En temperaturgradient analysen att bestämma termisk preferenser av Drosophila larver

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att avgöra den Rekommenderad omgivningstemperatur av Drosophila larver med en kontinuerlig termisk gradient.

Abstract

Många djur, inklusive bananflugan, Drosophila melanogaster, klarar av diskriminerande minuten skillnader i omgivningstemperatur, som gör det möjligt för dem att söka sin föredragna termisk landskap. Om du vill definiera temperatur preferenser larverna över ett definierat linjärt område, utvecklat vi ett test med en temperaturgradient. För att upprätta en enda dubbelriktade gradient, är två aluminium block anslutna till oberoende vattenbad, vilka styr temperaturen på enskilda block. De två blocken sätter nedre och övre gränser på toningen. Temperaturlutning etableras genom att placera en agaros-belagd aluminium plattan över två vatten-kontrollerade block så att plattan sträcker sig över avståndet mellan dem. Ändarna av aluminium plattan som ligger på toppen av vatten block definierar de lägsta och högsta temperaturerna och regionerna däremellan två block bildar en linjär temperaturgradient. Gradient analysen kan tillämpas på larver av olika åldrar och kan användas för att identifiera mutanter som uppvisar fenotyper, såsom de med mutationer som påverkar gener som kodar för TRP-kanaler och opsins, som krävs för temperatur diskriminering.

Introduction

Thermotaxis är anställd av mobila djur att välja en miljö med den mest gynnsamma villkor^1,2,3. Om klimatet är överdrivet varmt eller kallt, är detta avgörande för överlevnad. Dessutom, många djur är känsliga för mycket små skillnader i temperatur i intervallet bekväma och söka ute omgivningen med en idealisk temperatur. Detta är särskilt viktigt för poikilothermic organismer som bananflugor, som temperera sin kroppstemperatur med miljön. Analyser att övervaka larval thermotaxis har varit avgörande för att identifiera och tydliggöra rollerna för molekylär sensorer såsom Drosophila Transient Receptor Potential (TRP) kanaler^4,5,6, rhodopsins^7,8, varvid jonkanalkopplad receptor receptorer (IRs)⁹, förse dessa djur med temperatur känslighet olika temperaturområden.

Ett tvåvägs val test erbjuder en metod för att studera termisk preferenser i larver^6,7. Analysen innebär att upprätta två olika temperaturzoner och låter djuren att välja ena över den andra. Resultaten från tvåvägs val tester kan vara robust, särskilt om temperaturskillnaderna mellan de två alternativen är stora. Dessutom, eftersom varje analys innebär tabulering endast två grupper, kan data uttryckas som ett enkelt index. Den lätthet och enkelhet av tvåvägs val analyser kan också bli föremål för genetiska skärmar. En stor begränsning är dock att många experiment är skyldiga att upprätta vildtyp eller muterade djur Rekommenderad temperatur.

En gradient analysen erbjuder möjlighet att fastställa den önskad temperaturen i en enda analys⁸. Dessutom till skillnad från tvåvägs val testet möjliggör det utvärdering av fördelningen av en grupp djur, när de konfronteras med en kontinuerlig rad temperaturer. En gradient assay använder en petriskål och enskilda djur och är väl lämpad för kännetecknar detaljerad beteendet hos enskilda djur¹⁰. Men eftersom petriskålar är runda, storleken på temperaturzoner varierar och kan successivt mindre beroende på avståndet från centrum. Därför är denna inställning inte idealisk för övervakning temperatur valen av populationer av djur.

En kontinuerlig termisk gradient apparat som är väl lämpad att bedöma temperatur preferenser grupper av larver sysselsätter en rektangulär arena och beskrivs här. Apparaten är enkel att konstruera och montera. Dessutom toningen är linjär, och är flexibel, eftersom det kan användas för att bedöma thermotaxis stora temperaturområden från 10 ° C till 42 ° C. Analysen är snabb och enkel att utföra och ger reproducerbara data. Förutom att rapportera gynnade temperaturen av larver, avslöjar det preferenser av befolkningen av djur över ett helt linjär sortiment i en enda experiment. På grund av dessa fördelar är det ett utmärkt val för att identifiera gener som krävs för thermotaxis.

Protocol

1. utrustning tillverkning och montering apparater för Gradient analyser

1. Tillverka aluminium assay plattorna för singel-directional gradient analysen.
   1. Trimma och slipa varje assay aluminiumplåt (figur 1A) ur ett enda stycke aluminium med en bandsåg och skarpa vertikal mill med följande mått: yttre storlek är 140 x 100 x 9 mm och inre storlek är 130 x 90 x 8 mm (figur 1B). Anodize insidan av varje assay platta med svart färg att göra det lättare att visualisera larverna och förhindra rost.
      Obs: Tillverkning av aluminium assay pläterar för singel-directional toningen görs genom en mekanisk verkstad. Anodisering utförs av en kommersiell leverantör.
   2. Markera de övre och nedre kanterna av varje assay platta med 13 avgränsningar, avgränsade med 10 mm med en permanent markörpenna. Placera de första och sista avgränsningarna 5 mm från innerkanten av assay pläterar (figur 1A, B).
2. För att tillverka aluminium assay plattan för dubbelriktad gradient, klipp ut en aluminiumplåt med följande mått med plåt sax: 250 x 220 x 2 mm. Anodize assay plattorna med svart färg.
   Obs: Tillverkning av aluminium assay pläterar för dubbelriktad Övertoningarna utförs av en verkstad. Anodisering är gjort av en kommersiell leverantör.
3. Tillverka aluminium block.
   Obs: Två block behövs för singel-directional toningen och tre block behövs för dubbelriktad gradient.
   1. Skära aluminium block (figur 1 c) ur ett enda stycke aluminium med en bandsåg (mått 50 x 255 x 14 mm) (figur 1 c, D).
   2. Borr vatten kanalen inuti blocket (7 mm i diameter) med en vertikal mill och tråd spår i de öppna ändarna på ena sidan (figur 1 d). Stäng de räfflade hål med bultar och gängtejp sigill att bilda en U-formad vattenkanal (figur 1 c, D).
      Obs: Tillverkning av aluminium assay block utförs av en verkstad.
   3. Fixa kopplingen i aluminiumblock (figur 1 d) med skruvgängor och tråd tätning band i ena änden. Passa in den andra ändan med flera hullingar i silikon slangar (ID 1/4 ”x 3/8” OD x 1/16 ”vägg).
4. Få två kylda/uppvärmda cirkulerande bad.
5. Montera temperaturreglerade block för gradient assay systemet.
   1. För singel-directional övertoningen, Anslut varje två aluminium block till ett separat vattenbad så att temperaturen i varje block är kontrollerade av en oberoende vatten cirkulerande system (figur 2A). Använd silikon slangar (ID 1/4 ”x 3/8” OD x 1/16 ”vägg) att ansluta uttaget av vattenbad till kontakten på insidan av aluminium blocket (figur 2A). Också använda slangar för att ansluta yttre sidan kontakten på blocket aluminium till inloppet i vattenbadet.
   2. För dubbelriktade övertoningen, placera två av de tre blocken under vänster och höger sida av plattan och Anslut dem till samma vattenbad med slangen (figur 2B). Anslut det tredje aluminium blocket till en andra vattenbad och plats nedanför mitten av plattan (figur 2B).
      Obs: Denna apparat och analys är behövs bara om larverna ackumuleras i zonen på en kant eller andra singel-directional övertoningen. Om så är fallet, är det viktigt att bedöma om det finns en kant effekt eller inte. För att testa denna möjlighet, upprätta en dubbelriktad gradient som kant zon temperaturen program av larver med singel-directional övertoningen (t.ex. 18 ° C) är temperaturen i mitten av plattan av dubbelriktad gradient (figur 3E , F).

2. larval synkronisering

1. Ge näring till flugor som ska användas för äggläggning.
   1. Blanda jäst granulat och destillerat vatten med en mortelstöt för att jäst klistra in. Slipa och rör om tills pastan konsistens är liknar jordnötssmör noggrant. Undvik överdrivet torr pasta, som kan flagna när du överför flugor till färska injektionsflaskor eller blöt pasta, som kunde fånga flugor.
   2. Använder en mortelstöt, tillsätt jäst pastan nära de inre väggarna i standard Drosophila injektionsflaskor, strax ovanför ytan av maten.
   3. Räkna 12-35 kvinnor och upp till hälften så många hanar (men inte mer än 10) på en CO₂ pad, och Lägg till jäst pasta-innehållande en injektionsflaska honor och hanar.
   4. För att hålla flugan mat med jäst-klistra in fuktig, medan flugorna foder, kombinera dessa flaskor i ett fack som rymmer upp till 100 injektionsflaskor med 20 öppna injektionsflaskor som innehåller destillerat vatten bara. Placera brickan i en genomskinlig plast påse och förslut.
   5. Inkubera facket i en 25 ° C inkubator för 48 h så att honorna får näring på lämpligt sätt, varigenom dem att lägga stora mängder ägg.
2. Ställa in injektionsflaskor för äggläggning.
   1. Över näring flugorna till ny mat injektionsflaskor för ägg-insamling genom att knacka dem över. Använd inte CO_2, som kan orsaka flugorna till lägger färre ägg över fönstret följande kort tid.
      Obs: Standard Drosophila mat injektionsflaskor används utan jäst pasta för insamling av ägg.
   2. Låt flugorna till lägga ägg för 3 h vid 25 ° C så att alla äggen samlas över en relativt smala tidsfönstret.
      Obs: Detta aktiverar larvaena som ska synkroniseras på samma utvecklingsstadiet.
   3. Placera de injektionsflaskor innehållande ägg i facket som innehåller vatten flaskorna och dra åt påsen. Inkubera vid 25 ° C under 12 h ljus: 12 h mörka cykler.
   4. Ålder larverna för ett givet antal timmar efter äggläggning (AEL) beroende på larvstadium önskas.
      Obs: Tabell 1 är en uppskattning av sambandet mellan AEL och den larvstadium, som varierar beroende på den flyga materielen, mat, uppfödning temperatur etc. exakt förhållandet mellan AEL och utvecklingsstadier måste vara verifierade av varje utredare använder fysiska kriterier, såsom morfologi av munnen krokar och externa¹¹.

3. temperaturgradient Setup

1. Förbereda singel-directional övertoning
   1. För att skapa en fuktig omgivande miljö under analyserna, placera två aluminium block ansluten till två vattenbad på våta pappershanddukar, avgränsade med 10 cm (figur 2A).
   2. Slå på de två vattenbad ~ 2 h innan analysen för att ge tillräckligt med tid för temperaturen i aluminium block temperera.
      Obs: Det rekommenderas att utföra en mock experiment för att bestämma temperaturen i varje vattenbad som behövs för att uppnå önskad linjär temperatur övertoningen. Några typiska temperatur par att ställa vattenbad listas i tabell 2. Observera dock att yttemperaturen påverkas av omgivande temperatur. Längden på slang också påverkar temperaturen eftersom det är kylning i rören. Längden på slangen i våra setup är 1,5 m.
   3. Mikrovågsugn 100 mL 1% agaros på inställningen hög effekt i en 500 mL runda bred mun flaska och häll 25 mL/assay plattan på en nivå bänkmonterade. Förbered två assay pläterar, som kan placeras på aluminium block samtidigt (figur 2A).
   4. Efter agarosen stelnat (10-20 min), försiktigt gnugga varje agaros yta med en standard kök svamp eller melamin svamp att göra agaros ytan något grov, så att när spraya vatten på agarosgel, skapas en jämn tunn vatten membran, och inga vattendroppar kommer bilda.
   5. Helt dränka plattorna i en behållare med destillerat vatten tills analysen är klar ska utföras för att förhindra att plattorna blir uttorkad.
2. Förbereda en dubbelriktad gradient (tillval)
   1. För att skapa en fuktig omgivande miljö under analyserna, placera tre aluminium block 8 cm mellanrum (figur 2B) på våta pappershanddukar.
   2. Slå på de två vattenbad ~ 2 h innan analysen för att ge tillräckligt med tid för temperaturen i aluminium block temperera.
      Obs: Det rekommenderas att utföra en mock experiment för att bestämma temperaturen i varje vattenbad för dubbelriktad gradient. Några typiska temperatur par att ställa vattenbad listas i tabell 3. Observera dock att yttemperaturen påverkas av omgivande temperatur. Längden på slang också påverkar temperaturen eftersom det är kylning i rören. Längden på slangen i våra setup är 1,5 m.
   3. För att förhindra Agarens rinner ur plattan, Linda kanterna av aluminium plattan med märkning tejp för att bilda en 10 mm-hög vägg (figur 2B).
   4. Med inställningen hög effekt, mikrovågsugn 200 mL 1% agaros i en 500 mL runda bred mun flaska och häll 120 mL på en assay tallrik.
   5. Efter agarosen stelnat (~ 30 min), försiktigt gnugga varje agaros yta med en standard kök svamp eller melamin svamp att göra agaros ytan något grov, så att när spraya vatten på agarosgel, en jämn tunn vatten membran skapas och inga vattendroppar form.
   6. Helt dränka assay plattorna i en behållare med destillerat vatten tills analysen är klar ska utföras för att förhindra dem från att torka ut.
3. Ställa in single-directional övertoning
   1. Förbereda reagenser och objekt på en bänk bredvid lutning assay apparaten (se Tabell för material).
   2. För att främja effektiv temperatur överföring, fylla eventuella luckor mellan aluminium block och assay plattorna genom att spraya vatten på gränssnittet mellan block och plattan.
   3. Använda handskar, ta bort assay plattorna från vattentanken. Om vatten invaderar mellan agarosgel och plattan och orsakar knölar bildas på ytan, ta bort vattnet med en P1000 mikropipett.
   4. Placera assay plattorna på aluminium block så att avgränsningarna som är 2 cm från vardera kanten exakt matcha kanterna av aluminium block (figur 2A, C).
   5. Spruta vatten på ytan av plattan (en tunn vatten membran som täcker agaros ytan räcker) att förhindra agarosgel torkar ut. Kontrollera att vatten membranet är kontinuerlig och fri av vattendroppar eftersom larver kan fastna i vattendroppar.
   6. Täcka lutning systemet med en kartong att minska vattenavdunstning och bidra till att stabilisera temperaturen av gel ytan. Vänta 5-10 min så att temperaturen temperera.
   7. Kontrollera Yttemperaturen på 12 punkter på plattan (figur 2 c). Gör två mätningar inom varje zon att fastställa huruvida det finns variationer inom en zon. Kontrollera temperaturen på båda ställen är ± 0,2 ° C av önskad temperatur.
      Obs: Variabilitet inom en zon oftast eftersom de exakta avstånd av de två platserna till kanten av aluminium block inte är identiska. Justera positionen för plattan på aluminium block för att kontrollera att de avgränsningar som är 2 cm från vardera kanten exakt matchar kanterna av aluminium block.
   8. Om den uppmätta temperatur lutningen avviker från den önska lutningen, öka eller minska den vatten bad temperatur setting(s) och dubbelgranska yttemperaturen efter temperaturen i vatten Baden stabilize(s).
   9. Täcka lutning systemet med en kartong tills start analysen.
4. Konfigurera dubbelriktad gradient (valfritt)
   1. Förbereda reagenser och objekt på en bänk bredvid lutning assay apparaten (se Tabell för material).
   2. Spraya vatten på ytor av tre aluminium block för att främja effektiv temperatur överföring från aluminium block till assay plattorna genom att fylla eventuella luckor mellan ytorna.
   3. Ta bort assay plattorna försiktigt från vattenbehållaren och placera på aluminium block. Om vatten invaderar mellan agarosgel och plattan, vilket kan orsaka knölar bildas på ytan, ta bort vattnet med en P1000 mikropipett.
   4. Placera assay plattan på aluminium block så att midlines av de första och sista zonerna från antingen kant exakt matcha kanterna på de två sida aluminium block (figur 2B, D).
   5. Spruta vatten på ytan av plattan (en tunn vatten membran som täcker agaros ytan räcker) att förhindra agarosgel torkar ut. Kontrollera att vatten membranet är kontinuerlig och fri av vattendroppar, eftersom larver kan fastna i vattendroppar.
   6. Täcka lutning systemet med en kartong att minska vattenavdunstning och bidra till att stabilisera temperaturen av gel ytan. Vänta 5-10 min så att temperaturen temperera.
   7. Kontrollera Yttemperaturen på två punkter längs mittlinjen av varje av de 10 zonerna (figur 2D). Gör två mätningar inom varje zon att fastställa huruvida det finns variationer inom en zon. Kontrollera temperaturen på båda ställen är ± 0,2 ° C av önskad temperatur.
      Obs: Variabilitet inom en zon oftast eftersom de exakta avstånd av de två platserna till kanten av aluminium block inte är identiska. Justera positionen för plattan på aluminium block för att se till att midlines av de första och sista zonerna närmast varje kant exakt matchar kanterna på två sida aluminium block.
   8. Om den uppmätta temperatur lutningen avviker från den önska lutningen, justera den vatten bad temperatur setting(s) och dubbelgranska yttemperaturen efter temperaturen i vatten Baden stabilize(s).
   9. Täcka block med en kartong tills början av analysen.

4. larval insamling och tvätt

1. Isolera ren larver (alternativ 1)
   1. Tillsätt ~ 40 mL 18% sackaroslösning i en 50 mL rör. Scoop alla larver från mat vaccinkoncentratet med scoopula och överföring till 18% sackaros lösningen.
   2. Blanda noga men försiktigt med en scoopula att skilja larverna från mat skräp. Vänta 30-60 s tills larverna flottören till det översta lagret av röret. Häll det översta lagret som innehåller larver (~ 10 mL) till en annan 50 mL-röret och fyll röret med färska 18% sackaroslösning. Vänta 30-60 s tills larverna flottören till det översta lagret igen.
      Obs: Stora matrester ibland överföra tillsammans med larver och kan påverka larval thermotaxis om de inte avlägsnas. Om stora matrester kvar i det översta lagret, upprepa steg 4.1.1-4.1.2 eller manuellt ta bort dem med en scoopula.
   3. Överföra det översta lagret av larver (~ 10 mL) till två andra 50 mL rör och fyll två rören med destillerat vatten för att minska sackaroshalten, så att larverna snabbt sjunker i vatten. Vänta 30-60 s tills larverna sjunka till botten. Utför detta och följande steg så snabbt som möjligt för att förhindra larverna från att drunkna.
   4. Kassera så mycket av vattnet som möjligt genom att försiktigt luta rören. Kombinera larver i ett rör genom att hälla ut larver med kvarvarande vatten och fyll röret med destillerat vatten.
   5. Vänta 30-60 s tills alla larverna sjunka ner och ta bort så mycket vatten som möjligt genom att försiktigt luta rören. Upprepa detta tvätt steg 2 - 4 gånger att helt ta bort sackaros och alla synliga mat.
   6. Kasta så mycket av vattnet som möjligt och överföra larverna till en tom 35 mm petriskål genom dekantering. Spraya röret med vatten och Använd en liten pensel för att överföring larverna.
   7. Avlägsna överskottsvatten från petriskål med en P1000 mikropipett. Lämna ~0.5 mL vatten för att förhindra uttorkning av larverna.
   8. Placera locket på skålen som hindrar att larverna flyr. Vrid locket upp och ned för att minska möjligheten för larverna att fly genom en liten lucka mellan locket och maträtt. Tillåta larverna att återvinna för 10-20 min.
2. Isolera ren larver (alternativ 2)
   Obs: Detta alternativ metod för rengöring larver mildrar möjligheten av kvävande larverna under förfarandet för tvätt. För att använda denna metod, Fortsätt med följande steg efter utföre den ovanstående steg 4.1.1-4.1.2.
   1. Placera en cell sil (300 µm, behåller larver 72 h AEL eller äldre) ovanpå en 50 mL tub.
   2. När du har bekräftat att det finns ingen vuxen organ eller matrester som flyter på ytan av sackaros lösningen, häll det översta lagret som innehåller larver genom silen att fälla alla larver på skärmen mesh. Tvätta larvaena noggrant med destillerat vatten tills 50 mL röret fylls.
   3. Ta bort cellen silen med larver och kassera det använda vattnet från röret. Placera silen som innehåller larver ovanpå tom röret och tvätta larvaena igen med destillerat vatten tills 50 mL röret fylls.
   4. Upp och ner vänd en tom 35 mm petriskål silen och spruta vatten från toppen av cell silen överföra larverna till petriskål. Överföra de återstående larver med en liten pensel.
   5. Fortsätt till steg 4.1.7 ovanför innan du fortsätter till steg 5.

5. analys och beräkning

1. Ta bort kartongen och kontrollera gel yttemperaturen omedelbart innan du överför larverna till plattan. Minimera den tid som kartong är öppen att förhindra störa den temperatur Jämviktstiden. Om ytan är torr, spraya en liten mängd vatten på ytan.
2. Distribuera 150 ± 50 larver nära mitten av varje tallrik (mellan zon 3 och 4 av de 6 zonerna) för single-directional övertoningen (release zon; Figur 2 c).
   Obs: För dubbelriktad övertoningen, fördela 200-400 larver längs den mellersta zonen på varje halva (figur 2D).
3. Placera mikroplattan lock över varje assay platta att förhindra att larverna kryper ut. Täcka setup med en kartong att förhindra ljusexponering, som kan påverka larval val på agarosgel.
   Obs: För dubbelriktad övertoningen, bör det inte vara nödvändigt för att täcka plattan med lock, eftersom plattan är större, och larverna Rekommenderad temperatur är i den mellersta zonen. Följaktligen, några larver ackumuleras i kanterna och har möjlighet att krypa ut.
4. Gör analysen att fortsätta för 10-30 min för singel-directional toningen och för 15-35 min för dubbelriktad övertoningen, beroende på ålder av larverna (tabell 4).
5. Ta bort kartongen och mikroplattan locket. Fotografera plattorna från ovan med en digitalkamera. Ta två fotografier av varje assay platta så att utredaren kan välja en med bättre kontrast och ljusstyrka för analys.
6. Ta bort alla larver från assay plattorna och var som helst utanför plattorna av aspiration.
7. Ren plattorna assay, rören och cell silen noggrant med destillerat vatten. Återanvända assay plattorna förberedd den dagen om inte ytan Agarens är skadad.
8. Beräkna den procentuella fördelningen av larver i varje zon.
   1. Öppna den fotografiska bilden av analysens resultat använda någon programvara som gör att lägga till markeringar i bilden. För att indikera zonerna assay, rita vertikala linjer var 2 cm baserat på avgränsningarna på assay plattan.
   2. Räkna antalet larver i varje zon och spela in siffrorna. Räknas inte larver i regioner 0,5 cm från någon av väggarna. Gelen är tjockare nära väggarna, och yttemperaturen är inte linjär i dessa regioner.
   3. För singel-directional övertoningen, beräkna den procentuella fördelningen i varje zon enligt följande:
      (antal larver i en viss zon 2-cm) / (totalt antal larver i 6 zoner) x 100.
   4. För dubbelriktade övertoningen, beräkna den procentuella fördelningen i varje zon enligt följande:
      (antal larver i en viss zon 2-cm) / (totalt antal larver i 5 zoner på varje sida av övertoningen) x 100.

Representative Results

För att upprätta en 18 ° C till 28 ° C singel-directional gradient, vi satt av två vattenbad temperatur till 16,8 ° C och 31 ° C. Vi få temperaturer på 13 punkter genom att mäta temperaturen på 26 positioner inom de övre och nedre delarna av alla 6 zoner, kantlinjerna mellan zonerna, och i den yttersta ändar av agaros gel ytan (figur 2 c, 2E). Temperaturfördelningen längs lutningen var nästan linjär (Y = 0.9672 * X + 16.19, R² = 0.9961) (figur 2E).

Vi analyseras temperatur preferenser kontroll (w¹¹¹⁸) larver i olika åldrar. 1^st (24 ± 1,5 h AEL), 2^nd (48 ± 1,5 h AEL) och tidig-3^rd larver (72 ± 1,5 h) visade toppar i zonen 24 ° C (figur 3A, B). Temperatur preferenser ändrats under 3^rd instar larval utveckling. Den största procentandelen av mid-3^rd instar (96 ± 1,5 h AEL) samlade i zonen 18 ° C (figur 3A, B), och denna bias ökade med åldern. Bland sena-3^rd instar larver (före klättring; 120 ± 1,5 h AEL), ~ 50% grupperade i zonen 18 ° C, och denna temperatur var ~ 4-fold högre än zonen intill 20 ° C (18 ° C-zon, 50,2%; 20 ° C-zon, 15,1%; Figur 3A ” B). Den benägenhet att ansamlas i zonen 18 ° C i w¹¹¹⁸ berodde inte på en kant effekt eftersom sena-3^rd instar larver fortfarande ackumuleras i zonen 18 ° C, med hjälp av en dubbelriktad temperaturgradient (figur 3E, F ).

Vi testade också sent-3^rd instar larver (120 ± 1,5 h AEL) med mutationer i gener som krävs för diskriminerande temperaturskillnader i intervallet bekväma. Dessa inkluderar trpA1, vilket krävs för normal temperatur urval i 18 ° C - 24 ° C intervall^5,7,8. Larver med en null mutationen i trpA1 (trpA1¹) fördela lika över hela 18 ° C – 28 ° C gradient (figur 3 c). Larver som saknade bara de A och B isoformerna (trpA1-AB^G4), eller de C och D isoformerna (trpA1-CD^G4) också Visa allvarliga försämringar (figur 3 c). Flugor koda två isoformer av fosfolipas Cβ (PLC21C och NORPA) och mutationer som påverkar norpA (norpA^P24) men inte plc21c (plc21c^P319) också störa ackumulering i intervallet 18 ° C ( Figur 3D).

Figur 1. Apparater för att utföra den enda-directional temperaturgradient analysen. (A) en aluminium testa plattan används för testmetoder larval thermotaxis beteende. De 13 svarta linjerna på toppen och botten avgränsa 12 zoner (10 mm varje). Botten av plattan är anodiserad med svart färg så att det är lättare att visualisera larverna. (B) dimensioner av aluminium plattan (anges i mm). Aluminium plattan yttre storlek är 140 x 100 x 9 mm. Den inre storleken av aluminium plattan är 130 x 90 x 8 mm. Avgränsningarna är åtskilda av 10 mm. Första och sista avgränsningen är 5 mm från kanterna på det inre området av plattan. (C) topp och sidoutsikt över en av aluminium block för att styra temperaturen i övertoningen. Blocket har två kontakter används för att fästa till kisel rör, som ansluter till ett vattenbad. (D) dimensioner av aluminiumblock. Yttre storlek av aluminiumblock är 255 x 50 x 14 mm. Diameter inre vatten sökvägen är 7 mm. Två 30 mm kontakter till vänster kontakt med silicon slangar som sträcker sig till vattenbadet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Enkel- och dubbelriktad gradient assay uppställningar. (A) Single-directional lutning setup med två assay aluminiumplattor på två aluminium block. Temperaturen i aluminium block styrs av cirkulerande vatten från två vattenbad. (B) ordningen av de tre aluminium block, vattenbad och en aluminiumplåt (250 x 220 mm) för en dubbelriktad gradient. Vänster och höger block är anslutna till samma vattenbadet och mellersta blocket är ansluten till andra vattenbadet. Aluminium assay plattan är insvept med tejp för att bilda en 10 mm vägg för att innehålla den 1% agarosen. (C) positioner att kontrollera temperaturer (indikeras av prickar) och att släppa larver på plattan. Innan ett experiment, kontrollera temperaturen på två punkter inom varje zon att bekräfta att den önskade linjär temperaturgradient är etablerad. Larverna frigörs inom det angivna området nära mittlinjen. Larverna räknas inom de 2-cm-zonerna. (D) positioner för att kontrollera temperaturer (indikeras av prickar) och release zonerna för larverna på en dubbelriktad gradient. Ett lika stort antal larver frigörs längs mittlinjen på varje halva av dubbelriktad gradient. Numrerar av larver räknas i varje av 10 (2 cm) zoner. En typisk uppsättning temperaturer (18 ° C – 26 ° C) på agaros ytan är indicerat. (E) temperaturer mäts längs gränsen linjer och midlines för varje zon i en prov singel-directional övertoning. Uppgifterna representerar medeltemperatur ± SD. n = 8 analyser (150 ± 50 larver/analys). Delar av denna siffra återges från Sokabe et al. ⁸ med smärre ändringar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. Representativa resultat använder single-directional och dubbelriktad gradient analyser. (A, B) Menar procentsatser av larver i 6 zoner på singel-directional övertoningen. Data inkluderar 3^rd instar larver på de angivna timmarna efter värpning (AEL). n = 6-7. Felstaplar i ett representerar ±SEM. (C) termisk distributioner av före klättring sent-3^rd instar larver av kontroll (w¹¹¹⁸) och trpA1 mutanter på singel-directional övertoningen. n = 3-4. Felstaplar representera ±SEM. (D) termisk distributioner av sena-3^rd instar larver av kontroll (w¹¹¹⁸) och PLCβ mutanter på singel-directional övertoningen. n = 4-6. Felstaplar representera ±SEM (E) representativ fördelning före klättring, sena-3^rd instar larver (w¹¹¹⁸) på dubbelriktad gradient. Vänster och höger assay zonerna är indikeras med streckade linjer och åtskilda av zonen nr-count i mitten (skuggade regionen). (F) andelen före klättring sent-3^rd instar larver (w¹¹¹⁸) i varje zon längs termisk gradient. Larverna placerades i vänster och höger släppa zoner. Zonerna analysen avgränsas med en 3 cm nr-räkna zon i mitten och fördelningarna beräknas självständigt. Felstaplar representera SEMs. n = 3 analyser (200-400 larver/analys). Delar av denna siffra återges från Sokabe et al. ⁸ med smärre ändringar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Timmar AEL	Larvstadium
24	1st instar
48	2nd instar
72	Tidig-3rd instar
96	Mitten av-3rd instar
120	Sent-3rd instar, strax innan klättring scenen

Tabell 1. Förhållandet mellan timmarna efter värpning (AEL) och larval arrangerar.

Temperaturgradient på agaros tallrik (lutning)	Temperaturer på vattenbad	Temperaturer på aluminium block
10,0-25,0 ° C (1,5 ° C/cm)	~6.5-7°C/~28.5°C	~8.5°C/~26.8°C
18,0-28,0 ° C (1° C/cm)	~16.8°C/~31.0°C	~17.8°C/~29.7°C
14,0-34,0 ° C (2° C/cm)	~10.0°C/~40.0°C	~11.8°C/~36.8°C
12,5-42,0 ° C (2,95 ° C/cm)	~7.0°C/~55.0°C	~9.4°C/~49.4°C

Tabell 2. Typiska temperaturgradienter och motsvarande temperaturer av vattenbad och aluminium block för enda riktad övertoningar.

Temperaturgradient på agaros tallrik	Temperaturer på vattenbad	Temperaturer på aluminium block
22-10-22 ° C (1,5 ° C/cm)	~5.0°C /~25.0°C	~7.5°C/~24.0°C
26-18-26 ° C (1° C/cm)	~15.8°C /~30.6°C	~16.9°C/~28.4°C
30-14-30 ° C (2° C/cm)	~8.5°C /~36.4°C	~10.9°C/~32.8°C
36-12,5-36 ° C (2,95 ° C/cm)	~5.0°C /~47.2°C	~7.9°C/~40.9°C

Tabell 3. Typiska temperaturgradienter och motsvarande temperaturer av vattenbad och aluminium block för dubbelriktad övertoningar.

Larval ålder (AEL)	Analysens gång (enda directional)	Analysens gång (dubbelriktad)
24 h	30 min	35 min
48 h	22 min	27 min
72 h	16 min	21 min
96 h	13 min	18 min
120 h	10 min	15 min

Tabell 4. Olika larver åldrar (AEL) och motsvarande assay gånger.

Discussion

För att säkerställa framgången för detta protokoll, är det viktigt att vidta åtgärder för att erhålla ett tillräckligt antal larver att utföra experimenten. Dessa inkluderar före utfodring flugorna i jäst pasta-innehållande injektionsflaskor för 2-3 d att förbättra äggläggning. Injektionsflaskorna måste placeras i ett tråg innehållande vatten flaskor och inneslutna i en genomskinlig plast påse, som bibehåller fukten i maten och främjar effektiv utfodring av larver medan tillåter exponering för normal ljus-mörker cyklerna. Den jäst pastan bör dock inte så mjuka att flugorna blir instängda. Antalet kvinnor per injektionsflaska beror på genotypen. När det gäller w¹¹¹⁸är det oftast lämpligt att tillåta ~ 12 honor och ~ 6 hanar att lägga ägg för 3 h. Två injektionsflaskor ger normalt tillräckligt larver (100-200 larver) att placera på en tallrik för singel-directional analysen. Om flyga beståndet lägger färre ägg än vildtyp eller andelen larverna som kläcks reduceras, lägga till och ytterligare hondjur (upp till 30-35/injektionsflaska).

Det finns många orsaker till oavsiktliga variabilitet när du utför dessa analyser. Utvecklingsstadiet påverkar temperaturen preferensen av larverna. Därför är det absolut nödvändigt att noggrant använda larver av en definierad scenen. Till gör så, samla larver över en smal tidsperiod (t.ex. 3 h). Eftersom uppfödning förhållanden (temperatur, fuktighet, ljus-mörker cykel och typ av mat) och vissa mutationer påverkar utvecklingstakten, lita inte strikt på tiden efter värpning för att analysera comparably åldern larver. Det är också viktigt att undersöka fysiska drag, såsom storleken av munnen krokar och externa⁷ att avgöra om larver av olika genotyper på samma utvecklingsstadiet. Tider för 1^st, 2^nd och 3^rd instar larver att utveckla (tabell 1) baseras på med hjälp av majsmjöl-baserad mat och inkubation vid 25 ° C under 12 h ljus: 12 h mörka cykler. Larverna växer långsammare på melass-baserade livsmedel. Ordentlig hydration och mat färskhet påverkar även tillväxten av larver. Mängden vatten i maten bör lämna maten varken för torr att skala tillbaka från injektionsflaskan eller för löst på grund av överdriven vatten. Idealiskt, ~ 5 mm lagret närmast mat ytan är villkorat av växande larver och rör sig lätt när injektionsflaskan lutas eller knackade. Detta villkor kan uppnås med nylagad mat med 50-100 larver.

Det är viktigt att etablera en stabil temperaturgradient innan analysen. Därför vända på vattenbadet 1-2 h före inleda analysen, eftersom den vatten bad producera värme och kan ändras av omgivningens temperatur, vilket i sin tur har potential att påverka lutningen. Efter 1-2 h balanserar omgivningstemperaturen i mest luftkonditionerade rum. Detta måste dock fastställas i varje miljö. Dessutom, när du genererar en övertoning med ett stort temperaturområde (> 3,0 ° C cm), kan det vara svårt att få en stabil övertoning. En liten rörelse av assay plattan mer påtagligt ändrar temperaturlutning när utbudet är stort (t.ex. > 3,0 ° C/cm). Vi hittade att en 1-2 ° C cm lutning ger de mest stabila Övertoningarna.

I området i närheten finns det flera ytterligare överväganden som behöver styras för att begränsa variabilitet i de thermotaxis analyserna. Tvätta larverna är kritisk, eftersom förekomsten av matrester eller sackaros på larverna kan påverka analysen. Tvätt stegen måste utföras grundligt men snabbt, eftersom att begränsa deras syretillförsel överdrivet medan de är nedsänkt i vatten kan påverka deras hälsa. Därför rekommenderar vi använder cell silen (alternativ 2) för att rengöra larverna. En sil med en porstorlek på 300 µm fungerar bra för larver på tidig-3^rd instar scenen (72 h AEL) eller äldre. Dessutom är det viktigt att utföra experiment på samma tid på dagen, såsom från Zeitgeber tid (ZT) ZT4 till ZT8 (ZT = 0 är när tänds), att begränsa variationen på grund av effekterna av dygnsrytmen på temperatur urval. Fuktnivån på agaros plattan kan också orsaka variationer i resultaten. Medan ytan av plattorna måste vara fuktig, kunde vattendroppar fälla larverna, och därför måste undvikas.

Begränsa variabilitet i analyserna kommer att göra det möjligt att få stabila resultat utan att utföra ett stort antal oberoende experiment. 3-8 oberoende experiment är oftast tillräckligt för att få ett tillförlitligt resultat. Ordentlig tabellering av resultaten är också avgörande för framgången av de thermotaxis analyserna. Räknas inte larver distribueras i regionerna inom 0,5 cm från aluminium väggar, eftersom temperaturerna inte är linjär i dessa regioner. Vissa larver kommer att placeras vid gränsen mellan två zoner, vid analysen slutförs. Om mer än 50% av kroppslängden är bosatt i en zon, då inkludera larven i tabellen för den zonen. Om en larv är exakt 50% i minst två zoner, då räknas djuret som 0,5 larver i varje zon.

Med lutning analysen kan larverna att diskriminera en rad temperaturskillnader, finns det begränsningar till de nedre och övre temperaturerna som effektivt kan testas. Det är inte möjligt att testa temperaturer < 10 ° C sedan larverna rörlighet minskar kraftigt vid lägre temperaturer. Även övertoningar med övre temperaturen når 42 ° C kan fastställas, nästan ingen kontroll larver bo i någon zon > 28 ° C. Därför kontinuerlig gradient analyser kan inte användas för att diskriminera temperatur inställningar mellan olika zoner > 28 ° C. Gradient analyser vid dessa förhöjda temperaturer skulle dock kunna användas att karakterisera mutanter om de har mycket skiftade varm temperatur inställningar.

Om en mutant har en rörelseapparaten defekt, kan det nödvändigt att utföra ytterligare experiment för att se till att inställningen skenbar temperatur inte är felaktig på grund av en rörelse leverfunktion. För att åtgärda detta potentiella problem, kan det vara nödvändigt att fastställa längre assay gånger att låta djuren ytterligare tid att flytta till sin önskade zoner. Dubbelriktad gradient analysen kan också användas för att testa om djuren väljer samma Rekommenderad zon, oavsett där de placeras först på tallriken.

Sammanfattningsvis, har gradient analyserna beskrivs här fördelar jämfört med andra thermotaxis analyser. Medan tvåvägs val analyser är användbara, eftersom de kan ge robusta resultat, särskilt när temperaturskillnaderna mellan de två områdena är stora, är de inte effektiv i avslöjar en idealisk temperatur program av larver i ett enda experiment. För att göra detta kräver utför många tvåvägs val kombinationer för att bestämma den mest föredragna temperatur^5,6,7. Däremot ger gradient analysen djuret en möjlighet att välja sin Rekommenderad temperatur zon i en miljö med en enda kontinuerlig temperatur landskap. Därför är det onödigt att utforma en stor kombination av tvåvägs val att bestämma den föredragna termisk miljön. Studera thermotaxis med en rund petriskål har varit anställd att bedöma effekterna av temperatur på rörliga dynamiken i en larv¹⁰. Det är dock mindre användbart i diskriminera mellan inställningar mellan olika temperaturer, eftersom varje zon är en annan storlek. Slutligen, på grund av enkelheten i analysen, och dess nytta i diskriminerande små temperatur-inställningar i en enda analys, det kan användas till skärmen dussintals kandidatgener som är potentiellt inblandade i larval temperatur inställning som kan annars vara förbisedd använda andra analyser

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gradient assay apparatus
PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath	Thomas Scientific	9106	This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz.
Aluminum assay plate (for single directional gradient)			Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized.
Aluminum plate (for bidirectional gradient)			25 x 22 x 0.2 cm, black anodized.
Aluminum block			Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D.
Connector for aluminum blocks and tubing	McMaster-Carr	91355K82
Tygon Sanitary Silicone Tubing	Tygon	57296	1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall
Name	Company	Catalog Number	Comments
Items and reagents for assay
Pestle	USA Scientific	17361	Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes
Thermometer	Fluke	51II
Thermocouple	Fluke	K type
Universal microplate lid	Corning	6980A77
35 mm dish	Corning	9380D40
Labeling tape (for bidirectional gradient)	Fisher Scientific	15-951	Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds
Agarose	Invitrogen	16500500	Prepare 1% solution
Sucrose	Sigma	S0389-5KG	Prepare 18% solution right before starting assay
Paint brush	Fisher Scientific	11860
50 mL centrifuge tubes	Denville	C1062-P
Scoopula	Fisher Scientific	14-357Q
500 mL round wide-mouth bottle	Pyrex	1395-500
Cell strainer (300 mm pore)	PluriSelect	43-50300	Optional item for larvae washing
Cardboard box (vial tray)	Genesee Scientific	FS32-124
Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila food
Distilled water			22,400 mL
Cornmeal, yellow (extra fine mesh,flocked) 20 kg	LabScientific Inc.	NC0535320	1,609 g
Brewers yeast 100 lbs	MP Biomedicals	ICN90331280	379 g
NutriSoy® Soy Flour (10 kg/unit)	Genesee Scientific	62-115	221 g
Drosophila Agar, Type II (5 kg)	Genesee Scientific	66-103	190 g
Karo light corn syrup	Karo		1,700 mL
Methyl 4-hydroxybenzoate (suspend in 200 proof ethanol)	Sigma Aldrich	H5501-5KG	72 g/240 mL
Propionic acid puriss. p.a.,>99.5% (GC)	Sigma Aldrich	81910-1 L	108 mL
Phosphoric acid ACS reagent, ≥85 wt. % in H2O	Sigma Aldrich	438081-500 mL	8.5 mL