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Biology

Gezwungen Speichelfluss als Methode zur Vektorkompetenz von Stechmücken Analyse

doi: 10.3791/57980 Published: August 7, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Für die effiziente Steuerung der Moskito Virusübertragung zu tragen ist die Kenntnis der Vektor Potential der jeweiligen Mücken von besonderem Interesse. Wir beschreiben erzwungene Speichelfluss als Methode zur vektorkompetenz von Aedes Albopictus und drei verschiedenen Culex Taxa für die Übertragung der Zika-Virus zu analysieren.

Abstract

Vektorkompetenz ist definiert als das Potenzial einer Mückenarten Moskitos übertragene Virus (Mobovirus) zu einem fest gefügten Host übertragen. Tragfähige Viruspartikel sind während einer Blutmahlzeit über den Speichel einer infizierten Mücke übertragen. Erzwungene Speichelfluss Assays ermöglichen Bestimmung der potentiellen Vektor auf der Grundlage der einzelnen Mücken, den Verzicht auf Tierversuche. Die Methode ist geeignet, eine große Anzahl von Mücken in einem Experiment innerhalb kurzer Zeit zu analysieren. Erzwungene Speichelfluss Assays wurden verwendet, um 856 einzelne Mücken in Deutschland, darunter zwei verschiedene gefangen analysieren Culex Pipiens Pipiens Biotope, Culex Torrentium sowie Aedes Albopictus, die experimentell infiziert wurden mit Zika-Virus (ZIKV) und inkubierten bei 18 ° C und 27 ° C für zwei bis drei Wochen. Die Ergebnisse zeigten die mangelnde vektorkompetenz von verschiedenen Culex Taxa für ZIKV. Im Gegensatz dazu war Aedes Albopictus anfällig für ZIKV, aber nur bei 27 ° C, mit Übertragungsraten, die ähnlich wie eine Aedes Aegypti Labor Kolonie parallel getestet.

Introduction

In 2015, Zika-Virus (ZIKV), assoziiert ein Moskitos übertragene Virus (Mobovirus) aus der Familie , die Flaviviridae, in Kolumbien und Brasilien entstand und verbreitete sich rasch in ganz Nord-und Südamerika und der Karibik, verursacht eine Epidemie mit einer bemerkenswerten Anzahl von klinische Fälle von Mikrozephalie und Guillain-Barré-Syndrom1. Stechmücken der Gattung Aedes Aegypti und Aedes Albopictus gelten die primären und sekundären Vektoren von ZIKV2, aber andere Arten der Gattung Aedes haben auch bewiesen, experimentelle vektorkompetenz3 haben . Im Gegensatz zu den Aedes -Arten sind die meisten der Gattung Culex getestet bisher nicht in der Lage, das Virus4übertragen. Bloß, lieferten die Daten für Culex Quinquefasciatus eindeutigen Ergebnisse3. Derzeit fehlen Informationen über Moskito vektorkompetenz für ZIKV bei moderaten Temperaturen (< 20 ° C). Diese Information ist jedoch wesentlich für die Risikobewertung von möglichen Spreads in Regionen mit gemäßigtem Klima wie Mitteleuropa.

Ein kompetenter Vektor für ZIKV ist in der Lage zu erwerben, zu erhalten, zu verstärken und schließlich das Virus übertragen. Deshalb testen die Mücke Organe oder Körperteile, wie Beine, Mitteldarm, Kopf oder Speicheldrüsen, für ZIKV nicht ausreichen, um vektorkompetenz bestimmen. Es ist obligatorisch, infektiösen Viruspartikeln in freigegebenen Speichel testen. Zur Beurteilung vektorkompetenz müssen Infektionsrate (IR, Anzahl der ZIKV-positiven Moskito Körper pro Anzahl der engorged Mücken) und Übertragungsrate (TR, Anzahl der Mücken mit ZIKV-positiven Speichel pro Anzahl der ZIKV-positiven Moskito Körper), bestimmt. IRs Mücken kann leicht durch einfach homogenisierende Mücken gefolgt von eine Echtzeit-Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) analysiert werden gezielt ZIKV. Darüber hinaus kann die Infektion weiter charakterisiert werden, durch die Bestimmung der viralen heftnummern pro Mücke. Im Gegensatz dazu setzt die Analyse der Übertragungsraten auf die Erkennung von lebensfähigen Viruspartikel im Speichel der einzelnen Mücken. Dies kann erreicht werden durch die Fütterung von infizierten Mücken auf empfänglichen Wirtstiere, gefolgt von der Analyse der Virämie in der Host-5. Jedoch diese Methode stützt sich auf geeignete Modellorganismen und ist kostspielig und durch Tierschutz Vorschriften beschränkt. Um den Einsatz von Versuchstieren für die Analyse von Übertragungsraten zu vermeiden und Kosten zu senken, beschrieben künstliche neu Zuführsysteme mit Blut Tropfen wurden6. Prüfung auf individuellen Ebene kombiniert mit einer hohen Anzahl von Personen ist jedoch schwierig und zeitaufwändig. Die erste Beschreibung eines Speichelfluss Assays auf individueller Ebene erschien 19667 und erzwungene Speichelfluss Experimente geworden in den letzten Jahren die Methode der Wahl, die vektorkompetenz von Stechmücken3,8 zu bewerten .

Basierend auf unsere Vektor-Kompetenz-Studie der mitteleuropäischen Mücken veröffentlichte vor kurzem9, beschreiben wir gezwungen Speichelfluss, wie Anderson Et al.berichtet. 8 mit einigen Änderungen. Diese Methode ermöglicht hoher Durchsatz standardisiert Experimente Bedingungen hohe Biosafety Niveau (BSL-3) und umfasst die Ermittlung des aktiven Virus durch Zelle Kultur basierte Assays. Die hier beschriebenen Experimente gehören 856 Mücken. Sie waren mit ZIKV durch künstliche Blutmahlzeit angesteckt und anschließend auf das Vorhandensein von infektiösen Viruspartikeln im Speichel analysiert. Die Mücken in die Experimente bestand aus zwei alteingesessenen Labor Populationen von Ae. Aegypti und Culex Pipiens Pipiens Biotyp Molestus (Cx. p. Molestus) sowie Feld eingeführt gefangen Culex Pipiens Pipiens Biotyp Pipiens (Cx. s. Pipiens), Culex Torrentium (Cx. Torrentium) und zwei Ae. Albopictus Populationen. Mit Ausnahme von einem der beiden Ae. Albopictus Populationen, die in Italien gesammelt wurde, wurden alle Mücken in Deutschland gesammelt.

Protocol

1. bereiten Sie weibliche Stechmücken

  1. Sammeln Sie Mücken aus ein großer Käfig mit einer Absauganlage (ca. 400 Mücken pro großer Käfig).
  2. Betäuben Sie die Mücken mit Kohlendioxid (CO2) für 7 s.
  3. Sortieren Sie 20 Weibchen pro Kunststoff Vial (Ø 50 mm × 100 mm).
    Hinweis: Wenn die Mücken aufwachen, verwenden Sie weitere 3 s Co2.
  4. Verhungern Sie die Mücken über Nacht.

2. künstliche Blutmahlzeit

Hinweis: Alle Schritte sind unter BSL-3 Bedingungen durchgeführt.

  1. Bereiten Sie die infektiöse Blutmahlzeit.
    1. Verdünnen Sie den Virus bestand, die Konzentration von 1 x 108 Plaque bilden Einheiten (PFU) / mL.
      Hinweis: Die Lager Konzentration wurde bestimmt durch Gewebekultur Infektion Dosis 50-Methode (TCID50) ausführen und berechnet, indem die Spearman & Kärber Algorithmus10,11.
    2. Mix abgelaufen menschliches Blut (Blut-Erhaltung) von der Blutbank (nicht geeignet für Menschen mehr, aber nützlich für die Mücken) mit Fruchtzucker (8 % ige Lösung), filtriert, bovine Serum (FBS) und funktionierende Lösung des Bestands Virus (menschliches Blut: Fruktose: FBS abgelaufen: Arbeitslösung = 5:3:1:1).
      Hinweis: Wir entschieden uns für menschliches Blut, denn dies ist der bekannte natürliche Säugetier-Gastgeber des ZIKV.
  2. 140 µL Blutmahlzeit Mix zur weiteren Analyse über TCID50 einfrieren.
  3. Führen Sie die künstliche Ernährung mit verschiedenen Fütterung Methoden, abhängig von der Sorte:
    1. Aedes Aegypti: verwenden eine Membran Fütterungssystem für 30 min (1 mL pro Feeder).
    2. Culex spp.: bieten die ansteckende Blut über ein Wattestäbchen über Nacht und nicht das Blut (300 µL pro Fläschchen) Aufwärmen.
    3. Aedes Albopictus: zwei Tropfen (50 µL) der Blutmahlzeit Mischung in die Kunststoff-Flasche und lassen die Moskitos für 2 h füttern. Das Blut nicht Aufwärmen.
      Hinweis: Die Mücken werden in den ersten 15 min einfließen. Die längeren Inkubationszeit ist aus Sicherheitsgründen notwendig. Die Tröpfchen Blut abgelassen nach 2 h, damit das Kontaminationsrisiko reduziert wird, während die Sortierung der Mücken gefüttert.
  4. Betäuben Sie die Mücken mit CO2 für 7 s.
    Hinweis: Wenn die Mücken aufwachen, verwenden Sie weitere 3 s CO2.
  5. Art und Anzahl voll gestaut Mücken in ein neues Fläschchen.
  6. Fügen Sie ein Wattepad, gesättigt mit Fruchtzucker (8 % ige Lösung) zwischen das Fläschchen und ein Stecker.
  7. Halten Sie die Mücken an der vorgesehenen Temperatur von 18 ° C und 27 ° C in der Luftfeuchtigkeit von 80 % für 14 oder 21 Tage.
  8. Füttern Sie die Mücken mit Fruktose gesättigte Wattepads. Alle 72 h mit Fruktose (8 % ige Lösung) pro Fläschchen 1,5 mL Auffüllen (bis zu 20 Mücken, abhängig von der Fütterung bewerten, siehe Punkt 2.5).

(3) gezwungen Speichelfluss Assay an Tag 14 oder 21

Hinweis: Alle Schritte sind unter BSL-3 Bedingungen durchgeführt.

  1. 2 x 104 Vero-Zellen Seed / pro Bohrloch in ein 96 sowie Platte mit 200 µL Wachstumsmedium (Dulbecco´s modifiziert Eagle Medium (DMEM) mit 3 % FBS, 100 U/mL Penicillin, 100 mg/mL Streptomycin, 5 µg/mL Amphotericin B, 2 mM L-Glutamin ergänzt 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), 1 % Natrium Pyruvat).
  2. Bereiten Sie das Speichelfluss-Gerät:
    1. Legen Sie eine quadratische Glasplatte (20 × 20 cm) auf der Bank in einem Winkel von 30°.
      Hinweis: Dies ist notwendig, da der Unterdruck im Sicherheitslabor. Wenn die Platte horizontal oder vertikal, wird Flüssigkeit austreten.
    2. Legen Sie doppelseitiges Klebeband auf die Glasplatte.
    3. Rolle der Modelliermasse bis es erreicht einen Durchmesser von 0,5 cm und horizontal 1 cm entfernt von dem doppelseitigen Klebeband befestigen.
    4. Die ersten 0,3 cm von der Spitze der eine 10 µL Filterspitze abgeschnitten.
      Hinweis: Es empfiehlt sich, dies vor Beginn des Experiments außerhalb des Biosafety Labors vorzubereiten.
    5. Füllen Sie die Filter-Tips mit 10 µL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4).
    6. Legen Sie die Filter-Tips auf die Modelliermasse mit der Spitze in Richtung der Klebeband.
    7. Sichern Sie die Filter-Tips mit sanftem Druck.
  3. Bereiten Sie die Mücken:
    1. Die Mücken mit CO2zu betäuben.
    2. Entfernen Sie die Beine und Flügel, die Mücken zu immobilisieren.
    3. Befestigen Sie die Mücke lebenden Körper auf Klebeband über eine Filterspitze.
    4. Legen Sie den Rüssel sanft in die Filterspitze.
    5. Laufen Sie den Speichelfluss Test für 30 min.
    6. Entfernen Sie die Filter-Tips und entsorgen Sie der Lehm und Band.

4. Verarbeitung von Speichel

Hinweis: Schritte 4.1 – 4.6.2 sind unter BSL-3 Bedingungen durchgeführt.

  1. Vertreiben Sie den Inhalt in die Reaktionsgefäße mit 10 µL PBS.
  2. Mischen Sie vorsichtig und übertragen Sie die Inhalte in die Vertiefungen der vorbereiteten 96-well-Platte mit einem Brunnen pro Probe.
  3. 7 Tage bei 37 ° C mit 5 % CO2inkubieren Sie Platte.
  4. Verwenden Sie das Fernglas, um die Zellen auf das Vorhandensein von Zytopathischer Effekt (CPE) überprüfen.
  5. Wenn die nun positiv für CPE, Ernten des Überstands durch pipettieren 140 µL in einem Reaktionsgefäß für RNA-Extraktion.
  6. Reinigen Sie die RNA mittels einer RNA-Extraktion-Kit.
    1. Mix-140 µL des Überstands mit 560 µL AVL Puffer (virale Lyse Puffer) und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    2. Hinzufügen von 560 µL Ethanol (96 %) und Wirbel der Probe.
      Hinweis: Die Proben sind nach diesem Schritt deaktiviert und aus dem Labor BSL-3 abgeführt werden können.
    3. Pipettieren 630 µL der Probe auf eine Spalte und Zentrifuge mit 6.000 x g für 1 min.
    4. Verwerfen Sie das Filtrat, pipettieren der verbleibenden 630 µL auf die Spalte zu und wiederholen Sie die Zentrifugation.
    5. Waschen der RNS, gebunden an die Membran der Spalte, durch Zugabe von 500 µL Waschpuffer 1 Spalte und Zentrifuge bei 6.000 X g für 1 min.
    6. Entsorgen Sie das sammelröhrchen und legen Sie die Spalte in eine neue Kollektion-Röhre. Fügen Sie 500 µL waschen Puffer 2 und Zentrifuge bei 12.500 X g für 3 min.
    7. Entsorgen Sie das sammelröhrchen und legen Sie die Spalte in einem 1,5 mL Reaktionsgefäß.
    8. Fügen Sie 50 µL der Elution Buffer und 1 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    9. Bei 6.000 X g für 1 min zentrifugieren Sie und verwerfen Sie die Spalte.
  7. Die Proben für ZIKV RNA durch RT-qPCR analysieren.

5. Bearbeitung von Mosquito Körper

Hinweis: Die Schritte 5.1-5.5 sind unter BSL-3 Bedingungen durchgeführt.

  1. Entfernen Sie der Körper des Moskitos und jeder Körper in einem Reaktionsgefäß.
    Hinweis: Es ist möglich, das Experiment zu diesem Zeitpunkt anhalten und speichern die Proben bei-80 ° C.
  2. Fügen Sie 500 µL der Homogenisierung Medien (DMEM ohne irgendwelche Nahrungsergänzungsmittel) in das Reaktionsgefäß.
  3. Homogenisieren Sie den Körper mit motor Handmixer zu und verwenden Sie einen neuen Stempel für jede Probe.
  4. Fügen Sie 200 µL Das Homogenat in eine 96-Well-Platte für die Reinigung.
    Hinweis: Es ist möglich, das Experiment zu diesem Zeitpunkt anhalten und speichern die Proben bei-80 ° C.
  5. Deaktivieren Sie die Platte durch Inkubation für 60 min bei 60 ° C.
  6. Reinigen Sie die RNA durch automatisierte Nukleinsäure-Reinigung.
    Hinweis: Es ist möglich, das Experiment zu diesem Zeitpunkt anhalten und speichern die Proben bei-80 ° C.

6. Analyse

  1. Die virale RNA-Kopien mit RT-qPCR zu quantifizieren.
    Hinweis: Die RNA-Kopien wurden gemittelt über alle ZIKV-positiven Moskito Körper und ohne Einbeziehung der ZIKV-Negative Mücken.
  2. Berechnen Sie die IR, definiert als die Anzahl der ZIKV-positiven Moskito Körper pro Anzahl der Weibchen gefüttert.
  3. TR, definiert als die Anzahl der Mücken mit ZIKV-positiven Speichel pro Anzahl der ZIKV-positiven Moskito Körper zu berechnen. Die Übertragungsrate konnte nicht für Arten-Temperatur-Kombinationen mit keine ZIKV-positiven Körper berechnet werden.

Representative Results

Aedes Aegypti ist als kompetenter Vektor für ZIKV zumindest unter tropischen Klimabedingungen12bekannt. Daher verwendet wir Ae. Aegypti als Positivkontrolle der Assay etablieren und IRs sowie TRs bei einer Inkubationstemperatur von 27 ° C und einer Luftfeuchtigkeit von 80 % zu analysieren. IR und TR wurden definiert, wie zuvor beschrieben von Fortuna Et Al. 13. Challenged Ae. Aegypti zeigte IR von 50 % und 72 % und TR von 42 % und 31 % bei 14 und 21 Tagen post Infektion (dpi), bzw. (Abbildung 1A und 1 b). Anschließend wurden europäische Stechmücken für ZIKV Infektion und Übertragung mit tropischen sowie gemäßigten klimatischen Bedingungen getestet.

Bei 27 ° C Inkubationstemperatur zeigten alle Mückenarten ZIKV Infektion an 14 dpi sowie 21 dpi, mit Ausnahme von s. Pipiens Cx. und Cx. Torrentium Einzelpersonen, die mit 14 dpi nur positiv waren. Alle Arten der Aedes zeigte höhere IRs (zwischen 50 % und 72 %) sowie höhere virale RNA-Konzentration (106 bis 109 RNA-Kopien/Moskito-Proben) im Vergleich zu den verschiedenen Taxa Culex , offenbart die IRs zwischen 0 % und 32 % und Viruslast von 103 104 RNA-Kopien/Moskito-Proben. Alle Arten der Aedes angezeigt ZIKV-positiven Speichel (TR 13 – 42 %), während keiner der Speichelproben von Culex Taxa ZIKV (Abbildung 1A und 1 b) enthalten. Interessanterweise Übertragungsraten bei 21 dpi waren ähnlich in Ae. Aegypti und Ae. Albopictus aus Deutschland (30 %), aber deutlich niedriger in Ae. Albopictus aus Italien (13 %).

Inkubation von herausgefordert Mücken bei mäßiger Temperatur von 18 ° C zeigte im Allgemeinen niedriger Virus lädt in der Aedes -Arten (104– 106 RNA Kopien/Mücke) sowie in den verschiedenen Culex Taxa (102 –104 RNA Kopien/Mücke). Jedoch wurde bei 18 ° C Inkubationstemperatur, Übertragung von ZIKV nicht für eines der untersuchten Mückenarten beobachtet.

Figure 1
Abbildung 1: Übertragungsraten von Mücken experimentell infiziert mit ZIKV. Ergebnisse der Vektor-Kompetenz-Studium mit ZIKV in verschiedenen Mückenarten. Sechs verschiedene Moskito Taxa wurden mit ZIKV infiziert und bei 27 ° C und 18 ° C für 14 (A) oder 21 (B) Tage inkubiert. TR ist definiert als die Anzahl der Mücken mit ZIKV-positiven Speichel pro Anzahl der ZIKV-positiven Moskito Körper. Die Gesamtzahl der Moskitos untersucht wurde 856, mit einem Minimum von 30 Personen für jede Zeit-Punkt/Temperatur/Moskito-Taxa. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Bisher hat sich gezeigt, dass klassische neu Fütterung Experimente6Ergebnisse mit erzwungenen Speichelfluss entsprechen. Jedoch ist wieder Fütterungsversuche sowohl in unsere vorgestellte Methode der erzwungenen Speichelfluss, es unmöglich, direkt Nachweis Speichelfluss Aktivität oder die Freisetzung von Speichel zu überwachen. Um Speichelfluss Aktivität zu beweisen, konnte Proben getestet werden, für andere Komponenten im Speichel vorhanden (zB., Proteine, Kohlenhydrate, etc..). Darüber hinaus könnten zusätzliche qPCRs Nachweis von viraler RNA-Kopien. Dies erfordert allerdings, Spaltung der Speichelproben für verschiedene Analysen, die Empfindlichkeit in der Zelle Kultur Test bei sehr niedrigen Partikelanzahl begrenzen können. Im Gegenzug könnte dies zu einer Unterschätzung des ermittelten Übertragungsraten.

Um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen ist es notwendig, um sicherzustellen, dass alle Mücken bis zum Ende des Experiments am Leben zu bleiben. Dies wird gesteuert, indem Sie visuell überwachen den Körper Bewegungsaktivität der Moskitos. Darüber hinaus hat die Prinzip Verwendung des Speichelfluss Assays für einen bestimmten Mückenarten getestet werden, durch die Fütterung von Kontrolle-Viren, die bekannt sind, durch diese bestimmte Mückenarten übertragen werden. Umgekehrt, hat jeder Virus erstmals in einem Experiment in einer anfälligen Mücke getestet werden.

Erzwungene Speichelfluss Assays haben viele Vorteile. Hohe Anzahl von Mücken können gleichzeitig auf einem einzigen Exemplar unter kontrollierten standardisierten Bedingungen getestet werden, ohne dass Konflikte mit Tierschutz Vorschriften9.

Die Methode wird von mehreren Labors verwendet. Genaue Einstellungen können jedoch abweichen, um Unterschiede in den Ergebnissen zwischen den Labors führen kann. Eine wichtige Komponente ist die Kapillare, den Speichel zu sammeln, die von Glas14 oder Kunststoff15erfolgen kann. Zur Einhaltung der hohen Sicherheitsbestimmungen ein Biosafety Level 3 Insectary benutzten wir Kunststoff Filterspitzen anstelle von Glaskapillaren, wodurch das Risiko von Verletzungen. Filter-Tips haben darüber hinaus den Vorteil, dass die gesammelte Flüssigkeit mit einer Pipette leicht übertragen werden kann.

Das Setup des hier vorgestellten erzwungene Speichelfluss Assays beruht auf zwei Ermittler arbeiten zusammen und teilen Aufgaben. Demobilisierung der Mücke wird von einer Person durchgeführt, während die andere gleichzeitig das erzwungene Speichelfluss Setup bereitet. Dies reduziert die Bearbeitungszeit erheblich und minimiert das Risiko der Probe Schalter als Wechsel zwischen der Demobilisierung-Arbeitsplatz und den Speichelfluss-Platte ist nicht notwendig. Darüber hinaus erlaubt es die Mücken auf dem erzwungenen Speichelfluss Gerät sofort nach der Demobilisierung platzieren. Diese eher kurze Mücke Bearbeitungszeit ist entscheidend für erfolgreiche erzwungene Speichelfluss. Schließlich können die Mücken direkt auf Motilität in das ganze Experiment überwacht werden.

Die hier vorgestellten Speichelfluss-Assay wird verwendet, um Einblicke in das Vektor-Potenzial der Mückenarten. Jedoch, einige konkreten Fragen zu beantworten (zB., die Zahlen von Mückenstichen, die erforderlich sind, um Wirbeltiere infizieren), tierische Experimente noch erforderlich sein könnten.

Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wir bedanken uns bei Ella Weinert, Michelle Helms und Marlis Badusche für hervorragende technische Unterstützung, Jessica Börstler für Analysen von Culex -Mücken, Norbert Becker und Björn Pluskota für die Bereitstellung von Aedes Albopictus Eier und Olli Vapalahti für Bereitstellung den Virus bestand. ML wurde von der Leibniz-Gemeinschaft unterstützt; Nummer Säge-2014-SGN-3 zu gewähren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inject+matic Sleeper Inject+matic
Bugdorm-1 Insect Rearing Cage BugDorm Store
Drosophila cultivation tubes carl roth PK11.2 plastic vial for mosquitoes
Plug for drosophila cultivation tubes carl roth PK15.1
Constant climate chamber Binder KBF-240
Blood banked human blood, expired, not usable for medical application
Dumont-Pincette Electronic SS Dumont B40c
Vero cells BNITM
Flash light aspirator Bioquip 2809
double-sided adhesive tape no specific provider
Gammex Powder-free gloves with AMT Ansell for safety reasons necessary during work with pricks in the BSL3 laboratory
RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit altona diagnostics 591013
MagMax Pathogen RNA/DNA Kit Thermo fisher scientific 4462359 RNA isolation of mosquito bodies
Qiamp viral RNA Mini Kit Qiagen 52906 RNA-Isolation of supernatant
filter tips (20 µL) Sarstedt 701,116,210 Cut the first 3 mm of the tip
hand motor mixer carl roth sold out
micro pestles for hand motor mixer carl roth CXH8.1
DMEM P0403550
L Glutamine Penicilin/Streptomycin PAN P0819100
Amphotericin B PAN P06-0110
Fructose carl roth 4981.5
Phosphate buffered saline PAN P04-36500
FBS PAN
Sodium Pyruvat PAN P0443100
MEM NAA PAN P0832100
Hemotek Feeder Hemotek PS6
Light Cycler Roche 480 II
Light Cycler Software Roche 480 SW 1.5.1
Modeling clay no specific provider
King Fisher Flex Purification System ThermoFisher scientific
Aedes albopictus eggs were collected in Freiburg, Germany
Binocular MOTIC SMZ-168
Binocular light MOTIC MLC-150C
CO2-Incubator Thermo scientific MIDI 40

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Gezwungen Speichelfluss als Methode zur Vektorkompetenz von Stechmücken Analyse
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Heitmann, A., Jansen, S., Lühken, R., Leggewie, M., Schmidt-Chanasit, J., Tannich, E. Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes. J. Vis. Exp. (138), e57980, doi:10.3791/57980 (2018).More

Heitmann, A., Jansen, S., Lühken, R., Leggewie, M., Schmidt-Chanasit, J., Tannich, E. Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes. J. Vis. Exp. (138), e57980, doi:10.3791/57980 (2018).

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