Summary
Здесь мы представляем протокол для определения предпочтительного окружающей температуры личинок дрозофилы , с помощью непрерывного тепловой градиент.
Abstract
Многие животные, в том числе плодовой мушки Drosophila melanogaster, способны взыскательные мелкие различия в температуре окружающей среды, что позволяет им искать их предпочтительным тепловой ландшафта. Для определения температуры предпочтения личинок за определенный диапазон линейных, мы разработали assay с использованием градиента температуры. Создать один направленного градиент, два алюминиевых блоков цилиндров подключены к независимым водяные бани, каждый из которых контролирует температуру отдельных блоков. Два блока установки нижнего и верхнего пределов градиента. Градиент температуры устанавливается, поместив агарозы покрытием алюминиевой пластине двух блоков под контролем воды так, чтобы пластины охватывает расстояние между ними. Концы алюминиевой пластине, что находится на вершине блоков воды определяет минимальные и максимальные температуры, и промежуточных областей двух блоков образуют линейный градиент температуры. Градиента могут быть применены к личинок разных возрастов и может использоваться для идентификации мутантов, которые демонстрируют фенотипы, например с мутациями затрагивающих гены, кодирующие ГТО каналы и опсины, которые требуются для температуры дискриминации.
Introduction
Чтобы выбрать среду с наиболее благоприятные условия1,2,3мобильных животных работает терморегуляцию. Если Климат слишком горячей или холодной, такое поведение является жизненно важным для выживания. Кроме того многие животные чувствительны к очень небольшие различия в температуре в пределах удобной и искать окрестности с идеальной температуры. Это имеет особое значение для пойкилотермных организмов, таких как плодовых мух, которые сбалансировать температура их тела с окружающей средой. Анализы для мониторинга личиночной терморегуляцию сыграли важную роль в определении и уточнении роли молекулярных сенсоров например дрозофилы переходных потенциальных рецепторов (ГТО) каналы4,5,6, хромопротеинам7,8и ИОНОТРОПНЫХ рецепторов рецепторы (IRs)9, которые наделения этих животных с температурой чувствительности различных температурных диапазонах.
Двусторонний выбор тест предоставляет один из подходов к изучению тепловой предпочтения в личинки6,7. Влечет за собой установления двух различных температурных зон и позволяет животных для выбора одной стороны над другой. Результаты тестов двусторонний выбор может быть надежной, особенно если большой разницы температур между двумя вариантами. Кроме того поскольку калибровочных предполагает табулированию только две группы, данные может быть выражено как простое предпочтение индекс. Легкость и простота двусторонний выбор анализов также поддаются генетических экраны. Однако главным недостатком является, что многие эксперименты, обязаны установить предпочтительный температуры одичал тип или мутанта животных.
Градиент пробирного предлагает возможность установить предпочтительный температуры в одном пробирного8. Кроме того в отличие от двусторонней выбор теста, он разрешает оценки распределения группы животных, когда они сталкиваются с непрерывный диапазон температур. Один из градиента использует чашку Петри и одиночные животные и хорошо подходит для квалификации поведением отдельных животных10. Однако поскольку Петри раунд, размеры температурных зон варьируются и постепенно меньше, в зависимости от расстояния от центра. Таким образом эта установка не является идеальным для контроля температуры выбор популяций животных.
Постоянной тепловой градиент аппарат, который хорошо подходит для оценки температуры предпочтения групп личинки использует прямоугольную Арена и описан здесь. Аппарат прост для построения и сборки. Кроме того градиент линейной и гибкие, как он может быть использован для оценки терморегуляцию в широком диапазоне температур от 10 ° C до 42 ° C. Быстрый и простой для выполнения и дает воспроизводимость данных. В дополнение к отчетности благоприятствования температура личинок, он раскрывает предпочтения населения животных над целиком диапазона линейной в одном эксперименте. Из-за этих преимуществ это отличный выбор для идентификации генов, необходимых для терморегуляцию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Оборудование для изготовления и монтажа аппарат для градиента анализов
- Изготовление алюминиевых пластин пробирного для assay сингл направленного градиента.
- Обрезать и шлифуют каждого пробирного алюминиевой пластины (рис. 1A) из цельного куска алюминия с использованием ленточнопильных и резкое Вертикальная мельница со следующими размерами: наружный размер 140 х 100 х 9 мм и внутренний размер 130 x 90 x 8 мм (рис. 1B). Анодирования внутри каждого пробирного пластины с черной краской, чтобы сделать его проще для визуализации личинки и предотвращения коррозии.
Примечание: Изготовление алюминиевых пластин пробирного сингл направленного градиента осуществляется механический цех. Анодирование осуществляется коммерческим поставщиком. - Марк верхнего и нижнего колеса каждого пробирного пластины с 13 демаркации, разделенных 10 мм с помощью постоянного маркера. Место первого и последнего демаркации 5 мм от внутреннего края плит пробирного (рис. 1A, B).
- Обрезать и шлифуют каждого пробирного алюминиевой пластины (рис. 1A) из цельного куска алюминия с использованием ленточнопильных и резкое Вертикальная мельница со следующими размерами: наружный размер 140 х 100 х 9 мм и внутренний размер 130 x 90 x 8 мм (рис. 1B). Анодирования внутри каждого пробирного пластины с черной краской, чтобы сделать его проще для визуализации личинки и предотвращения коррозии.
- Для изготовления пробирного алюминиевой пластине для двунаправленных градиента, вырезать из алюминиевой пластины с габаритами, используя ножницы листового металла: 250 x 220 x 2 мм. анодирования пробирного пластины с черной краской.
Примечание: Изготовление алюминиевых пластин пробирного для двунаправленных градиентов осуществляется механический цех. Анодирование осуществляется коммерческим поставщиком. - Изготовление алюминиевых блоков цилиндров.
Примечание: Два блока необходимо для одного направленного градиента и трех блоков необходимы для двунаправленных градиента.- Вырезать из цельного куска алюминия с использованием ленточная пила (размеры 50 x 255 x 14 мм) алюминиевых блоков цилиндров (рис. 1 c) (рис. 1 c, D).
- Дрель канал воды внутри блока (7 мм в диаметре) с помощью Вертикальная мельница и поток канавки в открытые концы на одной стороне (рис. 1 d). Закройте желобчатых отверстия с болтами и поток печать ленты в форме U-образный водный канал (рис. 1 c, D).
Примечание: Изготовление алюминиевых блоков цилиндров пробирного осуществляется механический цех. - Исправьте соединителя в алюминиевый блок (рис. 1 d) с резьбой и поток запечатать ленту на одном конце. Другой конец с несколькими колкостями вписываются в силиконовой трубки (ID 1/4" x 3/8" OD х 1/16" стены).
- Получите две бани циркулирующего охлажденных и отоплением.
- Соберите температурного блоков для градиента пробирного системы.
- Сингл направленного градиента, для подключения каждого из двух алюминиевых блоков к отдельной водяной бане таким образом, чтобы температура каждого блока контролируется независимым воды, циркуляционные системы (рисунок 2A). Использование силиконовой трубки (ID 1/4" x 3/8" OD х 1/16" стена) для подключения к разъему на внутренней стороне алюминиевых блоков (рисунок 2A) на выходе из водяной бани. Кроме того использование труб для подключения внешней стороне разъема на алюминиевый блок к входу водяной ванны.
- Для двунаправленных градиента поместите два из трех блоков под левой и правой стороны пластины и подключите их к же водяная баня с трубки (рис. 2B). Подключите третий блок алюминия к второй водяной бане и место ниже центре пластины (рис. 2B).
Примечание: Этот аппарат и пробирного необходимы только если личинки накапливаются в зоне на одной кромке или другой сингл направленного градиента. Если это так, то важно оценить ли есть эффект края. Чтобы проверить эту возможность, установить двунаправленный градиент, в котором температура зоны края, предпочитают личинки, с использованием градиента сингл направленного (например 18 ° C) — температура в середине плиты двунаправленный градиента (Рисунок 3E , F).
2. личиночной синхронизации
- Питают мух, которые будут использоваться для откладки.
- Смесь дрожжей гранул и дистиллированной воды с пестиком, чтобы вставить дрожжей. Тщательно Измельчить и перемешать до консистенции пасты похож на арахисовое масло. Избегайте чрезмерно сухой пасты, которая может отслаиваться при передаче мух свежие ампул, или влажная паста, которая может поймать мух.
- С помощью пестика, добавьте дрожжи пасту недалеко от внутренней стены стандартных дрозофилы флаконов, чуть выше поверхности пищи.
- Фото 12-35 женщин и до половины как многие мужчины (но не более 10) на площадку CO2 и добавить самок и самцов каждого флакона паста содержащие дрожжи.
- Чтобы сохранить лету пищи с влажной, дрожжи вставить в то время как кормить мух, объединить этих флаконов в лоток, который держит до 100 флаконов с 20 открытых флаконах, содержащих только дистиллированную воду. Поместите лоток в прозрачный пластиковый пакет и запечатать.
- Инкубируйте лоток в инкубаторе 25 ° C в течение 48 часов, так что женщины питаются адекватно, тем самым позволяя им заложить большое количество яиц.
- Настройка флаконы для откладки.
- Перевести питается мух в новой пищи флаконы для сбора яиц путем выстукивать их над. Не используйте CO2, что может привести к мухи откладывают яйца меньше за короткое время окно.
Примечание: Стандартные дрозофилы пищи флаконы используются без дрожжей паста для сбора яиц. - Разрешить мухи откладывают яйца на 3 ч при 25 ° C, таким образом, чтобы все яйца собраны над окном, сравнительно узких время.
Примечание: Это позволит личинки синхронизируются на той же стадии развития. - Место флаконы, содержащие яйца в лоток, содержащий воды флаконы и затяните мешок. Инкубировать при 25 ° C под 12 h свет: 12 h темные циклов.
- Возраста личинок для заданного числа часов после откладки (AEL) в зависимости от стадии личиночной желаемого.
Примечание: Таблица 1 является оценка взаимосвязи между часов AEL и личиночной стадии, которая будет варьироваться в зависимости от покупать акции, питание, воспитание температуры и т.д. точные отношения между AEL и стадии развития должны быть проверяется каждый следователь, с использованием физических критериев, таких как морфология рот крючки и дыхальца11.
- Перевести питается мух в новой пищи флаконы для сбора яиц путем выстукивать их над. Не используйте CO2, что может привести к мухи откладывают яйца меньше за короткое время окно.
3. Настройка градиента температуры
- Подготовка одного направленного градиент
- Чтобы создать влажной окружающей среде во время анализов, поместите два алюминиевых блоков цилиндров, подключенных к двум водяные бани на влажных бумажных полотенец, разделенных 10 см (рис. 2A).
- Включите две водяные бани ~ 2 h до начала анализа достаточно времени для температуры алюминиевых блоков, чтобы сбалансировать.
Примечание: Рекомендуется выполнить пробный эксперимент, чтобы определить температуру каждого водяной бане, которая необходима для достижения желаемого линейного градиента температуры. В таблице 2перечислены некоторые типичные температуры пар для установки ванны водой. Однако, обратите внимание, что температура поверхности зависят от температуры окружающей среды. Длина трубки также влияет температура как там охлаждения в трубах. Длина труб в нашей установки составляет 1,5 м. - СВЧ 100 мл агарозы 1% на мощных параметр в 500 мл круглый широкий рот бутылку и залить 25 мл/пробирного пластины на уровне benchtop. Подготовьте два пробирного пластины, которые могут быть размещены на алюминиевых блоков цилиндров в то же время (рис. 2A).
- После агарозы затвердевшим (10-20 мин), мягко руб каждый агарозы поверхности стандартная кухня губкой или меламин губкой, чтобы сделать поверхность агарозы немного грубый, так что при распылении воды на геле агарозы, будет создаваться мембраной гладкой тонкой воды, и не капли воды будет.
- Полностью погрузите пластины в контейнере с дистиллированной водой до тех пор, пока assay готов быть выполнены, чтобы предотвратить получение сморщившимися пластины.
- Подготовить двунаправленный градиент (опционально)
- Для создания влажной окружающей среде во время анализов, место три алюминиевых блоков 8 см друг от друга (рис. 2B) на влажные бумажные полотенца.
- Включите две водяные бани ~ 2 h до начала анализа достаточно времени для температуры алюминиевых блоков, чтобы сбалансировать.
Примечание: Рекомендуется выполнить пробный эксперимент, чтобы определить температуру каждого водяной бане для двунаправленных градиента. В таблице 3перечислены некоторые типичные температуры пар для установки ванны водой. Однако, обратите внимание, что температура поверхности зависят от температуры окружающей среды. Длина трубки также влияет температура как там охлаждения в трубах. Длина труб в нашей установки составляет 1,5 м. - Чтобы предотвратить разлив из плиты агарозы, оберните краями алюминиевой пластины с маркировки ленты сформировать 10 мм высотой стены (рис. 2B).
- С помощью параметра мощных, Микроволновая 200 мл агарозы 1% 500 мл раунд широкий рот бутылку и залить 120 мл на плите assay.
- После агарозы затвердевшим (~ 30 мин), аккуратно протрите поверхность каждого агарозы стандартная кухня губкой или меламин губкой, чтобы сделать поверхность агарозы немного грубый, так, что создается при распылении воды на геле агарозы, гладкой тонкой воды мембранные и без форма капли воды.
- Полностью погрузите пробирного пластины в контейнере с дистиллированной водой до тех пор, пока assay готов быть выполнены, чтобы предотвратить их от высыхания.
- Настройка градиента сингл направленный
- Подготовка реагентов и предметы на скамейке рядом с градиента пробирного аппарата (см. Таблицу материалов).
- Для содействия передаче эффективных температур, заполните любые пробелы между алюминиевых блоков и плит пробирного путем распыления воды на стыке между блоки и плиты.
- С помощью перчатки, удалите пробирного пластины из воды контейнера. Если вода вторгается между геля агарозы и пластиной и вызывает неровности в виде на поверхности, удалите воду с P1000 микропипеткой.
- Поместите пластины для пробирного на алюминиевых блоков, так что демаркации, которые являются 2 см от края либо точно соответствуют края алюминиевых блоков цилиндров (рисунок 2A, C).
- Брызг воды на поверхность плиты (тонкий воды мембрану покрытие агарозы достаточно) для предотвращения высыхания геля агарозы. Убедитесь, что мембраны вода является непрерывной и бесплатно капли воды, так как личинки могут попасть в ловушку в капельки воды.
- Обложка градиента системы с картонной коробки для уменьшения испарения воды и помочь стабилизировать температуру поверхности геля. Подождите 5-10 мин разрешить температуру сбалансировать.
- Проверьте температуру поверхности в 12 точках на пластину (рис. 2 c). Возьмите два измерения в пределах каждой зоны, чтобы установить, является ли или не изменчивости в пределах зоны. Убедитесь, что температура в обеих точках в пределах ± 0,2 ° C желаемой температуры.
Примечание: Изменчивости в пределах зоны обычно происходит потому, что точные расстояния двух точек к краю алюминиевых блоков цилиндров не идентичны. Отрегулируйте положение пластины на алюминиевых блоков, чтобы убедиться, что демаркации, которые являются 2 см от края либо точно соответствуют края алюминиевых блоков цилиндров. - Если измеренные градиента температуры отклоняется от желаемого градиента, увеличить или уменьшить установки температуры воды ванна и еще раз проверьте температуру поверхности после того, как температура воды ванны stabilize(s).
- Обложка градиента системы с картонной коробки до начала анализа.
- Настройка двунаправленной градиента (опционально)
- Подготовка реагентов и предметы на скамейке рядом с градиента пробирного аппарата (см. Таблицу материалов).
- Брызги воды на поверхности три алюминиевых блоков для содействия передаче эффективной температуры от алюминиевых блоков цилиндров на тарелки пробирного путем заполнения любых пробелов между поверхностями.
- Осторожно извлеките пробирного пластины из воды контейнера и поместите на алюминиевых блоков цилиндров. Если вода проникает между геля агарозы и плита, которая может вызвать шишки формы на поверхности, удалите воду с P1000 микропипеткой.
- Поместите пробирного пластину на алюминиевых блоков, так что midlines первый и последний зон от либо края точно соответствовать края двух боковых алюминиевых блоков (рис. 2B, D).
- Брызг воды на поверхность плиты (тонкий воды мембрану покрытие агарозы достаточно) для предотвращения высыхания геля агарозы. Убедитесь, что вода мембрана является непрерывной и свободной от капель воды, поскольку личинки могут попасть в ловушку в капельки воды.
- Обложка градиента системы с картонной коробки для уменьшения испарения воды и помочь стабилизировать температуру поверхности геля. Подождите 5-10 мин, чтобы позволить температуры сбалансировать.
- Проверьте температуру поверхности в двух точках вдоль средней линии каждого из 10 зон (Рисунок 2D). Возьмите два измерения в пределах каждой зоны, чтобы установить, является ли или не изменчивости в пределах зоны. Убедитесь, что температура в обеих точках в пределах ± 0,2 ° C желаемой температуры.
Примечание: Изменчивости в пределах зоны обычно происходит потому, что точные расстояния двух точек к краю алюминиевых блоков цилиндров не идентичны. Отрегулируйте положение пластины на алюминиевых блоков, чтобы убедиться, что midlines первый и последний зон ближайшего каждого края точно соответствуют края двух боковых алюминиевых блоков. - Если измеренные градиента температуры отклоняется от желаемого градиента, отрегулировать установки температуры воды ванна и еще раз проверьте температуру поверхности после того, как температура воды ванны stabilize(s).
- Крышки блоков с картонной коробки до начала анализа.
4. личиночной коллекции и мытья
- Изолировать чистой личинки (вариант 1)
- ~ 40 мл 18% сахарозы решение добавьте 50 мл пробирку. Совок все личинки от пищи vial(s) с scoopula и передачи до 18% раствора сахарозы.
- Смесь тщательно, но осторожно, используя scoopula отделить личинок от остатков пищи. Подождите 30-60 s до личинки float в верхний слой трубки. Налить верхний слой, содержащий личинки (~ 10 мл) в другой 50 мл трубки и заполнить трубу с свежий раствор сахарозы 18%. Подождите 30-60 s до личинки float в верхний слой снова.
Примечание: Частицы большой пищи иногда передачи вместе с личинки и может повлиять на личиночной терморегуляцию, если они не будут удалены. Если большие пищевые частицы остаются в верхнем слое, повторите шаги 4.1.1-4.1.2, или вручную удалить их с помощью scoopula. - Верхний слой личинок (~ 10 мл) передать два других 50 мл трубки и заполнить две трубы с дистиллированной водой для уменьшения концентрации сахарозы, так что личинки быстро тонуть в воде. Подождите 30-60 сек, до тех пор, пока личинки опускаться на дно. Как можно предотвратить личинки от утопления быстрее выполняйте это и следующие шаги.
- Выбросите столько воды, как возможно, слегка наклоняя трубы. Объединить личинок в одну трубу, наливая личинки с остатки воды и заполнить трубу с дистиллированной водой.
- Ждать 30-60 сек, до тех пор, пока все личинки опуститься и удалить столько воды, как это возможно, слегка наклоняя трубы. Повторите этот шаг Стиральная 2 - 4 раза для полностью удалить сахарозы и все видимые пищи.
- Удалить столько воды, как можно и передать пустой 35 мм Петри личинки, переливание. Спрей трубки с водой и использовать небольшой кистью для переноса личинок.
- Удалите излишки воды из Петри с помощью P1000 микропипеткой. Оставьте ~0.5 мл воды, чтобы предотвратить обезвоживание личинок.
- Поместите крышку на блюдо для предотвращения побега личинки. Поверните крышку вниз, чтобы уменьшить способность личинок бежать через небольшой зазор между крышкой и блюдо. Разрешить личинки восстановить для 10-20 мин.
- Изолировать чистой личинки (вариант 2)
Примечание: Этот альтернативный метод для очистки личинки снижает возможность удушливой личинки во время стирки. Чтобы использовать этот метод, продолжите следующие шаги после выполнения выше шаги 4.1.1-4.1.2.- Место ячейки сита (300 мкм, сохраняет личинки 72 h AEL или старше) на вершине 50 мл трубки.
- После подтверждения, что нет взрослых тел или остатки пищи, плавающей на поверхности раствора сахарозы, налейте верхний слой, содержащий личинки через сетчатый фильтр для улавливания всех личинок на экране сетки. Мыть личинки тщательно промыть дистиллированной водой, пока не будет заполнено Тюбик 50 мл.
- Удалите ячейку ситечко с личинки и утилизация использованной воды из трубки. Место сетчатый фильтр, содержащий личинки поверх пустых труб и мыть личинки снова с дистиллированной водой, пока не будет заполнено Тюбик 50 мл.
- Поверните фильтр вверх ногами над пустой 35 мм Петри и брызги воды из верхней части клетки ситечко для переноса личинок на Петри блюдо. Перенести оставшиеся личинки, с помощью небольшой кистью.
- Продолжать шаг 4.1.7 выше, прежде чем перейти к шагу 5.
5. анализ и расчет
- Удалите картонную коробку и проверьте температуру поверхности гель непосредственно перед передачей личинки к пластине. Минимизируйте время, что картонная коробка открыта для предотвращения нарушения уравновешивания температуры. Если поверхность сухой, распыляйте небольшое количество воды на поверхности.
- Распространять 150 ± 50 личинок в центре каждой пластины (между зонами 3 и 4 из 6 зон) для одного направленного градиента (релиз зоны; Рисунок 2 c).
Примечание: Для двунаправленных градиента, распространять 200-400 личинки вдоль средней зоны каждой половины (Рисунок 2D). - Место Гонав крышка над каждой пластины пробирного чтобы предотвратить обход из личинки. Обложка установки с картонной коробки для предотвращения воздействия света, который может повлиять на выбор личинок на геле агарозы.
Примечание: Для двунаправленных градиента, она не следует необходимо покрыть тарелка с крышкой, потому что плита больше, и предпочтительным температура личинок в средней зоне. Следовательно несколько личинок накапливаются на краях и имеют возможность выползти. - Разрешить assay перейти на 10-30 минут для одного направленного градиента и 15-35 мин для двунаправленных градиента, в зависимости от возраста личинок (Таблица 4).
- Удалите картонную коробку и микроплиты крышкой. Фотография пластины сверху с помощью цифровой камеры. Возьмите две фотографии каждого пробирного пластины, так, что следователь может выбрать один с лучшей контрастности и яркости для анализа.
- Удалите все личинки из плит пробирного и в любом месте за пределами пластин путем аспирации.
- Очистите пробирного пластин, труб и ситечко клетки тщательно промыть дистиллированной водой. Повторное использование пробирного пластины, подготовленного в тот день, если повреждена поверхность агарозы.
- Вычислите процентное распределение личинок в каждой зоне.
- Откройте фотографическое изображение результатов анализа с помощью любого программного обеспечения, которое позволяет добавлять маркировку на изображение. Чтобы указать пробирного зон, рисовать вертикальные линии, каждые 2 см на основе демаркации на табличке пробирного.
- Подсчитать количество личинок в каждой зоне и запись чисел. Личинки в регионах 0,5 см от любого из стен, не учитываются. Гель толще возле стены, и температура поверхности не являются линейными в этих регионах.
- Для одного направленного градиента Рассчитайте процентное распределение в каждой зоне следующим образом:
(количество личинок в данной зоне 2-см) / (общее число личинок в 6 зон) x 100. - Для двунаправленных градиента Рассчитайте процентное распределение в каждой зоне следующим образом:
(количество личинок в данной зоне 2-см) / (общее число личинок в 5 зонах на каждой стороне градиента) x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Учредить 18 ° С - 28 ° C сингл направленного градиента, мы установить температуру две ванны водой до 16,8 ° C и 31 ° C. Мы получаем температур на 13 пунктов путем измерения температуры на 26 должностей в пределах верхней и нижней части всех 6 зон, линии границы между зонами и в крайних концах поверхности геля агарозы (рис. 2 c, 2E). Распределение температуры вдоль градиента был почти линейное (Y = 0.9672 * X + 16.19, R2 = 0.9961) (рис. 2е).
Мы assayed температуры предпочтения управления (w1118) личинок разных возрастов. 1st (24 ± 1,5 h AEL),nd (48 ± 1,5 h AEL) и личинок раннего-3rd (72 ± 1,5 ч) показал пиков в зоне 24 ° C (рис. 3а, B). Температура предпочтения изменены во время 3rd Инстар развития личинок. Самый большой процент середины 3rd instar (96 ± 1,5 h AEL), накопленных в зоне 18 ° C (рис. 3а, B), и эта предвзятость увеличивается с возрастом. Среди поздно-3rd instar личинки (предварительно восхождение; 120 ± 1,5 h AEL), ~ 50% сосредоточены в зоне 18 ° C, и выбор этой температуры ~ 4 раза выше, чем в зоне прилегающих 20 ° C (18 ° C зона, 50,2%; 20 ° C зона, 15,1%; На рисунке 3A Б). Склонность к накоплению в зоне 18 ° C в w1118 был не из-за края эффект с конца-3rd Инстар личинки, по-прежнему накопленных в зоне 18 ° C, с использованием градиента температуры двунаправленный (Рисунок 3E, F ).
Мы также протестировали поздно-3rd instar личинки (120 ± 1,5 h AEL) с мутаций в генах, необходимых для требовательных разницу температур в пределах удобной. К ним относятся trpA1, который необходим для выбора нормальной температуры в5,7,на 18 ° C - 24 ° C в диапазоне8. Личинки с null мутации в trpA1 (trpA11) распределить поровну по всей 18 ° C — 28 ° C градиент (рис. 3 c). Личинки, пропавших без вести только A и B изоформ (trpA1-ABG4), или C и D изоформ (trpA1-CDG4) также показывают серьезными нарушениями (рис. 3 c). Мухи кодировать две изоформы фосфолипазы Cβ (PLC21C и NORPA), и мутаций, затрагивающих norpA (norpAP24) но не plc21c (plc21cP319) также сорвать накопление в диапазоне 18 ° C ( 3D рисунок).
Рисунок 1. Аппарат для выполнения assay сингл направленного градиента температуры. (A) алюминия тест тарелка для assaying личиночной терморегуляцию поведение. 13 черные линии на верхней и нижней демаркацию 12 зон (по 10 мм). В нижней части пластины анодированный с черной краской, так что это легче визуализировать личинки. (B) размеры алюминиевой пластине (указывается в мм). Наружный размер алюминиевой пластине-140 х 100 х 9 мм. Внутренний размер алюминиевой пластине-130 x 90 x 8 мм. Ограждающие устройства разделяются на 10 мм. Первый и последний демаркации — 5 мм от краев области внутренние пластины. (C) верхней и боковой вид одного из алюминиевых блоков цилиндров используются для контроля температуры градиента. Блок имеет два разъема используются для подключения к силиконовой трубки, которые подключаются к ванне с водой. (D) размеры алюминиевого блока. Внешний размер блока алюминия — 255 x 50 x 14 мм. Диаметр внутренние водные пути-7 мм. Два 30-мм разъемы на левой стороне соединяют с силиконовой трубки, который распространяется на водяной бане. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Одно- и двунаправленных градиента пробирного установок. (A) сингл направленного градиента установки с двумя пластинами пробирного алюминия на двух алюминиевых блоков цилиндров. Температура алюминиевых блоков цилиндров контролируются циркулирующей воды из двух водяные бани. (B) расположение трех алюминиевых блоков, водяные бани и алюминиевой пластине (250 x 220 мм) для двунаправленных градиента. Левый и правый блоки связаны с же водяной бане и Средняя шашка подключен к другой водяной бани. Алюминиевой пластине пробирного завернутый с лентой сформировать стену 10 мм, чтобы содержать агарозы 1%. (C) позиции для проверки температуры (обозначается точками) и выпустить личинок на плите. Перед началом эксперимента, проверьте температуру в двух точках в пределах каждой зоны, чтобы подтвердить, что желаемый линейный градиент температуры установлен. Личинки выпускаются в пределах указанной области возле средней линии. Личинки, учитываются в рамках каждой из зон, 2 см. (D) позиции для проверки температуры (обозначается точками) и выпуска зон для личинок на двунаправленный градиент. Равное количество личинок выпускаются вдоль средней линии каждой половины двунаправленный градиента. Количество личинок, учитываются в каждом из 10 (2 см) зон. Указывается один типичный набор (18 ° C - 26 ° C) температур на поверхности агарозы. (E) температура измеряется вдоль линии границы и midlines каждой зоны в сингл направленного образца градиента. Данные представляют собой средние температуры ± SD. n = 8 анализов (150 ± 50 личинок/проба). Воспроизводятся части этой фигуры из Sokabe и др. 8 с незначительными изменениями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Представитель результаты, с использованием одного направленного и двунаправленный градиента анализов. (A, B) Средний процент личинок в 6 зон на сингл направленного градиента. Данные включают в себя 3rd instar личинок указанных часов после откладки яиц (AEL). n = 6-7. Планки погрешностей в представляют ±SEM. (C) тепловой дистрибутивов предварительно восхождение поздно-3rd Инстар личинки управления (w1118) и trpA1 мутантов на сингл направленного градиента. n = 3-4. Планки погрешностей представляют ±SEM. (D) тепловой дистрибутивов конце-3rd instar личинки управления (w1118) и PLCβ мутантов на сингл направленного градиента. n = 4-6. Планки погрешностей представляют ±SEM. (E) представитель распределение предварительно скалолазание, поздно-3rd instar личинки (w1118) на двунаправленный градиента. Левый и правый пробирного зоны обозначается пунктирной линии и разделенных без граф зоны в центре (затененные области). (F) процент предварительно восхождение поздно-3rd Инстар личинки (w1118) в каждой зоне вдоль теплового градиента. Личинки были помещены в левом и правом освобождения зон. Пробирного зоны разделены зоны без граф 3-cm в центре и распределений вычисляются независимо друг от друга. Планки погрешностей представляют SEMs. n = 3 анализов (200-400 личинок/проба). Воспроизводятся части этой фигуры из Sokabe и др. 8 с незначительными изменениями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Часов AEL | Личиночной стадии | |
| 24 | 1st instar | |
| 48 | 2-й instar | |
| 72 | Раннее-3rd instar | |
| 96 | Середина-3rd instar | |
| 120 | Поздно-3rd instar, как раз перед восхождением этап | |
Таблица 1. Взаимосвязь между часов после откладки яиц (AEL) и личиночных стадиях.
| Градиент температуры на табличке агарозы (склон) | Температура воды ванны | Температура алюминиевых блоков цилиндров |
| 10.0-25,0 ° C (1,5 ° C/см) | ~6.5-7°C/~28.5°C | ~8.5°C/~26.8°C |
| 18,0-28,0 ° C (1° C/см) | ~16.8°C/~31.0°C | ~17.8°C/~29.7°C |
| 14,0-34.0° C (2° C/см) | ~10.0°C/~40.0°C | ~11.8°C/~36.8°C |
| 12,5-42.0° C (2,95 ° C/см) | ~7.0°C/~55.0°C | ~9.4°C/~49.4°C |
Таблица 2. Типичный температурных градиентов и соответствующей температуры воды ванны и алюминиевых блоков цилиндров для одного направления градиентов.
| Градиент температуры на табличке агарозы | Температура воды ванны | Температура алюминиевых блоков цилиндров |
| 22-10-22 ° C (1,5 ° C/см) | ~5.0°C /~25.0°C | ~7.5°C/~24.0°C |
| 26-18-26 ° C (1° C/см) | ~15.8°C /~30.6°C | ~16.9°C/~28.4°C |
| 30-14-30 ° C (2° C/см) | ~8.5°C /~36.4°C | ~10.9°C/~32.8°C |
| 36-12,5-36 ° C (2,95 ° C/см) | ~5.0°C /~47.2°C | ~7.9°C/~40.9°C |
Таблица 3. Типичный температурных градиентов и соответствующей температуры воды ванны и алюминиевых блоков цилиндров для двунаправленных градиентов.
| Личиночных возраста (AEL) | Время анализа (одной направленности) | Время анализа (двунаправленный) |
| 24 h | 30 мин. | 35 мин |
| 48 ч | 22 мин | 27 мин |
| 72 h | 16 мин | 21 мин |
| 96 ч | 13 мин | 18 мин |
| 120 h | 10 мин | 15 мин |
Таблица 4. Разновозрастных личинок (AEL) и соответствующий пробирного раз.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для обеспечения успеха этого протокола, важно предпринять шаги для получения достаточного количества личинок для выполнения экспериментов. Они включают в себя предварительно кормления мух в дрожжей содержащие паста ампул для 2-3 d улучшить откладки. Флаконы должны быть помещены в лоток, содержащий воду флаконов и заключены в прозрачный пластиковый мешок, который сохраняет влагу пищи и способствует эффективное кормление личинки допуская воздействия обычных циклов свето тени. Однако вставить дрожжи не должно быть настолько мягкими, что попасть в ловушку мух. Количество женщин на флакон зависит от генотипа. В случае w1118обычно достаточен позволить ~ 12 женщин и мужчин ~ 6 откладывают яйца в течение 3 ч. 2 флакона обычно предоставляют достаточно личинки (100-200 личинок) поставить на тарелку для assay сингл направленный. Если покупать акции откладывает яйца меньше чем одичал тип или уменьшается доля которых вылупляются личинки, добавьте дополнительные (до 30-35/флакона) мужчины и.
Есть много причин непреднамеренные изменчивости при выполнении этих анализов. Стадии развития влияет температура предпочтение личинок. Таким образом крайне важно тщательно использовать личинки определенного этапа. Чтобы сделать это, собирать личинок более узкие временные рамки (например, 3 ч). Так как воспитание условия (температура, влажность, свето тени цикла и тип пищи) и некоторые мутации влияют на скорость развития, строго не полагайтесь на время после откладки яиц для анализа соответствующе возрасте личинки. Важно также изучить физические черты, такие как размер в рот крючки и дыхальца7 для определения, являются ли личинок различных генотипов на той же стадии развития. Раз за 1ст, 2-й и 3rd instar личинки развивать (Таблица 1) основаны на использовании на кукурузной основе продовольствия и инкубации при 25 ° C под 12 h свет: 12 h темные циклов. Личинки растут медленнее на основе патоки пищи. Надлежащее увлажнение и питание свежесть также влияет на рост личинок. Количество воды в пище следует оставить пищу слишком свободно из-за чрезмерного воды ни слишком сухой корки из флакона. В идеале ~ 5 мм слой ближайшего поверхности продовольствия обусловлено растущей личинки и движется легко флакон при наклоне или постучал. Это условие может быть достигнуто с помощью свежеприготовленной пищи с 50-100 личинок.
Это необходимо для установления стабильного температурного градиента до начала анализа. Таким образом поверните на водяной бане 1-2 ч до начала анализа, как водяные бани производят тепло и может изменить комнатной температуре, которые в свою очередь могут влиять на градиент. После 1-2 ч уравновешивает температуре наиболее номерах. Однако это должно определяться в каждой среде. Кроме того, при создании градиента с большим температурным диапазоном (> 3.0 ° C/см), это может быть трудно получить стабильные градиента. Крошечные движения пробирного пластины более существенно изменяет градиента температуры при большой диапазон (например > 3.0 ° C/см). Мы обнаружили, что градиент 1-2 ° C/cm производит наиболее стабильных градиентов.
Существует несколько дополнительных соображений, которые необходимо контролировать, ограничивать изменчивость в терморегуляцию анализов. Стиральная личинки является критическим, как присутствие частицы пищи или сахарозы на личинок может повлиять на пробу. Стиральная шаги должны быть выполнены тщательно, но быстро, потому что ограничение их кислородом чрезмерно в то время как они погружены в воды может повлиять на их здоровье. Поэтому мы рекомендуем использовать ячейки сита (вариант 2) для очистки личинки. Сито с порами размером 300 мкм работает хорошо для личинок в начале 3rd Инстар этап (72 h AEL) или старше. Кроме того, важно выполнять эксперименты в то же время дня, такие, как от Zeitgeber времени (ZT) ZT4 к ZT8 (ZT = 0, когда огни включены), чтобы ограничить изменчивость из-за воздействия циркадианных ритмов на выбор температуры. Уровень влажности на пластину агарозы могут также вызвать изменчивости в результатах. В то время как на поверхности пластины должна быть влажной, капельки воды может ловушку личинки и поэтому необходимо избегать.
Ограничивая вариативность анализов позволит получить надежные результаты без выполнения большого числа независимых экспериментов. Как правило 3-8 независимых экспериментов являются достаточно для получения надежных результатов. Правильного подсчета результатов также имеет решающее значение для успеха терморегуляцию анализов. Не считаются личинки, распространены в регионах в пределах 0,5 см от стен алюминия, так как температура не являются линейными в этих регионах. Некоторые личинки будет располагаться на границе между двумя зонами, на момент заключения assay. Если более 50% от длины тела находятся в одной зоне, затем включите личинка в табуляцию для этой зоны. Если larva именно 50% в каждом из двух зон, затем граф животное как 0,5 личинки в каждой зоне.
В то время как градиент assay позволяет личинки различать диапазон разницы температур, существуют ограничения на нижней и верхней температуры, которые могут быть эффективно проверены. Это не возможно для проверки температуры < 10 ° C с мобильностью личинки значительно уменьшается при более низких температурах. Хотя можно создать градиенты с верхней температура достигает + 42 ° C, почти без контроля личинки остаются в любой зоне > 28 ° C. Таким образом, непрерывный градиент анализов не может использоваться для дискриминации настройки температуры между различными зонами > 28 ° C. Однако градиента анализов на этих повышенных температурах могут потенциально использоваться для характеризуют мутантов, если они изменились весьма теплой температуры предпочтения.
Если мутант двигательного дефекта, это может быть необходимо проводить дополнительные эксперименты, чтобы убедиться, что предпочтение явно Температура не неточными из-за обесценения движения. Чтобы исправить эту потенциальную проблему, может быть необходимо создать больше пробирного раз чтобы позволить животных дополнительное время для перемещения их желаемых зонах. Двунаправленный градиента assay также могут быть использованы для проверки ли животные выберите же предпочтительным зону, независимо в том, где они первоначально размещены на плите.
В заключение градиент анализов, описанные здесь имеют преимущества перед другими терморегуляцию анализов. В то время как двусторонний выбор анализов являются полезными, поскольку они могут принести надежные результаты, особенно при большой разницы температур между двумя зонами, они не являются эффективными в раскрытии идеальной температуры, предпочитают личинок в одном эксперименте. Для этого требуется выполнение многих двусторонний выбор комбинаций, чтобы определить наиболее предпочтительным температуры5,6,7. В отличие от градиента assay обеспечивает животное возможность выбрать их предпочтительным температуры зоны в среде с одной постоянной температуры пейзаж. Таким образом нет необходимости разрабатывать большое сочетание двусторонний варианты для определения предпочтительного тепловой среде. Изучая терморегуляцию, используя круглые Петри был нанят для оценки влияния температуры на движущихся динамика личинка10. Однако это менее полезными в различении предпочтений между разными температурами, так как каждая зона является другой размер. Наконец благодаря простоте assay, и его полезность в требовательных малых температура предпочтения в одном assay, он может быть использован для экрана десятки кандидата генов, которые участвуют в личиночной температуры предпочтения, которые могли бы потенциально в противном случае нельзя упускать из виду, с использованием других анализов
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
К.м. поддерживается финансирование от NEI (EY008117, EY010852), NIDCD (DC007864, DC016278) и NIAID (1DP1AI124453).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gradient assay apparatus | |||
| PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath | Thomas Scientific | 9106 | This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz. |
| Aluminum assay plate (for single directional gradient) | Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized. | ||
| Aluminum plate (for bidirectional gradient) | 25 x 22 x 0.2 cm, black anodized. | ||
| Aluminum block | Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D. | ||
| Connector for aluminum blocks and tubing | McMaster-Carr | 91355K82 | |
| Tygon Sanitary Silicone Tubing | Tygon | 57296 | 1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Items and reagents for assay | |||
| Pestle | USA Scientific | 17361 | Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes |
| Thermometer | Fluke | 51II | |
| Thermocouple | Fluke | K type | |
| Universal microplate lid | Corning | 6980A77 | |
| 35 mm dish | Corning | 9380D40 | |
| Labeling tape (for bidirectional gradient) | Fisher Scientific | 15-951 | Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | Prepare 1% solution |
| Sucrose | Sigma | S0389-5KG | Prepare 18% solution right before starting assay |
| Paint brush | Fisher Scientific | 11860 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Denville | C1062-P | |
| Scoopula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| 500 mL round wide-mouth bottle | Pyrex | 1395-500 | |
| Cell strainer (300 mm pore) | PluriSelect | 43-50300 | Optional item for larvae washing |
| Cardboard box (vial tray) | Genesee Scientific | FS32-124 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila food | |||
| Distilled water | 22,400 mL | ||
| Cornmeal, yellow (extra fine mesh,flocked) 20 kg | LabScientific Inc. | NC0535320 | 1,609 g |
| Brewers yeast 100 lbs | MP Biomedicals | ICN90331280 | 379 g |
| NutriSoy® Soy Flour (10 kg/unit) | Genesee Scientific | 62-115 | 221 g |
| Drosophila Agar, Type II (5 kg) | Genesee Scientific | 66-103 | 190 g |
| Karo light corn syrup | Karo | 1,700 mL | |
| Methyl 4-hydroxybenzoate (suspend in 200 proof ethanol) | Sigma Aldrich | H5501-5KG | 72 g/240 mL |
| Propionic acid puriss. p.a.,>99.5% (GC) | Sigma Aldrich | 81910-1 L | 108 mL |
| Phosphoric acid ACS reagent, ≥85 wt. % in H2O | Sigma Aldrich | 438081-500 mL | 8.5 mL |
References
- Fowler, M. A., Montell, C. Drosophila TRP channels and animal behavior. Life Sci. 92, 394-403 (2013).
- Palkar, R., Lippoldt, E. K., McKemy, D. D. The molecular and cellular basis of thermosensation in mammals. Curr Opin Neurobiol. 34, 14-19 (2015).
- Vriens, J., Nilius, B., Voets, T.
- Rosenzweig, M., et al. The Drosophila ortholog of vertebrate TRPA1 regulates thermotaxis. Genes Dev. 19, 419-424 (2005).
- Kwon, Y., Shim, H. S., Wang, X., Montell, C. Control of thermotactic behavior via coupling of a TRP channel to a phospholipase C signaling cascade. Nat Neurosci. 11, 871-873 (2008).
- Kwon, Y., Shen, W. L., Shim, H. S., Montell, C. Fine thermotactic discrimination between the optimal and slightly cooler temperatures via a TRPV channel in chordotonal neurons. J Neurosci. 30 (31), 10465-10471 (2010).
- Shen, W. L., et al.
- Sokabe, T., Chen, H. S., Luo, J., Montell, C. A switch in thermal preference in Drosophila larvae depends on multiple rhodopsins. Cell Rep. 17, 336-344 (2016).
- Ni, L., et al. The Ionotropic Receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila. Elife. 5, 13254 (2016).
- Luo, L., et al. Navigational decision making in Drosophila thermotaxis. J Neurosci. 30 (12), 4261-4272 (2010).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. Drosophila: a laboratory handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).
