (g) | 4 Л (g) |
| 1 | Хлорид натрия (NaCl) | 123 | 58,4 | 14.38 | 28,75 |
| 2 | Бикарбонат натрия (2NaHCO) | 25.2 | 84.01 | 4.23 | 8.46 |
| 3 | Декстроза (D-глюкоза) | 10 | 180.16 | 3.6 | 7.21 |
| 4 | Хлорид калия (KCl) | 4 | 74.55 | 0.6 | 1.19 |
| 5 | Сульфат магния (MgSO4· H2O) | 1 | 246.47 | 0,49 | 0.99 |
| 6 | Натрия фосфат монокальций моногидрат (HNaPO4· H2O) | 1.2 | 137.99 | 0,33 | 0.66 |
| 7 | Хлорид кальция (CaCl2·2H2O) | 1 | 147.01 | 0.29 | 0,59 |
Таблица 4: рецепт для нулевой мг 2 + грызунов искусственных спинномозговой жидкости (Zero-мг2 + фаго). Это инструкции, чтобы сделать тома 2 Л или 4 Л. МВт = молекулярная масса экстракцию.
| # | Реагент | Высококонцентрированные [мм] | МВт (г/моль) | 2 Л (g) | 4 Л (g) |
| 1 | Хлорид натрия (NaCl) | 123 | 58,4 | 14.37 | 28.73 |
| 2 | Бикарбонат натрия (2NaHCO) | 26 | 84.01 | 4.37 | 8.74 |
| 3 | Декстроза (D-глюкоза) | 10 | 180.16 | 3.6 | 7.21 |
| 4 | Хлорид калия (KCl) | 4 | 74.55 | 0.6 | 1.19 |
| 5 | Сульфат магния (MgSO4· H2O) | Условно бесплатная | 246.47 | 0 | 0 |
| 6 | Натрия фосфат монокальций моногидрат (HNaPO4· H2O) | 1.2 | 137.99 | 0,33 | 0.66 |
| 7 | Хлорид кальция (CaCl2·2H2O) | 1.5 | 147.01 | 0.29 | 0,59 |
Таблица 5: рецепт для нулевой мг 2 + человека искусственного спинномозговой жидкости (Zero-мг2 + человека фаго). Инструкции сделать 2 Л или тома 4 Л; МВт = молекулярная масса экстракцию.
| # | Реагент | Высококонцентрированные [мм] | МВт (г/моль) | 2 Л (g) | 4 Л (g) |
| 1 | Хлорид натрия (NaCl) | 123 | 58,4 | 14.38 | 28,75 |
| 2 | Бикарбонат натрия (2NaHCO) | 25.2 | 84.01 | 4.23 | 8.46 |
| 3 | Декстроза (D-глюкоза) | 10 | 180.16 | 3.6 | 7.21 |
| 4 | Хлорид калия (KCl) | 4 | 74.55 | 0.6 | 1.19 |
| 5 | Сульфат магния (MgSO4· H2O) | Условно бесплатная | 246.47 | 0 | 0 |
| 6 | Натрия фосфат монокальций моногидрат (HNaPO4· H2O) | 1.2 | 137.99 | 0,33 | 0.66 |
| 7 | Хлорид кальция (CaCl2·2H2O) | 1 | 147.01 | 0.29 | 0,59 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Срезы мозга относятся с proconvulsant наркотиков или изменены фаго perfusate увеличить нейросеть в возбудимости и содействовать осадков во события (электрографические захват подобных). Для мышей предпочтительным корональных ломтики области соматосенсорные Мотор должен содержать поясной коры, зона 2 (CG), но не в retrosplenial зоне (РС); Эти анатомические маркеры помогает определить спектр корональные срезы, которые лучше всего подходят для вызывающих приступ события. Дополнительные модификации для мышей ткани — пополам двух полушарий мозга фрагмент соответствует паре экспериментальных образцов, как двух полушарий являются практически идентичными (аналогичные экспериментальные единицы). При подготовке срезы мозга для создания противоречивых событий, важно поддерживать целостность нейронной сети и ее синаптических связей, потому что приступ события явление нейронной сети. Три очка на шаге 1 протокола, которые являются критическими для ломтик качества являются 1) нарезки процедуры, 2) инкубации и 3) оксигенацию. Во-первых нарезки процедура требует баланса между скоростью и технику. Важно свести к минимуму время между обезглавливание (или хирургическая резекция) и инкубации, а также стараясь каждый контакт и движение мозга фрагмента, чтобы избежать повреждения. Во-вторых качество ткани очень чувствительны к температуре инкубации и продолжительность. Это важно использовать таймер и термометр для обеспечения инкубации при 35 ° C за 30 мин. в-третьих, жизнеспособность ткани мозга чувствительных к воздействию ничего, кроме кислородом (искусственный) спинномозговой жидкости. Срез мозга истекает, если она не увлажненную с carbogenated фаго для продолжительного периода времени (~ 1 мин).
Срезы мозга от мышей в возрасте p13 - p16 предлагают наибольшую вероятность успешного получения противоречивых событий. Причина что p16 ≤ мышей не требуют transcardial перфузии до вскрытия. Это эффективно уменьшает вероятность ошибок и ускоряет процесс вскрытия, который является огромным преимуществом, потому что количество времени между обезглавливание и инкубации обратно коррелирует с срез мозга жизнеспособность. Тем временем, мышей > p13 сократили количество NKCC1, которые сопоставимы с взрослых36. В целом, несовершеннолетних (< p21) ткани более жизнеспособным, чем взрослый ткани вследствие исключительной способностью оправиться от разрушительных нарезки процедуры. Это-недельная окно между p13 и p21 предлагает возможность эксплуатировать мышей взрослого как физиологии и способность несовершеннолетних как легко генерировать противоречивых событий37,38. Однако если эксперименты требуют изучения противоречивых событий в срезах головного мозга от взрослых мышей, на основе NMDG фаго с HEPES, тиомочевины и аскорбата будут способствовать жизнеспособности тканей взрослого24,,3940, 41. для человеческой ткани, Добавление антиоксидантов, таких как α-токоферол, рассечение решение может принести пользу жизнеспособности тканей, особенно во время междугородние перевозки (> 30 мин) между операционной комнате и лаборатории нарезка8,26. Для всех фрагментов мозга благоприятные условия для создания противоречивых событий, для записи от 450 мкм толстые ломтики на 36 ° C. Срезы мозга необходимо быть по меньшей мере 350 мкм толщиной содержат достаточное количество нейронов нейронной сети для создания структурированных противоречивых событий. Однако, фрагменты не может быть толще, чем 500 мкм, как это сделает его трудным для кислорода для диффузного в центр ткани. Фрагменты, которые являются 450 мкм представляют оптимальная толщина, где достаточное количество нейронной сети поддерживается без противодействия на перфузии кислорода в ткани. И наконец осадков противоречивых событий является оптимальным в 33-36 ° C; Если запись камеры не является по меньшей мере 33 ° C, это будет трудно для противоречивых событий.
Ограничение острой захват модели является, что они не генерируют изъятий. Они только генерировать противоречивых событий, которые являются электрографические подпись захвата. Приступ события имеют не связанные поведенческие компоненты, такие как потеря сознания или моторные судороги, которые определяют захват. Следовательно острый захват модели не может использоваться для подтверждения эффективности потенциальных кандидатов Антиконфискации наркотиков или приобрести проницательности в epileptogenesis; такие исследовательские вопросы должны решаться модели хронической эпилепсии и клинические испытания. Острый захват модели должны использоваться только по назначению выполнения основных предварительных исследований по механизмам захвата. Только наиболее перспективные выводы от острой захват модели следует дополнительно на выше модели, которые являются более дорогостоящими, трудоемким, чтобы подготовить и требуют гораздо более сложные этические соображения.
Чтобы добиться прогресса в исследовании эпилепсии и захват, важно иметь надежный захват острый модель, которая может точно воспроизвести электрографические захват активность наблюдается клинически в ЭЭГ захват пациентов. Достоверно воспроизвести во события в срезах головного мозга, требуются не расторможенность методы повышения возбудимости, тогда как методы растормаживания (т.е., антагонист рецепторов ГАМКA ИМТ) обычно приводят в пики активности напоминает межприступная деятельности, а не противоречивых событий (рис. 3A). Предпочтительным методом для растормаживания является применять 4-AP proconvulsant агента, потому что он может надежно генерируют последовательной приступ за 1 ч. В отличие от Zero-мг2 + корковых модель создает во события только ~ 10 мин до быстро преобразования в взрыв как деятельность (рисунок 2A). Если с помощью нуль-мг2 + модель, добавление 5-10 мкм баклофен, агонистом рецепторов ГАМКB , поможет превратить противоречивых событий (рис. 2B), как ранее показанного в гиппокампе ломтики42разрывной активности. Кроме того модель 4-AP захват в пробирке является предпочтительным, поскольку выводы из этой модели может быть воспроизведена в его в естественных условиях коллегой, в естественных условиях 4-AP корковых захват модели (рис. 4). Это не возможно изменить весь спинномозговой жидкости живой взрослых мыши воссоздать острой в естественных условиях Zero-Mg2 + среды.
Приложение 4-ап в кусочки коры мозга может точно воспроизвести захват активность наблюдается клинически15,33. В отличие от 4-AP-лечение гиппокампа ломтиками предрасположены к генерации межприступная как пики активности43 и статус эпилептический как условия (рис. 3B). Таким образом для целей изучения припадки, острый в vitro 4-AP корковых модель предпочтительнее в vitro 4-AP гиппокампа модели. Кроме того существует практически никаких возможностей для записи от жизнеспособного человека гиппокампа ломтиками, как наиболее гиппокампа резекции СА1 и CA3 поврежден21. В отличие от не патологических корковых тканей человека более легко доступны, как что является вторичным исходам подкорковых нейрохирургических процедур, таких как височная эпилепсия хирургии. Кортикальное ткани non эпилептический «управления» может быть также приобретено от операции резекции опухоли. По этим причинам коры является предпочтительным местом для моделирования захват активность из-за своей мобильности между мышью и человеческих тканей для подтверждения клинической значимости. Наконец штамм мышей C57BL/6 является предпочтительным, поскольку они легко выразить трансгенов, и коммерчески доступны варианты optogenetic. Optogenetic мышей модели позволяют для начала по требованию приступ события через минимально инвазивной, краткие легкой стимуляции. Это делает исследование изъятий невероятно эффективным путем устранения времени ожидания и позволяя для целевых активации нейронов субпопуляции. Кроме того способность вызвать судороги по требованию позволяет для новых путей окончательно демаркацию точно в точке начала захвата и потенциально изучить эффективность Антиконфискации наркотиков кандидатов. Удобной для пользователей на основе MATLAB программа была специально разработана обнаруживать и классифицировать различные типы эпилептиформный события, которые происходят в моделях 4-AP захват в vitro и in vivo. Эта программа обнаружения доступен для загрузки из репозитория GitHub Valiante лаборатории (https://github.com/Valiantelab/ChangValiante2018).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана канадской институтов медицинских исследований (СС 119603 Питер л Карлин и Taufik A. Valiante), Института мозга Онтарио (чтобы Taufik а. Valiante) и Mightex студенческий исследовательский грант (до Майкл Чанг). Мы хотели бы поблагодарить Liam долго за его помощь в съемках видео рукопись. Мы хотели бы признать Paria Baharikhoob, Abeeshan Selvabaskaran и Shadini Dematagoda за их помощь в составлении фигур и таблиц в этой рукописи. 1A цифры, 3А, 4аи 6A являются все оригинальные фигуры, сделанные из данных, опубликованных в Чанг et al. 16.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium pentobarbital | N/A | N/A | Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers |
| 1 mm syringe | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| 25G 5/8” sterile needle | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Single edge razor blade (2x) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Instant adhesive glue | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Lens paper | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Glass petri dish (2x) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Splinter forceps (2x) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| PVC handle micro spatula | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Micro spoon with flat end | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Detailing brush 5/0 | N/A | N/A | Purcahsed from a boutique art store |
| Wide bore transfer pipette | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Dental Tweezer | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Thermometer (digital) | N/A | N/A | Purchased on Amazon.ca |
| Check carbogen tank (95%O2/5%CO2) | N/A | N/A | Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers |
| Vibratome | Leica | N/A | Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers |
| brain slice incubation chamber (a.k.a. brain slice keeper) | Scientific Systems Design Inc | N/A | |
| Sodium Chloride (NaCl) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Sodium Bicarbonate | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Dextrose | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Potassium Chloride (KCl) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Magnesium Sulfate (MgSO4 H2O) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (HNaPO4·H2O) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Calcium Chloride (CaCl2·2H2O) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Sucrose | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
References
- Jefferys, J. G. R. Advances in understanding basic mechanisms of epilepsy and seizures. Seizure. 19 (10), 638-646 (2010).
- Fujiwara, H., et al. Resection of ictal high-frequency oscillations leads to favorable surgical outcome in pediatric epilepsy. Epilepsia. 53 (9), 1607-1617 (2012).
- Chen, H. Y., Albertson, T. E., Olson, K. R. Treatment of drug-induced seizures. British Journal of Clinical Pharmacology. 81 (3), 412-419 (2015).
- Kwan, P., Brodie, M. J. Early Identification of Refractory Epilepsy. New England Journal of Medicine. 342 (5), 314-319 (2000).
- Giussani, G., et al. A population-based study of active and drug-resistant epilepsies in Northern Italy. Epilepsy & Behavior. 55, 30-37 (2016).
- Pellock, J. M. Overview: definitions and classifications of seizure emergencies. Journal of Child Neurology. 22 (5_suppl), 9S-13S (2007).
- Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
- Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2016).
- Castel-Branco, M., Alves, G., Figueiredo, I., Falcão, A., Caramona, M. The maximal electroshock seizure (MES) model in the preclinical assessment of potential new antiepileptic drugs. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 31 (2), 101-106 (2009).
- Wendling, F., Bartolomei, F., Modolo, J. Neocortical/Thalamic In Silico Models of Seizures and Epilepsy. Models of Seizures and Epilepsy. Pitkänen, A., Buckmaster, P., Galanopoulou, A. S., Moshé, S. , Academic Press. London, San Diego (CA), Cambridge (MA), Oxford. 233-246 (2017).
- Cocchi, L., Gollo, L. L., Zalesky, A., Breakspear, M. Criticality in the brain: A synthesis of neurobiology, models and cognition. Progress in Neurobiology. 158, 132-152 (2017).
- Xue, M., Atallah, B. V., Scanziani, M. Equalizing excitation-inhibition ratios across visual cortical neurons. Nature. 511 (7511), 596-600 (2014).
- Engel, J. Seizures and epilepsy. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2013).
- Panuccio, G., Curia, G., Colosimo, A., Cruccu, G., Avoli, M. Epileptiform synchronization in the cingulate cortex. Epilepsia. 50 (3), 521-536 (2009).
- Avoli, M., de Curtis, M. GABAergic synchronization in the limbic system and its role in the generation of epileptiform activity. Progress in Neurobiology. 95 (2), 104-132 (2011).
- Chang, M., et al. Brief activation of GABAergic interneurons initiates the transition to ictal events through post-inhibitory rebound excitation. Neurobiology of Disease. 109, 102-116 (2018).
- Jiruska, P., et al. High-frequency network activity, global increase in neuronal activity, and synchrony expansion precede epileptic seizures in vitro. The Journal of Neuroscience. 30 (16), 5690-5701 (2010).
- Jirsa, V. K., Stacey, W. C., Quilichini, P. P., Ivanov, A. I., Bernard, C. On the nature of seizure dynamics. Brain. 137 (Pt 8), 2210-2230 (2014).
- Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Ion Channels: Methods and Protocols. 337, 117-125 (2006).
- Li, H., Prince, D. A. Synaptic activity in chronically injured, epileptogenic sensory-motor neocortex. Journal of Neurophysiology. 88 (1), 2-12 (2002).
- Köhling, R., Avoli, M. Methodological approaches to exploring epileptic disorders in the human brain in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 1-19 (2006).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), e680 (2008).
- Ritter, L. M., et al. WONOEP appraisal: optogenetic tools to suppress seizures and explore the mechanisms of epileptogenesis. Epilepsia. 55 (11), 1693-1702 (2014).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
- Arenkiel, B. R., et al. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).
- Heinemann, U., et al. Brain slices from human resected tissue. Models of Seizures and Epilepsy. Pitkänen, A., Buckmaster, P., Galanopoulou, A. S., Moshé, S. , Academic Press. London, San Diego (CA), Cambridge (MA), Oxford. 285-299 (2017).
- Florez, C., et al. In vitro recordings of human neocortical oscillations. Cerebral Cortex. 25 (3), 578-597 (2015).
- Lein, P. J., Barnhart, C. D., Pessah, I. N. Acute hippocampal slice preparation and hippocampal slice cultures. Methods in Molecular Biology. , 115-134 (2011).
- Haas, H. L., Schaerer, B., Vosmansky, M. A simple perfusion chamber for the study of nervous tissue slices in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 1 (4), 323-325 (1979).
- Poulton, T. J., Ellingson, R. J. Seizure associated with induction of anesthesia with isoflurane. Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 61 (4), 471-476 (1984).
- Borris, D. J., Bertram, E. H., Kapur, J. Ketamine controls prolonged status epilepticus. Epilepsy Research. 42 (2-3), 117-122 (2000).
- DeFelipe, J., Alonso-Nanclares, L., Arellano, J. I. Microstructure of the neocortex: comparative aspects. Journal of Neurocytology. 31 (3-5), 299-316 (2002).
- Velasco, A. L., Wilson, C. L., Babb, T. L., Engel, J. Functional and anatomic correlates of two frequently observed temporal lobe seizure-onset patterns. Neural Plasticity. 7 (1-2), 49-63 (2000).
- Vlachos, A., Reddy-Alla, S., Papadopoulos, T., Deller, T., Betz, H. Homeostatic regulation of gephyrin scaffolds and synaptic strength at mature hippocampal GABAergic postsynapses. Cerebral Cortex. 23 (11), 2700-2711 (2012).
- Kirmse, K., et al. GABA depolarizes immature neurons and inhibits network activity in the neonatal neocortex in vivo. Nature Communications. 6, 7750 (2015).
- Stein, V., Hermans-Borgmeyer, I., Jentsch, T. J., Hübner, C. A. Expression of the KCl cotransporter KCC2 parallels neuronal maturation and the emergence of low intracellular chloride. Journal of Comparative Neurology. 468 (1), 57-64 (2004).
- Wong, B. Y., Prince, D. A. The lateral spread of ictal discharges in neocortical brain slices. Epilepsy Research. 7 (1), 29-39 (1990).
- Trevelyan, A. J., Sussillo, D., Watson, B. O., Yuste, R. Modular propagation of epileptiform activity: evidence for an inhibitory veto in neocortex. Journal of Neuroscience. 26 (48), 12447-12455 (2006).
- Brahma, B., Forman, R., Stewart, E., Nicholson, C., Rice, M. Ascorbate inhibits edema in brain slices. Journal of Neurochemistry. 74 (3), 1263-1270 (2000).
- MacGregor, D. G., Chesler, M., Rice, M. E. HEPES prevents edema in rat brain slices. Neuroscience Letters. 303 (3), 141-144 (2001).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: Application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Patch-clamp Methods and Protocols. Martina, M., Taverna, S. , Humana Press. New York, NY. 221-242 (2014).
- Swartzwelder, H. S., Lewis, D., Anderson, W., Wilson, W. Seizure-like events in brain slices: suppression by interictal activity. Brain Research. 410 (2), 362-366 (1987).
- Lees, G., Stöhr, T., Errington, A. C. Stereoselective effects of the novel anticonvulsant lacosamide against 4-AP induced epileptiform activity in rat visual cortex in vitro. Neuropharmacology. 50 (1), 98-110 (2006).
