Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Akut Ictal faaliyet kemirgen ve insan dokusu üretimi ve isteğe bağlı başlatma

doi: 10.3791/57952 Published: January 19, 2019

Summary

Akut kriz modelleri epileptiform olaylar altında yatan mekanizmaları eğitim için önemlidir. Ayrıca, epileptiform olaylar üstünde-istek oluşturma yeteneği kendi başlatma altında yatan olay tam sırası çalışmaya son derece verimli bir yöntem sağlar. Burada, fare ve insan dokusu içinde kurulan akut 4-aminopyridine kortikal nöbet modelleri açıklar.

Abstract

Nöbetler kontrol zorlu bir sorunu için tıbbi topluluk kalır. İlerleme için araştırmacılar kapsamlı nöbeti dynamics çalışma ve onun temel mekanizmaları araştırmak için bir yol gerekir. Akut kriz modelleri uygun, elektrofizyolojik kayıtlar gerçekleştirme olanağı sunar ve electrographic nöbet benzeri (ictal) olayları çok fazla oluşturabilirsiniz. Akut kriz modelleri gelecek vaat eden bulgular sonra kronik epilepsi modelleri ve klinik deneyler için gelişmiş olabilir. Böylece, sadakatle klinik nöbet electrographic ve dinamik imzalarını taklit eden akut modelleri ele geçirme vakaları eğitim klinik bulgular yapmak için gerekli olacak. İctal olaylar insan dokudan hazırlanan akut kriz modelleri okuyan da klinik bulgular yapmak için önemlidir. Anahtar bu gazetede in vivo ve in vitro çalışmalar, hem de fare ve insan dokusu ictal olay üretme onun çok yönlülük nedeniyle kortikal 4-AP model üzerinde odaklanmıştır. Bu kağıt yöntemlerde de nöbet indüksiyon sıfır-Mg2 + modelini kullanarak alternatif bir yöntem açıklar ve avantajları ayrıntılı bir özetini ve farklı oluşturulan gibi epileptiform aktivite sınırlamaları sağlar akut nöbet modelleri. Ayrıca, piyasada bulunan optogenetic fare suşları yararlanarak, kısa (30 ms) ışık Nabzı o kendiliğinden meydana gelen benzer bir ictal olayı tetiklemek için kullanılabilir. Benzer şekilde, 30-100 ms puffs nörotransmiterler (Gamma Amino bütirik asit veya glutamat), o kendiliğinden meydana gelen aynıdır ictal olayları tetiklemek için insan dokusu uygulanabilir. Akut nöbet modellerinde isteğe bağlı ictal olayları tetiklemek için yeteneği tam sırası, nöbet başlatma dynamics altında yatan ve verimli bir şekilde değerlendirmek olası anti-nöbet tedaviler olayları gözlemlemek için newfound yeteneği sunuyor.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Akut kriz modelleri başarıyla electrographic imza ictal olaylar electroencephalogram (EEG) kriz yaşayan bireyler gözlenen anımsatan yeniden oluşturabilirsiniz. Araştırmacılar bu ictal benzeri olaylar (burada 'ictal olaylar' da adlandırılır) için nöbet olay1vekilleri olarak kullanın. Klinik olarak, nöbetler beyinden kaynaklanan bir nörolojik bozukluk olduğundan ictal olaylar nöbet olaylar için güvenilir bir vekil olarak hizmet vermektedir. Epilepsi izleme birimi cinsinden nörologlar algılama beynin epileptogenic bölge onaylamak ve rezeksiyon2için yalıtmak için ictal olayların üzerine güveniyor. Yoğun bakım ünitesinde hekimler herhangi bir nöbet aktivitesi uyuşturulan hastaların3' te devam ederse değerlendirmek için ictal etkinliğini izleyin. Epilepsi hastalarının % 30 için kullanılabilir ilaç4,5uyuşturucu dayanıklıdır ve tıbbi durumlarda ilaçla nöbetler içeren yüzde 10'u olarak tıbbi topluluk için zorlu bir sorun olmaya nöbetler kontrol kalır Standart tedavi3yanıt vermiyor. Bu toplum için ciddi bir endişe Amerikan nüfusunun % 10 yaşamları boyunca bir nöbet olay yaşamaya aramıştı ve % 3 epilepsi6geliştirmek bekleniyor olarak sunar.

Kronik epilepsi modelleri ele geçirme vakaları Eğitim zahmetli, pahalı ve genellikle7hazırlamak aylar alır. Elektrofizyolojik kayıtlar hayvanlar özgürce hareket gerçekleştirmek zordur. İnsan klinik çalışmalarda benzer sorunları, hem de hastanın rızası, katılımcıların arka planlar ve ahlaki ve etik konuları dahil8değişkenliği ile ilgili ek karmaşıklığı yüz. Nispeten uygun hazırlamak, maliyet-etkin ve geniş hacimli çalışma9ictal olayların üretme yeteneğine sahip oldukları için akut kriz modelleri, öte yandan, uygun değildir. Ayrıca, elektrofizyolojik kayıtlar nöbeti dynamics ve ilgili temel patofizyolojisi eğitim gerekli gerçekleştirmek için ideal koşullar bu yüzden doku istikrarlı bir konumda sabit. Biyolojik malzeme beynin kurucu nöronal ağ tüm doğal faktörler ve ebatlarını değil sinaptik bağlantı ile oluşan temel çünkü akut kriz modelleri silico (bilgisayar) modelleri üzerinde olumlu kalır Hatta en ayrıntılı bilgisayar tarafından10modelleri. Bu özellikler akut kriz modelleri olası anti-nöbet tedaviler için eleme ve onları daha fazla kronik epilepsi modelleri ve klinik araştırma yapılması için ilerleyen önce ön bulgular yapma etkili olmaya hazır olun.

Genellikle, akut kriz modelleri telaşlı hiper koşullara tabi normal beyin dokusu türetilir. Sağlıklı beyin dokusu içinde klinik ictal olaylar ikna etmek için bu uyarma (E) ve (I) inhibisyon dengeli12nerede beyin en iyi şekilde kritik11 ' çalışmasını anlamak önemlidir. Bir bozulma e-ben denge içinde ictal olaylar çökelti telaşlı hiper nöbet durumuna neden olabilir. Buna göre bu kavramsal çerçevede Beyin dilimleri (vitro) veya bütün-beyin (in vivo) hazırlıkları ictal olayları oluşturmak için iki büyük strateji vardır: ya inhibisyon ("disinhibisyonu") azalma ya da arttı uyarma ("Sigara-disinhibisyonu"). Ancak, ictal olaylar çok sipariş edilen ve neural ağ etkinlik13,14yönetmek için GABAergic interneurons etkisi gerektiren olaylar senkronize. Vitro bir beyin dilim gibi15, vitro disinhibisyonu modelleri genellikle aktivite spiking için yol ise bu nedenle, Sigara disinhibisyonu modelleri izole sinir ağları, üreten ictal olaylar için en etkili vardır interictal benzeri spiking anımsatan. Ayrıca, bu kavramsal çerçevede bir anlık eşitleme olayı da güvenilir bir ictal olay16tetikleyebilir. Aslında, bir ictal olay bir kritik geçiş ("çatallanma") noktası18olduğunda sinir sistemi17 ' ye uygulanan herhangi bir küçük pertürbasyon tarafından tetiklenebilir. Geleneksel olarak, bu tedirginlikler elektriksel stimülasyon tarafından indüklenen. Optogenetics nörolojik, son gelişmeler ancak, şimdi kritik durumu geçişleri16ikna etmek için daha şık bir strateji sunuyor.

Bu makalede açıklanan yöntemleri ictal olayları isteğe bağlı akut kriz modelleri vitro (adım 1 Protokolü) ve in vivo çalışmalar (adım 2 iletişim kuralı) oluşturmak nasıl gösterir. Onlar beyin bölgesi, nöbet indüksiyon yöntemi, çalışma türü ve tür seçimi dahil; Ancak, odak noktası bir akut 4-AP kortikal nöbet modeli önerilen seçimi nedeniyle çok yönlü bir çeşitli çalışma türleri içinde olacaktır. Akut vitro 4-AP nöbet modeli yüksek kaliteli Beyin dilimleri elektrofizyolojik kayıtlar için hazırlamak için standart protokolü dayanmaktadır ve19görüntüleme çalışmaları. Bu protokoller zaten vitro koronal beyin dilim fareler16,20 ve insanlar21somatosensor motor korteks üzerinden yapmak için kullanılmaktadır. İctal olaylar bu tür beyin dilimler oluşturmak için değişiklikleri daha önce16 ve tüm ayrıntıları iletişim kuralı , açıklanan gösterilmiştir. Akut vivo içinde 4-AP kortikal nöbet modeli bir kranyotomi çalışmaları22görüntüleme için hazırlamak için standart protokolü dayanmaktadır. Değişiklik yok (cam slayt) pencere kranyotomi takip yüklü olduğu sunucudur. Bunun yerine, proconvulsant ajanlar (4-AP) topikal maruz korteks hayvan genel anestezi altında iken ictal olaylar ikna etmek için uygulanır. Bilgimizi, bizim grup fareler16,23bu akut vivo içinde kortikal nöbet modeli geliştirmek için ilkti. Yetişkin fareler hazırlanan akut vivo içinde 4-AP kortikal nöbet modeli Juvenil doku vitro dilim modelinden tamamlamak üzere geliştirilmiştir. Yetişkin vivo içinde nöbet modeli bulguları çoğaltma doğasında endişeleri bir 2D beyin dilim (karşı 3-b bütün-beyin fizyolojik olmayan şartlarda ilgili ele alarak dilim modelleri bulgular genelleştirmek için yardımcı olur Yapı) ve çocuk ve yetişkin doku arasındaki fizyolojik farklılıklar.

İsteğe bağlı ictal olay inisiyasyon yöntemi nörotransmitter ya puffs ile picospritzer veya optogenetic stratejileri kullanarak gösterilmiştir. Bizim bilgi en iyi şekilde, bizim grup insan dokusu nörotransmitter üzerinden bir picospritzer16kullanarak ictal olayları başlatmak için ilkidir. Optogenetic stratejileri için C57BL/6 fareler zorlanma transgenes ifade etmek için kullanılan geleneksel yük olduğunu. Channelrhodopsin-2 (ChR2) GABAergic interneurons veya glutamatergic piramit hücreleri ifade isteğe bağlı kısa ışık darbeleri ile isteğe bağlı ictal olaylar oluşturma yeteneği sağlar. ChR2 fare veziküler GABA ışınlama promotor (VGAT)24veya fare timus hücre antijen 1 kullanarak piramit hücreleri kullanarak her iki interneurons içinde ifade piyasada bulunan C57BL/6 değişken uygun optogenetic fareler suşları dahil promotor (Thy1)25. Bu piyasada bulunan VGAT-ChR2 ve Thy1-ChR2 fareler GABAergic nöronlar veya glutamatergic nöronlar, sırasıyla, mavi ile yeni korteksimiz etkinleştirmek için fırsat (470 nm) ışık. İctal olayları isteğe bağlı akut kriz modelleri oluşturma yeteneği nöbet başlatma dynamics çalışma ve verimli bir şekilde değerlendirmek olası anti-nöbet tedaviler roman fırsatlar sunabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hasta ile ilgili tüm araştırma Üniversitesi Sağlık ağ araştırma etik kurulu Helsinki Deklarasyonu doğrultusunda tarafından onaylanmış bir protokol altında gerçekleştirildi. Hayvanları içeren yordamlar hayvan bakımı Kanada Konseyi kurallara uygun olarak vardı ve Krembil Araştırma Enstitüsü hayvan bakımı Komitesi tarafından onaylanmış.

1. iletişim kuralı ı: akut vitro nöbet modeli

  1. Diseksiyon çözümleri ve yapay serebrospinal sıvı hazırlanması
    1. Carbogenate Ultrasaf Su (18,2 MΩ·cm direnci ile filtre su olan) ile carbogen (% 95'i O2/5% CO2) 5 min için kullanarak hava taş Kabarcıklı Difüzörler (havalandırıcılar akvaryumlar için).
      Not: Hava taşları carbogen tankın regülatörü ile standart silikon tüp için bağlanabilir. Hava Taş yoksa, mühür silikon tüp sonu kapa ve dışarı kabarcık carbogen gaz ve carbogenate çözüm sağlamak için mühür küçük delik poke.
    2. Bir diseksiyon çözüm solutes Tablo 1 ultrasaf suda çözülerek hazırlayın. CaCl2 carbogenated dağıtılması yardımcı olması en az 5 min için olmuştur bir çözüm ekleyin.
      Not: kolayca doymamış bir çözümde çözünebilmektedir alternatif olarak, CaCl2 ilk, ekleyin. Çözümde sıvı halde, 300-320 mOsm/L olmalı ve carbogen ile doymuş sonra pH 7.4 var.
      1. 0 - 4 ° C. diseksiyon çözüm chill Çözüm gece buzdolabında bırakın veya çözüm 1 h için buzluğa yerleştirin ve sürekli sıcaklık izlemek.
        Not: Diseksiyon eriyik-ebilmek var olmak stok ilâ 3 gece; daha sonra atın.
      2. Carbogenate 5-10dk kullanmadan önce diseksiyon çözüm.
        Not: İdeal olarak, çözüm de rüşvet görünmesi gereken veya kullanımdan önce slush geçiş.
    3. Kemirgen yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) Tablo 2 (veya Tablo 3 insan ACSF için) solutes çözülerek Ultrasaf Su hazırlamak. Carbogenate ACSF çözüm bu süre 35 ° C ila kadar kullanmak ısıtmalı bir su banyosu mevcuttur. CaCl2 carbogenated dağıtılması yardımcı olması en az 5 min için olmuştur bir çözüm ekleyin.
      Not: daha kolay doymamış bir çözümde çözünebilmektedir alternatif olarak, CaCl2 ilk ekleyin. Çözümde sıvı halde, 290 320 mOsm/L olmalı ve carbogen ile doymuş sonra pH 7.4 var. Çözüm 1, 2 veya 4 L cilt deneyler süresi bağlı olarak yapılmalıdır. 4 L tam gün (8 h) deneyler yapmak. ACSF her taze yapılmalıdır gün; 1 d daha uzun süre depolamayın.
  2. Beyin dokusu toplamak için fare diseksiyon
    Not: insan dokusu için Beyin dilimleri ile vibratome yapmaya sonraki adım (adım 1.3) devam edin. Beyin dokusunun küp şeklinde blok (1 cm3) yordamlar yukarıda açıklanan26,27kullanarak beyin cerrahı alınmalıdır.
    1. Tüm araçlar ve hayvan gruptakiler için gerekli malzemeleri toplamak. Hayvan gruptakiler için hazırlamak için çalışma alanını ayarlayın.
      1. Boş olmadığından emin olmak için carbogen tankı (95 %O2/5%CO2) kontrol. Eğer daha az 500 psi basınç kalan gaz silindir deneyler önce yerine.
      2. (Bıçak doku dilimleyici titreşimli) vibratome üreticisinin belgelerine göre kalibre. 1 mm kesme genliği ve kesme hızı 0,12 mm/s için ayarlama vibratome ayarlayın.
        Not: Her bireysel titreşimli doku bıçak kesici için optimum ayarlar farklı olabilir; Ancak, genel olarak, genlik yüksek olmalı ve kesme hızı düşük olmalıdır.
      3. Beyin dilim kuluçka odası (yani, beyin dilim kaleci) ACSF ile doldurmak ve carbogen ile kabarcık. Sonra 35 ° C'de ayarla bir su banyosunda kuluçka odası yer
        Not: kemirgen ACSF kemirgen beyin dilimleri ve insan ACSF insan beyninin dilimleri için kullanın.
    2. Çocukça bir fare 13 d (p13) 21 d (p0 Doğum tarihi nerede p21) çağı arasında her iki cinsiyetten edinin.
    3. Fare mayi sodyum Fentobarbital (55 mg/kg vücut ağırlığı) enjeksiyonu ile anestezi. Derhal fare derinden, ayak çimdik refleks yokluğunda tarafından belirtildiği şekilde anestezi sonra bir veteriner tarafından onaylanan Giyotin aleti bir hızlı hareket fare başını kesmek için kullanabilirsiniz.
      Not: Sodyum Fentobarbital enjeksiyon kurumsal kurallar tarafından önerilen yordamlara göre hazırlayın.
    4. Kesik baş stabilize ve yavaşça fare gözler arasında ve kafa derisi kafatası ortaya çıkarmak için tüm uzunluğu boyunca başlayan bir ensizyon yapmak için fare burun tutun. Kafatası ustura ile uygulanan basınç tarafından sıkıştırılmış değil emin olun. Razor's edge köşesinde kesilen hassas artırın için kullanın.
    5. Ayrı kafatası ortaya çıkarmak için parmaklarını kullanarak fare kafa derisi flep yayıldı. Ardından, bir razor's edge taze köşesinde kafatasının orta çizgi boyunca bir kesi yapmak için kullanın; serebral korteks ile herhangi bir temas önlemek için dikkat.
    6. INSERT splinter forseps içine kesik baş stabilize etmek ve bir kabında yeri fare göz yuvaları dolu (0 - 4 ° C) soğuk ile diseksiyon çözüm. Kafa tam diseksiyon çözümde sular altında emin olun.
    7. Splinter forseps, ikinci bir kümesini kullanın yavaşça fare derisi peel away, burun kemik peeling tarafından kaldırmak için ve kafatası arkası (kaudal yan) kaldırın.
      Not: Burun kemik Juvenil farelerin çok yumuşak ve kolayca kırık değil.
    8. Bir mikro spatula görme sinirini, trigeminal sinir ve spinal kord kesmek için kullanın. O zaman, mikro spatula yavaşça beyin kafatası ayırmak için kullanın. Diseksiyon çözüm ile dolu Petri kabına içinde tamamen sular altında beyin bırakın.
  3. Somatosensor-motor korteks üzerinden kortikal dilimleri hazırlanması
    1. Vibratome'nın arabellek tepsi soğuk (0 - 4 ° C) ~ 150 mL ile doldurulması diseksiyon çözüm.
      Not: İsteğe bağlı olarak, arabellek tepsi kadar dilimleme işlemi sırasında bir düşük sıcaklık sürdürmek için gerekli dondurucu unutmayın.
    2. Fare veya anlık yapıştırıcı tutkal kullanarak vibratome sahne alanı'na (numune tutucu/tepsi) insan beyin dokusundan tutkal. Fareler için kolayca düz (tavan yüz için beynin rostral yan izin verir) numune tutucu yapıştırılmış olabilir (yani, beyincik) beyin küçük bir kaudal kısmını kesme.
      Not: Alternatif olarak, yatay fare Beyin dilimleri (beyin ventral yan tavan yüz) numune tutucu üzerine beyin sırt tarafında yapıştırma tarafından hazırlanabilir28.
    3. Yavaşça (ile beyin dokusu) numune sahibi arabellek tepsisine yerleştirin. Beyin dorsal kısmı vibratome's blade dönük olduğundan emin olun.
      Not: Beyin havaya maruz zamanı en aza indirmek için önemlidir.
  4. Beyin dokusu kesit ve koleksiyon
    1. Beyin vibratome dorsal ventral yönüne kullanılarak 450 mikron kalınlığında dilimler halinde dilim. Beyin Dilimleme süre numune Tepsiyi tamamen tutturulmuş olarak kalmasını sağlamak.
      1. Olfaktör ampul kaldırmak için fare beynindeki ilk kesim yapmak. Somatosensor-motor alanı (yaklaşık yarısını olfaktör ampul ve bregma arasında bulunan) görülmektedir kadar sonra sonraki kesim yapmak.
        Not: corpus callosum somatosensor-motor alan yakın olduğunu gösterir beynin koronal görünümünde görünene kadar isteğe bağlı olarak, beyin daha ince (200 mikron) dilimleri ve dilim.
    2. Somatosensor-motor alanı içeren ve onları soğuk (0 - 4 ° C) içeren bir kabında daldırın koronal dilimleri (450 mikron) toplamak için geniş-geçişli transfer pipet kullanın diseksiyon çözüm.
    3. Dilimleri aşırı herhangi bir dokudan kesin ve yeni jilet kullanın. Fareler gelen koronal dilimler için sadece neocortical komissür (yani, corpus callosum) kesmek bir enine gerçekleştirin. Testere bir çekimde kesmeyin; sadece bıçağın dokusuna basınç uygulayın ve yavaşça doku ayırmak için ayrıntılı bir fırça kullanın. Koronal dilim hareketin en aza indirmek emin olun.
    4. İkinci bir petri için yeni korteksimiz (Katman 1-6) içeren koronal dilimleri dorsal bölümünü aktarmak için geniş-geçişli transfer pipet dolu sıcak (35 ° C) ACSF bir an için kullanımı (~ 1 s). Ardından derhal dilimleri sıcak (35 ° C) carbogenated ACSF içeren bir kuluçka odası aktarın.
      Not: Diseksiyon çözüm aktarmak kuluçka odası Beyin dilimleri wide-geçişli pipet ile aktarma sırasında en aza indirmek için transfer ACSF ile Petri çanak içine amacı budur. Farklı beyin dilimleri tutmak için birden çok kuyu organize kuluçka odası 's kullanmaktadır.
    5. Beyin ve kurumsal esaslarına göre hayvan leşi geri kalanını atmak.
  5. Kuluçka ve bakım
    1. 30 dk 35 ° C'de kuluçka odasında biraz batık Beyin dilimleri bırakın. O zaman, kuluçka odası su banyosundan kaldırmak ve oda sıcaklığına (20-25 ° C) sağlar. Elektrofizyolojik kayıtlar gerçekleştirmeden önce kurtarmak Beyin dilimleri için 1 saat bekleyin.
      Not: kuluçka odasında Beyin dilimleri altında toplamak yok hava kabarcıkları olduğundan emin olun. Hava kabarcıkları doku hasarına neden hava arabirimleri vardır. İnsan beyin dokusu-ebilmek var olmak stok için en fazla 24 saat uygun ACSF ile bir şey-carbogenated kuluçka odasında iken fare Beyin dilimleri 6-8 h için korunabilir.
  6. Yüzeysel kortikal tabakasının elektrofizyolojik kayıtlar
    Not: Ictal olaylar hücre dışı yerel alan potansiyel (LFP) kayıtları Beyin dilimleri üzerinden izlenmektedir. Beyin dilim LFP gözlenen ve bir arabirim türü odası29 ya da bir batık çoklu elektrot dizi (MEA) sistem16ile kaydedildi. Yordam yukarıda açıklanan16 olmuştur ve ek ayrıntılar aşağıda açıklanmıştır.
    1. Wide-geçişli transfer pipet veya detaylandırma fırça diş bir cımbız kullanarak yerde bir beyin dilim tutulur biraz daha büyük önceden kesilmiş objektif kağıt üzerine taşımak için kullanın. Kayıt odası (yani beyin dilim üzerine dinleniyor) objektif kağıt aktarmak ve ARP ekran ile pozisyonda güvenli.
    2. Çalışma sıcak (35 ° C), carbogenated ACSF perfusate 3 mL/dk (~ 1 damla/sn) hızında beyin dilim üzerinden kayıt odası aracılığıyla. Kayıt odası 33-36 ° c olduğundan emin olmak için dijital termometre kullanın
    3. 1-3 MΩ borosilikat cam boru üzerinden bir empedans (ile bir dış çapı 1,5 mm) ile cam elektrotlar çekin bir çektirmenin kullanarak. Is ACSF ile cam elektrotlar (~ 10 µL) Hamilton şırınga kullanarak. İpucu bozuksa hemen elektrot atmak.
      Not: gümüş tel (5 dk) çamaşır suyu ve yalnızca bir gürültü ve drift kayıtları sırasında en aza indirmek için ACSF geri dolu cam elektrotlar sokulmasına gümüş tel (yani, ucu) en az bir bölümü. Herhangi bir aşırı ACSF cam elektrot bir Hamilton şırınga gerekirse kaldırın.
    4. Kullanım 20 X stereo mikroskop doğru Kılavuzu kayıt cam elektrot kortikal içine yüzeysel tabaka (2/3) kullanarak el ile manipülatörler. Kayıt/beyin dilim elektriksel aktivitesinin bir bilgisayarla iletişim standart yazılım görünüm.
      Not: Uygun (yüksek kaliteli) beyin dilimleri uygulamalı elektriksel uyaranlar (100 µs, 30-300 μA) veya optogenetic doku için ışık darbeleri (30 ms, 10 mW/mm2) karşılık olarak sağlam bir uyarılmış potansiyel sergileyecek.
  7. İndüksiyon nöbet benzeri faaliyetleri
    1. ACSF beyin dilim üzerinde 100 µM 4-aminopyrimidine (4-AP) içeren sıvı. 4-AP 8,5 ml su 4-AP ACSF ACSF perfusate 100 µM ile elde etmek için 100 mL 100 µL 100 mM 4-AP hisse senedi çözüm eklemek bir hisse senedi çözüm 100 mM 4 AP. yapmak 80 mg geçiyoruz.
      Not: Alternatif olarak, sıfır-Mg2 + ACSF (Tablo 4), hiçbir ekledi Mg2 +, içeren değiştirilmiş bir ACSF çözüm beyin dilim sıvı için kullanın. İnsan dokusu için 100 µM 4-AP bir arada sıfır-Mg2 + içinde insan ACSF (Tablo 5) en iyi sonuçları elde etmek için kullanın. Ortalama görünmesini ictal olaylar için 15 dk zamanıdır; Ancak, bazı beyin dilimleri için 40 dakikaya kadar sürebilir.
  8. İsteğe bağlı nöbet üretimi: optogenetic fareler için bir optogenetic stratejisi
    1. Mavi kısa (30 ms) nabız uygulamak (470 nm) ışık (bir en az 1 mW/mm2 çıkış yoğunluğu ile) ictal bir olayı başlatmak için. El ile bir manipülatör 1000 µm göbek çapı optik fiber (0,39 NA) doğrudan kayıt bölge üzerinde konumlandırmak için kullanın.
      Not: ictal olay tekrarı istenen oranı eşleşecek şekilde fotoğraf stimülasyon oranını ayarlamak (yani, 1 darbe her 50 s). Ancak, oranı aşırı ictal olaylar gerçekleştiği iç oranı abartılı değil.
  9. İsteğe bağlı nöbet üretimi: insan dokusu için bir sigara optogenetic strateji
    1. Beyin dilim yüzeysel katmanları ters yönde ve derin katmanları perfusate kayıt odası aracılığıyla akış aşağı akım şekilde konumlandırın.
    2. Bir cam elektrot (aynı türde LFP kayıtları için kullanılan) Çek ve ucu ile küçük bir açılış oluşturmak için bir hassas görev silecek hafifçe dokun. Is ~ 25 µL 100 mm (suda) GABA ile elektrot ve picospritzer için ekleyin. Alternatif olarak, elektrot (suda) 200 µM glutamat ile tamamlanmıyor.
      Not: picospritzer (~ 50 µL) şişirilmiş güç tahmin etmek için bir test üfleme Plastik tabak (tercihen gridded) üzerine uygulayın. Daha sonra bir damlacık test puf ile bir karşılaştırma için bir pipet ile bilinen birimler (yani, 10 µL, 20 µL, 50 µL veya 100 µL) uygulayın.
    3. Puffs nörotransmitter (GABA veya glutamat), picospritzer (30-100 ms için 10-20 psi) ile insan dokusu ictal bir olayı başlatmak için uygulanır. Tek bir nefes ictal olayları yüzeysel katmanda oluşturmak için beyin dokusunun derin katmanı (5) üzerine 100 mm GABA uygulamak (2/3). Alternatif olarak, 200 µM glutamat ictal olayları yüzeysel katmanda oluşturmak için doğrudan yüzeysel katmanın üzerine tek bir puf uygulanır.
      Not: picospritzer oranı puf ictal olay tekrarı istenen oranı eşleşecek şekilde ayarlayın (Örneğin, 1 darbe her 50 s). Ancak, oranı aşırı ictal olaylar gerçekleştiği iç oranı abartılı değil.

2. Protokol II: Akut vivo içinde nöbet modeli

  1. Cerrahi hazırlık ve cerrahi
    1. Her iki cinsiyetten bir yetişkin fare (p35 - p60) edinin.
    2. Derin anestezi fare ile ketamin (95 mg/kg) ve Xylazine (5 mg/kg). Fare yatıştırıcı emin olmak için ayak-çimdik refleks testi gerçekleştirin. Alternatif olarak, fare anestezi için isoflurane (İndüksiyon, ameliyat için 1.5-%2 için % 4) kullanın.
      Not: Nöbet aktivitesi30,31anestezi seçimi etkileyebilir.
    3. Fare stereotaksik çerçeve içine kafasını kulak çubuklarla güvence tarafından monte. Ameliyat süresince fare altında ısıtmalı bir yastık koyun.
    4. Kafa derisi ortaya çıkarmak için bir kemirgen düzeltici kullanarak fare'nın başının tıraş. Lidocaine 0.3 mL ile bir 25 G 5/8'iğne aşırı kanama veya ağrı önlemek için kapaklarini enjekte. Deneme sırasında kurumasını engellemek için fareyi'nın gözleri göz merhem uygulamak.
    5. Çimdik ve onun refleksleri gitmiş olup olmadığını değerlendirmek için fare derisi ortasına kaldırın. Daha sonra kafatası lambda bölgesine bregma ortaya çıkarmak için kesmek yatay gerçekleştirin. Yavaşça tüm açık alan kuru bir yüzey oluşturmak için bir pamuk bez ile kafatasının kazı.
    6. Somatosensor korteks ortaya çıkarmak için koordinatları 2.0 mm lateromedial ve -2,0 mm rostrocaudal, çapı 4 mm bir kranyotomi gerçekleştirin. Kalıcı bir kalem kullanarak bir daire (4 mm içinde çap) ile işaretlemek. Kranyotomi kemik kalan tabaka kolayca şekilde aşağı itti verene çember ile Pnömatik diş tatbikat matkap. Kemik tabakası üzerine tuz çözüm kranyotomi splinter forseps ile kaldırmadan önce uygulanır. Daha sonra sıcak tuzlu çözüm maruz kalan bölgeye uygulamak.
  2. Kayıt yöntemleri ve ele geçirme vakalarının kimyasal indüksiyon
    1. 1-3 MΩ borosilikat cam boru üzerinden bir empedans (ile bir dış çapı 1,5 mm) ile cam elektrotlar çekin bir çektirmenin kullanarak. IS ~ 10 µL ACSF veya bir Hamilton kullanarak serum fizyolojik ile cam elektrotlar şırınga. İpucu bozuksa hemen elektrot atmak.
      Not: gümüş tel (5 dk) çamaşır suyu ve yalnızca bir gürültü ve drift kayıtları sırasında en aza indirmek için ACSF geri dolu cam elektrotlar sokulmasına gümüş tel (yani, ucu) en az bir bölümü. Herhangi bir aşırı ACSF cam elektrot bir Hamilton şırınga gerekirse kaldırın.
    2. Kortikal cam elektrot yüzeysel içine yol göstermesi için el ile bir manipülatör kullanın katman (2/3) somatosensor-motor alanında. Kayıt/beyin dilim elektriksel aktivitesinin bir bilgisayarla iletişim standart yazılım görünüm.
      Not: Katman 2/3 yaklaşık 0,3 mm yüzey32kişiden derin olduğunu.
    3. Topikal kadar tamamen kranyotomi kapsar ~0.5 mL 1.5 mM 4-AP serum üzerine fare maruz korteks bir şırınga ile uygulanır. 4-AP 100 ml izotonik salin 1.5 mM 4-AP salin hazır bir çözüm sağlamak için 14 mg geçiyoruz.
      Not: deneme başlamadan önce 4-AP salin hazır olun. Ortalama olarak, ictal Olaylar 15-30 dakika sonra topikal uygulama görünür.
  3. Talep üzerine üretimi optogenetic farelerde ele geçirme vakalarının
    1. Mavi kısa (30 ms) nabız uygulamak (470 nm) ışık (bir en az 10 mW/mm2 çıkış yoğunluğu ile) ictal bir olayı başlatmak için. El ile bir manipülatör 1000 µm göbek çapı optik fiber (0,39 NA) doğrudan kayıt bölge üzerinde konumlandırmak için kullanın.
      Not: ictal olay tekrarı istenen oranı eşleşecek şekilde fotoğraf stimülasyon oranını ayarlamak (yani, 1 darbe her 300 s). Ancak, oranı aşırı ictal olaylar gerçekleştiği iç oranı abartılı değil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

100 µM 4-AP iyi kalite (hasarsız) 450 kortikal beyin µm boyutunda dilimlere olaylardan bir çocuk VGAT-ChR2 güvenilir bir şekilde bağlı fare nükseden ictal (> 5 s) içinde 15 dk (1Ai rakam) uygulama. 100 µM 4-AP uygulamaya kalitesiz dilim olaylar patlama veya etkinlik (Şekil 1Aii) spiking sonuçlandı. Ortalama olarak, dilimleri--dan her disseke fare beyin % 40'ını başarıyla ictal olayları oluşturuyordu. Ayrıca, %83 (25/30) disseke fare ictal olaylar başarıyla oluşturulan en az bir beyin dilim içinde sonuçlandı. Kendiliğinden meydana gelen ile beyin dilimleri içinde ictal olaylar, kısa 30 ms hafif darbe beyin dilim üzerinde uygulama güvenilir morfoloji (1Aiii anlamaya ve 1Aiv) aynı ictal bir olay tetiklenir. Aynı bulgular beyin dilimler halinde Thy1-ChR2 fareler (Şekil 1B) yapıldı. Böylece, nöronal hangi subpopulation aktif ne olursa olsun, herhangi bir kısa izole olay eşitleme kortikal neural ağ ictal bir olayın başlangıcı için yol açtı. İctal bu olaylar sentinel (preictal) Başak (Şekil 2Aii ve 2Bii), tonik gibi ateş (Şekil 2Aiii ve 2Biii), klonik benzeri ateş (Şekil 2Aiv ve 2Biv) ve patlama aktivitesi oluşan sonlarına doğru (Şekil 2Av ve 2Bv); doğada benzer klinik nöbet33ile ilişkili electrographic imzaları olduklarını. Ayrıca, 10 µM bumetanide (serseri), bir NKCC1 engelleyici eklenmesiyle elde edilen ictal Etkinlikler (Şekil 2) üzerinde etkisi olduğu gibi çocuk bu fareler fizyolojik yetişkin gibi.

Sıfır-Mg2 + model genellikle ~ 10 dk ictal olaylar hızla patlama benzeri aktivite (dönüşüm önce oluşturulan, ancak vitro 4-AP kortikal dilim model güvenilir tutarlı ictal Olaylar ~ 1 h (Şekil 1Ai), için oluşturulan Şekil 3A). Nöbet indüksiyon 4 AP yöntemi gerekiyorsa, ancak, sıfır-Mg2 + modelini patlama etkinlik geri ictal etkinliklerine (Şekil 3B) dönüştürmek için 5-10 µM baklofen (GABAB reseptör agonist) ilavesi ile değiştirilebilir . Genel olarak, Sigara uyarılabilirlik (yani, 4-AP veya sıfır-Mg2 + ACSF) güvenilir bir şekilde artırmak için disinhibisyonu yöntemleri kortikal Beyin dilimleri içinde ictal olaylar çoğaltılamaz. Buna ek olarak, disinhibisyonu [yani, bicuculline (BMI), GABAA reseptör antagonisti] yöntemlerinin etkinlik interictal aktivitesinin anımsatan spiking veya ictal Olaylar (Şekil 4A) yerine etkinlik patlama sonuçlandı. Benzer şekilde, 100 µM 4-AP-ele hipokampal dilimleri hazırlanan akut kriz modelleri interictal benzeri spiking aktivite veya durum epileptikus benzeri koşullar CA3 içinde oluşturulan (Şekil 4B). Vivo 4-AP kortikal modeli buna nükseden ictal olayları (> 5 s) oluşturuyordu. İctal olaylar yüzeysel gözlendi katman (2/3) topikal uygulama 1,5 mM 4-AP yetişkin VGAT-ChR2 farelerin korteks maruz ~ 30 dakika içinde. Kısa 30 ms ışık nabız maruz korteks üzerine uygulanması güvenilir bir şekilde kendiliğinden meydana gelen (Şekil 5) morfolojik benzer ictal olaylar tetiklenir.

Uygulama sıfır-Mg2 + insan ACSF 100 µM 4-AP 'sigara-epileptik' kortikal beyin dilimlere (450 µm) temporal lob epilepsi hastaları ile güvenilir bir şekilde tekrarlayan ictal olayları (> 5 s) ~ 30 dk (Şekil 6Ai ve 6Bi) içinde oluşturuyordu. Kalitesiz dilim spiking etkinliğinde veya hiçbir etkinlik (Şekil 1Aii) oluşturulur. Beyin dilimleri canlılığı 'kaliteli' kabul edildi ne zaman kısa bir elektrik uyarıcı (100 µs, 30-300 µA) indüklenen LFP deney başında sağlam, uyarılmış yanıtta. İctal olaylar çökelti başlayınca, 100 mm GABA beyin dilim üzerine kısa bir nefes (75 ms 20 psi) uygulama güvenilir içinde morfoloji (Şekil 6Aii ve 6Aiii) kendiliğinden meydana gelen o aynıydı ictal olaylar tetiklenir . GABA, 100-200 µM, daha düşük bir konsantrasyon-ecek beğenmek var olmak de vitro deneyler34için etkili; Ancak, GABA, 100 mM, daha yüksek bir konsantrasyon içinde vivo deneyler35için önerilir. 200 µM glutamat kısa bir puf insan beyni dilimlere uygulandığında aynı gözlemleri çoğaltılamaz (Şekil 6Bii ve 6Biii). Böylece, hangi Post sinaptik reseptörleri aktive ne olursa olsun, izole insan Kortikal sinir ağı kısa bir eşitleme olayı güvenilir bir ictal olayı tetikleyen.

Figure 1
Resim 1: Akut vitro 4-AP kortikal nöbet modeli. Siyah çizgiler kayıt; yerel alan potansiyel (LFP) temsil mavi çizgiler hafif uyarıcı gösterir. (A)bu paneller bir VGAT-ChR2 fare modeli sonuçlarını temel alır. Onlar ictal olaylar LFP kayıt yüzeysel katmanından gözlenen göstermek (2/3) bir yüksek kaliteli kortikal beyin dilim 100 µM 4-AP. benile tedavi) Bu panel LFP kayıt özetini gösterir. II) Bunlar kalitesiz Beyin dilimleri kayıt LFP örneğidir. Dikey Ölçek çubuğu 0,4 olduğunu mV, yatay ölçek çubuğu olduğunu 20 s. III) bu yakınlaştırılmış içinde ışık tetiklenen bir ictal olay görülmektedir. IV) bu yakınlaştırılmış içinde spontan ictal olay görülmektedir. (B) Bu paneli bir Thy1-ChR2 fare modeli sonuçlarını temel alır. Onlar ictal olaylar LFP kayıt yüzeysel katmanından gözlenen göstermek (2/3) bir kortikal beyin dilim 100 µM 4-AP. benile tedavi) Bu panel LFP kayıt özetini gösterir. II) bu yakınlaştırılmış içinde ışık tetiklenen bir ictal olay görülmektedir. III) yakınlaştırılmış içinde spontan ictal olay görülmektedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: Ictal olayları oluşturulan bir beyin dilim (katman 2/3) bir çocuk (p13) VGAT-ChR2 fare 4-AP ve bumetanide (serseri) ile periosteum. Siyah çizgiler kayıt yerel alan potansiyel (LFP) temsil eder; mavi çizgiler hafif uyarıcı gösterir. (A) bu panelleri göstermek kendiliğinden ictal olay. ben) Bu panel tüm ictal olay özetini gösterir. Aşağıdaki panelleri göster: II) bir nöbetçi spike, III) tonik gibi ateş, IV) klonik benzeri ateş ve v) faaliyet patlama. (B) bu paneller ışık tetiklenen bir ictal olay göster. ben) Bu panel tüm ictal olay özetini gösterir. Aşağıdaki panelleri göster: II) kayıt, aynı dilim IIIgelen ani bir ışık tetiklemeli sentinel) tonik gibi ateş, IV) klonik benzeri ateş ve v) faaliyet patlama. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: Akut vitro sıfır-Mg2 + kortikal nöbet modeli. Siyah çizgiler kayıt yerel alan potansiyel (LFP) temsil eder; mavi çizgiler hafif uyarıcı gösterir. (A) Bu paneller bir VGAT-ChR2 fare modeli sonuçlarını temel alır. ben) Bu panel yüzeysel tabaka LFP kaydından gözlemlenen durum epileptikus benzeri koşullar gösterilmiştir (2/3) bir kortikal beyin dilim tedavi sıfır-Mg2 + ile ACSF. II) bu yakınlaştırılmış içinde ışık tetiklenen bir ictal olay görülmektedir. III) yakınlaştırılmış içinde durum epileptikus benzeri patlama faaliyet görülmektedir. (B) bu paneller baklofen eklenmesi ile kayıt aynı dilim göstermek. ben) 5 µM baklofen uygulama için sıfır-Mg2 + ACSF geri farklı ve tekrarlayan ictal olayların içine patlama aktivitesi dönüştürür. II) yakınlaştırılmış içinde patlama faaliyet görülmektedir. III) yakınlaştırılmış içinde farklı ictal olay görülmektedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: patlama/spiking modelleri akut vitro . Siyah çizgiler kayıt; yerel alan potansiyel (LFP) temsil mavi çizgiler hafif uyarıcı gösterir. (A)bu paneller göstermek bir kortikal dilim sonuçlarından VGAT ChR2mouse yüzeysel gözlenen patlama faaliyet gösteren (2/3) 100 µM 4AP. ben10 µM BMI eklenmesi aşağıdaki katman) bu LFP kayıt bir bakış niteliğindedir. Noktalı kırmızı çizgi ne zaman BMI yürürlüğe belirtir. II) bu yakınlaştırılmış içinde ışık tetiklenen bir ictal olay görülmektedir. III) yakınlaştırılmış içinde kendiliğinden patlama faaliyet görülmektedir. (B) bu paneller hipokampal bir dilim sonuçlarından bir VGAT-ChR2 fareden göstermek 100 µM 4AP. iuygulama takip CA3 bölgede gözlenen bir durum epileptikus benzeri olay gösteren) bu LFP kayıt bir bakış niteliğindedir. II) yakınlaştırılmış içinde ictal bir olayın görülmektedir. III) yakınlaştırılmış içinde ışık tetiklemeli ve spontan olaylar patlama görülmektedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: Akut vivo içinde 4-AP kortikal nöbet modeli. Siyah çizgiler kayıt; yerel alan potansiyel (LFP) temsil mavi çizgiler hafif uyarıcı gösterir. (A)bu paneller göster sonuçları bir yetişkinin (p56) VGAT-ChR2 fare modeli 1.5 mM 4-AP ile topikal uygulanan maruz korteks. ben) Bu panel bir ışık harekete geçirilen ictal olay yüzeysel katmanda gözlenen gösterir (2/3) somatosensor-motor çevrenin. II) bu yakınlaştırılmış içinde ışık harekete geçirilen ictal olay panelinden AIgörülmektedir. III) Bu bir süper yakınlaştırılmış içinde (siyah okla gösterilen) ışık harekete geçirilen ictal olay başlangıcı görünümüdür. Bu rakam bir rakam Chang vd. , filtre uygulanmamış sürümüdür 16. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: Akut vitro insan kortikal nöbet modeli. Siyah çizgiler kayıt yerel alan potansiyel (LFP) temsil eder; kahverengi çizgiler picospritzer puf gösterir. (A)bu paneller yüzeysel gözlenen ictal olayları gösteren bir medial temporal lob epilepsi (MTLE) hastadan bir kortikal beyin dilim sonuçlarını göstermek bir perfüzyon ile 100 µM 4-AP ve sıfır-Mg2 + (2/3) aşağıdaki katman insan ACSF . ben) bu LFP kayıt bir bakış niteliğindedir. Aşağıdaki panelleri göster: II) 100 mM GABA puf harekete geçirilen ictal olay ve IIIyakınlaştırılmış bileşenini görünümünü) görünümü yakınlaştırılmış içinde spontan ictal olay. (B) bu paneller yüzeysel gözlenen ictal olayları gösteren başka bir MTLE hastadan bir kortikal beyin dilim sonuçlarını göstermek bir perfüzyon ile 100 µM 4-AP ve sıfır-Mg2 + (2/3) aşağıdaki katman insan ACSF. ben) bu LFP kayıt bir bakış niteliğindedir. Aşağıdaki panelleri göster: II) bir yakınlaştırma görünümü bir 200 µM glutamat puf harekete geçirilen ictal olay ve III) görünümü yakınlaştırılmış içinde spontan ictal olay. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tablo 1: tarifi diseksiyon çözüm. Bu 1 L veya 2 L birimleri yapmak için talimatları vardır. MW çözünen molekül ağırlığı =.

# Reaktif Konsantrasyonlu [mM] MW (g/mol) 1L (g) 2L (g)
1 Sükroz 248 342.3 84.89 169.78
2 Sodyum bikarbonat (NaHCO2) 26 84.01 2.18 4.37
3 Dekstroz (D-glikoz) 10 180.16 1.8 3.6
4 Potasyum klorür (KCl) 2 74.55 0,15 0,3
5 Magnezyum sülfat (MgSO4·7H2O) 3 246.47 0,74 1.48
6 Sodyum fosfat Yem mono monohidrat (H2NaPO4· H2O) 1,25 137,99 0.17 0,34
7 Kalsiyum klorür (CaCl2·2H2O) 1 147.01 0,15 0,29

Tablo 2: kemirgen yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) için tarifi. Bu 2 L veya 4 L birimleri yapmak için talimatları vardır. MW çözünen molekül ağırlığı =.

# Reaktif Konsantrasyonlu [mM] MW (g/mol) 2L (g) 4L (g)
1 Sodyum klorür (NaCl) 123 58.4 14,37 28.73
2 Sodyum bikarbonat (NaHCO2) 26 84.01 4.37 8.74
3 Dekstroz (D-glikoz) 10 180.16 3.6 7,21
4 Potasyum klorür (KCl) 4 74.55 0,6 1.19
5 Magnezyum sülfat (MgSO4· H2O) 1.3 246.47 0.64 1.28
6 Sodyum fosfat Yem mono monohidrat (HNaPO4· H2O) 1.2 137,99 0,33 0.66
7 Kalsiyum klorür (CaCl2·2H2O) 1.5 147.01 0,44 0,88

Tablo 3: tarifi için insan yapay beyin omurilik sıvısı (insan ACSF). Bu 2 L veya 4 L birimleri yapmak için talimatları vardır. MW çözünen molekül ağırlığı =.

# Reaktif Konsantrasyonlu [mM] MW (g/mol) 2L (g) 4L (g)
1 Sodyum klorür (NaCl) 123 58.4 14.38 28,75
2 Sodyum bikarbonat (NaHCO2) 25,2 84.01 4.23 8.46
3 Dekstroz (D-glikoz) 10 180.16 3.6 7,21
4 Potasyum klorür (KCl) 4 74.55 0,6 1.19
5 Magnezyum sülfat (MgSO4· H2O) 1 246.47 0,49 0,99
6 Sodyum fosfat Yem mono monohidrat (HNaPO4· H2O) 1.2 137,99 0,33 0.66
7 Kalsiyum klorür (CaCl2·2H2O) 1 147.01 0,29 0.59

Tablo 4: sıfır-Mg tarifini 2 + kemirgen yapay beyin omurilik sıvısı (sıfır-Mg2 + ACSF). Bu 2 L veya 4 L birimleri yapmak için talimatları vardır. MW çözünen molekül ağırlığı =.

# Reaktif Konsantrasyonlu [mM] MW (g/mol) 2L (g) 4L (g)
1 Sodyum klorür (NaCl) 123 58.4 14,37 28.73
2 Sodyum bikarbonat (NaHCO2) 26 84.01 4.37 8.74
3 Dekstroz (D-glikoz) 10 180.16 3.6 7,21
4 Potasyum klorür (KCl) 4 74.55 0,6 1.19
5 Magnezyum sülfat (MgSO4· H2O) Sözde ücretsiz 246.47 0 0
6 Sodyum fosfat Yem mono monohidrat (HNaPO4· H2O) 1.2 137,99 0,33 0.66
7 Kalsiyum klorür (CaCl2·2H2O) 1.5 147.01 0,29 0.59

Tablo 5: sıfır-Mg tarifini 2 + insan yapay beyin omurilik sıvısı (sıfır-Mg2 + insan ACSF). Bu 2 L veya 4 L birimleri yapmak için talimatları vardır; MW çözünen molekül ağırlığı =.

# Reaktif Konsantrasyonlu [mM] MW (g/mol) 2L (g) 4L (g)
1 Sodyum klorür (NaCl) 123 58.4 14.38 28,75
2 Sodyum bikarbonat (NaHCO2) 25,2 84.01 4.23 8.46
3 Dekstroz (D-glikoz) 10 180.16 3.6 7,21
4 Potasyum klorür (KCl) 4 74.55 0,6 1.19
5 Magnezyum sülfat (MgSO4· H2O) Sözde ücretsiz 246.47 0 0
6 Sodyum fosfat Yem mono monohidrat (HNaPO4· H2O) 1.2 137,99 0,33 0.66
7 Kalsiyum klorür (CaCl2·2H2O) 1 147.01 0,29 0.59

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Beyin dilimleri ile proconvulsant bir ilaç ya da sinirsel ağ'ın uyarılabilirlik artışı ve bir yağış ictal Olaylar (electrographic nöbet benzeri olaylar) teşvik için değiştirilmiş bir ACSF perfusate kabul edilir. Fareler için tercih edilen koronal dilimleri motorlu somatosensor çevrenin içermelidir singulat korteks, alan 2 (CG), ama değil retrosplenial alan (RS); Bu anatomik işaretleri ictal olaylar inducing için en iyi koronal dilimleri aralığını belirlemek. İki hemisferlerin özdeş (benzer deneysel adet) olarak fareler doku için isteğe bağlı bir değişiklik için eşleşen çifti Deneysel tasarımlar, ikiye beyin dilim iki hemisfer azaltmak olduğunu. İctal olaylar bir neural ağ olgu olduğundan ictal olayları oluşturmak için beyin dilimler hazırlanırken, bu Ağ neural ve sinaptik bağlantıları, bütünlüğünü korumak için zorunludur. Dilim kalite için kritik olan üç adım 1 Protokolü'nün 1) Dilimleme yordamı, 2) kuluçka ve 3) oksijenasyonu noktalarıdır. İlk olarak, Dilimleme yordam hızı ve tekniği arasında bir denge gerektirir. İşten çıkarma (veya cerrahi rezeksiyon) arasındaki süreyi en aza indirmek çok önemlidir ve her kişi ve zarar görmemesi için beyin dilim hareketi ile dikkatli olurken aynı zamanda kuluçka,. İkinci olarak, doku kalitesi inkübasyon sıcaklığı ve süresi çok hassastır. Bir zamanlayıcı kullanmak önemlidir ve termometre kuluçka emin olmak için 30 dakika süreyle 35 ° C'de üçüncü olarak, beyin dokusu canlılığı oksijenli (yapay) beyin omurilik sıvısı dışında bir pozlama için duyarlı olmasıdır. Eğer uzun bir süre (~ 1 dk) carbogenated ACSF ile derin değil beyin dilim sona erecek.

Beyin dilimleri fareler dan p13 yaşlı - p16 teklif başarıyla ictal olay üretme olasılığı yüksek. Bu fareler ≤ p16 diseksiyonlarının önce transcardial perfüzyon gerektirmeyen nedenidir. Bu etkili bir şekilde hataları azaltır ve bu büyük bir yarar, işten çıkarma ve kuluçka arasındaki süreyi ters beyin dilimin canlılığı ile ilişkilidir çünkü diseksiyon işlemini hızlandırır. Bu arada, fareler > p13 bir yetişkin36için karşılaştırılabilir NKCC1 miktarda azalma. Genel olarak, juvenil (< p21) doku zarar Dilimleme yordamdan kurtarmak için olağanüstü bir yeteneği nedeniyle yetişkin doku daha uygun. Bu hafta süren pencere p13 ve p21 arasında fare'nın yetişkin gibi fizyolojisi ve çocuk gibi yetenek kolayca ictal olaylar37,38oluşturmak için yararlanmak için fırsat sunmaktadır. Deneyler ictal Beyin dilimleri yetişkin fareler gelen olaylarda eğitim gerektirir, ancak, HEPES, Tioüre ve askorbat NMDG tabanlı ACSF yetişkin doku24,39,40, canlılığı teşvik yardımcı olur 41. insan dokusu için α-tokoferol, diseksiyon çözüm gibi antioksidan ek doku canlılığı, özellikle taşımalarda uzun mesafe (> 30 dk) ameliyathane ve laboratuvar için yararlanabilir 8,26dilimleme. Tüm Beyin dilimleri için 450 µm kalınlığında dilimler 36 ° C'de kaydetmeye ictal olayları oluşturmak için uygun koşulları olur Beyin dilimleri en az 350 µm yapılandırılmış ictal olay oluşturmak için neural ağ yeterli nöronlarda içerecek şekilde kalın olması gerekir. Ancak, dilimleri 500 µm kalın olamaz bu doku ortasına diffüz oksijen için zor yapacak gibi. 450 µm vardır dilimleri temsil eder bir optimal kalınlık, nerede nöronal ağ bağlantısı bol miktarda oksijen boyunca doku perfüzyon engelleyen olmadan korunur. Son olarak, yağış ictal olayların 33-36 ° C'de en iyi yöntemdir; kayıt odası en az 33 ° C değilse, ictal olaylarının için zor olacak.

Bir akut kriz modeli nöbet oluşturmaz kısıtlamasıdır. Onlar sadece bir nöbet electrographic imza ictal olayları oluşturmak. İctal olayları bilinç ya da nöbet tanımlamak motor kasılmalar kaybı gibi ilişkili hiçbir davranış bileşeni vardır. Sonuç olarak, akut kriz modelleri olası anti-nöbet ilaç adaylarının etkinliğini doğrulamak veya epileptogenesis içine anlayışlar kazanmak için kullanılamaz; Böyle araştırma soruları kronik epilepsi modelleri ve klinik tarafından ele alınması gerekir. Akut kriz modelleri temel ön çalışmalar nöbet mekanizmaları üzerinde performans sadece kendi amacı için kullanılır. Akut kriz modelleri sadece en gelecek vaat eden bulgular daha pahalı, zahmetli hazırlamak ve çok daha karmaşık etik hususlar gerektirir daha yüksek modeller üstünde-e doğru gelişmiş.

Epilepsi ve nöbet araştırmada ilerleme sağlamak için doğru klinik olarak nöbet hastalarda EEG içinde gözlenen electrographic nöbet aktivitesi çoğaltabilir bir güvenilir akut nöbet model var zorunludur. Disinhibisyonu (yani, GABAA reseptör antagonisti BMI) yöntemleri genellikle aktivite spiking neden ise güvenilir ictal olaylar Beyin dilimleri yeniden oluşturmak için uyarılabilirlik artan disinhibisyonu sigara yöntemleri zorunludur ictal Olaylar (Şekil 3A) yerine interictal aktivite anımsatan. Disinhibisyonu tercih edilen yöntem güvenilir 1 h için tutarlı ictal olaylar oluşturabilir çünkü proconvulsant Ajan 4-AP uygulamaktır. Buna ek olarak, sıfır-Mg2 + kortikal model sadece ~ 10 dk ictal olaylar hızla seri çekim gibi faaliyet (Şekil 2A) içine dönüşüm önce oluşturur. Sıfır-Mg2 + modeli, 5-10 µM baklofen, ek kullanıyorsanız GABAB reseptör agonist yardımcı olacak patlama aktivitesi ictal Olaylar (Şekil 2B), daha önce hipokampal dilimleri42gösterildiği gibi geri dönüştürmek için. Ayrıca, çünkü bu model bulgular onun vivo içinde karşılık, in vivo 4-AP kortikal nöbet modeli (Şekil 4) çoğaltılabilir vitro 4-AP nöbet modeli tercih edilen,. Tüm beyin omurilik sıvısı akut vivo içinde sıfır-Mg2 + ortamını yeniden oluşturmak için canlı bir yetişkin fare değiştirmek mümkün değildir.

4-AP kortikal Beyin dilimleri içinde uygulanması doğru klinik olarak15,33gözlenen nöbet aktivitesi yeniden oluşturabilirsiniz. Buna ek olarak, hipokampal dilimleri 4-AP-ele interictal benzeri spiking etkinlik43 ve durum epileptikus benzeri koşulları (Şekil 3B) üreten yatkındır. Böylece, nöbetler eğitim amacıyla, akut vitro 4-AP kortikal vitro 4-AP hipokampal modeli üzerinde tercih edilen modelidir. Ayrıca, uygun insan hipokampal dilimleri en hipokampal rezeksiyonu CA1 CA321hasarlı olarak kaydetmek için hemen hemen hiçbir fırsatlar vardır. Buna ek olarak, patolojik olmayan insan beyin dokusu subcortical Nöroşirürji yordamlar temporal lob epilepsi cerrahisi gibi ikincil sonucu olduğu gibi daha kolayca erişilebilir. Sigara-epileptik 'denetim' neocortical doku tümörü rezeksiyonu ameliyat elde edilebilir. Bu nedenlerden dolayı korteks fare ve klinik önemi onaylamak için insan dokusu arasında onun taşınabilirlik nedeniyle nöbet aktivitesi modelleme için tercih edilen bir sitedir. Son olarak, çünkü onlar kolayca transgenes hızlı ve optogenetic çeşitleri piyasada tercih edilen fareler C57BL/6 yük olduğunu. Optogenetic fare modelleri isteğe bağlı başlatma ictal olaylar üzerinden için minimal invaziv, kısa ışık stimülasyon sağlar. Bu çalışmada ele geçirme vakalarının inanılmaz verimli bekleme süreleri ortadan kaldırarak yapar ve nöronal altgrupları hedeflenen aktivasyonu için izin. Ayrıca, yeteneği isteğe bağlı nöbetler tetiklemek için kesin olarak nöbet inisiyasyon noktadan ayıran ve potansiyel olarak anti-nöbet ilaç adaylarının etkinliğini çalışma için yeni yollar sağlar. MATLAB tabanlı kullanıcı dostu bir program algılamak ve tüp bebek ve içinde vivo 4-AP nöbet modellerinde gerçekleşen epileptiform olayların çeşitli türleri sınıflandırmak için özel olarak geliştirilmiştir. Bu algılama programı elde edilebilir için download--dan Valiante Lab's GitHub repository (https://github.com/Valiantelab/ChangValiante2018).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri (Peter L. Carlin ve Taufik A. Valiante 119603 paspas), Ontario beyin Enstitüsü (için Taufik A. Valiante) ve Mightex öğrenci araştırma bursu (için Michael Chang) tarafından desteklenmiştir. Liam uzun süre video el yazması filme onun yardım teşekkür etmek istiyorum. Şekiller ve tablolar bu el yazması içinde derleme onların yardım için Paria Baharikhoob, Abeeshan Selvabaskaran ve Shadini Dematagoda kabul etmek istiyoruz. Şekil 1A, 3A, 4Ave 6A Chang ve ark. içinde Yayınlanan verilerden yapılan tüm orijinal rakamlar 16.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium pentobarbital N/A N/A Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
1 mm syringe N/A N/A Purchased through UT Med Store
25G 5/8” sterile needle N/A N/A Purchased through UT Med Store
Single edge razor blade (2x) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Instant adhesive glue N/A N/A Purchased through UT Med Store
Lens paper N/A N/A Purchased through UT Med Store
Glass petri dish (2x) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Splinter forceps (2x) N/A N/A Purchased through UT Med Store
PVC handle micro spatula N/A N/A Purchased through UT Med Store
Micro spoon with flat end N/A N/A Purchased through UT Med Store
Detailing brush 5/0 N/A N/A Purcahsed from a boutique art store
Wide bore transfer pipette N/A N/A Purchased through UT Med Store
Dental Tweezer N/A N/A Purchased through UT Med Store
Thermometer (digital) N/A N/A Purchased on Amazon.ca
Check carbogen tank (95%O2/5%CO2 N/A N/A Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
Vibratome Leica N/A Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
brain slice incubation chamber (a.k.a. brain slice keeper)  Scientific Systems Design Inc N/A
Sodium Chloride (NaCl) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Sodium Bicarbonate N/A N/A Purchased through UT Med Store
Dextrose N/A N/A Purchased through UT Med Store
Potassium Chloride (KCl) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Magnesium Sulfate (MgSO4 H2O) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Sodium phosphate monobasic monohydrate (HNaPO4·H2O) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Calcium Chloride (CaCl2·2H2O) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Sucrose N/A N/A Purchased through UT Med Store

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jefferys, J. G. R. Advances in understanding basic mechanisms of epilepsy and seizures. Seizure. 19, (10), 638-646 (2010).
  2. Fujiwara, H., et al. Resection of ictal high-frequency oscillations leads to favorable surgical outcome in pediatric epilepsy. Epilepsia. 53, (9), 1607-1617 (2012).
  3. Chen, H. Y., Albertson, T. E., Olson, K. R. Treatment of drug-induced seizures. British Journal of Clinical Pharmacology. 81, (3), 412-419 (2015).
  4. Kwan, P., Brodie, M. J. Early Identification of Refractory Epilepsy. New England Journal of Medicine. 342, (5), 314-319 (2000).
  5. Giussani, G., et al. A population-based study of active and drug-resistant epilepsies in Northern Italy. Epilepsy & Behavior. 55, 30-37 (2016).
  6. Pellock, J. M. Overview: definitions and classifications of seizure emergencies. Journal of Child Neurology. 22, (5_suppl), 9S-13S (2007).
  7. Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20, (5), 359-368 (2011).
  8. Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2016).
  9. Castel-Branco, M., Alves, G., Figueiredo, I., Falcão, A., Caramona, M. The maximal electroshock seizure (MES) model in the preclinical assessment of potential new antiepileptic drugs. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 31, (2), 101-106 (2009).
  10. Wendling, F., Bartolomei, F., Modolo, J. Neocortical/Thalamic In Silico Models of Seizures and Epilepsy. Models of Seizures and Epilepsy. Pitkänen, A., Buckmaster, P., Galanopoulou, A. S., Moshé, S. Academic Press. London, San Diego (CA), Cambridge (MA), Oxford. 233-246 (2017).
  11. Cocchi, L., Gollo, L. L., Zalesky, A., Breakspear, M. Criticality in the brain: A synthesis of neurobiology, models and cognition. Progress in Neurobiology. 158, 132-152 (2017).
  12. Xue, M., Atallah, B. V., Scanziani, M. Equalizing excitation-inhibition ratios across visual cortical neurons. Nature. 511, (7511), 596-600 (2014).
  13. Engel, J. Seizures and epilepsy. Oxford University Press. Oxford, UK. (2013).
  14. Panuccio, G., Curia, G., Colosimo, A., Cruccu, G., Avoli, M. Epileptiform synchronization in the cingulate cortex. Epilepsia. 50, (3), 521-536 (2009).
  15. Avoli, M., de Curtis, M. GABAergic synchronization in the limbic system and its role in the generation of epileptiform activity. Progress in Neurobiology. 95, (2), 104-132 (2011).
  16. Chang, M., et al. Brief activation of GABAergic interneurons initiates the transition to ictal events through post-inhibitory rebound excitation. Neurobiology of Disease. 109, 102-116 (2018).
  17. Jiruska, P., et al. High-frequency network activity, global increase in neuronal activity, and synchrony expansion precede epileptic seizures in vitro. The Journal of Neuroscience. 30, (16), 5690-5701 (2010).
  18. Jirsa, V. K., Stacey, W. C., Quilichini, P. P., Ivanov, A. I., Bernard, C. On the nature of seizure dynamics. Brain. 137, (Pt 8), 2210-2230 (2014).
  19. Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Ion Channels: Methods and Protocols. 337, 117-125 (2006).
  20. Li, H., Prince, D. A. Synaptic activity in chronically injured, epileptogenic sensory-motor neocortex. Journal of Neurophysiology. 88, (1), 2-12 (2002).
  21. Köhling, R., Avoli, M. Methodological approaches to exploring epileptic disorders in the human brain in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 155, (1), 1-19 (2006).
  22. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), e680 (2008).
  23. Ritter, L. M., et al. WONOEP appraisal: optogenetic tools to suppress seizures and explore the mechanisms of epileptogenesis. Epilepsia. 55, (11), 1693-1702 (2014).
  24. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, (9), 745-752 (2011).
  25. Arenkiel, B. R., et al. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54, (2), 205-218 (2007).
  26. Heinemann, U., et al. Brain slices from human resected tissue. Models of Seizures and Epilepsy. Pitkänen, A., Buckmaster, P., Galanopoulou, A. S., Moshé, S. Academic Press. London, San Diego (CA), Cambridge (MA), Oxford. 285-299 (2017).
  27. Florez, C., et al. In vitro recordings of human neocortical oscillations. Cerebral Cortex. 25, (3), 578-597 (2015).
  28. Lein, P. J., Barnhart, C. D., Pessah, I. N. Acute hippocampal slice preparation and hippocampal slice cultures. Methods in Molecular Biology. 115-134 (2011).
  29. Haas, H. L., Schaerer, B., Vosmansky, M. A simple perfusion chamber for the study of nervous tissue slices in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 1, (4), 323-325 (1979).
  30. Poulton, T. J., Ellingson, R. J. Seizure associated with induction of anesthesia with isoflurane. Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 61, (4), 471-476 (1984).
  31. Borris, D. J., Bertram, E. H., Kapur, J. Ketamine controls prolonged status epilepticus. Epilepsy Research. 42, (2-3), 117-122 (2000).
  32. DeFelipe, J., Alonso-Nanclares, L., Arellano, J. I. Microstructure of the neocortex: comparative aspects. Journal of Neurocytology. 31, (3-5), 299-316 (2002).
  33. Velasco, A. L., Wilson, C. L., Babb, T. L., Engel, J. Functional and anatomic correlates of two frequently observed temporal lobe seizure-onset patterns. Neural Plasticity. 7, (1-2), 49-63 (2000).
  34. Vlachos, A., Reddy-Alla, S., Papadopoulos, T., Deller, T., Betz, H. Homeostatic regulation of gephyrin scaffolds and synaptic strength at mature hippocampal GABAergic postsynapses. Cerebral Cortex. 23, (11), 2700-2711 (2012).
  35. Kirmse, K., et al. GABA depolarizes immature neurons and inhibits network activity in the neonatal neocortex in vivo. Nature Communications. 6, 7750 (2015).
  36. Stein, V., Hermans-Borgmeyer, I., Jentsch, T. J., Hübner, C. A. Expression of the KCl cotransporter KCC2 parallels neuronal maturation and the emergence of low intracellular chloride. Journal of Comparative Neurology. 468, (1), 57-64 (2004).
  37. Wong, B. Y., Prince, D. A. The lateral spread of ictal discharges in neocortical brain slices. Epilepsy Research. 7, (1), 29-39 (1990).
  38. Trevelyan, A. J., Sussillo, D., Watson, B. O., Yuste, R. Modular propagation of epileptiform activity: evidence for an inhibitory veto in neocortex. Journal of Neuroscience. 26, (48), 12447-12455 (2006).
  39. Brahma, B., Forman, R., Stewart, E., Nicholson, C., Rice, M. Ascorbate inhibits edema in brain slices. Journal of Neurochemistry. 74, (3), 1263-1270 (2000).
  40. MacGregor, D. G., Chesler, M., Rice, M. E. HEPES prevents edema in rat brain slices. Neuroscience Letters. 303, (3), 141-144 (2001).
  41. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: Application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Patch-clamp Methods and Protocols. Martina, M., Taverna, S. Humana Press. New York, NY. 221-242 (2014).
  42. Swartzwelder, H. S., Lewis, D., Anderson, W., Wilson, W. Seizure-like events in brain slices: suppression by interictal activity. Brain Research. 410, (2), 362-366 (1987).
  43. Lees, G., Stöhr, T., Errington, A. C. Stereoselective effects of the novel anticonvulsant lacosamide against 4-AP induced epileptiform activity in rat visual cortex in vitro. Neuropharmacology. 50, (1), 98-110 (2006).
Akut Ictal faaliyet kemirgen ve insan dokusu üretimi ve isteğe bağlı başlatma
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chang, M., Dufour, S., Carlen, P. L., Valiante, T. A. Generation and On-Demand Initiation of Acute Ictal Activity in Rodent and Human Tissue. J. Vis. Exp. (143), e57952, doi:10.3791/57952 (2019).More

Chang, M., Dufour, S., Carlen, P. L., Valiante, T. A. Generation and On-Demand Initiation of Acute Ictal Activity in Rodent and Human Tissue. J. Vis. Exp. (143), e57952, doi:10.3791/57952 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter