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Neuroscience

एक तापमान ढाल परख Drosophila लार्वा के थर्मल वरीयताओं का निर्धारण करने के लिए

Published: June 25, 2018 doi: 10.3791/57963
Automatic Translation
*1, *2,3, 1
1Neuroscience Research Institute and Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of California, Santa Barbara, 2Division of Cell Signaling, National Institute for Physiological Sciences, National Institutes of Natural Sciences, 3Thermal Biology Group, Exploratory Research Center on Life and Living Systems, National Institutes of Natural Sciences
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम एक सतत थर्मल ढाल का उपयोग Drosophila लार्वा के पसंदीदा पर्यावरण के तापमान का निर्धारण करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं ।

Abstract

फल मक्खी, Drosophila melanogasterसहित कई जानवरों, पर्यावरण के तापमान में मिनट मतभेद है, जो उन्हें अपने पसंदीदा थर्मल परिदृश्य बाहर की तलाश करने के लिए सक्षम बनाता है भेदभाव करने में सक्षम हैं । एक परिभाषित रैखिक सीमा से अधिक लार्वा का तापमान वरीयताओं को परिभाषित करने के लिए, हम एक तापमान ढाल का उपयोग परख विकसित की है । एक एकल दिशात्मक ढाल स्थापित करने के लिए, दो एल्यूमीनियम ब्लॉकों स्वतंत्र जल स्नान से जुड़े हैं, जिनमें से प्रत्येक व्यक्तिगत ब्लॉकों के तापमान को नियंत्रित करता है । दो ब्लॉकों में ढाल की निचली और ऊपरी सीमाएं निर्धारित हैं । तापमान ढाल दो पानी नियंत्रित ब्लॉक इतना है कि प्लेट उन दोनों के बीच दूरी तक फैले पर एक agarose लेपित एल्यूमीनियम प्लेट रखकर स्थापित किया गया है । एल्यूमीनियम थाली कि पानी ब्लॉकों के शीर्ष पर सेट है के सिरों को ंयूनतम और अधिकतम तापमान को परिभाषित करता है, और क्षेत्रों में दो ब्लॉकों के बीच एक रैखिक तापमान ढाल फार्म । ढाल परख अलग उंर के लार्वा को लागू किया जा सकता है और म्यूटेंट कि प्रदर्शन phenotypes, ऐसे उत्परिवर्तनों टीआरपी चैनलों और opsins, जो तापमान भेदभाव के लिए आवश्यक है एंकोडिंग जीन को प्रभावित करने के साथ उन के रूप में की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

Thermotaxis सबसे अनुकूल शर्तों1,2,3के साथ एक वातावरण का चयन करने के लिए मोबाइल जानवरों द्वारा नियोजित है । यदि जलवायु जरूरत से ज्यादा गर्म या ठंडा है, यह व्यवहार अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है । इसके अलावा, कई जानवरों आरामदायक रेंज में तापमान में बहुत छोटे मतभेदों के प्रति संवेदनशील होते हैं और एक आदर्श तापमान के साथ बाहर परिवेश की तलाश । यह फल मक्खियों के रूप में poikilothermic जीवों के लिए विशेष महत्व का है, जो पर्यावरण के साथ अपने शरीर का तापमान equilibrate । लार्वा thermotaxis पर नजर रखने के लिए परख की पहचान करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है और Drosophila क्षणिक रिसेप्टर संभावित (टीआरपी) चैनल4,5,6जैसे आणविक सेंसर की भूमिकाओं को स्पष्ट, rhodopsins7,8, और ionotropic रिसेप्टर रिसेप्टर्स (आईआरएस)9, जो विभिन्न तापमान पर्वतमाला से अधिक तापमान संवेदनशीलता के साथ इन जानवरों राज्यसत्ता.

एक दो तरह की पसंद परीक्षण लार्वा6,7में थर्मल वरीयताओं का अध्ययन करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करता है । परख दो अलग तापमान क्षेत्रों की स्थापना जरूरत पर जोर देता है और जानवरों को दूसरे पर एक तरफ का चयन करने की इजाजत दी । दो तरह के विकल्प टेस्ट से परिणाम दमदार हो सकते हैं, खासकर अगर दो विकल्पों के बीच तापमान में अंतर बड़ा हो । इसके अलावा, के बाद से प्रत्येक परख केवल दो समूहों tabulating शामिल है, डेटा एक साधारण वरीयता सूचकांक के रूप में व्यक्त किया जा सकता है । दो तरह की सहजता और सादगी पसंद परख भी आनुवंशिक स्क्रीन के लिए उत्तरदायी हैं । हालांकि, एक प्रमुख सीमा है कि कई प्रयोगों जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती जानवरों के पसंदीदा तापमान स्थापित करने के लिए आवश्यक हैं ।

एक ढाल परख के लिए एक एकल परख8में पसंदीदा तापमान स्थापित करने का अवसर प्रदान करता है । इसके अलावा, दो तरह के विकल्प परीक्षण के विपरीत, यह पशुओं के एक समूह के वितरण के मूल्यांकन परमिट, जब तापमान की एक सतत श्रृंखला के साथ सामना । एक ढाल परख एक पेट्री पकवान और एक जानवर का उपयोग करता है और अच्छी तरह से व्यक्तिगत पशुओं10के विस्तृत व्यवहार निस्र्पक के लिए अनुकूल है । हालांकि, के बाद से पेट्री व्यंजन गोल कर रहे हैं, तापमान क्षेत्रों के आकार भिंन है और उत्तरोत्तर केंद्र से दूरी के आधार पर छोटे हैं । इसलिए, इस सेटअप आदर्श पशुओं की आबादी का तापमान चयन की निगरानी के लिए नहीं है ।

एक सतत थर्मल ढाल उपकरण है कि अच्छी तरह से लार्वा के समूहों के तापमान वरीयताओं का आकलन करने के लिए अनुकूल है एक आयताकार क्षेत्र को रोजगार और यहां वर्णित है । तंत्र का निर्माण और इकट्ठा करने के लिए सरल है । इसके अलावा, ढाल रैखिक है, और लचीला है, के रूप में यह 10 डिग्री सेल्सियस से ४२ डिग्री सेल्सियस तक बड़े तापमान पर्वतमाला पर thermotaxis का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । परख तेजी से और सरल करने के लिए प्रदर्शन और reproducible डेटा पैदावार है । लार्वा के इष्ट तापमान की रिपोर्ट करने के अलावा, यह एक एकल प्रयोग में एक पूरे रैखिक सीमा से अधिक जानवरों की आबादी की वरीयताओं को पता चलता है । इन फायदों के कारण, यह thermotaxis के लिए आवश्यक जीन की पहचान करने के लिए एक उत्कृष्ट पसंद है ।

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Protocol

1. उपकरण निर्माण और ढाल परख के लिए उपकरण कोडांतरण

  1. एक एकल दिशात्मक ढाल परख के लिए एल्यूमीनियम परख प्लेटें बनाना ।
    1. ट्रिम कर दीजिए और एक एल्यूमीनियम का एक टुकड़ा से बाहर एक एल्यूमिनियम परख प्लेट (आंकड़ा 1a) पीस एक बैंड का उपयोग कर देखा और निंनलिखित आयामों के साथ तेज ऊर्ध्वाधर मिल: बाहरी आकार १४० x १०० x 9 मिमी है और आंतरिक आकार १३० x ९० x 8 मिमी (आंकड़ा 1b) है । काले रंग के साथ प्रत्येक परख प्लेट के अंदर यांग यह आसान लार्वा कल्पना और जंग को रोकने के लिए बनाने के लिए ।
      नोट: एकल के लिए एल्यूमीनियम परख प्लेटों का निर्माण-दिशात्मक ढाल एक मशीन की दुकान द्वारा किया जाता है । यांग एक वाणिज्यिक विक्रेता द्वारा किया जाता है ।
    2. एक स्थायी मार्कर का उपयोग कर 10 मिमी से अलग, 13 बंदिशें के साथ प्रत्येक परख प्लेट के ऊपरी और निचले रिम्स मार्क. परख प्लेटों के भीतरी किनारे से पहली और अंतिम बंदिशें 5 मिमी रखें (आंकड़ा 1a, बी) ।
  2. को द्वि दिशा ढाल के लिए एल्यूमीनियम परख थाली बनाना, निंनलिखित आयाम शीट धातु कैंची का उपयोग कर के साथ एक एल्यूमीनियम थाली काट: २५० x २२० x 2 मिमी । काले रंग के साथ परख प्लेटों यांग ।
    नोट: द्वि-दिशा ढाल के लिए एल्यूमीनियम परख प्लेट का निर्माण एक मशीन की दुकान द्वारा किया जाता है । इस यांग एक वाणिज्यिक विक्रेता द्वारा किया जाता है ।
  3. एल्यूमीनियम ब्लॉकों गढ़े ।
    नोट: दो ब्लॉकों के लिए एक दिशात्मक ढाल की जरूरत है और तीन ब्लॉकों के लिए द्वि-दिशा ढाल के लिए आवश्यक हैं ।
    1. एल्यूमिनियम ब्लॉक (चित्रा 1C) एल्यूमीनियम का एक टुकड़ा से बाहर कट एक बैंड का उपयोग कर देखा (५० x २५५ x 14 मिमी के आयाम) (चित्रा 1C, डी) ।
    2. ब्लॉक के अंदर पानी चैनल ड्रिल (व्यास में 7 मिमी) एक ऊर्ध्वाधर मिल और खुले में धागा खांचे का उपयोग एक तरफ (चित्रा 1 डी) समाप्त होता है । बोल्ट और थ्रेड सील टेप के साथ एक यू के आकार का पानी चैनल फार्म (चित्रा 1C, डी) के साथ नाली छेद बंद करो ।
      नोट: एल्यूमीनियम परख ब्लॉकों का निर्माण एक मशीन की दुकान द्वारा किया जाता है ।
    3. एल्यूमीनियम ब्लॉक (चित्रा 1 डी) में पेंच धागे और एक छोर पर धागा सील टेप के साथ कनेक्टर ठीक करें । सिलिकॉन ट्यूबिंग में कई नजला के साथ दूसरे छोर फ़िट (1/4 "आईडी x 3/8" आयुध डिपो एक्स 1/16 "दीवार) ।
  4. दो प्रशीतित/गरम परिचालित स्नान प्राप्त करें ।
  5. ढाल परख प्रणाली के लिए तापमान नियंत्रित ब्लॉकों को इकट्ठा ।
    1. एकल दिशात्मक ढाल के लिए, एक अलग पानी स्नान करने के लिए दो एल्यूमीनियम ब्लॉकों में से प्रत्येक कनेक्ट इतना है कि प्रत्येक ब्लॉक के तापमान एक स्वतंत्र पानी परिसंचारी प्रणाली (चित्रा 2a) द्वारा नियंत्रित किया जाता है । सिलिकॉन टयूबिंग का प्रयोग करें (1/4 "आईडी x 3/8" आयुध डिपो एक्स 1/16 "दीवार) एल्यूमीनियम ब्लॉक (चित्रा 2a) के भीतर की ओर संबंधक को पानी स्नान के आउटलेट से कनेक्ट करने के लिए । इसके अलावा, पानी स्नान के प्रवेश के लिए एल्यूमीनियम ब्लॉक पर बाहरी पक्ष कनेक्टर कनेक्ट करने के लिए टयूबिंग का उपयोग करें ।
    2. द्वि-दिशा ढाल के लिए, प्लेट के बाएँ और दाएँ पक्ष के तहत तीन ब्लॉकों में से दो जगह और टयूबिंग (चित्रा बी) के साथ एक ही पानी स्नान करने के लिए उन्हें कनेक्ट. एक दूसरे पानी स्नान और प्लेट के केंद्र (चित्रा बी) के नीचे जगह के लिए तीसरे एल्यूमीनियम ब्लॉक कनेक्ट ।
      नोट: यह उपकरण और परख ही आवश्यक है अगर लार्वा एक किनारे पर क्षेत्र में जमा या एक-दिशात्मक ढाल के अंय । यदि हां, तो यह आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है कि वहां एक बढ़त प्रभाव है या नहीं । इस संभावना का परीक्षण करने के लिए, एक द्वि-दिशा ग्रेडिएंट स्थापित करें जिसमें किनारे क्षेत्र का तापमान एकल-दिशात्मक ग्रेडिएंट (उदा. 18 ° c) का उपयोग करके लार्वा को पसंद करता है, द्वि-दिशा ग्रैडिएंट की प्लेट के बीच में तापमान (चित्रा 3E , च).

2. लार्वा तुल्यकालन

  1. पौष्टिक मक्खियों अंडा बिछाने के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए ।
    1. एक मूसल खमीर पेस्ट बनाने के साथ खमीर granules और आसुत जल मिश्रण । अच्छी तरह से पीसने और हलचल जब तक पेस्ट की निरंतरता मूंगफली का मक्खन के समान है । जरूरत से ज्यादा शुष्क पेस्ट है, जो बंद परतदार जब ताजा शीशियों, या गीला पेस्ट है, जो मक्खी जाल सकता है मक्खियों को स्थानांतरित कर सकते हैं ।
    2. एक मूसल का प्रयोग, बस भोजन की सतह के ऊपर, मानक Drosophila शीशियों की भीतरी दीवारों के करीब खमीर पेस्ट जोड़ें ।
    3. 12-35 महिलाओं गिनती और आधे से अधिक के रूप में कई पुरुषों (लेकिन कोई 10 से अधिक) एक सह2 पैड पर, और प्रत्येक खमीर पेस्ट युक्त शीशी के लिए महिलाओं और पुरुषों जोड़ें ।
    4. मक्खी के साथ खाना रखने के लिए खमीर-पेस्ट नम, जबकि मक्खियों फ़ीड, एक ट्रे कि 20 खुली शीशियों के साथ १०० शीशियों को धारण में इन शीशियों गठबंधन केवल आसुत जल युक्त । ट्रे को साफ प्लास्टिक बैग में रखें और सील करें ।
    5. ४८ ज के लिए एक 25 डिग्री सेल्सियस मशीन में ट्रे मशीन ताकि महिलाओं को पर्याप्त रूप से पाला है, जिससे उंहें अंडे की बड़ी संख्या में रखना सक्षम ।
  2. अंडा बिछाने के लिए शीशियों की स्थापना की ।
    1. उन्हें दोहन से अधिक अंडे इकट्ठा करने के लिए नए भोजन शीशियों में पाला मक्खियों स्थानांतरण । 2 सह का उपयोग न करें, जो मक्खियों के कारण निम्न कम समय विंडो पर कम अंडे देना हो सकता है ।
      नोट: मानक Drosophila खाद्य शीशियों अंडा संग्रह के लिए खमीर पेस्ट के बिना उपयोग किया जाता है ।
    2. मक्खियों के लिए अंडे देना करने के लिए 3 एच 25 डिग्री सेल्सियस पर इतना है कि सभी अंडे एक अपेक्षाकृत संकीर्ण समय खिड़की पर एकत्र कर रहे है अनुमति देते हैं ।
      नोट: इससे लार्वा को समान विकासात्मक अवस्था में सिंक्रनाइज़ किया जा सकेगा ।
    3. पानी की शीशियों से युक्त ट्रे में अंडे युक्त शीशियों को रखें और बैग को कस लें । 25 डिग्री सेल्सियस के तहत 12 ज प्रकाश: 12 ज अंधेरे चक्र में मशीन ।
    4. अंडा बिछाने (AEL) लार्वा चरण के आधार पर वांछित के बाद घंटे की एक दी संख्या के लिए लार्वा की आयु ।
      नोट: 1 तालिका घंटे AEL और लार्वा चरण के बीच संबंधों का एक अनुमान है, जो मक्खी स्टॉक के आधार पर भिंन होगा, भोजन का इस्तेमाल किया, तापमान का पालन आदि AEL और विकासात्मक अवस्था के बीच सटीक संबंध होना चाहिए इस तरह के मुंह की आकृति विज्ञान के रूप में शारीरिक मानदंडों का उपयोग कर प्रत्येक अन्वेषक द्वारा सत्यापित, हुक और spiracles11.

3. तापमान ढाल सेटअप

  1. एकल-दिशात्मक ग्रेडिएंट तैयार करें
    1. को परख के दौरान एक आर्द्र परिवेश वातावरण बनाने के लिए, दो एल्यूमीनियम गीला कागज तौलिए पर दो पानी स्नान से जुड़े ब्लॉकों जगह, 10 सेमी (चित्रा 2a) से अलग कर दिया ।
    2. दो पानी स्नान पर बारी ~ 2 एच को परख शुरू करने से पहले equilibrate को एल्यूमीनियम ब्लॉकों के तापमान के लिए पर्याप्त समय की अनुमति ।
      नोट: यह वांछित रैखिक तापमान ढाल को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है कि प्रत्येक पानी स्नान के तापमान का निर्धारण करने के लिए एक नकली प्रयोग प्रदर्शन करने के लिए सिफारिश की है. कुछ ठेठ तापमान जोड़े पानी स्नान सेट करने के लिए 2 तालिकामें सूचीबद्ध हैं । हालांकि, ध्यान दें कि सतह के तापमान परिवेश के तापमान से प्रभावित होते हैं । टयूबिंग की लंबाई भी तापमान को प्रभावित करता है के रूप में वहां ट्यूबों में ठंडा है । हमारे सेटअप में ट्यूबिंग की लंबाई १.५ मीटर है ।
    3. एक ५०० मिलीलीटर दौर चौड़ा मुंह की बोतल में उच्च शक्ति की स्थापना पर 1% agarose की माइक्रोवेव १०० मिलीलीटर और एक स्तर benchtop पर 25 मिलीलीटर/ दो परख प्लेटें, जो एक ही समय (चित्रा 2a) पर एल्यूमीनियम ब्लॉकों पर रखा जा सकता है तैयार करते हैं ।
    4. के बाद agarose जम गया है (10-20 मिनट), धीरे से एक मानक रसोई स्पंज या एक melamine स्पंज के साथ एक agarose सतह रगड़ agarose सतह थोड़ा मोटे बनाने के लिए, ताकि जब agarose जेल, एक चिकनी पतली पानी झिल्ली पर पानी छिड़काव बनाया जाएगा, और कोई पानी की बूंदें बनेगी ।
    5. पूरी तरह से आसुत पानी के साथ एक कंटेनर में प्लेटें जलमग्न जब तक परख के लिए शुष्क हो रही से प्लेटों को रोकने के लिए प्रदर्शन किया जा करने के लिए तैयार है ।
  2. द्वि-दिशा ग्रैडिएंट तैयार करें (वैकल्पिक)
    1. को परख के दौरान एक आर्द्र परिवेश वातावरण बनाने के लिए, जगह तीन एल्यूमीनियम ब्लॉक 8 सेमी के अलावा (चित्रा 2 बी) गीला कागज तौलिए पर ।
    2. दो पानी स्नान पर बारी ~ 2 एच को परख शुरू करने से पहले equilibrate को एल्यूमीनियम ब्लॉकों के तापमान के लिए पर्याप्त समय की अनुमति ।
      नोट: यह द्वि-दिशा ढाल के लिए प्रत्येक जल स्नान के तापमान का निर्धारण करने के लिए एक नकली प्रयोग करने की सिफारिश की है । कुछ ठेठ तापमान जोड़े पानी स्नान सेट करने के लिए तालिका 3में सूचीबद्ध हैं । हालांकि, ध्यान दें कि सतह के तापमान परिवेश के तापमान से प्रभावित होते हैं । टयूबिंग की लंबाई भी तापमान को प्रभावित करता है के रूप में वहां ट्यूबों में ठंडा है । हमारे सेटअप में ट्यूबिंग की लंबाई १.५ मीटर है ।
    3. को प्लेट से बाहर फैल से agarose को रोकने के लिए, लेबलिंग टेप के साथ एल्यूमीनियम प्लेट के किनारों लपेटो एक 10 मिमी उच्च दीवार (आंकड़ा बी8) फार्म ।
    4. उच्च शक्ति की स्थापना का प्रयोग, माइक्रोवेव 1% agarose के २०० मिलीलीटर में एक ५०० मिलीलीटर दौर चौड़ा मुंह बोतल और एक परख प्लेट पर १२० मिलीलीटर डालना ।
    5. के बाद agarose जम गया है (~ 30 मिनट), धीरे से एक मानक रसोई स्पंज या एक melamine स्पंज के साथ एक agarose सतह रगड़ agarose सतह थोड़ा मोटे बनाने के लिए, ताकि जब agarose जेल, एक चिकनी पतली पानी झिल्ली पर पानी छिड़काव और बनाया है कोई पानी की बूंदें रूप ।
    6. पूरी तरह से आसुत पानी के साथ एक कंटेनर में परख प्लेटें जलमग्न जब तक परख के लिए उंहें बाहर सुखाने से रोकने के लिए प्रदर्शन किया जा करने के लिए तैयार है ।
  3. एकल-दिशात्मक ग्रेडिएंट सेट अप करें
    1. एक ढाल परख उपकरण के बगल में बेंच पर एजेंट और आइटम तैयार ( सामग्री की मेजदेखें) ।
    2. कुशल तापमान हस्तांतरण को बढ़ावा देने के लिए, ब्लॉक और प्लेट के बीच अंतरफलक पर पानी छिड़काव द्वारा एल्यूमीनियम ब्लॉकों और परख प्लेटों के बीच किसी भी अंतराल को भरने ।
    3. दस्ताने का प्रयोग, पानी के कंटेनर से परख प्लेटें हटा दें । अगर पानी agarose जेल और प्लेट के बीच आक्रमण और कारणों के लिए सतह पर फार्म का कारण बनता है, एक P1000 micropipette के साथ पानी निकालें ।
    4. एल्यूमीनियम ब्लॉकों पर परख प्लेटों जगह इतनी है कि बंदिशें कि या तो बढ़त से 2 सेमी बिल्कुल एल्यूमीनियम ब्लॉकों के किनारों से मेल खाती है (चित्रा 2a, सी) ।
    5. प्लेट की सतह पर स्प्रे पानी (agarose सतह को कवर एक पतली पानी की झिल्ली पर्याप्त है) बाहर सुखाने से agarose जेल को रोकने के लिए । सुनिश्चित करें कि पानी की झिल्ली निरंतर है और पानी की बूंदों से मुक्त है क्योंकि लार्वा पानी की बूंदों में फंस सकते हैं ।
    6. पानी के वाष्पीकरण को कम करने और जेल की सतह के तापमान को स्थिर करने में मदद करने के लिए एक गत्ता बॉक्स के साथ ढाल प्रणाली को कवर । equilibrate करने के लिए तापमान की अनुमति देने के लिए 5-10 मिनट के लिए रुको ।
    7. प्लेट पर 12 बिंदुओं पर सतह के तापमान की जांच करें (चित्रा 2c) । प्रत्येक क्षेत्र के भीतर दो माप लेने के लिए स्थापित है या नहीं, वहां एक क्षेत्र के भीतर परिवर्तनशीलता है । सुनिश्चित करें कि दोनों स्थानों पर तापमान वांछित तापमान के ± ०.२ ° c के भीतर है ।
      नोट: एक क्षेत्र के भीतर परिवर्तनशीलता आमतौर पर होती है क्योंकि एल्यूमीनियम ब्लॉकों के किनारे करने के लिए दो स्थानों की सटीक दूरी समान नहीं हैं । एल्यूमीनियम ब्लॉकों पर थाली की स्थिति को समायोजित करने के लिए सुनिश्चित करें कि बंदिशें कि या तो बढ़त से 2 सेमी बिल्कुल एल्यूमीनियम ब्लॉकों के किनारों से मेल खाते हैं ।
    8. यदि मापा तापमान ढाल वांछित ढाल से भटक, वृद्धि या पानी स्नान तापमान सेटिंग (ओं) को कम करने और पानी स्नान (ओं) को स्थिर (ओं) के तापमान के बाद सतह के तापमान की जांच करें ।
    9. एक गत्ता बॉक्स के साथ ढाल प्रणाली को कवर परख शुरू जब तक ।
  4. द्वि-दिशा ग्रैडिएंट सेट करें (वैकल्पिक)
    1. एक ढाल परख उपकरण के बगल में बेंच पर एजेंट और आइटम तैयार ( सामग्री की मेजदेखें) ।
    2. तीन एल्यूमीनियम ब्लॉकों की सतहों पर स्प्रे पानी सतहों के बीच किसी भी अंतराल को भरने के द्वारा परख प्लेटों के लिए एल्यूमीनियम ब्लॉकों से कुशल तापमान हस्तांतरण को बढ़ावा देने के ।
    3. पानी के कंटेनर और एल्यूमीनियम ब्लॉकों पर जगह से ध्यान से परख प्लेट निकालें । यदि पानी agarose जेल और प्लेट, जो सतह पर फार्म के लिए धक्कों का कारण हो सकता है के बीच आक्रमण, एक P1000 micropipette के साथ पानी निकाल दें ।
    4. एल्यूमीनियम ब्लॉकों पर परख प्लेट इतनी जगह है कि या तो बढ़त से पहले और अंतिम क्षेत्रों के midlines बिल्कुल दो पक्ष एल्यूमीनियम ब्लॉकों के किनारों मैच (चित्रा बीसी, डी) ।
    5. प्लेट की सतह पर स्प्रे पानी (agarose सतह को कवर एक पतली पानी की झिल्ली पर्याप्त है) बाहर सुखाने से agarose जेल को रोकने के लिए । सुनिश्चित करें कि पानी की झिल्ली निरंतर और पानी की बूंदों से मुक्त है, क्योंकि लार्वा पानी की बूंदों में फंस सकते हैं ।
    6. पानी के वाष्पीकरण को कम करने और जेल की सतह के तापमान को स्थिर करने में मदद करने के लिए एक गत्ता बॉक्स के साथ ढाल प्रणाली को कवर । equilibrate करने के लिए तापमान की अनुमति देने के लिए 5-10 मिनट रुको ।
    7. 10 क्षेत्रों (चित्रा 2d) में से प्रत्येक के midline साथ दो बिंदुओं पर सतह के तापमान की जांच करें । प्रत्येक क्षेत्र के भीतर दो माप लेने के लिए स्थापित है या नहीं, वहां एक क्षेत्र के भीतर परिवर्तनशीलता है । सुनिश्चित करें कि दोनों स्थानों पर तापमान वांछित तापमान के ± ०.२ ° c के भीतर है ।
      नोट: एक क्षेत्र के भीतर परिवर्तनशीलता आमतौर पर होती है क्योंकि एल्यूमीनियम ब्लॉकों के किनारे करने के लिए दो स्थानों की सटीक दूरी समान नहीं हैं । एल्यूमीनियम ब्लॉकों पर प्लेट की स्थिति को समायोजित करने के लिए सुनिश्चित करें कि पहले और पिछले क्षेत्रों के निकटतम प्रत्येक किनारे के midlines बिल्कुल दो पक्ष एल्यूमीनियम ब्लॉकों के किनारों से मेल खाते हैं ।
    8. यदि मापा तापमान ढाल वांछित ढाल से भटक, पानी स्नान तापमान सेटिंग (ओं) को समायोजित करने और पानी स्नान (ओं) को स्थिर (ओं) के तापमान के बाद सतह के तापमान की पुनः जांच ।
    9. कवर एक गत्ता बॉक्स के साथ ब्लॉक परख की शुरुआत तक ।

4. लार्वा संग्रह और धुलाई

  1. स्वच्छ लार्वा को अलग करना (विकल्प 1)
    1. जोड़ें ~ ४० एमएल 18% सुक्रोज एक ५० मिलीलीटर टेस्ट ट्यूब के लिए समाधान । एक scoopula के साथ भोजन की शीशी (ओं) से सभी लार्वा स्कूप और 18% सुक्रोज समाधान के लिए स्थानांतरण ।
    2. मिश्रण अच्छी तरह से लेकिन धीरे एक scoopula का उपयोग करने के लिए भोजन के मलबे से लार्वा अलग । 30-60 एस के लिए रुको जब तक लार्वा ट्यूब के ऊपर परत करने के लिए नाव । लार्वा युक्त शीर्ष परत डालो (~ 10 एमएल) एक और ५० एमएल ट्यूब करने के लिए और ताजा 18% सुक्रोज समाधान के साथ ट्यूब भरें । 30-60 एस के लिए रुको जब तक लार्वा फिर से ऊपर परत करने के लिए नाव ।
      नोट: बड़े भोजन के कण कभी-कभार लार्वा के साथ ट्रांसफर हो जाते हैं और अगर उन्हें नहीं हटाया जाता तो लार्वा thermotaxis प्रभावित हो सकता है । यदि बड़े भोजन कण ऊपर की परत में रहें, तो चरण शुू-4.1.2 दोहराएं, या मैंयुअल रूप से किसी scoopula का उपयोग करके उंहें निकालें ।
    3. लार्वा की शीर्ष परत (~ 10 मिलीलीटर) को दो अंय ५० मिलीलीटर ट्यूबों में स्थानांतरित करें और सुक्रोज एकाग्रता को कम करने के लिए आसुत जल के साथ दो ट्यूबों भरें, ताकि लार्वा जल्दी पानी में डूब जाएं । 30-60 के लिए रुको जब तक लार्वा नीचे सिंक । इस और लार्वा को डूबने से रोकने के लिए यथासंभव शीघ्रता से निम्न चरणों का पालन करें ।
    4. धीरे ट्यूबों झुकाव द्वारा संभव के रूप में पानी की ज्यादा के रूप में त्यागें । बचे हुए पानी से लार्वा को बाहर डालने के द्वारा एक ट्यूब में लार्वा को संयोजित करें और आसुत जल से ट्यूब भरें ।
    5. 30-60 s के लिए प्रतीक्षा करें जब तक सभी लार्वा नीचे सिंक और धीरे ट्यूबों झुकाव द्वारा संभव के रूप में ज्यादा पानी के रूप में हटा दें । सुक्रोज और सभी दृश्यमान भोजन को पूरी तरह से निकालने के लिए इस वाशिंग स्टेप को 2-4 बार दोहराएं ।
    6. यथासंभव अधिक से अधिक पानी का त्याग करें और लार्वा को एक खाली ३५ mm पेट्री डिश में मिलाकर उसका अंतरण करें । पानी के साथ ट्यूब स्प्रे और लार्वा स्थानांतरित करने में मदद करने के लिए एक छोटे से पेंट ब्रश का उपयोग करें ।
    7. एक P1000 micropipette का उपयोग कर पेट्री डिश से अतिरिक्त पानी निकालें । छोड़ ~ ०.५ पानी की मिलीलीटर लार्वा के निर्जलीकरण को रोकने के लिए ।
    8. लार्वा को भागने से रोकने के लिए डिश पर ढक्कन लगाएं । ढक्कन और पकवान के बीच छोटे अंतर के माध्यम से बचने के लिए लार्वा की क्षमता को कम करने के लिए ढक्कन उल्टा बारी । 10-20 मिनट के लिए लार्वा ठीक करने की अनुमति दें ।
  2. स्वच्छ लार्वा को अलग करना (विकल्प 2)
    नोट: लार्वा क्लीनिंग के लिए इस वैकल्पिक विधि से वाशिंग प्रक्रिया के दौरान लार्वा को घुटना होने की संभावना कम होती है । इस विधि का उपयोग करने के लिए, ऊपर दिए गए चरणों को निष्पादित करने के बाद निम्न चरणों के साथ आगे बढ़ें शुू-4.1.2 ।
    1. एक सेल छलनी (३०० µm, लार्वा ७२ h AEL या पुराने बरकरार रखता है) एक ५० मिलीलीटर ट्यूब के शीर्ष पर रखें ।
    2. इस बात की पुष्टि करने के बाद कि कोई वयस्क शरीर या भोजन का मलबा सुक्रोज समाधान की सतह पर तैर रहा है, जाल स्क्रीन पर सभी लार्वा जाल करने के लिए छलनी के माध्यम से लार्वा युक्त शीर्ष परत डालो । ५० एमएल ट्यूब भर जाने तक लार्वा को आसुत जल से अच्छी तरह धो लें ।
    3. लार्वा के साथ सेल छलनी निकालें और ट्यूब से इस्तेमाल पानी के निपटान । खाली ट्यूब के ऊपर लार्वा युक्त छलनी को रखें और ५० एमएल ट्यूब भर जाने तक लार्वा को फिर से आसुत जल से धोएं ।
    4. एक खाली ३५ mm पेट्री डिश पर छलनी उल्टा बारी, और पेट्री डिश के लिए लार्वा हस्तांतरण करने के लिए सेल छलनी के ऊपर से पानी स्प्रे । एक छोटे से पेंट ब्रश का उपयोग कर शेष लार्वा स्थानांतरण ।
    5. चरण 5 पर आगे बढ़ने से पहले ऊपर 4.1.7 चरण के लिए जारी रखें ।

5. परख और गणना

  1. गत्ते का डिब्बा निकाल लें और तुरंत लार्वा को प्लेट में स्थानांतरित करने से पहले जेल की सतह का तापमान जांचें । गत्ता बॉक्स तापमान equilibration बाधित रोकने के लिए खुला है कि समय को कम करने. अगर सतह सूखी है, सतह पर पानी की एक छोटी राशि स्प्रे ।
  2. प्रत्येक थाली के केंद्र के पास १५० ± ५० लार्वा वितरित (6 क्षेत्रों के बीच 3 और 4 जोन के बीच) एकल दिशात्मक ढाल के लिए (रिलीज क्षेत्र; चित्र 2c).
    नोट: द्वि-दिशा ढाल के लिए, प्रत्येक आधे (चित्रा 2d) के मध्य क्षेत्र के साथ 200-400 लार्वा वितरित करें ।
  3. प्रत्येक परख प्लेट पर एक microplate ढक्कन प्लेस बाहर रेंगने से लार्वा को रोकने के लिए । कवर सेटअप एक गत्ता बॉक्स के साथ प्रकाश जोखिम को रोकने के लिए, जो agarose जेल पर लार्वा विकल्प को प्रभावित कर सकता है ।
    नोट: द्वि-दिशा ढाल के लिए, यह प्लेट एक ढक्कन के साथ कवर करने के लिए आवश्यक नहीं होना चाहिए, क्योंकि प्लेट बड़ा है, और लार्वा का पसंदीदा तापमान मध्य क्षेत्र में है । नतीजतन, कुछ लार्वा किनारों पर जमा हो जाते हैं और उन्हें क्रॉल करने का अवसर मिलता है ।
  4. परख के लिए एक दिशात्मक ढाल के लिए 10-30 मिनट के लिए आगे बढ़ना है, और द्वि-दिशा ढाल के लिए 15-35 मिनट के लिए, लार्वा की उंर (तालिका 4) के आधार पर अनुमति देते हैं ।
  5. गत्ते का डिब्बा और microplate ढक्कन हटा दें । फोटोग्राफ एक डिजिटल कैमरे का उपयोग कर ऊपर से प्लेटें । प्रत्येक परख प्लेट के दो तस्वीरें ले लो ताकि अंवेषक बेहतर कंट्रास्ट और विश्लेषण के लिए चमक के साथ एक का चयन कर सकते हैं ।
  6. आकांक्षा द्वारा प्लेटों के बाहर और कहीं भी परख प्लेट से लार्वा के सभी निकालें ।
  7. साफ परख प्लेटें, ट्यूबों, और सेल छलनी से आसुत जल के साथ अच्छी तरह से । पुनः प्रयोग परख उस दिन तैयार प्लेटें जब तक agarose की सतह क्षतिग्रस्त है ।
  8. प्रत्येक जोन में लार्वा के प्रतिशत वितरण की गणना करें ।
    1. किसी भी सॉफ्टवेयर है कि छवि को मार्क्स जोड़ने की अनुमति देता है का उपयोग कर परख परिणामों के फोटोग्राफिक छवि खोलो । परख क्षेत्रों इंगित करने के लिए, ऊर्ध्वाधर लाइनों प्रत्येक 2 सेमी परख प्लेट पर बंदिशें पर आधारित आकर्षित ।
    2. प्रत्येक जोन में लार्वा की संख्या की गणना करें और संख्याओं को रिकॉर्ड करे । किसी भी दीवारों से ०.५ cm क्षेत्रों में लार्वा की गणना न करें । जेल दीवारों के पास मोटा है, और सतह के तापमान इन क्षेत्रों में रैखिक नहीं कर रहे हैं ।
    3. एकल-दिशात्मक ग्रेडिएंट के लिए, प्रत्येक ज़ोन में प्रतिशत वितरण निम्नानुसार परिकलित करें:
      (किसी दिए गए 2-मुख्यमंत्री जोन में लार्वा की संख्या)/(6 जोनों में लार्वा की कुल संख्या) x १०० ।
    4. द्वि-दिशा ग्रेडिएंट के लिए, प्रत्येक ज़ोन में प्रतिशत वितरण निम्नानुसार परिकलित करें:
      (किसी दिए गए 2-cm ज़ोन में लार्वा की संख्या)/(ग्रैडिएंट के प्रत्येक पक्ष पर 5 ज़ोन में लार्वा की कुल संख्या) x १०० ।

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Representative Results

एक 18 ° c -28 ° c एकल-दिशात्मक ढाल स्थापित करने के लिए, हम १६.८ डिग्री सेल्सियस और 31 डिग्री सेल्सियस के लिए दो पानी स्नान के तापमान निर्धारित किया है । हम सभी 6 क्षेत्रों के ऊपरी और निचले भागों के भीतर 26 पदों पर तापमान को मापने के द्वारा 13 बिंदुओं पर तापमान को प्राप्त करने, क्षेत्रों के बीच सीमा लाइनों, और agarose जेल सतह के चरम छोर पर (चित्रा 2c2E) । ढाल के साथ तापमान वितरण लगभग रेखीय था (Y = 0.9672 * X + १६.१९, R2 = ०.९९६१) (चित्रा 2E) ।

हम नियंत्रण के तापमान वरीयताओं को परख (डब्ल्यू१११८) विभिंन युगों में लार्वा । 1अनुसूचित जनजाति (24 ± १.५ एच AEL), 2एन डी (४८ ± १.५ एच AEL) और जल्दी-3rd लार्वा (७२ ± १.५ एच) 24 डिग्री सेल्सियस क्षेत्र (आंकड़ा 3ए, बी) में चोटियों दिखाया । तापमान वरीयताओं को 3rd instar लार्वा विकास के दौरान बदल दिया है । मध्य 3rd instar का सबसे बड़ा प्रतिशत (९६ ± १.५ ज AEL) 18 डिग्री सेल्सियस क्षेत्र में संचित (3ए, बी), और इस पूर्वाग्रह उंर के साथ वृद्धि हुई । देर-3rd instar लार्वा (पूर्व में चढ़ाई के बीच; १२० ± १.५ ज AEL), ~ ५०% 18 डिग्री सेल्सियस क्षेत्र में संकुल, और इस तापमान का चयन था ~ 4-आसंन 20 डिग्री सेल्सियस क्षेत्र (18 ° c क्षेत्र, ५०.२% से अधिक गुना; 20 ° c क्षेत्र, १५.१%; चित्र 3 ए , ख). proclivity डब्ल्यू१११८ में 18 डिग्री सेल्सियस क्षेत्र में जमा करने के लिए देर-3rd instar लार्वा अभी भी 18 डिग्री सेल्सियस क्षेत्र में संचित, एक द्वि-दिशा तापमान ढाल का उपयोग कर के बाद से एक बढ़त प्रभाव के कारण नहीं था (चित्रा 3E, एफ ).

हम भी देर से परीक्षण-3rd instar लार्वा (१२० ± १.५ एच AEL) आरामदायक रेंज में तापमान मतभेदों को भेदभाव के लिए आवश्यक जीन में उत्परिवर्तनों के साथ । ये trpA1, जो 18 डिग्री सेल्सियस -24 डिग्री सेल्सियस5,7,8में सामान्य तापमान चयन के लिए आवश्यक है शामिल हैं । trpA1 (trpA11) में एक नल उत्परिवर्तन के साथ लार्वा पूरे 18 डिग्री सेल्सियस पर समान रूप से वितरित-28 डिग्री सेल्सियस ढाल (आंकड़ा 3सी) । लार्वा लापता बस ए और बी isoforms (trpA1-एबीg4), या सी और डी isoforms (trpA1-सीडीg4) भी गंभीर विकलांगता (चित्रा 3सी) दिखा । मक्खियों phospholipase Cβ (PLC21C और NORPA) के दो isoforms सांकेतिक शब्दों में बदलना, और NORPA (NORPAP24) लेकिन नहीं PLC21C (PLC21C P319)को प्रभावित उत्परिवर्तनों भी 18 डिग्री सेल्सियस रेंज में संचय बाधित ( चित्रा 3 डी) ।

Figure 1
चित्र 1. एकल-दिशात्मक तापमान ढाल परख प्रदर्शन के लिए उपकरण । (क) एक एल्यूमीनियम परीक्षण प्लेट लार्वा thermotaxis व्यवहार परख के लिए इस्तेमाल किया । 13 काले लाइनों के ऊपर और नीचे demarcate 12 क्षेत्रों (10 मिमी प्रत्येक) । थाली के नीचे काले रंग के साथ यांग है कि यह लार्वा कल्पना करने के लिए आसान है । (ख) एल्यूमीनियम प्लेट के आयामों (मिमी में संकेत दिया) । एल्यूमीनियम की थाली के बाहरी आकार १४० x १०० x 9 मिमी है । एल्यूमीनियम की थाली के भीतरी आकार १३० x ९० x 8 मिमी है । इस बंदिशें को 10 एमएम से अलग कर दिया जाता है । पहली और अंतिम सीमांकन प्लेट के भीतरी क्षेत्र के किनारों से 5 मिमी है । (ग) एल्यूमीनियम ब्लॉक में से एक के ऊपर और पक्ष विचार ढाल के तापमान को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया । ब्लॉक दो connectors के लिए सिलिकॉन ट्यूबों, जो एक पानी के स्नान से कनेक्ट करने के लिए देते थे । (घ) एक एल्यूमीनियम ब्लॉक के आयाम । एल्यूमीनियम ब्लॉक के बाहरी आकार २५५ x ५० x 14 मिमी है । भीतरी जल मार्ग का व्यास ७ मि. मी. बाईं तरफ २ ३० मिमी connectors सिलिकॉन टयूबिंग है कि पानी के स्नान के लिए प्रदान करता है के साथ कनेक्ट । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. एकल और द्वि-दिशा ढाल परख setups । (एक) दो एल्यूमीनियम ब्लॉकों पर दो एल्यूमिनियम परख प्लेटों के साथ एकल दिशात्मक ढाल सेटअप । एल्यूमीनियम ब्लॉकों के तापमान में दो जल स्नान से पानी को प्रसारित करके नियंत्रित किया जाता है. (ख) तीन एल्यूमीनियम ब्लॉकों की व्यवस्था, पानी स्नान और एक द्वि-दिशा ढाल के लिए एक एल्यूमीनियम प्लेट (२५० x २२० मिमी) । लेफ्ट और राइट ब्लॉक्स इसी वॉटर बाथ से जुड़े हैं और मिडिल ब्लॉक दूसरे वॉटर बाथ से जुड़ा है । एल्यूमीनियम परख प्लेट टेप के साथ लिपटे के लिए एक 10 मिमी दीवार फार्म के लिए 1% agarose शामिल है । (ग) पदों की जांच करने के लिए तापमान (डॉट्स द्वारा संकेत) और प्लेट पर लार्वा जारी. एक प्रयोग आरंभ करने से पहले, प्रत्येक क्षेत्र के भीतर दो बिंदुओं पर तापमान की जांच करने के लिए कि वांछित रैखिक तापमान ढाल की स्थापना की है पुष्टि । लार्वा midline के निकट संकेत क्षेत्र के भीतर जारी किया गया है । लार्वा 2-सेमी ज़ोन में से प्रत्येक के भीतर गिना जाता है । (D) स्थितियां तापमान की जांच करने के लिए (डॉट्स द्वारा इंगित) और एक द्वि-दिशा ग्रैडिएंट पर लार्वा के लिए रिलीज़ ज़ोन । लार्वा की एक बराबर संख्या द्वि-दिशा ढाल के प्रत्येक आधे के midline के साथ जारी कर रहे हैं । लार्वा की संख्या 10 (2 सेमी) क्षेत्रों में से प्रत्येक में गिना जाता है । agarose सतह पर तापमान (18 डिग्री सेल्सियस -26 डिग्री सेल्सियस) का एक विशिष्ट सेट इंगित किया गया है । (ङ) सीमा रेखाएं और एक नमूना एकल-दिशात्मक ढाल में प्रत्येक क्षेत्र के midlines साथ मापा तापमान । डेटा का प्रतिनिधित्व मतलब तापमान ± एसडी. n = 8 परख (१५० ± ५० लार्वा/ इस आंकड़े के कुछ हिस्सों Sokabe एट अल से reproduced हैं । 8 मामूली संशोधनों के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. एकल दिशात्मक और द्वि-दिशा ढाल परख का उपयोग प्रतिनिधि परिणाम । (A, B) एकल दिशात्मक ढाल पर 6 क्षेत्रों में लार्वा के प्रतिशत का मतलब है । डाटा अंडे बिछाने (AEL) के बाद संकेत दिया घंटे में 3rd instar लार्वा शामिल हैं । n = 6-7. त्रुटि सलाखों के एक का प्रतिनिधित्व करते है ± SEM. (ग) पूर्व चढ़ाई देर-3rd instar लार्वा नियंत्रण के थर्मल वितरण (डब्ल्यू१११८) और trpA1 म्यूटेंट पर एक दिशात्मक ढाल । n = 3-4. त्रुटि सलाखों ± SEM प्रतिनिधित्व करते हैं । (घ) देर-3rd instar लार्वा ऑफ कंट्रोल (डब्ल्यू१११८) और PLCβ म्यूटेंट के थर्मल वितरण एकल-दिशात्मक ढाल पर । n = 4-6. त्रुटि सलाखों ± SEM का प्रतिनिधित्व करते हैं । (ङ) पूर्व-चढ़ाई के प्रतिनिधि वितरण, देर-3rd instar लार्वा (डब्ल्यू१११८) द्वि-दिशा ढाल पर । वाम और सही परख क्षेत्रों बिंदीदार लाइनों द्वारा संकेत दिया और नहीं, केंद्र में गिनती क्षेत्र (छायांकित क्षेत्र) द्वारा अलग कर रहे हैं । (एफ) थर्मल ढाल के साथ प्रत्येक क्षेत्र में पूर्व चढ़ाई देर-3आरडी instar लार्वा (डब्ल्यू१११८) का प्रतिशत । लार्वा को बाएं और दाएं जारी ज़ोन में रखा गया था । परख क्षेत्रों में एक 3 सेमी नहीं, केंद्र में गिनती क्षेत्र और वितरण स्वतंत्र रूप से गणना कर रहे है द्वारा अलग कर रहे हैं । त्रुटि पट्टियां SEMs का प्रतिनिधित्व करती हैं । n = 3 परख (200-400 लार्वा/ इस आंकड़े के कुछ हिस्सों Sokabe एट अल से reproduced हैं । 8 मामूली संशोधनों के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

घंटे AEL लार्वा स्टेज
24 1st instar
४८ 2एनडी instar
७२ अर्ली-3rd instar
९६ मिड-3rd instar
१२० देर-3आरडी instar, बस चढ़ने से पहले मुकाम

तालिका 1. अंडे बिछाने (AEL) और लार्वा चरणों के बाद घंटे के बीच संबंध ।

agarose प्लेट पर तापमान ढाल (ढलान) पानी स्नान के तापमान एल्यूमीनियम ब्लॉकों का तापमान
10.0-25.0 ° c (1.5 ° c/ ~ 6.5-7 ° c/~ 28.5 ° c ~ 8.5 ° c/~ 26.8 ° c
18.0-28.0 ° c (1 ° c/ ~ 16.8 ° c/~ 31.0 ° c ~ 17.8 ° c/~ 29.7 ° c
14.0-34.0 ° c (2 ° c/ ~ 10.0 ° c/~ 40.0 ° c ~ 11.8 डिग्री सेल्सियस/~ 36.8 ° c
12.5-42.0 ° c (2.95 ° c/ ~ 7.0 ° c/~ 55.0 ° c ~ 9.4 ° c/~ 49.4 ° c

तालिका 2. ठेठ तापमान ढाल और एक दिशात्मक ढाल के लिए पानी स्नान और एल्यूमीनियम ब्लॉकों के इसी तापमान ।

agarose प्लेट पर तापमान ढाल पानी स्नान के तापमान एल्यूमीनियम ब्लॉकों का तापमान
22-10-22 ° c (1.5 ° c/ ~ 5.0 ° c/~ 25.0 ° c ~ 7.5 ° c/~ 24.0 ° c
26-18-26 ° c (1 ° c/ ~ 15.8 ° c/~ 30.6 ° c ~ 16.9 ° c/~ 28.4 ° c
30-14-30 ° c (2 ° c/ ~ 8.5 ° c/~ 36.4 ° c ~ 10.9 ° c/~ 32.8 ° c
36-12.5-36 ° c (2.95 डिग्री सेल्सियस/ ~ 5.0 ° c/~ 47.2 ° c ~ 7.9 ° c/~ 40.9 ° c

तालिका 3. ठेठ तापमान ढाल और पानी स्नान और द्वि-दिशा ढाल के लिए एल्यूमीनियम ब्लॉकों के इसी तापमान ।

लार्वा age (AEL) परख समय (एकल दिशात्मक) परख समय (द्वि-दिशा)
24 ज 30 min ३५ मिनट
४८ ज 22 min 27 min
७२ ज 16 min 21 min
९६ ज 13 min 18 min
१२० ज 10 min 15 मिनट

तालिका 4. विभिंन लार्वा उंर (AEL) और इसी परख टाइंस ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल की सफलता सुनिश्चित करने के लिए, यह प्रयोग करने के लिए लार्वा की पर्याप्त संख्या प्राप्त करने के लिए कदम उठाने के लिए महत्वपूर्ण है । इनमें पूर्व में मक्खियों को खमीर पेस्ट से युक्त 2-3 डी के लिए अंडे बिछाने में सुधार करने की शीशियों को खिलाने शामिल हैं । शीशियों को पानी की शीशियों से युक्त ट्रे में रखा जाना चाहिए और एक स्पष्ट प्लास्टिक बैग में नत्थी किया जाना चाहिए, जो खाने की नमी को बनाए रखता है और सामान्य प्रकाश-अंधेरे चक्रों के लिए जोखिम की अनुमति देते हुए लार्वा द्वारा प्रभावी भोजन को बढ़ावा देता है । हालांकि, खमीर पेस्ट इतना नरम नहीं होना चाहिए कि मक्खियों फंस जाते हैं । प्रति शीशी मादाओं की संख्या जीनोटाइप पर निर्भर करती है. डब्ल्यू१११८के मामले में, यह आमतौर पर अनुमति देने के लिए पर्याप्त है ~ 12 महिलाओं और ~ 6 पुरुषों के लिए अंडे देना 3 एच । दो शीशियों आम तौर पर पर्याप्त लार्वा (100-200 लार्वा) एक प्लेट पर एक दिशात्मक परख के लिए जगह प्रदान करते हैं । यदि मक्खी स्टॉक जंगली प्रकार या लार्वा कि हैच के अनुपात से कम अंडे देता है कम है, अतिरिक्त महिलाओं को जोड़ने के लिए (अप करने के लिए 30-35/

वहां अनपेक्षित परिवर्तनशीलता के कई कारण है जब इन परख प्रदर्शन कर रहे हैं । विकासात्मक अवस्था में लार्वा का तापमान वरीयता को प्रभावित करता है । इसलिए, एक निर्धारित चरण के लार्वा का सावधानीपूर्वक उपयोग करना अनिवार्य है । ऐसा करने के लिए, लार्वा को एक संकीर्ण समय सीमा (जैसे 3 h) पर एकत्रित करें । के बाद से पालन की स्थिति (तापमान, आर्द्रता, प्रकाश अंधेरे चक्र और भोजन के प्रकार) और कुछ उत्परिवर्तनों विकास की दर को प्रभावित करते हैं, सख्ती से समय पर भरोसा नहीं अंडे बिछाने के बाद तुलना में वृद्ध लार्वा का विश्लेषण । यह भी महत्वपूर्ण है शारीरिक लक्षण की जांच करने के लिए, जैसे मुंह हुक के आकार और7 spiracles निर्धारित करने के लिए कि क्या अलग पादी के लार्वा एक ही विकास के चरण में हैं । 1अनुसूचित जनजातिके लिए टाइंस, 2एन डी और 3rd instar लार्वा विकसित करने के लिए (तालिका 1) 25 डिग्री सेल्सियस के तहत 12 एच प्रकाश में मकई भोजन आधारित भोजन और मशीन का उपयोग पर आधारित हैं: 12 ज अंधेरे चक्र । लार्वा गुड़-आधारित भोजन पर धीमे बढ़ते हैं । उचित जलयोजन और खाद्य ताजगी भी लार्वा की वृद्धि को प्रभावित करता है । भोजन में पानी की मात्रा न तो खाना छोड़ना चाहिए न ही शीशी से वापस छील लेना चाहिए और न ही अत्यधिक पानी के कारण भी ढीला रहना चाहिए. आदर्श रूप में, ~ 5 मिमी परत के निकटतम खाद्य सतह बढ़ते लार्वा द्वारा वातानुकूलित है और आसानी से चालें जब शीशी झुका या टेप किया जाता है । इस हालत 50-100 लार्वा के साथ नए सिरे से बनाया भोजन का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है ।

यह परख आरंभ करने से पहले एक स्थिर तापमान ढाल स्थापित करने के लिए आवश्यक है । इसलिए, पानी स्नान पर बारी 1-2 एच परख शुरुआत करने से पहले, के रूप में पानी स्नान गर्मी का उत्पादन और परिवेश कमरे के तापमान, जो बारी में ढाल को प्रभावित करने की क्षमता है बदल सकता है । 1-2 एच के बाद, सबसे वातानुकूलित कमरे equilibrates के परिवेश के तापमान । हालांकि, यह प्रत्येक वातावरण में निर्धारित किया जाना चाहिए । इसके अलावा, जब एक बड़े तापमान रेंज के साथ एक ढाल पैदा (> 3.0 ° c/सेमी), यह एक स्थिर ढाल प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो सकता है । परख प्लेट के एक छोटे से आंदोलन और अधिक महत्वपूर्ण तापमान ढाल परिवर्तन जब सीमा बड़ी है (जैसे > 3.0 ° c/ हमने पाया है कि एक 1-2 ° c/सेमी ढाल सबसे स्थिर ढाल पैदा करता है ।

वहां कई अतिरिक्त विचार है कि जरूरत को thermotaxis परख में परिवर्तनशीलता को नियंत्रित किया जा रहे हैं । लार्वा को धोना महत्वपूर्ण है, क्योंकि लार्वा पर खाद्य कणों या सुक्रोज की उपस्थिति परख पर प्रभाव डाल सकती है । धोने कदम अच्छी तरह से प्रदर्शन किया जाना चाहिए, लेकिन जल्दी, क्योंकि उनके ऑक्सीजन की आपूर्ति जरूरत से ज्यादा सीमित जबकि वे पानी में डूब रहे है उनके स्वास्थ्य को प्रभावित कर सकते हैं । इसलिए, लार्वा को साफ करने के लिए हम सेल छलनी (विकल्प 2) का उपयोग करने की सलाह देते हैं । ३०० µm के एक ताकना आकार के साथ एक छलनी जल्दी-3rd instar स्टेज (७२ ज AEL) या पुराने पर लार्वा के लिए अच्छी तरह से काम करता है । इसके अलावा, यह दिन के एक ही समय में प्रयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है, जैसे Zeitgeber समय (ZT) ZT4 से ZT8 (ZT = 0 है जब रोशनी चालू कर रहे हैं), तापमान चयन पर circadian लय के प्रभावों के कारण परिवर्तनशीलता को सीमित करने के लिए । agarose प्लेट पर नमी का स्तर भी परिणाम में परिवर्तनशीलता पैदा कर सकता है । जबकि प्लेटों की सतह नम करने की जरूरत है, पानी की बूंदों लार्वा जाल सकता है, और इसलिए से बचने की जरूरत है ।

परख में परिवर्तनशीलता सीमित यह स्वतंत्र प्रयोगों की बड़ी संख्या में प्रदर्शन के बिना मजबूत परिणाम प्राप्त करने के लिए संभव बना देगा । आमतौर पर, 3-8 स्वतंत्र प्रयोग एक विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए पर्याप्त हैं । परिणामों की उचित सारणीकरण भी thermotaxis की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है । एल्यूमीनियम दीवारों से ०.५ सेमी के भीतर क्षेत्रों में वितरित लार्वा गिनती नहीं है, क्योंकि इन क्षेत्रों में तापमान रैखिक नहीं कर रहे हैं । कुछ लार्वा दो जोनों के बीच सीमा पर तैनात होंगे, उस समय परख संपन्न हो जाएगा । यदि शरीर की लंबाई से अधिक ५०% एक क्षेत्र में रहता है, तो उस क्षेत्र के लिए सारणीकरण में लार्वा शामिल हैं । प्रत्येक दो क्षेत्रों में एक लार्वा ठीक ५०% है, तो प्रत्येक क्षेत्र में ०.५ लार्वा के रूप में पशु की गणना ।

जबकि ढाल परख लार्वा तापमान मतभेदों की एक श्रृंखला के लिए अनुमति देता है, वहां कम और ऊपरी तापमान कि प्रभावी ढंग से परीक्षण किया जा सकता करने के लिए सीमाएं हैं । यह तापमान का परीक्षण करने के लिए व्यवहार्य नहीं है < 10 ° c के बाद से लार्वा की गतिशीलता कम तापमान पर बहुत कम हो जाती है । हालांकि ऊपरी तापमान ४२ डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने के साथ ढाल स्थापित किया जा सकता है, लगभग कोई नियंत्रण लार्वा किसी भी क्षेत्र में रहना > 28 ° c । इसलिए, लगातार ढाल परख के लिए विभिंन क्षेत्रों > 28 डिग्री सेल्सियस के बीच भेदभाव तापमान वरीयताओं को नहीं किया जा सकता है । हालांकि, इन ऊंचा तापमान पर ढाल परख संभावित म्यूटेंट विशेषताएं अगर वे अत्यधिक गर्म तापमान वरीयताओं को स्थानांतरित किया जा सकता है ।

यदि एक उत्परिवर्ती एक हरकत दोष है, यह सुनिश्चित करें कि स्पष्ट तापमान वरीयता एक आंदोलन हानि के कारण गलत नहीं है बनाने के लिए अतिरिक्त प्रयोगों का संचालन करने के लिए आवश्यक हो सकता है । इस संभावित समस्या के उपचार के लिए, यह अब परख समय स्थापित करने के लिए पशुओं को अतिरिक्त समय के लिए अपने वांछित क्षेत्रों में जाने की अनुमति आवश्यक हो सकता है । द्वि-दिशा ढाल परख भी परीक्षण के लिए कि क्या जानवरों को एक ही पसंदीदा क्षेत्र का चयन करें, चाहे के रूप में जहां वे प्लेट पर शुरू में रखा जाता है नियोजित किया जा सकता है ।

अंत में, ढाल परख यहां वर्णित अंय thermotaxis परख पर लाभ है । जबकि दो तरह के विकल्प परख उपयोगी होते हैं, क्योंकि वे मजबूत परिणाम उपज सकते हैं, खासकर जब दो क्षेत्रों के बीच तापमान मतभेद बड़े हैं, वे एक ही प्रयोग में लार्वा द्वारा पसंद आदर्श तापमान का खुलासा करने में प्रभावी नहीं हैं । ऐसा करने के लिए कई दो तरह के विकल्प संयोजन प्रदर्शन की आवश्यकता है सबसे पसंदीदा तापमान5,6,7निर्धारित करने के लिए । इसके विपरीत, ढाल परख जानवर एक वातावरण में एक भी निरंतर तापमान परिदृश्य के साथ अपने पसंदीदा तापमान क्षेत्र का चयन करने का अवसर प्रदान करता है । इस प्रकार, यह करने के लिए दो तरह के विकल्प का एक बड़ा संयोजन ईजाद करना अनावश्यक है पसंदीदा थर्मल वातावरण निर्धारित करते हैं । एक दौर पेट्री पकवान का उपयोग कर thermotaxis अध्ययन एक लार्वा10की चलती गतिशीलता पर तापमान के प्रभाव का आकलन करने के लिए नियोजित किया गया है. हालांकि, यह अलग तापमान के बीच वरीयताओं के बीच भेदभाव में कम उपयोगी है, के बाद से प्रत्येक क्षेत्र में एक अलग आकार है । अंत में, परख की सादगी के कारण, और एक एकल परख में छोटे तापमान वरीयताओं को भेदभाव में अपनी उपयोगिता, यह उंमीदवार जीन है कि संभवतः लार्वा तापमान वरीयता में शामिल है के दर्जनों स्क्रीन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है अंयथा अंय परख का उपयोग कर अनदेखी हो

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

C.M. नेि (EY008117, EY010852), NIDCD (DC007864, DC016278) और NIAID (1DP1AI124453) से धन द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gradient assay apparatus
PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath Thomas Scientific 9106 This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz.
Aluminum assay plate (for single directional gradient) Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized.
Aluminum plate (for bidirectional gradient) 25 x 22 x 0.2 cm, black anodized.
Aluminum block Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D.
Connector for aluminum blocks and tubing McMaster-Carr 91355K82
Tygon Sanitary Silicone Tubing Tygon 57296 1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall
Name Company Catalog Number Comments
Items and reagents for assay
Pestle USA Scientific 17361 Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes
Thermometer Fluke 51II
Thermocouple Fluke K type
Universal microplate lid Corning 6980A77
35 mm dish Corning 9380D40
Labeling tape (for bidirectional gradient) Fisher Scientific 15-951 Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds
Agarose Invitrogen 16500500 Prepare 1% solution
Sucrose Sigma S0389-5KG Prepare 18% solution right before starting assay
Paint brush Fisher Scientific 11860
50 mL centrifuge tubes Denville C1062-P
Scoopula Fisher Scientific 14-357Q
500 mL round wide-mouth bottle Pyrex 1395-500
Cell strainer (300 mm pore) PluriSelect 43-50300 Optional item for larvae washing
Cardboard box (vial tray) Genesee Scientific FS32-124
Name Company Catalog Number Comments
Drosophila food
Distilled water 22,400 mL
Cornmeal, yellow (extra fine mesh,flocked) 20 kg LabScientific Inc. NC0535320 1,609 g
Brewers yeast 100 lbs MP Biomedicals ICN90331280 379 g
NutriSoy® Soy Flour (10 kg/unit) Genesee Scientific 62-115 221 g
Drosophila Agar, Type II (5 kg) Genesee Scientific 66-103 190 g
Karo light corn syrup Karo 1,700 mL
Methyl 4-hydroxybenzoate (suspend in 200 proof ethanol) Sigma Aldrich H5501-5KG 72 g/240 mL
Propionic acid puriss. p.a.,>99.5% (GC) Sigma Aldrich 81910-1 L 108 mL
Phosphoric acid ACS reagent, ≥85 wt. % in H2O Sigma Aldrich 438081-500 mL 8.5 mL

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक १३६ Drosophila लार्वा thermotaxis तापमान ढाल व्यवहार somatosensation
एक तापमान ढाल परख <em>Drosophila</em> लार्वा के थर्मल वरीयताओं का निर्धारण करने के लिए
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Liu, J., Sokabe, T., Montell, C. A… More

Liu, J., Sokabe, T., Montell, C. A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (136), e57963, doi:10.3791/57963 (2018).

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