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Neuroscience

Iniciação de geração e demanda de atividade estável aguda em roedores e tecido humano

Published: January 19, 2019 doi: 10.3791/57952
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,2,3,5,6, 1,2,3,4
1Division of Fundamental Neurobiology, Krembil Research Institute, 2Institute of Medical Science, Faculty of Medicine, University of Toronto, 3Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto, 4Division of Neurosurgery, Department of Surgery, University of Toronto, 5Division of Neurology, Department of Medicine, University of Toronto, 6Department of Physiology, University of Toronto

Summary

Modelos de convulsão aguda são importantes para estudar os mecanismos subjacentes epileptiforme eventos. Além disso, a capacidade de gerar eventos epileptiforme sob demanda fornece um método altamente eficiente para estudar a sequência exata de eventos subjacentes a sua iniciação. Aqui, descrevemos os modelos de apreensão cortical aguda 4-aminopiridina estabelecidos em mouse e tecido humano.

Abstract

Controlar convulsões permanece uma questão desafiadora para a comunidade médica. Para progredir, pesquisadores precisam de uma maneira extensivamente estudar a dinâmica de apreensão e investigar seus mecanismos subjacentes. Modelos de convulsão aguda são convenientes, oferecem a capacidade de realizar gravações eletrofisiológicas e podem gerar um grande volume de electrographic apreensão, como de eventos (estável). Os resultados promissores de modelos de convulsão aguda então podem ser avançados para modelos de epilepsia crônica e ensaios clínicos. Assim, estudar convulsões em modelos agudas que reproduzem fielmente as assinaturas electrographic e dinâmicas de uma convulsão clínica será essencial para fazer achados clinicamente relevantes. Estudar eventos estável em convulsão aguda modelos preparados a partir de tecido humano também é importante para fazer descobertas que são clinicamente relevantes. O foco principal deste artigo é sobre o modelo 4-AP cortical devido a sua versatilidade em gerar eventos estável em estudos tanto in vivo e in vitro , bem como em rato e tecido humano. Os métodos neste artigo também irão descrever um método alternativo de indução de convulsões, usando o modelo2 + Zero-Mg e fornecer uma visão geral detalhada das vantagens e limitações da atividade epileptiforme semelhantes gerados em diferentes aguda modelos de apreensão. Além disso, aproveitando comercialmente disponível optogenetic cepas de rato, um pulso de luz breve (30 ms) pode ser usado para acionar um evento estável idêntico àqueles que ocorrem espontaneamente. Da mesma forma, 30-100 ms sopros de neurotransmissores (ácido gama-Amino butírico ou glutamato) podem ser aplicados para o tecido humano para acionar eventos estável que são idênticos aos que ocorrem espontaneamente. A capacidade de desencadear eventos estável sob demanda em modelos de convulsão aguda oferece a recém-descoberta capacidade de observar a sequência exata dos eventos que dão suporte à dinâmica de iniciação de apreensão e com eficiência, avaliar potenciais terapias anti-apreensão.

Introduction

Modelos de convulsão aguda com êxito podem reproduzir electrographic assinaturas reminiscentes de eventos estável observados no eletroencefalograma (EEG) de indivíduos tendo uma convulsão. Os pesquisadores utilizam esses eventos como estável (aqui referidos como 'eventos estável') como substitutos para a apreensão de evento1. Clinicamente, estável eventos servem como um proxy confiável para eventos de apreensão desde convulsões são um transtorno neurológico que se origina no cérebro. Na unidade de monitorização de epilepsia, neurologistas dependem a detecção de eventos estável para confirmar eletrofisiolà região do cérebro e isolá-lo para ressecção2. Em unidade de terapia intensiva, os médicos monitoram atividade estável para avaliar se alguma atividade de apreensão persiste em pacientes sedado3. Controlar convulsões continua a ser uma questão desafiadora para a comunidade médica, como 30% dos pacientes de epilepsia são resistentes aos medicamentos, a medicação disponível4,5, e 10% dos casos médicos envolvendo convulsões induzidas por drogas são Não responde ao tratamento padrão3. Isto apresenta uma preocupação séria para a sociedade, como 10% da população americana é prospectado para experimentar um evento de apreensão em sua vida e 3% são esperados para desenvolver epilepsia6.

Estudando as apreensões em modelos de epilepsia crônica é caro, trabalhoso e muitas vezes levar meses para preparar a7. É também difícil de executar gravações eletrofisiológicas em animais movimentando-se livremente. Ensaios clínicos humanos enfrentam problemas semelhantes, bem como as complexidades adicionais relacionadas com o consentimento do paciente, variabilidade nas origens dos participantes e as considerações morais e éticas envolvidas8. Modelos de convulsão aguda, por outro lado, são favoráveis, porque eles são relativamente conveniente para preparar, custo-eficiente e capaz de gerar grandes volumes de eventos estável para estudo9. Além disso, o tecido é fixo em uma posição estável, assim que as condições são ideais para a realização das gravações eletrofisiológicas necessárias para estudar a dinâmica de apreensão e a fisiopatologia subjacente relacionada. Modelos de convulsão aguda permanecem favoráveis sobre modelos em silico (computador), porque eles são baseados no material biológico composto de rede neuronal constituintes do cérebro com todos os seus factores inerentes e conectividade sináptica, que não pode ser capturada por computador até os mais detalhado modelos10. Estas características fazem modelos de convulsão aguda preparados para ser eficiente na triagem para potenciais anti-apreensão terapias e fazer conclusões preliminares antes de avançá-los para maiores investigações em modelos de epilepsia crônica e ensaios clínicos.

Normalmente, modelos de convulsão aguda são derivados do tecido cerebral normal que tenha sido submetido a condições hiperexcitável. Para induzir eventos estável clinicamente relevantes no tecido cerebral saudável, é importante compreender que o cérebro funciona otimamente em um estado crítico11 onde (E) de excitação e inibição (I) são equilibradas12. Uma interrupção do E-eu balanço pode levar ao estado de hiperexcitável apreensão em que precipitam eventos estável. Da mesma forma, dentro deste quadro conceptual, há duas estratégias principais para gerar eventos estável em fatias de cérebro (em vitro) ou em preparações todo-cérebro (na vivo): diminuição da inibição ("desinibição") ou aumentada excitação ("não-desinibição"). No entanto, eventos estável são altamente ordenados e sincronizado eventos que exigem a influência dos interneurônios gabaérgica para orquestrar a rede neural atividade13,14. Por esta razão, não-desinibição modelos são os mais eficazes para gerar eventos estável em redes neurais isolados, como em um em vitro cérebro fatia15, Considerando que em vitro modelos desinibição comumente levam a picos de atividade reminiscência de interictais como cravação. Além disso, dentro deste quadro conceptual, um evento de sincronização momentâneo confiável também pode desencadear um evento estável16. Na verdade, um evento estável pode ser desencadeado por qualquer pequena perturbação aplicada ao sistema neural17 quando está em um estado crítico de transição ("bifurcação") ponto18. Tradicionalmente, estas perturbações foram induzidas por estimulação elétrica. No entanto, o recente desenvolvimento de optogenetics em neurociência, oferece agora uma estratégia mais elegante para induzir transições de estado crítico16.

Os métodos descritos neste artigo demonstram como gerar eventos estável sob demanda em modelos de convulsão aguda para tanto in vitro (etapa 1 do protocolo) e na vivo estudos (etapa 2 do protocolo). Eles envolvem a escolha da região do cérebro, método de indução de convulsões, tipo de estudo e espécie; no entanto, o foco será sobre a escolha recomendada de um modelo de apreensão de cortical aguda 4-AP devido à sua versatilidade em uma grande variedade de tipos de estudo. O modelo 4-AP convulsão aguda em vitro é baseado no protocolo padrão para preparar fatias de cérebro de alta qualidade para gravações eletrofisiológicas e19estudos de imagiologia. Esses protocolos já tem sido usados para fazer em vitro coronal do cérebro fatias de córtex somatossensorial-motor de ratos16,20 e humanos21. Modificações para gerar eventos estável nestes tipos de fatias do cérebro tenham sido demonstradas anteriormente16 e os detalhes são descritos no protocolo abaixo. O modelo 4-AP cortical convulsão aguda na vivo é baseado no protocolo padrão para preparar uma craniotomia para estudos22de imagem. A modificação é que nenhuma janela (lâmina de vidro) é instalada após a craniotomia. Em vez disso, agentes proconvulsant (4-AP) são topicamente aplicados ao córtex exposto para induzir eventos estável, enquanto o animal está sob anestesia geral. A nosso conhecimento, nosso grupo foi o primeiro a desenvolver este modelo de apreensão cortical aguda na vivo em camundongos16,23. O modelo 4-AP cortical convulsão aguda na vivo preparado a partir de ratos adultos foi desenvolvido para complementar o modelo in vitro fatia do tecido juvenil. A replicação das conclusões no modelo de apreensão adulto na vivo contribui para generalizar os resultados de modelos de fatia, abordando as preocupações inerentes sobre as condições de não-fisiológica de uma fatia do cérebro 2D (contra um 3D todo-cérebro estrutura) e as diferenças fisiológicas entre jovens e adulto de tecido.

O método de início de evento estável sob demanda é demonstrado usando ou sopros de neurotransmissores com uma estratégias de picospritzer ou optogenetic. O melhor de nosso conhecimento, nosso grupo é a primeira a iniciar eventos estável em tecido humano usando neurotransmissores através de um picospritzer16. Estratégias de optogenetic, a cepa de camundongos C57BL/6 é a tensão convencional usada para expressar transgenes. A expressão de channelrhodopsin-2 (ChR2) em interneurônios gabaérgica ou células piramidais glutamatérgico irá fornecer a capacidade opcional para gerar eventos estável on-demand com breves pulsos de luz. Cepas de ratos optogenetic adequado incluem a variante C57BL/6 comercialmente disponível que expressa ChR2 em qualquer interneurônios, usando o rato vesicular GABA transportador promotor (VGAT)24, ou células piramidais, usando o antígeno da pilha do mouse Timo 1 promotor (Thy1)25. Estes ratos VGAT-ChR2 e Thy1-ChR2 comercialmente disponíveis oferecem a oportunidade de ativar os neurônios gabaérgica ou neurônios glutamatérgico, respectivamente, no neocórtex com azul (470 nm) luz. A capacidade de gerar eventos estável sob demanda em modelos de convulsão aguda pode oferecer novas oportunidades para estudar a dinâmica de iniciação de apreensão e eficientemente avaliar potenciais terapias anti-apreensão.

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Protocol

Toda pesquisa envolvendo pacientes foi realizada sob um protocolo aprovado pelo Conselho de ética da Universidade saúde rede pesquisa em conformidade com a declaração de Helsinque. Procedimentos que envolvam animais estavam em conformidade com as diretrizes do Conselho canadense no cuidado Animal e aprovaram pelo Krembil Research Institute Animal conta Comité.

1. protocolo i: aguda com base no modelo In vitro apreensão

  1. Preparação de soluções de dissecação e artificial líquido cefalorraquidiano
    1. Carbogenate água ultrapura (que é água filtrada com uma resistividade de 18,2 MΩ·cm) com carbogênio (95% O25% CO2) por 5 min usando ar difusores de bolha pedra (aeradores para aquários).
      Nota: As pedras de ar podem ser conectadas para o tanque carbogênio regulador através do silicone padrão tubulação. Se pedras de ar não estão disponíveis, selo feche a extremidade do tubo do silicone e picar furos pequenos no selo para permitir que o gás carbogen a bolha para fora e carbogenate a solução.
    2. Prepare uma solução de dissecação, dissolvendo os solutos da tabela 1 em água ultrapura. Adicione o CaCl2 para uma solução que tem sido carbogenated pelo menos 5 min ajudar a dissolver.
      Nota: Como alternativa, adicione o CaCl2 primeiro, assim que pode dissolver facilmente em uma solução insaturada. A solução, na forma líquida, deve ser de 300-320 mOsm/L e tem um pH de 7.4 após ser saturado com carbogênio.
      1. Esfriar a solução de dissecação para 0 - 4 ° C. Deixe a solução na geladeira durante a noite ou coloque a solução no congelador por 1h e monitorar continuamente a temperatura.
        Nota: A solução de dissecação pode ser armazenada por até 3 noites; Descarte depois.
      2. Carbogenate a solução de dissecação por 5-10 min antes de usar.
        Nota: Idealmente, a solução também deve aparecer como lama ou estar em transição para lama antes da utilização.
    3. Prepare-se roedores artificial líquido cefalorraquidiano (ACSF), dissolvendo os solutos da tabela 2 (ou 3 tabela para humano ACSF) em água ultrapura. Carbogenate a solução ACSF enquanto ele está em um banho de água aquecido a 35 ° C até o uso. Adicione o CaCl2 para uma solução que tem sido carbogenated pelo menos 5 min ajudar a dissolver.
      Nota: Como alternativa, adicione CaCl2 primeiro, assim que pode dissolver mais fácil em uma solução insaturada. A solução, na forma líquida, deve ser 290-320 mOsm/L e tem um pH de 7.4 após ser saturado com carbogênio. Soluções devem ser feitas em volumes 1, 2 ou 4 L, dependendo da duração dos experimentos. Fazer 4 L por um dia completo (8 h) de experimentos. A ACSF deve ser feito fresco cada dia; não armazená-lo por mais de 1 d.
  2. Dissecação de mouse para coletar o tecido cerebral
    Nota: Para o tecido humano, prossiga para a próxima etapa (etapa 1.3) em fazer fatias do cérebro com o vibratome. Os blocos em forma de cubo (3de 1 cm) de tecido cerebral devem ser obtidos com o neurocirurgião usando os procedimentos descritos anteriormente26,27.
    1. Recolha todas as ferramentas e materiais necessários para as dissecções de animais. Configure o espaço de trabalho para se preparar para as dissecções de animais.
      1. Verifique se o tanque de carbogênio (95 %O2/5%CO2) para garantir que não está vazio. Substitua o cilindro de gás antes de experiências se houver menos de 500 psi de pressão restante.
      2. Calibre o vibratome (cortador de lâmina tecido de vibração) de acordo com o manual de instruções do fabricante. Ajuste o vibratome de configuração para uma amplitude de corte de 1 mm e uma velocidade de corte de 0.12 mm/s.
        Nota: As configurações ideais podem ser diferentes para cada cortador de lâmina de tecido vibração individual; no entanto, em geral, a amplitude deve ser alta e a velocidade de corte deve ser baixa.
      3. Encha a câmara de incubação de fatia de cérebro (ou seja, o guardião de fatia do cérebro) com ACSF e bolha-lo com carbogênio. Em seguida, coloque a câmara de incubação num banho de água a 35 ° C.
        Nota: Utilize o roedor ACSF para fatias de cérebro de roedor e ACSF humano para fatias do cérebro humano.
    2. Obter um rato juvenil de ambos os sexos, entre a idade de 13 d (p13) para 21 d (p21, onde p0 é a data de nascimento).
    3. Anestesia o rato com uma injeção intraperitoneal de pentobarbital de sódio (55 mg/kg de peso corporal). Uma vez que o mouse é profundamente anestesiado, conforme indicado pela ausência de reflexo de pitada do dedo do pé, prontamente, use um instrumento de guilhotina veterinário aprovado para decapitar o mouse em um movimento rápido.
      Nota: Prepare a injeção de pentobarbital de sódio de acordo com os procedimentos recomendados pelas diretrizes institucionais.
    4. Segura o nariz do rato para estabilizar a cabeça decapitada e suavemente faça uma incisão começando entre os olhos do rato e ao longo do comprimento inteiro do couro cabeludo para expor o crânio. Garantir que o crânio não é comprimido pela pressão aplicada pela navalha. Use o canto da navalha para aumentar a precisão do corte.
    5. Afastados os retalhos de couro cabeludo do mouse usando os dedos para expor o crânio. Em seguida, use o canto fresco de uma navalha para fazer uma incisão ao longo da linha média do crânio; Preste muita atenção para evitar qualquer contato com o córtex cerebral.
    6. Fórceps de lasca de inserção em soquetes do olho do rato para estabilizar a cabeça decapitada e colocá-lo em uma placa de Petri cheia de frio (0 - 4 ° C) solução de dissecação. Certifique-se de que a cabeça é totalmente imersa na solução de dissecação.
    7. Use um segundo conjunto de pinças de lasca suavemente descascar o couro cabeludo do rato, remova o osso do nariz descascando-lo e remover a parte de trás (lado caudal) do crânio.
      Nota: O osso do nariz dos ratos juvenis é muito macio e facilmente quebrados.
    8. Use uma micro espátula para cortar a medula espinhal, nervos trigêmeo e nervos ópticos. Em seguida, use a micro espátula delicadamente separar o cérebro o crânio. Deixa o cérebro totalmente submergido na prato de Petri preenchida com solução de dissecação.
  3. Preparação de corticais fatias de córtex somatossensorial-motor
    1. Encha a bandeja de tampão com do vibratome com ~ 150 mL de frio (0 - 4° C) solução de dissecação.
      Nota: Opcionalmente, mantenha a bandeja de tampão no congelador até que seja necessário manter a temperatura baixa durante o procedimento de corte.
    2. Cole o tecido de cérebro de rato ou humanos para o palco vibratome (espécime titular/bandeja) usando cola adesiva instantânea. Para os ratos, corte uma pequena porção caudal do cérebro (ou seja, o cerebelo) para que pode ser facilmente colada horizontalmente sobre o suporte de amostra (permitindo o lado rostral do cérebro para enfrentar o teto).
      Nota: Como alternativa, fatias de cérebro de rato horizontal podem ser preparadas pela colagem do lado dorsal do cérebro para o suporte de amostra (o lado ventral do cérebro deve enfrentar o teto)28.
    3. Coloque suavemente o suporte de amostra (com tecido cerebral) no bandeja de tampão. Certifique-se de que a porção dorsal do cérebro está enfrentando a lâmina do vibratome.
      Nota: É fundamental para minimizar a quantidade de tempo que o cérebro é exposto ao ar.
  4. Corte de tecido de cérebro e coleção
    1. Corte o cérebro em 450 μm de espessura usando o vibratome no dorsal para direção ventral. Certifique-se de que o cérebro permanece completamente ancorado na bandeja do espécime enquanto corta.
      1. Fazer o primeiro corte no cérebro do rato para remover o bulbo olfativo. Em seguida, fazer cortes subsequentes até a área somatossensorial-motor é observada (localizado aproximadamente no meio do caminho entre o bulbo olfativo e bregma).
        Nota: Opcionalmente, fatia do cérebro mais finas fatias (200 μm) até o corpo caloso aparece na exibição coronal do cérebro, que indica que a área somatossensorial-motor está perto.
    2. Usar uma pipeta de transferência largo-furo para coletar fatias coronais (450 μm) que contêm a área somatossensorial-motor e mergulhe-os em um prato de Petri contendo frio (0 - 4 ° C) solução de dissecação.
    3. Usar uma nova lâmina e corte qualquer excesso de tecido do rodelas. Para fatias coronais de ratos, execute um corte logo abaixo da comissura neocortical (ou seja, corpo caloso) transverso. Não corte num movimento de serrar; simplesmente aplicar pressão sobre a lâmina no tecido e um pincel de detalhamento para separar suavemente o tecido. Certifique-se de minimizar o movimento da fatia coronal.
    4. Utilização de uma pipeta de transferência largo-furo para transferir a porção dorsal das fatias coronais que contêm o neocórtex (camada 1-6), para uma segunda placa de Petri cheia de morna (35 ° C) ACSF por um momento (~ 1 s). Então, prontamente transfira as fatias para uma câmara de incubação contendo morna (35 ° C) carbogenated ACSF.
      Nota: A finalidade da transferência para o prato de Petri com ACSF é minimizar a transferência de solução de dissecação para a câmara de incubação enquanto transfere fatias do cérebro com a pipeta de largo diâmetro. Utilize a câmara úmida organizaram vários poços para manter fatias diferentes do cérebro.
    5. Descarte o resto do cérebro e carcaça de animais de acordo com as orientações institucionais.
  5. Incubação e manutenção
    1. Deixe as fatias de cérebro ligeiramente submergidas na câmara de incubação a 35 ° C por 30 min. Em seguida, remova a câmara de incubação do banho de água e deixe-o voltar à temperatura ambiente (20-25 ° C). Espere 1h para as fatias de cérebro para se recuperar antes de realizar gravações eletrofisiológicas.
      Nota: Certifique-se há nenhuma bolha de ar que recolhem por baixo as fatias de cérebro em câmara úmida. Bolhas de ar são interfaces de ar que causam danos aos tecidos. As fatias de cérebro de rato podem ser mantidas por 6-8 h, enquanto o tecido do cérebro humano pode ser armazenado por até 24 h em uma câmara de incubação bem-carbogenated com a ACSF apropriado.
  6. Eletrofisiológicas gravações da camada cortical superficial
    Nota: Eventos estável são observados nas gravações (LFP) potenciais extracelular campo local de fatias de cérebro. A LFP da fatia cerebral pode ser observada e gravada com uma interface tipo câmara29 ou um sistema de matriz de multi eletrodo submerso (MEA)16. O procedimento tem sido descrito anteriormente16 e detalhes adicionais são descritos abaixo.
    1. Use uma pipeta de transferência de calibre largo ou uma escova de detalhamento para mover uma fatia do cérebro para o papel de lente pré-cortada ligeiramente maior que é realizada utilizando uma pinça odontológica. Transferir o papel de lente (que a fatia do cérebro está descansando em cima) para a câmara de gravação e fixá-lo em posição com uma tela de harpa.
    2. Executar quente (35 ° C), carbogenated ACSF perfusato através da câmara de gravação sobre a fatia do cérebro a uma taxa de 3 mL/min (~ 1 gotejamento/s). Use um termômetro digital para garantir que a câmara de gravação é 33-36° C.
    3. Puxe os eletrodos de vidro com uma impedância de 1-3 MΩ de tubos de vidro de borosilicato (com um diâmetro exterior de 1,5 mm) usando um extrator. Aterre os eletrodos de vidro com ACSF (~ 10 µ l) utilizando uma seringa de Hamilton. Descarte imediatamente o eletrodo se a ponta estiver danificada.
      Nota: Bleach o fio de prata (5 min) e permitir apenas uma parcela mínima (ou seja, a ponta) do fio de prata para ser submersa os eletrodos de vidro cheio de volta ACSF para minimizar o ruído e a deriva durante as gravações. Remova qualquer excesso ACSF o eléctrodo de vidro com uma seringa de Hamilton, se necessário.
    4. Uso de microscópio estéreo X 20 com precisão guia o gravação eléctrodo de vidro para o superficial cortical da camada (2/3) usando manipuladores manuais. / Modo de registro da atividade elétrica da fatia cerebral em um computador com software padrão.
      Nota: Fatias viável (alta qualidade) cérebro irão expor um robusto potencial evocado em resposta aos estímulos elétricos aplicados (100 µs, 30-300 μA) ou pulsos de luz (30 ms, 10 mW/mm2) para o tecido optogenetic.
  7. Indução de convulsão, como atividades
    1. Perfundir ACSF contendo 100 µM 4-aminopyrimidine (4-AP) sobre a fatia de cérebro. Dissolva a 80 mg de 4-AP em 8,5 mL de água para fazer uma solução stock de 100 mM 4-AP. Adicionar 100 µ l de solução-mãe de 100 mM 4-AP para 100 mL de ACSF para alcançar um perfusato ACSF com 100 µM 4-AP.
      Observação: Como alternativa, use Zero-Mg2 + ACSF (tabela 4), uma solução ACSF modificada contendo nenhum adicionado Mg2 +, para perfundir a fatia do cérebro. Para o tecido humano, use uma combinação de 100 µM 4-AP em Zero-Mg2 + ACSF humano (tabela 5) para alcançar melhores resultados. O tempo médio para eventos estável aparecer é de 15 min; no entanto, pode demorar até 40 min para algumas fatias de cérebro.
  8. Geração de demanda apreensão: uma estratégia de optogenetic para optogenetic de ratos
    1. Aplicar um pulso de breves (30 ms) de azul (470 nm) luz (com uma intensidade de saída mínimo 1 mW/mm2 ) para iniciar um evento estável. Use um manipulação manual para posicionar um núcleo de fibra 1.000 µm de diâmetro ótica (0,39 NA) diretamente acima da região de gravação.
      Nota: Definir a taxa da foto-estimulação para coincidir com a taxa desejada da ocorrência do evento estável (ou seja, 1 pulso a cada 50 s). No entanto, a taxa não pode ser excessivamente exagerada da taxa intrínseca em que ocorrem eventos estável.
  9. Geração de demanda apreensão: uma estratégia de não-optogenetic de tecido humano
    1. Posicione a fatia do cérebro para que as camadas superficiais são rio acima, e nas camadas profundas são a jusante para o fluxo do perfusato através da câmara de gravação.
    2. Puxe um eléctrodo de vidro (mesmo tipo usado para as gravações de LFP) e toque levemente sua ponta com um limpador de delicada tarefa de criar uma pequena abertura. Aterramento do eletrodo com ~ 25 µ l de 100mm GABA (dissolvido em água) e anexá-lo para o picospritzer. Alternativamente, o aterramento do eletrodo com 200 µM glutamato (dissolvido em água).
      Nota: Para estimar o volume sendo inchado da picospritzer (~ 50 µ l), aplique uma baforada de teste em uma placa de plástico (de preferência quadriculada). Em seguida, aplica uma gota de volumes conhecidos (ou seja, 10 µ l, 20 µ l, 50 µ l ou 100 µ l), com uma pipeta para uma comparação com o sopro de teste.
    3. Aplica os sopros do neurotransmissor (GABA ou glutamato) para o tecido humano com um picospritzer (10-20 psi para 30-100 ms) para iniciar um evento estável. Aplicar um único sopro de 100mm GABA na camada profunda (5) do tecido cerebral para gerar eventos estável na camada superficial (2/3). Como alternativa, aplica um único sopro de 200 µM glutamato diretamente sobre a camada superficial para gerar eventos estável na camada superficial.
      Nota: Definir a taxa de picospritzer o sopro para coincidir com a taxa desejada da ocorrência do evento estável (ou seja, 1 pulso a cada 50 s). No entanto, a taxa não pode ser excessivamente exagerada da taxa intrínseca em que ocorrem eventos estável.

2. Protocolo II: Aguda In vivo modelo de apreensão

  1. Cirurgia e preparação cirúrgica
    1. Obter um rato adulto (p35 - p60) de ambos os sexos.
    2. Anestesia profundamente mouse com cetamina (95 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg). Realize o teste de reflexo de dedo-pinch para garantir que o rato está sedado. Como alternativa, use o isoflurano (4% para indução, 1.5-2% para a cirurgia) para anestesiar o mouse.
      Nota: A escolha dos anestésicos pode afetar a atividade de apreensão30,31.
    3. Monte o mouse em uma armação estereotáxica fixando sua cabeça com barras de orelha. Coloque uma almofada aquecida sob o mouse para a duração da cirurgia.
    4. Raspe a parte superior da cabeça do rato usando um trimmer de roedor para expor o couro cabeludo. Injete 0,3 mL de lidocaína com um 25 5/8 na agulha o periósteo para evitar sangramento excessivo ou dor. Aplica a pomada para os olhos do rato para evitar que sequem durante o experimento.
    5. Beliscar e levantar o centro do couro cabeludo do rato para avaliar se seus reflexos desapareceram. Posteriormente, realize uma horizontal de corte para expor o bregma a região de lambda do crânio. Delicadamente, raspe toda a área exposta do crânio com um cotonete de algodão para criar uma superfície seca.
    6. Execute uma craniotomia de 4 mm de diâmetro na coordenadas 2,0 mm rostrocaudal lateromedial e-2,00 mm para expor o córtex somatossensorial. Marca o local com um círculo (4 milímetros no diâmetro) usando um marcador permanente. Broca ao redor do círculo com uma broca pneumática dental até a camada restante do osso craniotomia facilmente cede quando empurrado para baixo. Aplica solução salina sobre a camada de osso antes de remover a craniotomia com fórceps de lasca. Posteriormente, aplica a solução salina tépida à região exposta.
  2. Métodos de gravação e química indução de convulsões
    1. Puxe os eletrodos de vidro com uma impedância de 1-3 MΩ de tubos de vidro de borosilicato (com um diâmetro exterior de 1,5 mm) usando um extrator. Aterre os eletrodos de vidro com ~ 10 µ l de ACSF ou soro fisiológico usando um Hamilton de seringa. Descarte imediatamente o eletrodo se a ponta estiver danificada.
      Nota: Bleach o fio de prata (5 min) e permitir apenas uma parcela mínima (ou seja, a ponta) do fio de prata para ser submersa os eletrodos de vidro cheio de volta ACSF para minimizar o ruído e a deriva durante as gravações. Remova qualquer excesso ACSF o eléctrodo de vidro com uma seringa de Hamilton, se necessário.
    2. Usar um manipulador manual para guiar o eletrodo de vidro para o superficial cortical (2/3) da camada na área somatossensorial-motor. / Modo de registro da atividade elétrica da fatia cerebral em um computador com software padrão.
      Nota: Camada 2/3 é aproximadamente de 0,3 mm de profundidade da superfície32.
    3. Topicamente, aplica ~0.5 mL 1,5 mM 4-AP soro fisiológico para o córtex exposto do rato com uma seringa até cobrir completamente a craniotomia. Dissolva a 14 mg de 4-AP em 100 mL de solução salina isotônica, tornar-se uma solução de soro fisiológico 4-AP 1,5 mM.
      Nota: Prepare o soro fisiológico 4-AP antes de começa o experimento. Em média, estável eventos aparecem 15 a 30 min após aplicação tópica.
  3. Geração de demanda de convulsões em ratos optogenetic
    1. Aplicar um pulso de breves (30 ms) de azul (470 nm) luz (com uma intensidade de saída mínimo 10 mW/mm2 ) para iniciar um evento estável. Use um manipulação manual para posicionar um núcleo de fibra 1.000 µm de diâmetro ótica (0,39 NA) diretamente acima da região de gravação.
      Nota: Definir a taxa da foto-estimulação para coincidir com a taxa desejada da ocorrência do evento estável (ou seja, 1 pulso a cada 300 s). No entanto, a taxa não pode ser excessivamente exagerada da taxa intrínseca em que ocorrem eventos estável.

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Representative Results

A aplicação de 100 µM 4-AP para (sem danos) 450 fatias de cérebro cortical µm de tamanho boa qualidade de um juvenil VGAT-ChR2 rato induzido confiável estável eventos recorrentes (> 5 s) dentro de 15 min (Figura 1Ai). A aplicação de 100 µM 4-AP para fatias de má qualidade resultou na ruptura eventos ou spiking atividade (Figura 1Aii). Em média, 40% das fatias de cada cérebro de rato dissecado gerado com êxito eventos estável. Além disso, 83% (25/30) dos ratos dissecados resultou na fatia de pelo menos um cérebro que gerado com êxito eventos estável. Em fatias de cérebro com espontaneamente ocorrendo eventos estável, a aplicação de um pulso de luz breve 30 ms na fatia cerebral confiantemente desencadeou um evento estável que era idêntico em morfologia (Figura 1Aiii e 1Aiv). As mesmas conclusões foram feitas em fatias de cérebro de ratos Thy1-ChR2 (figura 1B). Assim, independentemente de qual neuronal-subpopulação foi ativado, qualquer breve evento em isolados de sincronização rede neural cortical levou ao aparecimento de um evento estável. Esses eventos estável foram compostos de uma sentinela espiga (preictal) (Figura 2Aii e 2Bii), tônico, como queima (Figura 2Aiii e 2Biii), clônica, como queima (Figura 2Aiv e 2Biv) e atividade rebentamento no final (Figura 2Av e 2Bv); Eles eram semelhantes na natureza para as assinaturas electrographic associadas clínico apreensões33. Além disso, estes ratos juvenis foram fisiologicamente, como adulto, como a adição de 10 µM bumetanida (BUM), um bloqueador de NKCC1, não teve efeito sobre os eventos estável resultantes (Figura 2).

O modelo 4-AP cortical fatia em vitro confiantemente gerados eventos estável consistentes para ~ 1 h (Figura 1Ai), Considerando que o modelo2 + Zero-Mg normalmente gerados eventos estável para ~ 10 min antes de se transformar rapidamente em actividades semelhantes a explosão ( Figura 3A). No entanto, se um método não-4-AP de indução de convulsões é necessário, o modelo2 + Zero-Mg pode ser modificado com a adição de 5-10 µM baclofen (um agonista de receptores GABAB ) para transformar a atividade de rebentamento volta em eventos estável (Figura 3B) . Em geral, métodos de não-desinibição para aumentar a excitabilidade (isto é, 4-AP ou Zero-Mg2 + ACSF) confiável reproduziram eventos estável em fatias de cérebro cortical. Em contraste, métodos de desinibição [i.e., prosencefálico (IMC), um antagonista dos receptores GABAA ] resultaram em picos de atividade reminiscente de atividade interictais ou estourando a atividade, ao invés de eventos estável (Figura 4A). Da mesma forma, modelos de convulsão aguda preparados a partir de 100 µM 4-AP-tratados fatias hippocampal gerado interictais cravação atividade ou estado de mal epiléptico como condições semelhantes no CA3 (Figura 4B). O vivo 4-AP cortical modelo correspondentemente gerados eventos recorrentes estável (> 5 s). Estável eventos foram observados em superficial camada (2/3) dentro de ~ 30 min de aplicar topicamente 1.5 mM 4-AP para o córtex exposto de ratos adultos VGAT-ChR2. A aplicação de um pulso de luz breve 30 ms para o córtex exposto confiantemente desencadeou eventos estável que foram morfologicamente semelhantes aos que ocorrem espontaneamente (Figura 5).

O aplicativo de Zero-Mg2 + ACSF humano com 100 µM 4-AP para fatias de 'não-epiléptica' cérebro cortical (450 µm) de pacientes de epilepsia do lobo temporal confiável gerados eventos recorrentes estável (> 5 s) dentro de ~ 30 min (Figura 6Ai e 6Bi). Fatias de má qualidade gerado a atividade de cravação ou nenhuma atividade (Figura 1Aii). A viabilidade de fatias do cérebro foi considerada 'boa qualidade' quando um breve estímulo elétrico (100 µs, 30-300 µA) induziu uma resposta robusta, evocada na LFP no início do experimento. Uma vez estável eventos começaram a precipitar, a aplicação de um breve sopro (75 ms a 20 psi) de 100 mM GABA sobre a fatia de cérebro confiantemente desencadeou eventos estável que eram idênticos na morfologia com os que ocorrem espontaneamente (Figura 6Aii e 6Aiii) . Uma baixa concentração de GABA, 100-200 µM, provavelmente será eficaz também para em vitro experiências34; no entanto, uma maior concentração de GABA, 100 mM, recomenda-se para na vivo experimentos35. As mesmas observações foram reproduzidas quando um breve sopro de 200 µM glutamato foi aplicado para fatias do cérebro humano (Figura 6Bii e 6Biii). Assim, independentemente de quais receptores pós-sinápticos foram ativados, um evento de sincronização breve na rede neural cortical humano isolado confiantemente desencadeou um evento estável.

Figure 1
Figura 1: Modelo aguda em vitro apreensão cortical 4-AP. As linhas pretas representam o local campo potencial (LFP) gravação; as linhas azuis representam o estímulo da luz. (A) estes painéis são baseados nos resultados de um modelo de mouse VGAT-ChR2. Eles ilustram estável acontecimentos observados na gravação LFP da camada superficial (2/3) de uma fatia do cérebro cortical de alta qualidade, tratadas com 100 µM 4-AP. eu) este painel mostra uma visão geral da gravação LFP. ii) são exemplos de LFP gravação de fatias de cérebro de má qualidade. Barra de escala vertical é 0,4 mV, barra de escala horizontal é de 20 s. iii) isto é ampliado em vista de um evento de luz-acionou estável. iv) isto é ampliado em vista de um evento espontâneo e estável. (B) estes painel baseiam-se nos resultados de um modelo de mouse Thy1-ChR2. Eles ilustram estável acontecimentos observados na gravação LFP da camada superficial (2/3) de uma fatia do cérebro cortical tratados com 100 µM 4-AP. eu) este painel mostra uma visão geral da gravação LFP. ii) isto é ampliado em vista de um evento de luz-acionou estável. iii) isto é ampliado em vista de um evento espontâneo e estável. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: estável eventos gerados em uma fatia do cérebro (camada 2/3) de um juvenil (p13) VGAT-ChR2 rato perfundido com 4-AP e bumetanida (BUM). As linhas pretas representam o local campo potencial (LFP) gravação; as linhas azuis representam o estímulo da luz. (A), estes painéis mostram uma espontânea estável evento. eu) este painel mostra uma visão geral de todo o evento estável. Os seguintes painéis mostram ii) um sentinela spike, iii) tônico, como fogo, iv) disparo clônica-como e v) estourando a atividade. (B) estes painéis mostram um luz-acionou evento estável. eu) este painel mostra uma visão geral de todo o evento estável. Os seguintes painéis mostram ii) um pico de luz-acionou Sentinela da mesma fatia de gravação, iii) tônico, como fogo, iv) disparo clônica-como e v) estourando a atividade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Aguda em vitro Zero-Mg2 + apreensão cortical modelo. As linhas pretas representam o local campo potencial (LFP) gravação; as linhas azuis representam o estímulo da luz. () Estes painéis são baseados nos resultados de um modelo de mouse VGAT-ChR2. eu) este painel ilustra as condições de status epiléptico, como observadas na gravação LFP da camada superficial (2/3) de uma fatia do cérebro cortical tratados com Zero-Mg2 + ACSF. ii) isto é ampliado em vista de um evento de luz-acionou estável. iii) esta é uma visão de zoom-in a estado de mal epiléptico rebentamento de atividade de. (B) estes painéis mostram a mesma fatia de gravação com a adição de baclofen. eu) a aplicação de 5 µM de baclofen para o Zero-Mg2 + ACSF transforma a atividade de rebentamento volta em distintos eventos recorrentes estável. ii) isto é ampliado em vista da atividade rebentamento. iii) esta é uma visão de zoom-in do evento estável distinta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Aguda em vitro estourando/cravação de modelos. As linhas pretas representam o local campo potencial (LFP) gravação; as linhas azuis representam o estímulo da luz. (A) estes painéis mostram os resultados de uma fatia cortical de um VGAT-ChR2mouse, ilustrando a ruptura atividade observada em superficial da camada (2/3) após a adição de 10 µM IMC para 100 µM 4AP. eu) esta é uma visão geral da gravação LFP. A linha vermelha pontilhada indica quando o IMC entrou em vigor. ii) isto é ampliado em vista de um evento de luz-acionou estável. iii) isto é ampliado em vista da atividade ruptura espontânea. (B) estes painéis mostram os resultados de uma fatia de hipocampo de um rato de VGAT-ChR2, ilustrando um evento de status de mal epiléptico, como observado na área CA3 mediante a aplicação de 100 µM 4AP. i) esta é uma visão geral da gravação LFP. ii) isto é ampliado em vista de um evento estável. iii) esta é uma visão de zoom-in de luz-acionou e espontânea estourando eventos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Modelo aguda na vivo apreensão cortical 4-AP. As linhas pretas representam o local campo potencial (LFP) gravação; as linhas azuis representam o estímulo da luz. (A) estes painéis mostram os resultados de um adulto (p56) modelo de mouse VGAT-ChR2 com 1.5 mM 4-AP topicamente aplicado ao córtex exposto. eu) este painel ilustra um evento estável acionada por luz observado na camada superficial (2/3) da área somatossensorial-motor. ii) esta é uma visão de zoom-in do evento estável acionada por luz de painel Ai. iii) esta é uma super zoom-in Vista da superveniência de luz-acionou evento estável (indicado pela seta preta). Esta figura é a versão não filtrada de uma figura de Chang et al . 16. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Aguda em vitro modelo de apreensão cortical humana. As linhas pretas representam o local campo potencial (LFP) gravação; as linhas marrons representam o sopro de picospritzer. (A) estes painéis mostram os resultados de uma fatia da cortical do cérebro de um paciente de epilepsia (MTLE) do lóbulo temporal, ilustrando os eventos estável observados em superficial da camada (2/3) seguindo uma perfusão com 100 µM 4-AP e Zero-Mg2 + ACSF humana . eu) esta é uma visão geral da gravação LFP. Os seguintes painéis mostram ii) ampliado em vista um evento estável acionadas por sopro de 100mm GABA e iii) ampliado em vista de um evento espontâneo e estável. (B) estes painéis mostram os resultados de uma fatia do cérebro cortical de outro paciente MTLE, ilustrando os eventos estável observados em superficial da camada (2/3) seguindo uma perfusão com 100 µM 4-AP e Zero-Mg2 + ACSF humana. eu) esta é uma visão geral da gravação LFP. Os seguintes painéis mostram ii) ampliado em vista de um 200 µM glutamato acionadas por sopro evento de estável e iii) ampliado em vista de um evento espontâneo e estável. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: receita para solução de dissecação. Estas são as instruções para fazer 1 L ou L 2 volumes. MW = peso molecular do soluto.

# Reagente Conc. [mM] MW (g/mol) 1L (g) 2L (g)
1 Sacarose 248 342.3 84.89 169.78
2 Bicarbonato de sódio (NaHCO2) 26 84.01 2.18 4.37
3 Glicose (D-glucose) 10 180.16 1.8 3.6
4 Cloreto de potássio (KCl) 2 74.55 0.15 0.3
5 O sulfato de magnésio (MgSO4·7H,2O) 3 246.47 0,74 1.48
6 Fosfato de sódio monobásico monohidratado (H2NaPO4· H2O) 1.25 137,99 0.17 0,34
7 Cloreto de cálcio (CaCl2·2H,2O) 1 147.01 0.15 0,29

Tabela 2: receita para roedor fluido espinal cerebral artificial (ACSF). Estas são as instruções para fazer 2 ou 4 L volumes. MW = peso molecular do soluto.

# Reagente Conc. [mM] MW (g/mol) 2L (g) 4L (g)
1 Cloreto de sódio (NaCl) 123 58,4 14.37 28.73
2 Bicarbonato de sódio (NaHCO2) 26 84.01 4.37 8,74
3 Glicose (D-glucose) 10 180.16 3.6 7.21
4 Cloreto de potássio (KCl) 4 74.55 0.6 1.19
5 O sulfato de magnésio (MgSO4· H2O) 1.3 246.47 0.64 1.28
6 Fosfato de sódio monobásico monohidratado (HNaPO4· H2O) 1.2 137,99 0,33 0,66
7 Cloreto de cálcio (CaCl2·2H,2O) 1.5 147.01 0,44 0,88

Tabela 3: receita para humano artificial espinal cerebral fluido (humano ACSF). Estas são as instruções para fazer 2 ou 4 L volumes. MW = peso molecular do soluto.

# Reagente Conc. [mM] MW (g/mol) 2L (g) 4L (g)
1 Cloreto de sódio (NaCl) 123 58,4 14.38 28,75
2 Bicarbonato de sódio (NaHCO2) 25.2 84.01 4.23 8.46
3 Glicose (D-glucose) 10 180.16 3.6 7.21
4 Cloreto de potássio (KCl) 4 74.55 0.6 1.19
5 O sulfato de magnésio (MgSO4· H2O) 1 246.47 0,49 0,99
6 Fosfato de sódio monobásico monohidratado (HNaPO4· H2O) 1.2 137,99 0,33 0,66
7 Cloreto de cálcio (CaCl2·2H,2O) 1 147.01 0,29 0,59

Tabela 4: receita para Zero-Mg 2 + artificial roedor espinal cerebral (Zero-Mg2 + ACSF). Estas são as instruções para fazer 2 ou 4 L volumes. MW = peso molecular do soluto.

# Reagente Conc. [mM] MW (g/mol) 2L (g) 4L (g)
1 Cloreto de sódio (NaCl) 123 58,4 14.37 28.73
2 Bicarbonato de sódio (NaHCO2) 26 84.01 4.37 8,74
3 Glicose (D-glucose) 10 180.16 3.6 7.21
4 Cloreto de potássio (KCl) 4 74.55 0.6 1.19
5 O sulfato de magnésio (MgSO4· H2O) Nominalmente livre 246.47 0 0
6 Fosfato de sódio monobásico monohidratado (HNaPO4· H2O) 1.2 137,99 0,33 0,66
7 Cloreto de cálcio (CaCl2·2H,2O) 1.5 147.01 0,29 0,59

Tabela 5: receita para Zero-Mg 2 + fluido espinal cerebral humano artificial (Zero-Mg2 + humana ACSF). Estas são as instruções para fazer 2 L ou L 4 volumes; MW = peso molecular do soluto.

# Reagente Conc. [mM] MW (g/mol) 2L (g) 4L (g)
1 Cloreto de sódio (NaCl) 123 58,4 14.38 28,75
2 Bicarbonato de sódio (NaHCO2) 25.2 84.01 4.23 8.46
3 Glicose (D-glucose) 10 180.16 3.6 7.21
4 Cloreto de potássio (KCl) 4 74.55 0.6 1.19
5 O sulfato de magnésio (MgSO4· H2O) Nominalmente livre 246.47 0 0
6 Fosfato de sódio monobásico monohidratado (HNaPO4· H2O) 1.2 137,99 0,33 0,66
7 Cloreto de cálcio (CaCl2·2H,2O) 1 147.01 0,29 0,59

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Discussion

As fatias do cérebro são tratadas com uma droga proconvulsant ou um perfusato ACSF alterado para aumentar a excitabilidade da rede neural e promover uma precipitação de estável eventos (electrographic apreensão-como). Para os ratos, as fatias coronais preferenciais da área somatossensorial-motor devem conter o córtex cingulado, área 2 (CG), mas não a área de retrosplenial (RS); estes marcadores anatômicos ajudam a identificar a gama de fatias coronais que são melhores para induzir eventos estável. Uma modificação opcional para o tecido de ratos é de cortar os dois hemisférios de fatia o cérebro ao meio para correspondência-par projetos experimentais, como os dois hemisférios são praticamente idênticas (unidades experimentais semelhantes). Ao preparar fatias de cérebro para gerar eventos estável, é imperativo para manter a integridade da rede neural e suas conexões sinápticas, porque eventos estável são um fenômeno de rede neural. Três pontos na etapa 1 do protocolo que são críticos para a qualidade da fatia são 1) o fatiamento procedimento 2) incubação e oxigenação 3). Em primeiro lugar, o procedimento de corte requer um equilíbrio entre velocidade e técnica. É crucial minimizar o tempo entre a decapitação (ou ressecção cirúrgica) e incubação, estando também cuidado com cada contato e movimento da fatia para evitar danos cerebrais. Em segundo lugar, a qualidade do tecido é muito sensível à temperatura de incubação e duração. É importante usar um timer e termômetro para garantir a incubação é a 35 ° C por 30 min. em terceiro lugar, que a viabilidade do tecido cerebral é sensível à exposição para algo diferente de oxigenado espinal cerebral (artificial). A fatia do cérebro irá expirar se isso não é perfundido com carbogenated ACSF por um período prolongado (~ 1 min).

Fatias de cérebro de ratos com idade p13 - p16 oferecem a maior probabilidade de sucesso gerando eventos estável. A razão é que os ratos ≤ p16 não requerem uma perfusão de transcardial antes de dissecações. Isso efetivamente reduz as chances de erros e acelera o processo de dissecação, que é um benefício enorme, porque a quantidade de tempo entre a decapitação e a incubação é inversamente correlacionada com viabilidade a fatia cérebro. Enquanto isso, os ratos > p13 reduziram a quantidade de NKCC1 que são comparável a um adulto de36. Em geral, juvenil (< p21) tecido é mais viável do que tecido adulto devido a uma excepcional capacidade de recuperação do procedimento de corte prejudicial. Esta semana a janela entre p13 e p21 oferece a oportunidade de explorar dos ratos adulto, como fisiologia e juvenil como uma habilidade para facilmente gerar eventos estável37,38. No entanto, se experiências exigem estudar eventos estável em fatias de cérebro de ratos adultos, um ACSF baseados em NMDG com HEPES, Tioureia e ascorbato ajudará a promover a viabilidade do tecido adulto24,39,40, 41. para o tecido humano, a adição de antioxidantes, como α-tocoferol, para a solução de dissecação pode beneficiar a viabilidade do tecido, especialmente durante o transporte de longa distância (> 30 min) entre a sala de operações e o laboratório para corte8,26. Para todas as fatias do cérebro, as condições favoráveis para gerar eventos estável são gravar a partir de 450 µm fatias grossas a 36 ° C. Fatias de cérebro precisam ser pelo menos 350 µm de espessura para conter suficiente neurônios na rede neural para gerar o evento estruturado e estável. No entanto, fatias não podem ser superior a 500 µm, enquanto que tornará difícil para o oxigênio difunda para o centro do tecido. Fatias que são 450 µm representam uma espessura ideal, onde uma ampla quantidade de conectividade de rede neuronal é mantida sem impedir a perfusão de oxigênio por todo o tecido. Por último, a precipitação de eventos estável é ideal 33 e 36 ° c; se a câmara de gravação não é pelo menos de 33 ° C, será difícil para estável eventos ocorram.

Uma limitação do modelo de apreensão aguda é que não geram convulsões. Eles só geram eventos estável, que são a assinatura electrographic de convulsão. Eventos estável tem não componentes comportamentais associados, tais como a perda de consciência ou convulsões motor que definem uma convulsão. Por conseguinte, modelos de convulsão aguda não podem ser usados para confirmar a eficácia dos potenciais candidatos de drogas anti-apreensão ou obter insights sobre epileptogenesis; tais questões de pesquisa devem ser dirigidas por modelos de epilepsia crônica e ensaios clínicos. Modelos de convulsão aguda devem ser usados somente para sua finalidade de realizar estudos preliminares fundamentais sobre os mecanismos de apreensão. Apenas os resultados mais promissores de modelos de convulsão aguda devem ser avançados para modelos superiores que são mais caros, trabalhoso preparar e requerem muito mais complexas considerações éticas.

Para progredir na investigação de epilepsia e convulsão, é imperativo ter um modelo de apreensão aguda confiável que pode se replicar com precisão a atividade de apreensão electrographic observada clinicamente no EEG de pacientes de apreensão. Para confiantemente reproduzir eventos estável em fatias de cérebro, métodos não-desinibição de aumentar a excitabilidade são necessários, Considerando que os métodos de desinibição (i.e., a antagonista dos receptores GABAA BMI) normalmente resultam em picos de atividade relembram a atividade interictais, ao invés de eventos estável (Figura 3A). O método preferido de não-desinibição é aplicar o agente proconvulsant 4-AP porque confiável pode gerar eventos estável consistentes por 1h. Em contraste, o Zero-Mg2 + cortical modelo gera eventos estável para somente ~ 10 min antes de se transformar rapidamente em atividades de ruptura (Figura 2A). Se usando o modelo2 + Zero-Mg, a adição de 5-10 µM baclofen, um agonista de receptores GABAB , vai ajudar a transformar eventos estável (Figura 2B), conforme mostrado anteriormente em fatias hippocampal42a atividade de ruptura. Além disso, o modelo 4-AP apreensão em vitro é preferível, porque as conclusões de que o modelo podem ser replicadas em seu na vivo homólogo, o vivo 4-AP cortical apreensão modelo (Figura 4). Não é possível modificar o todo fluido espinal cerebral de um rato adulto ao vivo para recriar o ambiente de aguda na vivo Zero-Mg2 + .

O aplicativo de 4-AP em fatias de cérebro cortical com precisão pode reproduzir a atividade de apreensão observada clinicamente15,33. Em contraste, fatias hippocampal 4-AP-tratados são predispostas a gerar interictais cravação atividade43 e status epiléptico como condições semelhantes (Figura 3B). Assim, para efeitos de estudar as convulsões, o aguda em vitro 4-AP cortical modelo é preferido sobre o in vitro 4-AP hippocampal modelo. Além disso, há praticamente sem oportunidades para gravar a partir de fatias hippocampal humanas viáveis, como ressecções mais hippocampal têm o CA1 e CA3 danificado21. Em contraste, o tecido cortical humano não-patológica é mais prontamente acessível como é que o resultado secundário de procedimentos neurocirúrgicos subcorticais, tais como a cirurgia de epilepsia do lobo temporal. Tecido neocortical non-epiléptica 'controle' também pode ser adquirido de cirurgias de ressecção do tumor. Por estas razões, o córtex é o local mais indicado para modelar a atividade de convulsão por causa da sua transportabilidade entre mouse e tecido humano para confirmar a relevância clínica. Finalmente, a tensão de C57BL/6 de ratos é preferida porque eles prontamente expressam transgenes, e variantes de optogenetic estão disponíveis comercialmente. Modelos de ratos de Optogenetic permitem a iniciação na demanda de eventos estável através de uma estimulação luminosa minimamente invasiva, breve. Isto torna o estudo de convulsões incrivelmente eficiente, eliminando os tempos de espera e permitindo a ativação alvo de subpopulações neuronais. Além disso, a capacidade de desencadear convulsões sob demanda permite novas formas de demarcar definitivamente o ponto exato de início de convulsão e potencialmente estudar a eficácia de candidatos da droga anti-convulsivante. Um programa fácil de usar baseado em MATLAB foi especificamente desenvolvido para detectar e classificar os diversos tipos de eventos epileptiforme que ocorrem nos modelos in vitro e in vivo apreensão 4-AP. Este programa de deteção está disponível para download a partir do repositório de GitHub do laboratório Valiante (https://github.com/Valiantelab/ChangValiante2018).

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pela institutos canadenses de pesquisa em saúde (MOP 119603 para Peter L. Carlen e Taufik A. Valiante), o Instituto do cérebro de Ontário (a Taufik A. Valiante) e a bolsa de pesquisa do estudante de Mightex (para Michael Chang). Gostaríamos de agradecer o Liam Long por sua assistência em filmar o vídeo manuscrito. Gostaríamos de agradecer a Paria Baharikhoob, Abeeshan Selvabaskaran e Shadini Dematagoda, por sua assistência na elaboração de figuras e tabelas neste manuscrito. Figura 1A, 3A, 4Ae 6A são todas as figuras originais, feitas a partir de dados publicados em Chang et al . 16.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium pentobarbital N/A N/A Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
1 mm syringe N/A N/A Purchased through UT Med Store
25G 5/8” sterile needle N/A N/A Purchased through UT Med Store
Single edge razor blade (2x) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Instant adhesive glue N/A N/A Purchased through UT Med Store
Lens paper N/A N/A Purchased through UT Med Store
Glass petri dish (2x) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Splinter forceps (2x) N/A N/A Purchased through UT Med Store
PVC handle micro spatula N/A N/A Purchased through UT Med Store
Micro spoon with flat end N/A N/A Purchased through UT Med Store
Detailing brush 5/0 N/A N/A Purcahsed from a boutique art store
Wide bore transfer pipette N/A N/A Purchased through UT Med Store
Dental Tweezer N/A N/A Purchased through UT Med Store
Thermometer (digital) N/A N/A Purchased on Amazon.ca
Check carbogen tank (95%O2/5%CO2)  N/A N/A Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
Vibratome Leica N/A Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
brain slice incubation chamber (a.k.a. brain slice keeper)  Scientific Systems Design Inc N/A
Sodium Chloride (NaCl) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Sodium Bicarbonate N/A N/A Purchased through UT Med Store
Dextrose N/A N/A Purchased through UT Med Store
Potassium Chloride (KCl) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Magnesium Sulfate (MgSO4 H2O) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Sodium phosphate monobasic monohydrate (HNaPO4·H2O) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Calcium Chloride (CaCl2·2H2O) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Sucrose N/A N/A Purchased through UT Med Store

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Neurociência edição 143 epileptiforme apreensão estável interictais 4-AP optogenetic ChR2 GABA sob demanda córtex hipocampo
Iniciação de geração e demanda de atividade estável aguda em roedores e tecido humano
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Chang, M., Dufour, S., Carlen, P.… More

Chang, M., Dufour, S., Carlen, P. L., Valiante, T. A. Generation and On-Demand Initiation of Acute Ictal Activity in Rodent and Human Tissue. J. Vis. Exp. (143), e57952, doi:10.3791/57952 (2019).

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