Pour un contrôle efficace des moustiques, la charge de la transmission du virus, la connaissance du potentiel vecteur de moustiques respectifs est particulièrement intéressant. Nous décrivons la salivation forcée comme une méthode pour analyser la compétence vectorielle d’Aedes albopictus et trois différents taxons de Culex pour la transmission du virus Zika.
Vector compétence se définit comme le potentiel d’une espèce de moustique pour transmettre un virus transmises par les moustiques (mobovirus) à un hôte vertébré. Particules virales viables sont transmises lors d’un repas de sang par l’intermédiaire de la salive d’un moustique infecté. Forcé de la salivation essais permettent de déterminer le potentiel vecteur sur la base des moustiques unique, évitant l’utilisation de l’expérimentation animale. Cette méthode convient analyser un grand nombre de moustiques dans une expérience dans un court laps de temps. Forcé de la salivation essais ont été utilisés pour analyser les 856 moustiques individuels pris au piège en Allemagne, dont deux différents biotypes de Culex pipiens pipiens , Culex torrentium ainsi Aedes albopictus, qui ont été infectés expérimentalement avec Zika virus (ZIKV) et incubé à 18 ° C ou 27 ° C pendant deux à trois semaines. Les résultats ont indiqué le manque de compétence vectorielle des différents taxons Culex pour ZIKV. En revanche, Aedes albopictus a été sensible aux ZIKV, mais seulement à 27 ° C, avec des vitesses de transmission semblables à une colonie de laboratoire de Aedes aegypti testée en parallèle.
En 2015, Zika virus (ZIKV), un virus transmises par les moustiques (mobovirus) appartenant à la famille des Flaviviridae, a émergé en Colombie et au Brésil et se propager rapidement à travers les Amériques et les Caraïbes, causant une épidémie avec un nombre notable d’associés cas cliniques de microcéphalie et syndrome de Guillain-Barré1. Les moustiques de l’espèce Aedes aegypti et Aedes albopictus sont considérés comme les vecteurs primaires et secondaires de ZIKV2, mais les autres espèces du genre Aedes se sont également révélés avoir compétence expérimentale vecteur3 . Contrairement aux espèces d’Aedes , la plupart des espèces Culex testées jusqu’à présent n’est pas capable de transmettre le virus4. Simplement, les données de Culex quinquefasciatus fournies résultats non concluants,3. À l’heure actuelle, information fait défaut sur la compétence du vecteur moustique pour ZIKV dans des conditions de température modérée (< 20 ° C). Toutefois, cette information est importante pour l’évaluation des risques des "spreads" possible aux régions à climat tempéré comme l’Europe centrale.
Un vecteur compétent pour ZIKV est en mesure d’acquérir, conserver, amplifier et enfin de transmettre le virus. Donc, test moustique cadavres ou parties du corps, y compris les jambes, de l’intestin moyen, tête ou les glandes salivaires, pour ZIKV n’est pas suffisant pour déterminer la compétence vectorielle. Il est obligatoire d’essai pour les particules de virus infectieux dans la salive libérée. Afin d’évaluer la compétence vectorielle, les taux d’infection (IR, plusieurs corps de moustique ZIKV séropositifs en nombre de moustiques engorgées) et vitesse de transmission (TR, nombre de moustiques avec de la salive ZIKV positives par le nombre de corps de moustique ZIKV séropositifs), doivent être déterminé. IRs de moustiques peuvent être facilement analysés par les moustiques simplement homogénéisation suivies d’une réaction en chaîne polymérase en temps réel de transcriptase inverse (RT-qPCR) ciblant les ZIKV. Par ailleurs, l’infection peut être davantage caractérisée en déterminant le nombre de copies virales par le moustique. Par contre, l’analyse des taux de transmission repose sur la détection des particules virales viable dans la salive des moustiques individuels. Ceci peut être réalisé en se nourrissant de moustiques infectés sur des animaux de l’hôte sensible, suivies de l’analyse de la virémie chez l’ hôte5. Toutefois, cette méthode s’appuie sur des organismes modèles adaptés et est coûteux et restreinte par les règlements de protection des animaux. Pour éviter l’utilisation des animaux de laboratoire pour l’analyse des débits de transmission et de réduire les coûts, re-systèmes d’alimentation artificielle en utilisant le sang des gouttelettes ont été décrit6. Cependant, le test à l’échelle individuelle combinée avec un nombre élevé de personnes est long et difficile. La première description d’un test de salivation à échelle individuelle a été publiée en 19667 et au cours de ces dernières années, forcé de la salivation expériences sont devenues la méthode de choix pour évaluer la compétence vectorielle de moustiques3,8 .
Basé sur notre étude de compétence vectorielle des pays d’Europe centrale, les moustiques publié récemment9, nous décrivons forcée de la salivation, tel que rapporté par Anderson et al. 8 avec quelques modifications. Cette méthode permet des expériences dans des conditions de niveau élevé sur la biosécurité (BSL-3) à haut débit normalisé et comprend l’identification du virus actif par essais fondés sur la culture de cellules. Les expériences décrites ici comprennent 856 moustiques. Ils étaient infectés par la ZIKV de la farine de sang artificielle et analysés par la suite la présence de particules virales infectieuses dans la salive. Les moustiques introduits dans les populations de laboratoire établi de longue date deux expériences composés de Ae. aegypti et Culex pipiens pipiens biotype molestus (Cx. p. molestus), ainsi que champ pris Culex pipiens pipiens biotype pipiens (Cx. p. pipiens), Culex torrentium (Cx. torrentium) et deux populations de Ae. albopictus . À l’exception d’une des deux populations Ae. albopictus , qui ont été recueillis en Italie, tous les moustiques ont été recueillis en Allemagne.
Il a déjà été démontré que les résultats obtenus avec la salivation forcée correspondent classique d’expériences ré-alimentation6. Cependant, dans re-expériences d’alimentation et dans notre méthode présentée de la salivation forcée, il est impossible de directement la preuve de l’activité de la salivation ou surveiller le rejet de la salive. Pour prouver que l’activité de la salivation, les échantillons pourraient être testés pour autres composants présent dans la salive (e.g., protéines, glucides, etc..). En outre, y supplémentaires permettrait à détection de copies de RNA virales. Ceci, cependant, exige fractionnement des échantillons de salive pour diverses analyses, ce qui pourraient limiter la sensibilité dans l’épreuve de culture cellulaire en cas de nombres de particules très faible. À son tour, cela pourrait conduire à une sous-estimation des taux de transmission déterminé.
Pour obtenir des résultats reproductibles, il est nécessaire de s’assurer que tous les moustiques restent en vie jusqu’à la fin de l’expérience. Ceci est contrôlé en contrôlant visuellement l’activité de mouvement du corps des moustiques. En outre, l’utilisation du principe du dosage salivation pour une espèce de moustique donnée doit être testé en se nourrissant de virus control, qui sont connus pour être transmis par cette espèce de moustique spécifique. Inversement, tous les virus introduits dans une expérience doit être testé dans un moustique sensible.
Les tests de salivation forcé ont beaucoup d’avantages. Un nombre élevé de moustiques peut être testé simultanément sur un seul spécimen de base dans des conditions normalisées contrôlées sans entrer en conflit avec le bien-être animal règlements9.
La méthode est utilisée par plusieurs laboratoires. Toutefois, les configurations exactes peuvent différer, qui peut conduire à des différences de résultats entre les laboratoires. Un élément essentiel est le capillaire pour recueillir la salive, qui peut être faite de verre14 ou en plastique15. Pour respecter les normes de sécurité élevées d’un Insectarium de niveau 3 de biosécurité, nous avons utilisé des pointes à filtre en plastique au lieu de capillaires en verre, réduisant ainsi le risque de blessures. En outre, bouts filtrants ont l’avantage que le liquide recueilli peut être facilement transféré à l’aide d’une pipette.
La configuration de l’essai de salivation forcée présentée ici est basée sur deux enquêteurs travaillant ensemble et en partageant les tâches. Démobilisation du moustique est effectuée par une seule personne, tandis que l’autre prépare simultanément le paramétrage forcé de la salivation. Cela a significativement réduit le temps de manipulation et minimise le risque d’échantillon que de changer entre la démobilisation-lieu de travail et la salivation-plaque de commutation n’est pas nécessaire. En outre, il permet de placer les moustiques sur le périphérique de salivation forcé immédiatement après la démobilisation. Ce moustique plutôt court durée de la manipulation est essentiel pour la salivation forcée réussie. Enfin, les moustiques peuvent être directement contrôlés pour la motilité pendant toute l’expérience entière.
Le test de salivation présenté ici est utilisé pour mieux comprendre le potentiel vecteur des espèces de moustiques. Toutefois, pour répondre à certaines questions spécifiques (p. ex.., le nombre de piqûres de moustiques qui sont nécessaires pour infecter les vertébrés), animal expériences pourraient encore être nécessaires.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions Ella Weinert, Michelle Helms et Marlis Badusche pour son aide technique, Jessica Börstler pour les analyses de moustiques du genre Culex , Norbert Becker et Björn Pluskota pour fournir des oeufs de l’Aedes albopictus et Olli Vapalahti pour fournir le stock de virus. ML a été soutenue par la Communauté Leibniz ; accorder le numéro scie-2014-SGN-3.
Inject+matic Sleeper | Inject+matic | ||
Bugdorm-1 Insect Rearing Cage | BugDorm Store | ||
Drosophila cultivation tubes | carl roth | PK11.2 | plastic vial for mosquitoes |
Plug for drosophila cultivation tubes | carl roth | PK15.1 | |
Constant climate chamber | Binder | KBF-240 | |
Blood | banked human blood, expired, not usable for medical application | ||
Dumont-Pincette Electronic SS | Dumont | B40c | |
Vero cells | BNITM | ||
Flash light aspirator | Bioquip | 2809 | |
double-sided adhesive tape | no specific provider | ||
Gammex Powder-free gloves with AMT | Ansell | for safety reasons necessary during work with pricks in the BSL3 laboratory | |
RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit | altona diagnostics | 591013 | |
MagMax Pathogen RNA/DNA Kit | Thermo fisher scientific | 4462359 | RNA isolation of mosquito bodies |
Qiamp viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52906 | RNA-Isolation of supernatant |
filter tips (20 µL) | Sarstedt | 701,116,210 | Cut the first 3 mm of the tip |
hand motor mixer | carl roth | sold out | |
micro pestles for hand motor mixer | carl roth | CXH8.1 | |
DMEM | P0403550 | ||
L Glutamine Penicilin/Streptomycin | PAN | P0819100 | |
Amphotericin B | PAN | P06-0110 | |
Fructose | carl roth | 4981.5 | |
Phosphate buffered saline | PAN | P04-36500 | |
FBS | PAN | ||
Sodium Pyruvat | PAN | P0443100 | |
MEM NAA | PAN | P0832100 | |
Hemotek Feeder | Hemotek | PS6 | |
Light Cycler | Roche | 480 II | |
Light Cycler Software | Roche | 480 SW 1.5.1 | |
Modeling clay | no specific provider | ||
King Fisher Flex Purification System | ThermoFisher scientific | ||
Aedes albopictus | eggs were collected in Freiburg, Germany | ||
Binocular | MOTIC | SMZ-168 | |
Binocular light | MOTIC | MLC-150C | |
CO2-Incubator | Thermo scientific | MIDI 40 |