为有效控制蚊媒传播病毒, 有关蚊子的矢量电位的知识尤其值得关注。本文将强迫流涎作为一种分析白纹伊蚊和三种不同淡色类群对 Zika 病毒传播的载体能力的方法。
向量能力被定义为蚊子种类的潜力传播蚊子传播的病毒 (mobovirus) 到脊椎动物宿主。有效的病毒粒子通过感染蚊子的唾液在血液中传播。强迫流涎化验允许在单蚊子的基础上确定矢量电位, 避免使用动物实验。该方法适用于在短时间内对大量蚊虫进行一次实验分析。采用强迫流涎测定法分析了德国境内856只蚊子, 包括两种不同的淡色库蚊虱、淡色 torrentium和白纹伊蚊,实验感染与 Zika 病毒 (ZIKV) 和孵化在18°c 或27°c 为两个和三周。结果表明, 不同淡色类群对 ZIKV 的载体能力缺乏。相比之下,白纹伊蚊易受 ZIKV 的影响, 但只有27摄氏度, 传播速率类似于白纹伊蚊蚊实验室菌落平行测试。
在 2015年, Zika 病毒 (ZIKV) 是属于家庭Flaviviridae的一种蚊媒病毒 (mobovirus), 出现在哥伦比亚和巴西, 在美洲和加勒比地区迅速蔓延, 引起了大量相关的流行病。小头和 Guillain–Barré综合征1例临床病例。蚊和白纹伊蚊的蚊子被认为是 ZIKV2的主要和次要载体, 但白纹伊属的其他种类也被证明具有实验向量能力3.与伊蚊不同的是, 迄今为止测试的大多数淡色物种都无法传播病毒4。只是,淡色致倦的数据提供了不确定的结果3。目前, 在中等温度条件下 (< 20 摄氏度), ZIKV 的蚊媒能力缺乏信息。然而, 这一信息对于可能蔓延到诸如中欧等温带气候地区的风险评估是很重要的。
ZIKV 的有效载体能够获得、维持、放大并最终传播病毒。因此, 对 ZIKV 的蚊体或身体部位, 包括腿部、中肠、头或涎腺进行检测, 不足以确定载体的能力。在释放的唾液中检测感染病毒微粒是强制性的。为了评估向量的能力, 两种感染率 (IR, 每数量的 ZIKV 阳性蚊子的数量) 和传播率 (TR, 蚊子数量与 ZIKV 阳性唾液每数量 ZIKV 阳性蚊子身体), 必须确定。蚊子的 IRs 可以很容易地通过简单的均质蚊子分析, 其次是反向逆转录酶链反应 (RT qPCR) 靶向 ZIKV。此外, 感染还可以通过确定每只蚊子的病毒拷贝数来进一步表征。相比之下, 传输速率的分析依赖于在个体蚊子唾液中检测出可行的病毒微粒。这可以通过喂养受感染的蚊子在敏感的寄主动物, 其次是分析的病毒血症在主机5。然而, 这种方法依赖于合适的模型有机体, 而且代价高昂, 受到动物福利法规的限制。为了避免使用实验动物来分析传输速率和降低成本, 使用血滴的人工再喂养系统被描述了6。然而, 个体规模的测试与大量个体的结合是困难和耗时的。流涎的第一个描述在个体尺度被出版了在 1966年7年, 并且在近几年, 强迫流涎实验成为了评估蚊子的媒介能力的选择方法3,8.
根据我们的媒介能力研究最近出版的中欧蚊子9, 我们描述强迫流涎报告由安德森et。8与一些修改。该方法允许高生物安全水平条件下的高通量标准化实验 (BSL-3), 包括基于细胞培养的活性病毒的鉴定。这里所描述的实验包括856只蚊子。他们通过人工血餐感染 ZIKV, 随后对唾液中感染性病毒微粒的存在进行分析。在实验中引入的蚊子包括两个长期建立的 Ae 的实验室种群. 蚊和淡色库蚊虱molestus (Cx molestus), 以及田间捕捉淡色库蚊虱库蚊 (cx),淡色 torrentium (cx torrentium) 和两个Ae. 伊蚊种群。除了其中的两个Ae.在意大利收集的伊蚊种群中, 所有蚊子都是在德国收集的。
以前已经表明, 强迫流涎获得的结果与经典的再喂养实验6一致。然而, 无论是在重新喂养实验和我们提出的强迫流涎的方法, 它是不可能直接证明流涎活动或监测唾液释放。为了证明流涎的活性, 样品可以检测唾液中的其他成分 (例如,蛋白质, 碳水化合物等)。此外, 额外的 qPCRs 将允许检测病毒 RNA 拷贝。然而, 这需要在不同的分析中分离唾液样本, 这可能会限制细胞培养实验中极低颗粒数的敏感性。反过来, 这可能导致低估了已确定的传输速率。
为了重现的结果, 有必要确保所有蚊子活着直到实验结束。这是通过视觉监测蚊子的身体运动活动来控制的。此外, 对某种蚊子物种的流涎试验的原则使用必须通过喂养控制病毒进行测试, 已知这类蚊子是由这种特定的蚊虫传播的。反之亦然, 在实验中引入的每种病毒都必须在易感蚊子中进行测试。
强迫流涎测定有许多优点。高数量的蚊子可以同时测试在一个单一的标本基地在控制标准化的条件下, 而不与动物福利条例9的冲突。
该方法由几个实验室使用。然而, 确切的设置可能会有所不同, 这可能导致实验室之间的结果差异。一个关键的组成部分是毛细管收集唾液, 可以由玻璃14或塑料15。为了符合安全等级 3 insectary 的高安全性规定, 我们使用了塑料过滤器的小贴士代替了玻璃毛细血管, 从而降低了受伤的风险。此外, 过滤器提示有优势, 收集的液体可以很容易地转移使用吸管。
这里提出的强制流涎试验的设置是基于两个调查人员一起工作和分担职责。蚊子的复员是由一个人执行的, 另一个则同时准备强制流涎设置。这大大减少了处理时间, 并减少了样本切换的风险, 因为在复员工作场所和流涎之间的变化是不必要的。此外, 它允许在复员后立即将蚊子放在强制流涎装置上。这相当短的蚊子处理时间是必不可少的成功强迫流涎。最后, 在整个实验中可以直接监测蚊子的运动。
本文介绍的流涎分析方法是为了深入了解蚊虫的载体电位。然而, 为了回答其他一些具体问题 (例如, 感染脊椎动物所需的蚊子叮咬数量), 动物实验可能仍然需要。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢艾拉 Weinert, 米歇尔赫尔姆斯和 Marlis Badusche 为优秀的技术援助, 杰西卡 Börstler 分析淡色蚊子, 罗伯特贝克尔和 Björn Pluskota 提供白纹伊蚊蛋和为 Vapalahti提供病毒储存。ML 得到了莱布尼茨协会的支持;授予编号 SAW-2014-SGN-3。
Inject+matic Sleeper | Inject+matic | ||
Bugdorm-1 Insect Rearing Cage | BugDorm Store | ||
Drosophila cultivation tubes | carl roth | PK11.2 | plastic vial for mosquitoes |
Plug for drosophila cultivation tubes | carl roth | PK15.1 | |
Constant climate chamber | Binder | KBF-240 | |
Blood | banked human blood, expired, not usable for medical application | ||
Dumont-Pincette Electronic SS | Dumont | B40c | |
Vero cells | BNITM | ||
Flash light aspirator | Bioquip | 2809 | |
double-sided adhesive tape | no specific provider | ||
Gammex Powder-free gloves with AMT | Ansell | for safety reasons necessary during work with pricks in the BSL3 laboratory | |
RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit | altona diagnostics | 591013 | |
MagMax Pathogen RNA/DNA Kit | Thermo fisher scientific | 4462359 | RNA isolation of mosquito bodies |
Qiamp viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52906 | RNA-Isolation of supernatant |
filter tips (20 µL) | Sarstedt | 701,116,210 | Cut the first 3 mm of the tip |
hand motor mixer | carl roth | sold out | |
micro pestles for hand motor mixer | carl roth | CXH8.1 | |
DMEM | P0403550 | ||
L Glutamine Penicilin/Streptomycin | PAN | P0819100 | |
Amphotericin B | PAN | P06-0110 | |
Fructose | carl roth | 4981.5 | |
Phosphate buffered saline | PAN | P04-36500 | |
FBS | PAN | ||
Sodium Pyruvat | PAN | P0443100 | |
MEM NAA | PAN | P0832100 | |
Hemotek Feeder | Hemotek | PS6 | |
Light Cycler | Roche | 480 II | |
Light Cycler Software | Roche | 480 SW 1.5.1 | |
Modeling clay | no specific provider | ||
King Fisher Flex Purification System | ThermoFisher scientific | ||
Aedes albopictus | eggs were collected in Freiburg, Germany | ||
Binocular | MOTIC | SMZ-168 | |
Binocular light | MOTIC | MLC-150C | |
CO2-Incubator | Thermo scientific | MIDI 40 |