Voor een efficiënte controle van mug virusverspreiding gedragen, is de kennis van het potentieel van de vector van respectieve muggen van bijzonder belang. Beschrijven we gedwongen speekselvloed als een methode voor het analyseren van vector bevoegdheid van Aedes albopictus en drie verschillende Culex taxa voordeoverdracht van Zika-virus.
Bevoegdheid van de vector is gedefinieerd als het potentieel van een mug soort te zenden een muggen overgebrachte virus (mobovirus) naar een gewervelde host. Levensvatbare virusdeeltjes worden verzonden tijdens een maaltijd van bloed via het speeksel van een besmette mug. Gedwongen speekselvloed testen laten bepalen de vectorpotentiaal op basis van één muggen, het vermijden van het gebruik van dierproeven. De methode is geschikt voor het analyseren van een groot aantal muggen in één experiment binnen een korte periode van tijd. Gedwongen speekselvloed assays werden gebruikt voor het analyseren van 856 individuele muggen gevangen in Duitsland, waaronder twee verschillende Culex pipiens pipiens biotypes, Culex torrentium evenals Aedes albopictus, die experimenteel besmet waren met Zika-virus (ZIKV) en bebroede bij 18 ° C of 27 ° C gedurende twee tot drie weken. De resultaten aangegeven vector bevoegdheid van de verschillende Culex taxa voor ZIKV. Aedes albopictus werd daarentegen gevoelig voor ZIKV, maar alleen bij 27 ° C, met transmissiesnelheden vergelijkbaar met een kolonie van Aedes aegypti laboratorium getest in parallel.
In 2015, Zika-virus (ZIKV), een muggen overgebrachte virus (mobovirus) behoort tot de familie Flavivirus, ontstaan in Columbia en Brazilië en snel verspreid over Amerika en het Caribisch gebied, waardoor er een epidemie met bekende nummers van geassocieerde klinische gevallen van microcefalie en Guillain-Barré syndroom1. Muggen van de soort Aedes aegypti en Aedes albopictus worden beschouwd als de primaire en secundaire vectoren van ZIKV2, maar andere soorten van het geslacht Aedes hebben ook bewezen experimentele vector bevoegd3 . In tegenstelling tot de Aedes -soorten zijn de meeste van de Culex soorten getest tot nu toe niet kundig voor zenden de virus4. De gegevens voor Culex quinquefasciatus verstrekt slechts, twijfelachtige resultaten3. Op dit moment ontbreekt informatie over mosquito vector bevoegdheid voor ZIKV onder gematigde temperatuursomstandigheden (< 20 ° C). Deze informatie is echter aanzienlijk voor de risico-evaluatie van mogelijke uitspreidt aan regio's met een gematigd klimaat zoals Midden-Europa.
Een bevoegde vector voor de ZIKV staat te verwerven, te handhaven, te versterken en ten slotte het doorgeven van het virus. Daarom, het testen van de mosquito kadavers of delen van de organen, met inbegrip van de benen, middendarm, head of speekselklieren, voor ZIKV is niet volstaat het te bepalen van de bevoegdheid van de vector. Het is verplicht om te testen voor besmettelijke virusdeeltjes binnen vrijgegeven speeksel. Om te beoordelen vector bevoegdheid, zowel besmettingstarief (IR, aantal ZIKV-positieve mug instanties per aantal overvuld muggen) en transmissiesnelheid (TR), aantal muggen met ZIKV-positieve speeksel per aantal ZIKV-positieve mug organen, moet worden bepaald. IRs van muggen kan gemakkelijk worden geanalyseerd door gewoon homogenisator muggen, gevolgd door een reverse-transcriptase real-time polymerasekettingreactie (RT-qPCR) gericht op ZIKV. Bovendien kan de infectie verder worden gekarakteriseerd door het bepalen van de aantallen van de virale kopie per mug. In tegenstelling, berust de analyse van transmissiesnelheden op de detectie van levensvatbare virusdeeltjes in het speeksel van individuele muggen. Dit kan worden bereikt door het eten van besmette muggen op gastheer voor de ziekte vatbare dieren, gevolgd door de analyse van de voorjaarsviremie in de host-5. Echter deze methode berust op geschikt modelorganismen, en is duur en beperkt door dierenwelzijn verordeningen. Om te voorkomen dat het gebruik van proefdieren voor het analyseren van transmissiesnelheden en kosten te verlagen, met behulp van druppels zijn bloed op kunstmatige opnieuw voedersystemen6zijn beschreven. Testen op individuele schaal gecombineerd met een groot aantal personen is echter moeilijk en tijdrovend. De eerste beschrijving van een bepaling van de speekselvloed op individuele schaal werd gepubliceerd in 19667 en tijdens de afgelopen jaren gedwongen speekselvloed experimenten zijn geworden de methode van keuze voor de evaluatie van de bevoegdheid van de vector van muggen3,8 .
Gebaseerd op onze vector bevoegdheid studie van Centraal-Europese muggen onlangs gepubliceerd9, zoals gerapporteerd door Anderson et al.beschrijven we gedwongen speekselvloed. 8 met enkele wijzigingen. Met deze methode kunt hoge doorvoer gestandaardiseerd experimenten onder hoge bioveiligheid niveau voorwaarden (BSL-3) en omvat de identificatie van actieve virus door cel cultuur gebaseerd testen. De hier beschreven experimenten omvatten 856 muggen. Ze waren geïnfecteerd met ZIKV door kunstmatige bloedmeel en vervolgens geanalyseerd voor de aanwezigheid van besmettelijke virusdeeltjes in het speeksel. De muggen die de experimenten bestond uit twee reeds lang bestaande laboratorium populaties van Ae. aegypti en Culex pipiens pipiens biotype molestus (Cx. p. molestus), evenals veld binnengebracht gevangen Culex pipiens pipiens pipiens biotype (Cx. p. pipiens), Culex torrentium (Cx. torrentium) en twee Ae. albopictus populaties. Met uitzondering van één van de twee Ae. albopictus populaties, die werd verzameld in Italië, waren alle muggen verzamelde in Duitsland.
Het is eerder aangetoond dat de resultaten verkregen met gedwongen speekselvloed klassieke opnieuw voeding experimenten6stroken. Voor opnieuw het voederen van experimenten zowel in onze voorgestelde methode van gedwongen speekselvloed, is het echter onmogelijk om direct bewijs speekselvloed activiteit of controleren de release van speeksel. Om te bewijzen speekselvloed activiteit, monsters kunnen worden getest, andere onderdelen aanwezig in het speeksel (bv., eiwitten, koolhydraten, enz.). Bovendien zou de extra qPCRs detectie van virale RNA exemplaren. Dit vereist echter splitsing van speeksel monsters voor diverse analyses, die gevoeligheid in de cel cultuur bepaling in geval van zeer lage deeltje nummers kunnen beperken. Beurtelings, kan dit leiden tot een onderschatting van de vastberaden transmissiesnelheden.
Reproduceerbare resultaten is het noodzakelijk om ervoor te zorgen dat alle muggen leven tot het einde van het experiment blijven. Dit wordt geregeld door visueel bewakingsactiviteit het lichaam beweging van de muggen. Bovendien heeft het gebruik van het beginsel van de speekselvloed assay voor een bepaalde mug soort te worden getest door het voeren van bestrijding virussen, waarvan bekend is dat door deze specifieke mug soort toegezonden. Omgekeerd, moet elke virus binnengebracht van een experiment worden getest in een gevoelig mug.
Gedwongen speekselvloed testen hebben veel voordelen. Groot aantal muggen kan gelijktijdig worden getest op een enkel exemplaar basis onder gecontroleerde gestandaardiseerde omstandigheden zonder conflict met het welzijn van dieren verordeningen9.
De methode wordt gebruikt door verschillende laboratoria. Exacte opstellingen kunnen echter verschillen, die kan leiden tot verschillen in resultaten tussen laboratoria. Een kritische component is het capillair te verzamelen van het speeksel, die kan worden gemaakt van glas14 of kunststof15. Om te voldoen aan de hoge veiligheidsnormen van een bioveiligheid niveau 3 insectary, gebruikten we plastic filter tips in plaats van glas haarvaten, waardoor het risico van letsel. Filter tips hebben bovendien het voordeel dat de verzamelde vloeistof gemakkelijk kan worden overgedragen met behulp van een precisiepipet.
De installatie van de bepaling van de gedwongen speekselvloed hier gepresenteerd is gebaseerd op twee onderzoekers samenwerken en het delen van taken. Demobilisatie van de mug wordt uitgevoerd door één persoon, terwijl anderzijds tegelijkertijd de gedwongen speekselvloed setup bereidt. Dit aanzienlijk vermindert de verwerkingstijd en minimaliseert het risico van monster schakelen als het veranderen tussen de demobilisatie-werkplek en de speekselvloed-plaat is niet nodig. Bovendien kan het plaatsen van de muggen op het gedwongen speekselvloed apparaat onmiddellijk na demobilisatie. Dit vrij kort mug verwerkingstijd is essentieel voor succesvolle gedwongen speekselvloed. Tot slot, de muggen kunnen rechtstreeks worden gecontroleerd voor motiliteit gedurende het hele experiment.
De bepaling van de speekselvloed gepresenteerde wordt inzichten te krijgen in de vectorpotentiaal mug soorten gebruikt. Echter sommige andere specifieke vragen te beantwoorden (bv., de nummers van muggenbeten die nodig zijn om te besmetten gewervelden), dierlijke experimenten kunnen nog steeds worden vereist.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Ella Weinert, Michelle Helms en Marlis Badusche voor uitstekende technische bijstand, Jessica Börstler voor analyse van muggen Culex , Norbert Becker en Björn Pluskota voor het verstrekken van Aedes albopictus eieren en Olli Vapalahti voor het verstrekken van de voorraad van het virus. ML werd ondersteund door de vereniging van Leibniz; verlenen nummer SAW-2014-SGN-3.
Inject+matic Sleeper | Inject+matic | ||
Bugdorm-1 Insect Rearing Cage | BugDorm Store | ||
Drosophila cultivation tubes | carl roth | PK11.2 | plastic vial for mosquitoes |
Plug for drosophila cultivation tubes | carl roth | PK15.1 | |
Constant climate chamber | Binder | KBF-240 | |
Blood | banked human blood, expired, not usable for medical application | ||
Dumont-Pincette Electronic SS | Dumont | B40c | |
Vero cells | BNITM | ||
Flash light aspirator | Bioquip | 2809 | |
double-sided adhesive tape | no specific provider | ||
Gammex Powder-free gloves with AMT | Ansell | for safety reasons necessary during work with pricks in the BSL3 laboratory | |
RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit | altona diagnostics | 591013 | |
MagMax Pathogen RNA/DNA Kit | Thermo fisher scientific | 4462359 | RNA isolation of mosquito bodies |
Qiamp viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52906 | RNA-Isolation of supernatant |
filter tips (20 µL) | Sarstedt | 701,116,210 | Cut the first 3 mm of the tip |
hand motor mixer | carl roth | sold out | |
micro pestles for hand motor mixer | carl roth | CXH8.1 | |
DMEM | P0403550 | ||
L Glutamine Penicilin/Streptomycin | PAN | P0819100 | |
Amphotericin B | PAN | P06-0110 | |
Fructose | carl roth | 4981.5 | |
Phosphate buffered saline | PAN | P04-36500 | |
FBS | PAN | ||
Sodium Pyruvat | PAN | P0443100 | |
MEM NAA | PAN | P0832100 | |
Hemotek Feeder | Hemotek | PS6 | |
Light Cycler | Roche | 480 II | |
Light Cycler Software | Roche | 480 SW 1.5.1 | |
Modeling clay | no specific provider | ||
King Fisher Flex Purification System | ThermoFisher scientific | ||
Aedes albopictus | eggs were collected in Freiburg, Germany | ||
Binocular | MOTIC | SMZ-168 | |
Binocular light | MOTIC | MLC-150C | |
CO2-Incubator | Thermo scientific | MIDI 40 |