En temperaturgradient Assay til at fastlægge termisk præferencer af Drosophila larver

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at bestemme den foretrukne miljømæssige temperaturen i Drosophila larver ved hjælp af en kontinuerlig termisk gradient.

Abstract

Mange dyr, herunder bananfluen Drosophila melanogaster, er i stand til at diskriminere minut forskelle i miljømæssige temperatur, som gør det muligt for dem at opsøge deres foretrukne termisk landskab. Hvis du vil definere indstillingerne temperatur af larver over en defineret lineære område, udviklede vi en analyse ved hjælp af en temperaturgradient. For at etablere en enkelt-directional gradient, er to aluminium blokke forbundet til uafhængige vandbade, hvoraf hver styrer temperaturen i individuelle blokke. De to blokke angive de øvre og nedre grænser for farveforløbet. Temperaturgradient er etableret ved at placere en Agarosen-belagt aluminiumplade over de to vand-kontrollerede blokke, således at pladen strækker sig over afstanden mellem dem. Enderne af aluminiumplade, der ligger på toppen af vandet blokke definerer de minimale og maksimale temperaturer, og regionerne mellem de to blokke udgør en lineær temperaturgradient. Gradient analysen kan anvendes til larver i forskellige aldre og kan bruges til at identificere mutanter, som udviser fænotyper, såsom dem med mutationer påvirker gener kodning TRP kanaler og opsins, som er nødvendige for temperatur forskelsbehandling.

Introduction

Thermotaxis er ansat af mobile dyr at vælge et miljø med de mest favorable vilkår^1,2,3. Hvis klimaet er alt for varmt eller koldt, er denne adfærd afgørende for overlevelse. Derudover mange dyr er følsomme over for meget små forskelle i temperatur i den komfortable område og opsøge omgivelser med en ideelle temperatur. Dette er af særlig betydning for koldblodede organismer såsom bananfluer, som reagensglasset deres kropstemperatur med miljøet. Assays til at overvåge larve thermotaxis har været medvirkende til at identificere og præcisere rollefordelingen mellem molekylære sensorer som Drosophila forbigående Receptor potentielle (TRP) kanaler^4,5,6, rhodopsiner^7,8, og ionotropic receptor receptorer (IRs)⁹, som udstyrer disse dyr med temperatur følsomheder over forskellige temperaturområder.

En to-vejs valg test giver én tilgang til at studere termisk præferencer i larver^6,7. Analysen forudsætter oprettelse af to forskellige temperaturzoner og tillader dyr at vælge ene over den anden. Resultater fra to-vejs valg test kan være robust, især hvis temperaturforskelle mellem de to muligheder er store. Derudover da hvert assay omfatter tabulerer kun to grupper, kan dataene, der udtrykkes som en simpel præference indeks. Den lethed og enkelhed af to-vejs valg assays er også indstillet til genetiske skærme. Men en stor begrænsning er, at mange eksperimenter er forpligtet til at fastsætte den foretrukne temperatur af wild-type eller mutant dyr.

En gradient assay tilbyder mulighed for at fastsætte den foretrukne temperatur i en enkelt assay⁸. Desuden, i modsætning til to-vejs valg test, det tillader evalueringen af fordelingen af en gruppe af dyr, når de konfronteres med en kontinuerlig række temperaturer. En gradient assay bruger en petriskål og enkelt dyr og er velegnet til kendetegner den detaljerede opførsel af enkelte dyr¹⁰. Men da petriskåle er runde, størrelser af temperaturzoner varierer og er gradvis mindre afhængigt af afstanden fra centrum. Derfor, denne opsætning er ikke ideelt til at overvåge temperatur valg af populationer af dyr.

En kontinuerlig termisk gradient apparat, der er velegnet til at vurdere temperatur indstillingerne af grupper af larver beskæftiger en rektangulær arena og er beskrevet her. Apparatet er enkelt at konstruere og samle. Derudover gradient er lineær, og er fleksibel, så det kan bruges til at vurdere thermotaxis over store temperaturområder fra 10 ° C til 42 ° C. Analysen er hurtig og ligetil at udføre og giver reproducerbare data. Ud over at rapportere den foretrukne temperatur af larver, afslører det præferencer af populationen af dyr over en hel lineære område i et enkelt eksperiment. På grund af disse fordele er det et glimrende valg for at identificere gener, der kræves til thermotaxis.

Protocol

1. udstyr fabrikation og montering apparater til Gradient Assays

1. Fremstil aluminium assay plader for single-directional gradient assay.
   1. Trim og male hver aluminium assay plade (figur 1A) ud af et enkelt stykke aluminium ved hjælp af en båndsav og skarp lodret mill med følgende dimensioner: den ydre størrelse er 140 x 100 x 9 mm og den indre er 130 x 90 x 8 mm (figur 1B). Anodize på indersiden af hvert assay plade med sort maling til at gøre det nemmere at visualisere larverne og forhindre rust.
      Bemærk: Fremstilling af aluminium assay plader for single-directional gradient er udført af et Maskinværksted. Anodization er udført af en kommerciel leverandør.
   2. Markere de øvre og nedre fælge i hvert assay plade med 13 afgrænsninger, adskilt af 10 mm ved hjælp af en permanent markør. Placer de første og sidste proveniensregioner 5 mm fra den inderste kant af assay plader (figur 1A, B).
2. For at fremstille aluminium assay plade for torettede sprog hældning, skåret ud af en aluminiumplade med følgende dimensioner ved hjælp af metalplader sakse: 250 x 220 x 2 mm. Anodize assay plader med sort maling.
   Bemærk: Fremstilling af aluminium assay plader til tovejs gradienter er udført af et Maskinværksted. Anodization er gjort af en kommerciel leverandør.
3. Fremstil aluminium blokke.
   Bemærk: To blokke er nødvendig for single-directional gradient og tre blokke er nødvendige for torettede sprog hældning.
   1. Skære aluminium blokke (figur 1 c) ud af et enkelt stykke aluminium ved hjælp af en båndsav (dimensioner 50 x 255 x 14 mm) (figur 1 c, D).
   2. Drill vand kanal indeni blok (7 mm i diameter) ved hjælp af en lodret mill og tråd riller i de åbne ender på den ene side (fig. 1 d). Luk de rillede huller med bolte og tråd seal tape til at danne en U-formet vand kanal (figur 1 c, D).
      Bemærk: Fremstilling af aluminium assay blokke er udført af et Maskinværksted.
   3. Fix stikket i aluminium blok (fig. 1 d) med gevind og tråd forsegle tape i den ene ende. Passe anden enden med flere modhager i silikone slanger (ID 1/4" x 3/8" OD x 1/16" væg).
4. Få to nedkølet/opvarmet cirkulerende bade.
5. Samle temperaturregulerede blokke for gradient assay system.
   1. For single-directional gradient, tilslutning af hver af de to blokke, aluminium til en separat vandbad så temperaturen i hver blok er kontrolleret af en uafhængig vandet cirkulerer system (figur 2A). Bruge silikoneslanger (ID 1/4" x 3/8" OD x 1/16" væg) tilsluttes stikkontakt i vandbadet til stikket på den indvendige side af aluminium blok (figur 2A). Også bruge slangen til at forbinde den udvendige side stik på aluminium blok til indløb af vandbadet.
   2. For torettede sprog hældning, placere to af de tre blokke under venstre og højre side af pladen og forbinde dem til de samme vandbad med slangen (figur 2B). Tilslut den tredje aluminium blok til en anden vandbad og sted nedenfor midten af pladen (figur 2B).
      NOTE: Dette apparat og assay er kun nødvendigt hvis larverne ophobes i zonen på kanten eller den anden af single-directional gradient. Hvis ja, er det vigtigt at vurdere, om der er en kant effekt. For at teste denne mulighed, etablere et tovejs forløb hvor kant zone temperaturen foretrækkes af larver ved hjælp af single-directional gradient (f.eks. 18 ° C) er temperaturen i midten af pladen af tovejs gradient (figur 3E , F).

2. larve synkronisering

1. Nære fluer skal anvendes til æglægning.
   1. Bland gær granulat og destilleret vand med en pistil at gøre gær indsætte. Grundigt slibe og rør indtil konsistensen af pastaen er svarende til jordnøddesmør. Undgå alt for tør pasta, som kan flage ud, når du overfører fluer til frisk hætteglas, eller våd pasta, som kunne fange fluer.
   2. Med en pistil, tilføje gær pasta tæt på de indvendige vægge af standard Drosophila hætteglas, lige over overfladen af maden.
   3. Antal 12-35 hunner og op til halvt så mange mænd (men ikke mere end 10) på et CO₂ pad, og tilføje hunner og hanner til hvert gær pasta-holdige hætteglas.
   4. For at holde fluen mad med gær-paste fugtig, mens fluer feed, kombinere disse hætteglas i en bakke, der holder op til 100 hætteglas med 20 åben hætteglas indeholdende destilleret vand. Placer skuffen i en klar plasticpose og forsegle.
   5. Inkuber bakken i en 25 ° C inkubator for 48 h, således at hunnerne er næret tilstrækkeligt, hvilket gør det muligt for dem at lægge stort antal æg.
2. Oprette hætteglas til æglægning.
   1. Overføre næret fluer til nye fødevarer hætteglas til indsamling af æg ved at trykke dem. Brug ikke CO_2, hvilket kan forårsage fluer at lægge færre æg over vinduet følgende kort tid.
      Bemærk: Standard Drosophila mad hætteglas bruges uden gær pasta for ægudtagning.
   2. Tillad fluer at lægge æg i 3 timer ved 25 ° C, således at alle æg er indsamlet over en forholdsvis smal tidsvindue.
      Bemærk: Dette vil aktivere larver skal synkroniseres på de samme udviklingsstadiet.
   3. Placer hætteglas indeholdende æg i den bakke, der indeholder vand hætteglas og stramme posen. Der inkuberes ved 25 ° C under 12 h lys: 12 h mørke cyklusser.
   4. Alder larverne for et givet antal timer efter æglægning (AEL) afhængigt af stadiet larve ønskes.
      Bemærk: Tabel 1 er en vurdering af forholdet mellem timer AEL og larver scenen, som vil variere afhængigt af flyve bestanden, mad anvendes, opdræt temperatur etc. det præcise forhold mellem AEL og udviklingsstadiet skal være verificeret af hver investigator bruger fysisk kriterier, såsom morfologi af munden kroge og Spirakler¹¹.

3. temperaturgradient Setup

1. Forberede single-directional gradient
   1. Du kan oprette et fugtigt omgivende miljø under assays, placere to aluminium blokke tilsluttet to vandbade på vådt papirhåndklæder, adskilt af 10 cm (figur 2A).
   2. Slå de to vandbade ~ 2 h før indlede assay for at give tilstrækkelig tid til temperaturen i aluminium blokke til Reagensglasset.
      Bemærk: Det anbefales at udføre en mock eksperiment for at bestemme temperaturen i hver vandbad, der er nødvendige for at opnå den ønskede lineær temperaturgradient. Nogle typiske temperatur par til at indstille vandbade er angivet i tabel 2. Bemærk dog, at den overfladetemperatur påvirkes af omgivelsernes temperatur. Længden af slanger også påvirker temperaturerne som der er køling i rør. Længde af slange i vores setup er 1,5 m.
   3. Mikroovn 100 mL 1% Agarosen på indstillingen high-power i en 500 mL runde bred mund flaske og hæld 25 mL/assay plade på en niveau benchtop. Forbered to assay plader, som kan placeres på aluminium blokke på samme tid (figur 2A).
   4. Efter Agarosen er størknet (10-20 min), forsigtigt gnide hver Agarosen overflade med en standard køkken svamp eller en melamin svamp at gøre Agarosen overfladen lidt grove, således at når sprøjte vand på agarosegel, oprettes der en jævn tynd vand membran, og ingen vanddråber vil danne.
   5. Fuldt dykke plader i en beholder med destilleret vand, indtil analysen er klar til at udføres for at forhindre, at pladerne bliver udtørret.
2. Forberede en tovejs gradient (valgfri)
   1. Du kan oprette et fugtigt omgivende miljø under assays, sted tre aluminium blokke 8 cm fra hinanden (figur 2B) på vådt papirhåndklæder.
   2. Slå de to vandbade ~ 2 h før indlede assay for at give tilstrækkelig tid til temperaturen i aluminium blokke til Reagensglasset.
      Bemærk: Det anbefales at udføre en mock eksperiment for at bestemme temperaturen i hver vandbad for torettede sprog hældning. Nogle typiske temperatur par til at indstille vandbade er angivet i tabel 3. Bemærk dog, at den overfladetemperatur påvirkes af omgivelsernes temperatur. Længden af slanger også påvirker temperaturerne som der er køling i rør. Længde af slange i vores setup er 1,5 m.
   3. For at forhindre Agarosen breder ud af pladen, wrap kanter af aluminiumplade med mærkning tape for at danne en 10 mm-høj væg (figur 2B).
   4. Ved hjælp af indstillingen high-power, mikrobølgeovn 200 mL 1% Agarosen i en 500 mL runde bred mund flaske og hæld 120 mL på en assay plade.
   5. Efter Agarosen er størknet (~ 30 min), forsigtigt gnide hver Agarosen overflade med en standard køkken svamp eller en melamin svamp at gøre Agarosen overfladen lidt grove, således at når sprøjte vand på agarosegel, en glat blå vand membran er lavet og ingen Vand slipværktøjer form.
   6. Fuldt dykke assay pladerne i en beholder med destilleret vand, indtil analysen er klar til at blive udført for at forhindre dem i at udtørre.
3. Oprette enkelt-directional gradient
   1. Forberede reagenser og elementer på en bænk ved siden af apparatet gradient assay (Se Tabel af materialer).
   2. For at fremme effektiv temperatur overførsel, skal du udfylde eventuelle huller mellem aluminium blokke og assay pladerne ved at sprøjte vand på grænsefladen mellem blokke og plade.
   3. Brug handsker, fjerne assay plader fra vandbeholderen. Hvis vand invaderer mellem agarosegel og pladen og forårsager knopper til form på overfladen, fjerne vand med en P1000 mikropipette.
   4. Placer assay plader på aluminium blokke, så de afgrænsninger, der er 2 cm fra hver kant præcis match kanter af aluminium blokke (figur 2A, C).
   5. Spray vand på overfladen af pladen (en tynd vand membran der dækker Agarosen overflade er tilstrækkelig) at forhindre agarosegel mod udtørring. Sørg for at vandet membran er fortløbende og gratis af vanddråber da larverne kan få fanget i vanddråber.
   6. Dækker den gradient system med en papkasse til at reducere vand fordampning og hjælpe med at stabilisere gel overflade. Vente på 5-10 min at tillade temperatur til Reagensglasset.
   7. Kontrollere overfladetemperatur på 12 point på pladen (figur 2 c). Tage to målinger inden for hver zone for at fastslå, hvorvidt der er variation inden for en zone. Sørg for at temperaturen ved begge steder ligger inden for ± 0,2 ° C af den ønskede temperatur.
      Bemærk: Variation inden for en zone normalt opstår fordi de nøjagtige afstande af de to steder til kanten af aluminium blokke ikke er identiske. Justere placeringen af pladen, aluminium blokke for at sikre, at de afgrænsninger, der er 2 cm fra hver kant præcis match kanter af aluminium blokke.
   8. Hvis den målte temperatur graduering afviger fra den ønskede gradient, øge eller formindske vand bad temperatur indstilling(er) og recheck overfladetemperatur, når temperaturen i vandet bath(s) stabilize(s).
   9. Dække den gradient system med en papkasse indtil begynder analysen.
4. Opsætning af tovejs gradient (valgfrit)
   1. Forberede reagenser og elementer på en bænk ved siden af apparatet gradient assay (Se Tabel af materialer).
   2. Spray vand på overflader af de tre blokke, aluminium at fremme effektive temperatur overførsel fra aluminium blokke til assay pladerne ved at udfylde eventuelle huller mellem overfladerne.
   3. Fjern assay plader omhyggeligt fra vandbeholderen og placere på aluminium blokke. Hvis vand invaderer mellem agarosegel og den plade, som kan forårsage stød til form på overfladen, fjerne vand med en P1000 mikropipette.
   4. Placer assay plade på aluminium blokke, så midlines af de første og sidste zoner fra enten kant svarer nøjagtigt til kanterne af to side aluminium blokkene (figur 2B, D).
   5. Spray vand på overfladen af pladen (en tynd vand membran der dækker Agarosen overflade er tilstrækkelig) at forhindre agarosegel mod udtørring. Sørg for at vandet membran er fortløbende og gratis af vanddråber, da larverne kan få fanget i vanddråber.
   6. Dækker den gradient system med en papkasse til at reducere vand fordampning og hjælpe med at stabilisere gel overflade. Vent 5-10 min for at tillade temperatur til Reagensglasset.
   7. Kontrollere overfladetemperatur på to punkter langs midterlinjen i hver af de 10 zoner (figur 2D). Tage to målinger inden for hver zone for at fastslå, hvorvidt der er variation inden for en zone. Sørg for at temperaturen ved begge steder ligger inden for ± 0,2 ° C af den ønskede temperatur.
      Bemærk: Variation inden for en zone normalt opstår fordi de nøjagtige afstande af de to steder til kanten af aluminium blokke ikke er identiske. Justere placeringen af pladen, aluminium blokke for at sikre, at midlines af de første og sidste zoner nærmeste hver kant præcis match kanter af to side aluminium blokkene.
   8. Hvis den målte temperatur graduering afviger fra den ønskede gradient, justere vand bad temperatur indstilling(er) og recheck overfladetemperatur, når temperaturen i vandet bath(s) stabilize(s).
   9. Dække blokke med en papkasse indtil starten af analysen.

4. larve samling og vask

1. Isolere ren larver (mulighed 1)
   1. Tilføje ~ 40 mL 18% rørsukkeropløsning til en 50 mL reagensglas. SCOOP alle larver fra mad vial(s) med scoopula og overførsel til 18% rørsukkeropløsning.
   2. Blandes grundigt men forsigtigt ved hjælp af en scoopula til at adskille larver fra madrester. Vente til 30-60 s larver float til det øverste lag af røret. Hæld det øverste lag, der indeholder larver (~ 10 mL) til en anden 50 mL tube og fylde røret med friske 18% rørsukkeropløsning. Vente på 30-60 s indtil larver float til det øverste lag igen.
      Bemærk: Store madpartikler undertiden overføre sammen med larver og kan påvirke larve thermotaxis, hvis de ikke fjernes. Hvis store fødevarer partikler forbliver i det øverste lag, Gentag trin 4.1.1-4.1.2, eller manuelt fjerne dem ved hjælp af en scoopula.
   3. Overføre det øverste lag af larver (~ 10 mL) til to andre 50 mL rør og udfylde de to rør med destilleret vand til at reducere saccharose, således at larver hurtigt drukne i vand. Vente 30-60 s, indtil larverne synker til bunds. Udføre dette og de følgende skridt så hurtigt som muligt at forhindre larverne fra at drukne.
   4. Kassér så meget vand som muligt ved at forsigtigt vippe rør. Kombinere larver ind i et rør ved at hælde ud af larverne med de resterende vand og fylde røret med destilleret vand.
   5. Vente 30-60 s, indtil alle larver synke ned og fjerne så meget vand som muligt ved at forsigtigt vippe rør. Gentag trinnet vask 2 - 4 gange til helt Fjern saccharose og alle synlige mad.
   6. Kassér så meget vand som muligt og overføre larverne til en tom 35 mm petriskål ved dekantering. Spray røret med vand og bruge en lille pensel til at overføre larverne.
   7. Fjern overskydende vand fra petriskål ved hjælp af en P1000 mikropipette. Forlade ~0.5 mL vand for at undgå dehydrering af larverne.
   8. Låget lægges på skålen til at forhindre, at larverne flygter. Drej låget op og ned for at reducere muligheden for larver at flygte gennem den lille kløft mellem låg og fad. Tillad larver at inddrive for 10-20 min.
2. Isolere ren larver (mulighed 2)
   Bemærk: Denne alternative metode til rengøring larver afbøder muligheden for kvælende larverne under vask procedure. Hvis du bruger denne metode, fortsætte med følgende trin efter at udføre ovenstående trin 4.1.1-4.1.2.
   1. Placer en celle si (300 µm, bevarer larver 72 h AEL eller ældre) på toppen af en 50 mL tube.
   2. Når du har bekræftet, at der er ingen voksne organer eller madrester flyder på overfladen af rørsukkeropløsning, hæld det øverste lag, der indeholder larverne gennem si til at fælde alle larver på skærmen mesh. Vask larver grundigt med destilleret vand, indtil 50 mL tube er fyldt.
   3. Fjerne celle si med larver og bortskaffe det brugte vand fra røret. Placer sien indeholdende larver oven på den tomme rør og vaske larver igen med destilleret vand, indtil 50 mL tube er fyldt.
   4. Drej sien hovedet over en tomme 35 mm petriskål, og sprøjte vand fra toppen af celle si at overføre larverne til petriskålen. Overføre de resterende larver ved hjælp af en lille pensel.
   5. Fortsæt til trin 4.1.7 ovenfor inden du fortsætter til trin 5.

5. analyse og beregning

1. Fjerne den papkasse og kontrollere gel overflade temperatur umiddelbart før overførsel larverne til pladen. Minimere den tid, at den papkasse er åben for forhindre forstyrre temperatur ækvilibrering. Hvis overfladen er tør, spray en lille mængde vand på overfladen.
2. Distribuere 150 ± 50 larver nær midten af hver tallerken (mellem zone 3 og 4 ud af de 6 zoner) for single-directional gradient (release zone; Figur 2 c).
   Bemærk: For torettede sprog hældning, distribuere 200-400 larver langs den midterste zone for hver halvdel (figur 2D).
3. Placer en mikrotiterplade låg over hver assay plade til at forhindre, at larver kravler ud. Dække setup med en papkasse til at forhindre lys eksponering, som kan påvirke larve valg på agarosegel.
   Bemærk: For torettede sprog hældning, det bør ikke være nødvendigt at dække plade med låg, fordi pladen er større, og larverne foretrukne temperatur er i mellemzonen. Derfor få larver ophobes på kanterne og har mulighed for at kravle ud.
4. Tillad analyse til at fortsætte i 10-30 min for single-directional gradient, og 15-35 min til tovejs gradient, afhængigt af alder af larver (tabel 4).
5. Fjerne den papkasse og mikrotiterplade låget. Fotografere plader fra oven ved hjælp af et digitalt kamera. Tage to fotografier af hvert assay plade, så investigator kan vælge ene med bedre kontrast og lysstyrke for analyse.
6. Fjerne alle larverne fra assay plader og overalt uden for pladerne ved aspiration.
7. Ren assay plader, rør og celle si grundigt med destilleret vand. Genbruge assay pladerne forberedt denne dag medmindre overfladen af Agarosen er beskadiget.
8. Beregn den procentvise fordeling af larver i hver zone.
   1. Åbn det fotografiske billede af analyse resultater ved hjælp af software, der tillader tilføjelse markeringer til billedet. For at angive assay zoner, tegne lodrette linjer hver 2 cm baseret på proveniensregioner på assay plade.
   2. Tæl antallet af larver i hver zone og indspille numrene. Tæl ikke larver i regioner 0,5 cm fra nogen af væggene. Gelen er tykkere i nærheden af væggene, og den overfladetemperatur er ikke lineær i disse regioner.
   3. Single-directional gradient, Beregn den procentvise fordeling i hver zone som følger:
      (antallet af larver i en given zone med 2-cm) / (antal larver i 6 zoner) x 100.
   4. For torettede sprog hældning, beregne den procentvise fordeling i hver zone som følger:
      (antallet af larver i en given zone med 2-cm) / (antal larver i 5 zoner på hver side af gradient) x 100.

Representative Results

For at etablere en 18 ° C - 28 ° C single-directional gradient, vi har sat temperaturer på to vandbade til 16,8 og 31 ° C. Vi opnå temperaturer på 13 point ved at måle temperaturen på 26 stillinger i de øvre og nedre dele af alle 6 zoner, kantlinjer mellem zoner, og i ekstreme enderne af Agarosen gel overflade (figur 2 c, 2E). Temperaturfordelingen langs forløbet var næsten lineær (Y = 0.9672 * X + 16.19, R² = 0.9961) (figur 2E).

Vi analyseres temperatur indstillinger af kontrol (w¹¹¹⁸) larver på forskellige alderstrin. 1^st (24 ± 1,5 h AEL), 2^nd (48 ± 1,5 h AEL) og tidlig-3^rd larver (72 ± 1,5 h) viste toppe i zonen 24 ° C (figur 3A, B). Temperatur indstillinger ændres under 3^rd instar larve udvikling. Den største procentdel af midten af 3^rd instar (96 ± 1,5 h AEL) akkumuleret i zonen 18 ° C (figur 3A, B), og denne bias øges med alderen. Blandt sene-3^rd instar larver (pre klatring; 120 ± 1,5 h AEL), ~ 50% grupperet i zonen 18 ° C, og at udvælgelsen af denne temperatur var ~ bukkes 4 gange højere end zonen tilstødende 20 ° C (18 ° C zone, 50.2%; 20 ° C zone, 15,1%; Figur 3A B). Hang til at akkumulere i zonen 18 ° C i w¹¹¹⁸ skyldtes ikke en kant effekt da sent-3^rd instar larver stadig akkumuleret i zonen 18 ° C ved hjælp af en tovejs temperaturgradient (figur 3E, F ).

Vi testede også sent-3^rd instar larver (120 ± 1,5 h AEL) med mutationer i gener, der kræves for kræsne temperaturforskelle inden for komfortabel rækkevidde. Disse omfatter trpA1, som er nødvendig for normal temperatur udvalg i 18 ° C - 24 ° C række^5,7,8. Larverne med en null mutation i trpA1 (trpA1¹) fordeler ligeligt over hele 18 ° C — 28 ° C gradient (figur 3 c). Larverne mangler bare A- og B-isoformer (trpA1-AB^G4), eller C- og D-isoformer (trpA1-CD^G4) også vise svær funktionsnedsættelse (figur 3 c). Fluer indkode to isoformer af fosfolipase Cβ (PLC21C og NORPA), og mutationer påvirker norpA (norpA^P24) men ikke plc21c (plc21c^P319) også forstyrre ophobning på 18 ° C-rækken ( Figur 3D).

Figur 1. Apparater til at udføre single-directional temperaturgradient assay. (A) en aluminium teste plade anvendes til boltpistoler larve thermotaxis adfærd. De 13 sorte streger øverst og nederst afgrænse 12 zoner (10 mm). Bunden af pladen er anodiseret med sort maling, således at det er nemmere at visualisere larverne. (B) dimensioner af aluminiumplade (angivet i mm). Aluminiumplade ydre størrelse er 140 x 100 x 9 mm. Den indre størrelse af aluminiumplade er 130 x 90 x 8 mm. Proveniensregionernes afgrænsning er adskilt af 10 mm. Den første og sidste afgrænsning er 5 mm fra kanten af det indre område af pladen. (C) Top og side udsigt over en af blokkene, aluminium bruges til at kontrollere temperaturen af gradienten. Blokken har to stik anvendes til at fastgøre til silicium rør, der tilsluttes et vandbad. (D) dimensioner af en aluminium blok. Den ydre størrelse af aluminium blok er 255 x 50 x 14 mm. Diameteren af den indre vand sti er 7 mm. To 30 mm stik til venstre forbinde med silikone slanger, der strækker sig til et vandbad. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Enkelt og torettede gradient assay opsætninger. (A) Single-directional gradient setup med to aluminium assay plader på to aluminium blokke. Af aluminium blokke temperatur styres af cirkulerende vand fra to vandbade. (B) arrangement af tre aluminium blokke, vandbade og en aluminiumplade (250 x 220 mm) for en tovejs gradient. De venstre og højre blokke er tilsluttet den samme vandbad og den mellemste blok er tilsluttet de andre bad med vand. Aluminium assay plade er omviklet med tape for at danne en 10 mm væg til at indeholde 1% agarosegelelektroforese. (C) holdninger at kontrollere temperaturer (angivet med prikker) og frigive larver på pladen. Før du indleder et eksperiment, kontrollere temperaturen på to punkter inden for hver zone for at bekræfte, at den ønskede lineær temperaturgradient er etableret. Larverne er udgivet inden for det angivne område nær midterlinjen. Larverne tælles inden for hver af de 2-cm zoner. (D) holdninger til at kontrollere temperaturer (angivet med prikker) og frigivelse zoner for larver på en tovejs gradient. Et tilsvarende antal larver er udgivet langs midterlinjen af hver halvdel af tovejs gradient. Antallet af larver tælles i hver af 10 (2 cm) zoner. En typisk sæt af temperaturer (18 ° C - 26 ° C) på Agarosen overflade er indiceret. (E) temperaturer målt langs grænsen linjer og midlines af hver enkelt zone i en prøve single-directional gradient. Data repræsenterer gennemsnitlige temperaturer ± SD. n = 8 assays (150 ± 50 larver/analyse). Dele af denne figur er gengivet fra Sokabe et al. ⁸ med mindre ændringer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. Repræsentative resultater ved hjælp af single-retningsbestemt og torettede gradient assays. (A, B) Nedrig procentsatser af larver i 6 zoner på single-directional gradient. Data omfatter 3^rd instar larver på de angivne timer efter æglægning (AEL). n = 6-7. Fejllinjer i et repræsenterer ±SEM. (C) termisk distributioner af den pre klatring sent-3^rd instar larver af kontrol (w¹¹¹⁸) og trpA1 mutanter på single-directional gradient. n = 3-4. Fejllinjer udgør ±SEM. (D) termisk distributioner af sene-3^rd instar larver af kontrol (w¹¹¹⁸) og PLCβ mutanter på single-directional gradient. n = 4-6. Fejllinjer udgør ±SEM. (E) repræsentative distribution af pre klatring, sent-3^rd instar larver (w¹¹¹⁸) på tovejs gradient. Venstre og højre assay zoner er angivet af stiplede linjer og adskilt af no-count zone i centrum (skraverede område). (F) procentdel af pre klatring sent-3^rd instar larver (w¹¹¹⁸) i hver zone langs den graduering, der termisk. Larverne blev placeret i venstre og højre frigive zoner. Zonerne assay er adskilt af en 3-cm no-count zone i midten og distributioner beregnes uafhængigt. Fejllinjer udgør SEMs. n = 3 assays (200-400 larver/analyse). Dele af denne figur er gengivet fra Sokabe et al. ⁸ med mindre ændringer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Timer AEL	Larve stadie
24	1st instar
48	2nd instar
72	Tidlig-3rd instar
96	Midten af 3rd instar
120	Sen-3rd instar, lige før klatring fase

Tabel 1. Forholdet mellem timer efter æglægning (AEL) og larver faser.

Temperaturgradient på Agarosen plade (hældning)	Temperaturer på vandbade	Temperaturer på aluminium blokke
10,0-25,0 ° C (1,5 ° C/cm)	~6.5-7°C/~28.5°C	~8.5°C/~26.8°C
18,0-28.0° C (1° C/cm)	~16.8°C/~31.0°C	~17.8°C/~29.7°C
14,0-34.0° C (2° C/cm)	~10.0°C/~40.0°C	~11.8°C/~36.8°C
12,5-42.0° C (2,95 ° C/cm)	~7.0°C/~55.0°C	~9.4°C/~49.4°C

Tabel 2. Typiske temperatur forløb og de tilsvarende temperaturer vandbade og aluminium blokke for enkelt retningsbestemt forløb.

Temperaturgradient på Agarosen plade	Temperaturer på vandbade	Temperaturer på aluminium blokke
22-10-22 ° C (1,5 ° C/cm)	~5.0°C /~25.0°C	~7.5°C/~24.0°C
26-18-26 ° C (1° C/cm)	~15.8°C /~30.6°C	~16.9°C/~28.4°C
30-14-30 ° C (2° C/cm)	~8.5°C /~36.4°C	~10.9°C/~32.8°C
36-12,5-36 ° C (2,95 ° C/cm)	~5.0°C /~47.2°C	~7.9°C/~40.9°C

Tabel 3. Typiske temperatur forløb og de tilsvarende temperaturer vandbade og aluminium blokke for tovejs forløb.

Larve alder (AEL)	Assay tid (enkelt retningsbestemt)	Assay tid (tovejs)
24 h	30 min	35 min
48 h	22 min	27 min
72 h	16 min	21 min
96 h	13 min	18 min
120 h	10 min	15 min

Tabel 4. Forskellige larve aldre (AEL) og de tilsvarende assay gange.

Discussion

For at sikre succes i denne protokol, er det vigtigt at tage skridt til at opnå tilstrækkelig antal larver at udføre eksperimenter. Disse omfatter pre fodring fluer i gær pasta-holdige hætteglas til 2-3 d at forbedre æglægning. Hætteglassene skal være placeret i en bakke, der indeholder vand hætteglas og indkapslet i en klar plastikpose, som bevarer fugt af maden og fremmer effektiv fodring af larverne samtidig tillader eksponering for normale lys-mørke cyklus. Gær Indsæt bør dog ikke være så blød, at fluerne blive fanget. Antallet af hunner pr. hætteglas afhænger af genotypen. For w¹¹¹⁸er det normalt tilstrækkeligt at tillade ~ 12 tæver, og ~ 6 hanner at lægge æg for 3 h. To hætteglas typisk give nok larver (100-200 larver) til at placere på en plade for single-directional assay. Hvis den flyve stock lægger færre æg end wild-type eller andelen af larver, der klækkes er reduceret, tilføje yderligere hunner (op til 30-35/vial) og hanner.

Der er mange årsager til utilsigtede variabilitet, når du udfører disse assays. Den udviklingsstadiet påvirker temperatur præference af larverne. Derfor er det bydende nødvendigt at omhyggeligt bruge larver af et defineret tidspunkt. For at gøre dette, skal du indsamle larver over en snæver tidsramme (f.eks. 3 h). Da opdræt betingelser (temperatur, fugtighed, lys-mørke cyklus og type mad) og nogle mutationer påvirker udviklingshastigheden, ikke stole strengt på tiden efter æglægning for at analysere sammenligneligt alderen larver. Det er også vigtigt at undersøge fysiske træk, såsom størrelsen af de munden kroge og Spirakler⁷ til at afgøre, om larver af forskellige genotyper er på den samme udviklingsstadiet. Gange for 1^st, 2^nd og 3^rd instar larver at udvikle (tabel 1) er baseret på ved hjælp af majsmel-baserede fødevarer og inkubation ved 25 ° C under 12 h lys: 12 h mørke cyklusser. Larver vokse langsommere på melasse-baserede fødevarer. Ordentlig hydrering og mad friskhed påvirker også væksten af larver. Mængden af vand i fødevarer bør forlade mad, hverken for tør til at skrælle tilbage fra hætteglasset eller for løs på grund af overdreven vand. Ideelt, ~ 5 mm lag nærmeste mad overflade er betinget af de voksende larver og flytter nemt når hætteglasset er vippet eller aflyttet. Denne tilstand kan opnås ved hjælp af frisklavet mad med 50-100 larver.

Det er afgørende at etablere en stabil temperaturgradient inden analysen. Derfor Tænd på vandbad 1-2 h forudgående at indlede assay, som vandbade producerer varme og kan ændre den omgivende rumtemperatur, som igen har potentiale til at påvirke gradienten. Efter 1-2 h afbalanceres den omgivende temperatur på de fleste værelser. Dette skal dog fastsættes i hvert miljø. Desuden, når du genererer et forløb med et stort Temperaturområde (> 3,0 ° C/cm), det kan være vanskeligt at opnå et stabilt forløb. En lille bevægelse af assay pladen mere væsentligt ændrer temperaturgradient når rækken er store (f.eks. > 3,0 ° C/cm). Vi fandt, at en 1-2 ° C/cm gradient producerer de mest stabile forløb.

Der er flere yderligere overvejelser, der skal kontrolleres for at begrænse variabilitet i thermotaxis-assays. Vask larverne er kritisk, som tilstedeværelsen af madrester eller saccharose på larverne kan påvirke analysen. Vask trin skal gennemføres grundigt, men hurtigt, fordi begrænse deres iltforsyning overdrevent mens de er nedsænket i vand kan påvirke deres helbred. Derfor, vi anbefaler at bruge celle si (mulighed 2) til at rense larverne. Et filter med en porestørrelse på 300 µm fungerer godt for larver på tidlig-3^rd instar fase (72 h AEL) eller ældre. Det er derudover vigtigt at udføre eksperimenter på det samme tidspunkt på dagen, som fra Zeitgeber tid (ZT) ZT4 til ZT8 (ZT = 0 er når lysene er tændt), at begrænse variabilitet nedslag af døgnrytmen på temperatur udvalg. Niveauet for fugt på Agarosen pladen kan også forårsage variation i resultaterne. Mens overfladen af pladerne skal være fugtig, kunne vanddråber fælde larverne, og derfor skal undgås.

Begrænse variationen i assays vil gøre det muligt at opnå robuste resultater uden at udføre stort antal selvstændige eksperimenter. Typisk er 3-8 uafhængige forsøg tilstrækkelige til at opnå et pålideligt resultat. Ordentlig opgørelsen af resultaterne er også afgørende for succes af thermotaxis-assays. Tæl ikke larver fordelt på regioner inden for 0,5 cm fra aluminium vægge, da temperaturerne ikke er lineær i disse regioner. Nogle larver vil blive placeret på grænsen mellem to zoner, på det tidspunkt analysen er indgået. Hvis mere end 50% af kroppens længde er bosat i en zone, så omfatte larve i opgørelsen i den pågældende zone. Hvis en larve er præcis 50% i hver af to zoner, så Tæl dyr som 0,5 larver i hver zone.

Mens gradient analysen giver larverne til at diskriminere en række temperaturforskelle, er der begrænsninger for de nedre og øvre temperaturer, der kan testes effektivt. Det er ikke muligt at teste temperaturer < 10 ° C siden mobilitet af larverne mindskes betydeligt ved lavere temperaturer. Selv om forløb med den øvre temperatur nåede 42 ° C kan etableres, næsten ingen kontrol larver bo i en af zonerne > 28 ° C. Derfor løbende gradient assays kan ikke bruges til at diskriminere temperatur indstillinger mellem forskellige zoner > 28 ° C. Gradient assays på disse forhøjede temperaturer kan imidlertid potentielt bruges til at karakterisere mutanter, hvis de har meget skiftede varm temperatur indstillinger.

Hvis en mutant har en bevægeapparatet defekt, kan det være nødvendigt at udføre yderligere forsøg for at sikre, at den tilsyneladende temperatur præference ikke er unøjagtig på grund af en bevægelse værdiforringelse. For at afhjælpe dette potentielle problem, kan det være nødvendigt at etablere længere assay gange at give dyrene ekstra tid til at flytte til deres ønskede zoner. Tovejs gradient analysen kan også anvendes til at teste, om dyrene Vælg samme foretrukne zone, uanset, hvor de er placeret i første omgang på pladen.

Afslutningsvis har de gradient assays beskrevet her fordele frem for andre thermotaxis assays. To-vejs valg assays er nyttige, da de kan give solide resultater, især når temperaturforskelle mellem de to zoner er stort, men de er ikke effektive afsløre den ideelle temperatur foretrækkes af larver i en enkelt eksperiment. For at gøre det kræver udfører mange to-vejs valg kombinationer for at bestemme den mest foretrukne temperatur^5,6,7. Derimod giver gradient analysen dyret en mulighed for at vælge deres foretrukne temperatur zone i et miljø med en enkelt kontinuerlig temperatur landskab. Det er således unødvendigt at udtænke en stor kombination af to-vejs valg til at bestemme den foretrukne termisk miljø. Studerer thermotaxis ved hjælp af en runde petriskål har været ansat til at vurdere virkningerne af temperatur på bevægelse dynamikken i en larve¹⁰. Det er imidlertid mindre nyttige i at diskriminere mellem indstillinger mellem forskellige temperaturer, da hver zone er en anden størrelse. Endelig, på grund af enkelheden i analysen, og dens nytte i kræsne små temperatur indstillinger i en enkelt assay, det kan være ansat til skærmen snesevis af kandidat gener, der er potentielt involveret i larve temperatur præference, der kan ellers blive overset ved hjælp af andre assays

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gradient assay apparatus
PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath	Thomas Scientific	9106	This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz.
Aluminum assay plate (for single directional gradient)			Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized.
Aluminum plate (for bidirectional gradient)			25 x 22 x 0.2 cm, black anodized.
Aluminum block			Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D.
Connector for aluminum blocks and tubing	McMaster-Carr	91355K82
Tygon Sanitary Silicone Tubing	Tygon	57296	1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall
Name	Company	Catalog Number	Comments
Items and reagents for assay
Pestle	USA Scientific	17361	Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes
Thermometer	Fluke	51II
Thermocouple	Fluke	K type
Universal microplate lid	Corning	6980A77
35 mm dish	Corning	9380D40
Labeling tape (for bidirectional gradient)	Fisher Scientific	15-951	Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds
Agarose	Invitrogen	16500500	Prepare 1% solution
Sucrose	Sigma	S0389-5KG	Prepare 18% solution right before starting assay
Paint brush	Fisher Scientific	11860
50 mL centrifuge tubes	Denville	C1062-P
Scoopula	Fisher Scientific	14-357Q
500 mL round wide-mouth bottle	Pyrex	1395-500
Cell strainer (300 mm pore)	PluriSelect	43-50300	Optional item for larvae washing
Cardboard box (vial tray)	Genesee Scientific	FS32-124
Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila food
Distilled water			22,400 mL
Cornmeal, yellow (extra fine mesh,flocked) 20 kg	LabScientific Inc.	NC0535320	1,609 g
Brewers yeast 100 lbs	MP Biomedicals	ICN90331280	379 g
NutriSoy® Soy Flour (10 kg/unit)	Genesee Scientific	62-115	221 g
Drosophila Agar, Type II (5 kg)	Genesee Scientific	66-103	190 g
Karo light corn syrup	Karo		1,700 mL
Methyl 4-hydroxybenzoate (suspend in 200 proof ethanol)	Sigma Aldrich	H5501-5KG	72 g/240 mL
Propionic acid puriss. p.a.,>99.5% (GC)	Sigma Aldrich	81910-1 L	108 mL
Phosphoric acid ACS reagent, ≥85 wt. % in H2O	Sigma Aldrich	438081-500 mL	8.5 mL