For effektiv kontroll av mygg borne virus smitte, er kunnskap om vektor potensialet i respektive mygg av spesiell interesse. Vi beskriver tvunget spyttsekresjon som metode for å analysere vektor kompetanse Aedes albopictus og tre forskjellige Culex taxa for overføring av Zika virus.
Vector kompetanse er definert som potensialet i en mygg Art å overføre mygg-borne virus (mobovirus) til en virveldyr vert. Levedyktig viruspartikler overføres under en blod måltid via spytt av en infisert mygg. Tvunget spyttsekresjon analyser tillater fastsetting vektor potensial på grunnlag av enkelt mygg, unngå bruk av dyreforsøk. Metoden er egnet til å analysere mange mygg i ett eksperiment innen en kort tidsperiode. Tvunget spyttsekresjon analyser ble brukt til å analysere 856 personlige mygg fanget i Tyskland, inkludert to ulike Culex pipiens pipiens biotypes, Culex torrentium samt Aedes albopictus, som var eksperimentelt infisert med Zika virus (ZIKV) og inkubert 18 ° C eller 27 ° C i to og tre uker. Resultatene indikerte mangel på vektor kompetansen til de forskjellige Culex taxa for ZIKV. Kontrast ble Aedes albopictus utsatt for ZIKV, men bare ved 27 ° C, med overføringshastigheter som ligner en Aedes aegypti laboratorium koloni testet parallelt.
I 2015, Zika virus (ZIKV), en mygg-borne virus (mobovirus) tilhører familien Flaviviridae, dukket opp i Columbia og Brasil og spres raskt over Amerika og Karibien, forårsaker en epidemi med kjente antall forbundet kliniske tilfeller av microcephaly og Guillain-Barrés syndrom1. Mygg av arten Aedes aegypti og Aedes albopictus regnes primære og sekundære vektorer av ZIKV2, men andre arter av slekten Aedes har også vist seg for å ha eksperimentelle vektor kompetanse3 . I motsetning til Aedes arter kan de fleste Culex arter testet så langt ikke overføre virus4. Bare, gitt data for Culex quinquefasciatus svar3. Foreløpig informasjon mangler på mygg vektor kompetanse for ZIKV under moderate temperaturer (< 20 ° C). Denne informasjonen er imidlertid betydelig for risikovurderinger av mulig sprer regioner med temperert klima som Sentral-Europa.
En kompetent vektor ZIKV er kjøpedyktig skaffe, vedlikeholde, forsterke og til slutt overføre viruset. Derfor er testing mygg organer eller deler av organer, inkludert beina, midttarmen, hodet eller spyttkjertler, for ZIKV ikke tilstrekkelig til å fastslå vektor kompetanse. Det er obligatorisk å teste infeksiøse viruspartikler innen utgitt spytt. For å vurdere vektor kompetanse, både infeksjon rate (IR, antall ZIKV-positive mygg organer per antall engorged mygg) og overføringshastighet (TR, antall mygg med ZIKV-positive spytt per antall ZIKV-positive mygg organer), må bestemt. IRs med mygg lett kan analyseres av bare homogenisere mygg etterfulgt av en revers transkriptase sanntids polymerasekjedereaksjons (RT-qPCR) rettet mot ZIKV. Videre kan smitte være ytterligere preget av bestemme viral kopi tallene per mygg. Derimot er analyse av overføringshastigheten avhengig av gjenkjenning av levedyktig viruspartikler i spytt av personlige mygg. Dette kan oppnås ved fôring av infiserte mygg på utsatt vert dyr, etterfulgt av analyse av viremia i vert5. Men denne metoden avhengig passende modell organismer, og og begrenset av dyr-velferd regler. Unngå bruk av forsøksdyr for å analysere overføringshastigheter og redusere kostnadene, kunstig fôring re systemer bruker blod dråper er beskrevet6. Imidlertid er testing i individuelle skala kombinert med et høyt antall personer vanskelig og tidkrevende. Den første beskrivelsen av en spyttsekresjon analysen på individuelle skala ble utgitt i 19667 og de siste årene, tvunget spyttsekresjon eksperimenter har blitt metoden for valg å evaluere vektor kompetanse mygg3,8 .
Basert på våre vektor kompetanse studie av sentraleuropeiske mygg publisert sist9, beskriver vi tvunget spyttsekresjon som rapportert av Anderson et al. 8 med noen modifikasjoner. Denne metoden tillater høy gjennomstrømning standardisert eksperimenter under høy biosikkerhet nivå forhold (BSL-3) og omfatter identifikasjon av aktiv virus ved celle kultur basert analyser. Eksperimenter beskrevet her inkluderer 856 mygg. De var infisert med ZIKV av kunstig blod måltid og deretter analysert for tilstedeværelsen av infeksiøse viruspartikler i spytt. Myggen introdusert i eksperimenter består to veletablert laboratorium befolkningen i Ae. aegypti og Culex pipiens pipiens biotype molestus (p. molestus Cx.), i tillegg til feltet fanget Culex Pipiens pipiens biotype pipiens (Cx. p. pipiens), Culex torrentium (Cx. torrentium) og to Ae. albopictus bestander. Med unntak av en av de to Ae. albopictus populasjonene, som var samlet i Italia, ble alle mygg samlet i Tyskland.
Det har tidligere vært vist at resultatene med tvungen spyttsekresjon er i tråd med klassisk re fôring eksperimenter6. Imidlertid er både nytt fôring eksperimenter og i våre presentert metoden for tvungen spyttsekresjon, det umulig å direkte bevis spyttsekresjon aktivitet eller overvåke utgivelsen av spytt. For å bevise spyttsekresjon aktivitet, prøver kunne bli testet for andre komponenter presentere i spytt (f.eks., proteiner, karbohydrater, etc.). Videre ville ytterligere qPCRs tillate oppdaging av viral RNA kopier. Dette krever imidlertid deling av spytt prøver for ulike analyser, noe som kan begrense følsomhet i celle kultur analysen ved svært lav partikkel tall. I sin tur kan dette føre til en undervurdering av de bestemt overføringshastigheter.
Reproduserbar resultatene er det nødvendig å sikre at alle mygg overleve til slutten av eksperimentet. Dette styres av visuelt overvåking kroppen bevegelse aktiviteten til myggen. Videre har prinsippet bruk av spyttsekresjon analysen for en gitt mygg Art å bli testet av fôring kontroll virus, som er kjent av denne bestemte mygg arter. Omvendt, må enhver virus introdusert i et eksperiment testes i en utsatt mygg.
Tvunget spyttsekresjon analyser har mange fordeler. Høyt antall mygg kan testes samtidig på en enkelt prøve base under kontrollerte standardisert forhold uten konflikt med dyrevelferd forskrifter9.
Metoden som brukes av flere laboratorier. Men kan nøyaktig oppsett variere, som kan føre til forskjellene i resultater mellom laboratorier. En kritisk komponent er av kapillær samle spytt, som kan være laget av glass14 eller plast15. Samsvar med høy sikkerhet forskrift av en biosafety nivå 3 insectary, brukte vi plast filter tips i stedet for glass kapillærene, dermed redusere risikoen for skader. Videre har filter tips fordelen at de samlet væsken kan enkelt overføres via en pipette.
Oppsettet av tvungen spyttsekresjon analysen presenteres her er basert på to etterforskere samarbeide og dele oppgaver. Demobilisering av av mosquito utføres av én person, mens den andre forbereder samtidig tvunget spyttsekresjon oppsettet. Dette betydelig reduserer håndtering tid og reduserer risikoen for eksempel bytte som endrer mellom demobilisering-arbeidsplassen og spyttsekresjon-platen er ikke nødvendig. Videre kan plassere myggen på tvunget spyttsekresjon enheten umiddelbart etter demobilisering. Ganske kort mygg behandlingstiden er avgjørende for vellykket tvunget spyttsekresjon. Til slutt, myggen kan være direkte kontrollert for motilitet gjennom hele eksperimentet.
Spyttsekresjon analysen presenteres her brukes til å få innsikt i vektor potensialet av mygg. Men andre spesifikke problemstillinger (f.eks., antall myggstikk som trengs for å infisere virveldyr), dyr eksperimenter kan fortsatt være nødvendig.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Ella Weinert, Michelle Helms og Marlis Badusche for utmerket kundestøtte, Jessica Börstler for analyser av Culex mygg, Norbert Becker og Björn Pluskota for å gi Aedes albopictus egg og Olli Vapalahti for gi virus aksjen. ML ble støttet av Leibniz Association; gi tall så-2014-SGN-3.
Inject+matic Sleeper | Inject+matic | ||
Bugdorm-1 Insect Rearing Cage | BugDorm Store | ||
Drosophila cultivation tubes | carl roth | PK11.2 | plastic vial for mosquitoes |
Plug for drosophila cultivation tubes | carl roth | PK15.1 | |
Constant climate chamber | Binder | KBF-240 | |
Blood | banked human blood, expired, not usable for medical application | ||
Dumont-Pincette Electronic SS | Dumont | B40c | |
Vero cells | BNITM | ||
Flash light aspirator | Bioquip | 2809 | |
double-sided adhesive tape | no specific provider | ||
Gammex Powder-free gloves with AMT | Ansell | for safety reasons necessary during work with pricks in the BSL3 laboratory | |
RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit | altona diagnostics | 591013 | |
MagMax Pathogen RNA/DNA Kit | Thermo fisher scientific | 4462359 | RNA isolation of mosquito bodies |
Qiamp viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52906 | RNA-Isolation of supernatant |
filter tips (20 µL) | Sarstedt | 701,116,210 | Cut the first 3 mm of the tip |
hand motor mixer | carl roth | sold out | |
micro pestles for hand motor mixer | carl roth | CXH8.1 | |
DMEM | P0403550 | ||
L Glutamine Penicilin/Streptomycin | PAN | P0819100 | |
Amphotericin B | PAN | P06-0110 | |
Fructose | carl roth | 4981.5 | |
Phosphate buffered saline | PAN | P04-36500 | |
FBS | PAN | ||
Sodium Pyruvat | PAN | P0443100 | |
MEM NAA | PAN | P0832100 | |
Hemotek Feeder | Hemotek | PS6 | |
Light Cycler | Roche | 480 II | |
Light Cycler Software | Roche | 480 SW 1.5.1 | |
Modeling clay | no specific provider | ||
King Fisher Flex Purification System | ThermoFisher scientific | ||
Aedes albopictus | eggs were collected in Freiburg, Germany | ||
Binocular | MOTIC | SMZ-168 | |
Binocular light | MOTIC | MLC-150C | |
CO2-Incubator | Thermo scientific | MIDI 40 |