Für die effiziente Steuerung der Moskito Virusübertragung zu tragen ist die Kenntnis der Vektor Potential der jeweiligen Mücken von besonderem Interesse. Wir beschreiben erzwungene Speichelfluss als Methode zur vektorkompetenz von Aedes Albopictus und drei verschiedenen Culex Taxa für die Übertragung der Zika-Virus zu analysieren.
Vektorkompetenz ist definiert als das Potenzial einer Mückenarten Moskitos übertragene Virus (Mobovirus) zu einem fest gefügten Host übertragen. Tragfähige Viruspartikel sind während einer Blutmahlzeit über den Speichel einer infizierten Mücke übertragen. Erzwungene Speichelfluss Assays ermöglichen Bestimmung der potentiellen Vektor auf der Grundlage der einzelnen Mücken, den Verzicht auf Tierversuche. Die Methode ist geeignet, eine große Anzahl von Mücken in einem Experiment innerhalb kurzer Zeit zu analysieren. Erzwungene Speichelfluss Assays wurden verwendet, um 856 einzelne Mücken in Deutschland, darunter zwei verschiedene gefangen analysieren Culex Pipiens Pipiens Biotope, Culex Torrentium sowie Aedes Albopictus, die experimentell infiziert wurden mit Zika-Virus (ZIKV) und inkubierten bei 18 ° C und 27 ° C für zwei bis drei Wochen. Die Ergebnisse zeigten die mangelnde vektorkompetenz von verschiedenen Culex Taxa für ZIKV. Im Gegensatz dazu war Aedes Albopictus anfällig für ZIKV, aber nur bei 27 ° C, mit Übertragungsraten, die ähnlich wie eine Aedes Aegypti Labor Kolonie parallel getestet.
In 2015, Zika-Virus (ZIKV), assoziiert ein Moskitos übertragene Virus (Mobovirus) aus der Familie , die Flaviviridae, in Kolumbien und Brasilien entstand und verbreitete sich rasch in ganz Nord-und Südamerika und der Karibik, verursacht eine Epidemie mit einer bemerkenswerten Anzahl von klinische Fälle von Mikrozephalie und Guillain-Barré-Syndrom1. Stechmücken der Gattung Aedes Aegypti und Aedes Albopictus gelten die primären und sekundären Vektoren von ZIKV2, aber andere Arten der Gattung Aedes haben auch bewiesen, experimentelle vektorkompetenz3 haben . Im Gegensatz zu den Aedes -Arten sind die meisten der Gattung Culex getestet bisher nicht in der Lage, das Virus4übertragen. Bloß, lieferten die Daten für Culex Quinquefasciatus eindeutigen Ergebnisse3. Derzeit fehlen Informationen über Moskito vektorkompetenz für ZIKV bei moderaten Temperaturen (< 20 ° C). Diese Information ist jedoch wesentlich für die Risikobewertung von möglichen Spreads in Regionen mit gemäßigtem Klima wie Mitteleuropa.
Ein kompetenter Vektor für ZIKV ist in der Lage zu erwerben, zu erhalten, zu verstärken und schließlich das Virus übertragen. Deshalb testen die Mücke Organe oder Körperteile, wie Beine, Mitteldarm, Kopf oder Speicheldrüsen, für ZIKV nicht ausreichen, um vektorkompetenz bestimmen. Es ist obligatorisch, infektiösen Viruspartikeln in freigegebenen Speichel testen. Zur Beurteilung vektorkompetenz müssen Infektionsrate (IR, Anzahl der ZIKV-positiven Moskito Körper pro Anzahl der engorged Mücken) und Übertragungsrate (TR, Anzahl der Mücken mit ZIKV-positiven Speichel pro Anzahl der ZIKV-positiven Moskito Körper), bestimmt. IRs Mücken kann leicht durch einfach homogenisierende Mücken gefolgt von eine Echtzeit-Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) analysiert werden gezielt ZIKV. Darüber hinaus kann die Infektion weiter charakterisiert werden, durch die Bestimmung der viralen heftnummern pro Mücke. Im Gegensatz dazu setzt die Analyse der Übertragungsraten auf die Erkennung von lebensfähigen Viruspartikel im Speichel der einzelnen Mücken. Dies kann erreicht werden durch die Fütterung von infizierten Mücken auf empfänglichen Wirtstiere, gefolgt von der Analyse der Virämie in der Host-5. Jedoch diese Methode stützt sich auf geeignete Modellorganismen und ist kostspielig und durch Tierschutz Vorschriften beschränkt. Um den Einsatz von Versuchstieren für die Analyse von Übertragungsraten zu vermeiden und Kosten zu senken, beschrieben künstliche neu Zuführsysteme mit Blut Tropfen wurden6. Prüfung auf individuellen Ebene kombiniert mit einer hohen Anzahl von Personen ist jedoch schwierig und zeitaufwändig. Die erste Beschreibung eines Speichelfluss Assays auf individueller Ebene erschien 19667 und erzwungene Speichelfluss Experimente geworden in den letzten Jahren die Methode der Wahl, die vektorkompetenz von Stechmücken3,8 zu bewerten .
Basierend auf unsere Vektor-Kompetenz-Studie der mitteleuropäischen Mücken veröffentlichte vor kurzem9, beschreiben wir gezwungen Speichelfluss, wie Anderson Et al.berichtet. 8 mit einigen Änderungen. Diese Methode ermöglicht hoher Durchsatz standardisiert Experimente Bedingungen hohe Biosafety Niveau (BSL-3) und umfasst die Ermittlung des aktiven Virus durch Zelle Kultur basierte Assays. Die hier beschriebenen Experimente gehören 856 Mücken. Sie waren mit ZIKV durch künstliche Blutmahlzeit angesteckt und anschließend auf das Vorhandensein von infektiösen Viruspartikeln im Speichel analysiert. Die Mücken in die Experimente bestand aus zwei alteingesessenen Labor Populationen von Ae. Aegypti und Culex Pipiens Pipiens Biotyp Molestus (Cx. p. Molestus) sowie Feld eingeführt gefangen Culex Pipiens Pipiens Biotyp Pipiens (Cx. s. Pipiens), Culex Torrentium (Cx. Torrentium) und zwei Ae. Albopictus Populationen. Mit Ausnahme von einem der beiden Ae. Albopictus Populationen, die in Italien gesammelt wurde, wurden alle Mücken in Deutschland gesammelt.
Bisher hat sich gezeigt, dass klassische neu Fütterung Experimente6Ergebnisse mit erzwungenen Speichelfluss entsprechen. Jedoch ist wieder Fütterungsversuche sowohl in unsere vorgestellte Methode der erzwungenen Speichelfluss, es unmöglich, direkt Nachweis Speichelfluss Aktivität oder die Freisetzung von Speichel zu überwachen. Um Speichelfluss Aktivität zu beweisen, konnte Proben getestet werden, für andere Komponenten im Speichel vorhanden (zB., Proteine, Kohlenhydrate, etc..). Darüber hinaus könnten zusätzliche qPCRs Nachweis von viraler RNA-Kopien. Dies erfordert allerdings, Spaltung der Speichelproben für verschiedene Analysen, die Empfindlichkeit in der Zelle Kultur Test bei sehr niedrigen Partikelanzahl begrenzen können. Im Gegenzug könnte dies zu einer Unterschätzung des ermittelten Übertragungsraten.
Um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen ist es notwendig, um sicherzustellen, dass alle Mücken bis zum Ende des Experiments am Leben zu bleiben. Dies wird gesteuert, indem Sie visuell überwachen den Körper Bewegungsaktivität der Moskitos. Darüber hinaus hat die Prinzip Verwendung des Speichelfluss Assays für einen bestimmten Mückenarten getestet werden, durch die Fütterung von Kontrolle-Viren, die bekannt sind, durch diese bestimmte Mückenarten übertragen werden. Umgekehrt, hat jeder Virus erstmals in einem Experiment in einer anfälligen Mücke getestet werden.
Erzwungene Speichelfluss Assays haben viele Vorteile. Hohe Anzahl von Mücken können gleichzeitig auf einem einzigen Exemplar unter kontrollierten standardisierten Bedingungen getestet werden, ohne dass Konflikte mit Tierschutz Vorschriften9.
Die Methode wird von mehreren Labors verwendet. Genaue Einstellungen können jedoch abweichen, um Unterschiede in den Ergebnissen zwischen den Labors führen kann. Eine wichtige Komponente ist die Kapillare, den Speichel zu sammeln, die von Glas14 oder Kunststoff15erfolgen kann. Zur Einhaltung der hohen Sicherheitsbestimmungen ein Biosafety Level 3 Insectary benutzten wir Kunststoff Filterspitzen anstelle von Glaskapillaren, wodurch das Risiko von Verletzungen. Filter-Tips haben darüber hinaus den Vorteil, dass die gesammelte Flüssigkeit mit einer Pipette leicht übertragen werden kann.
Das Setup des hier vorgestellten erzwungene Speichelfluss Assays beruht auf zwei Ermittler arbeiten zusammen und teilen Aufgaben. Demobilisierung der Mücke wird von einer Person durchgeführt, während die andere gleichzeitig das erzwungene Speichelfluss Setup bereitet. Dies reduziert die Bearbeitungszeit erheblich und minimiert das Risiko der Probe Schalter als Wechsel zwischen der Demobilisierung-Arbeitsplatz und den Speichelfluss-Platte ist nicht notwendig. Darüber hinaus erlaubt es die Mücken auf dem erzwungenen Speichelfluss Gerät sofort nach der Demobilisierung platzieren. Diese eher kurze Mücke Bearbeitungszeit ist entscheidend für erfolgreiche erzwungene Speichelfluss. Schließlich können die Mücken direkt auf Motilität in das ganze Experiment überwacht werden.
Die hier vorgestellten Speichelfluss-Assay wird verwendet, um Einblicke in das Vektor-Potenzial der Mückenarten. Jedoch, einige konkreten Fragen zu beantworten (zB., die Zahlen von Mückenstichen, die erforderlich sind, um Wirbeltiere infizieren), tierische Experimente noch erforderlich sein könnten.
The authors have nothing to disclose.
Wir bedanken uns bei Ella Weinert, Michelle Helms und Marlis Badusche für hervorragende technische Unterstützung, Jessica Börstler für Analysen von Culex -Mücken, Norbert Becker und Björn Pluskota für die Bereitstellung von Aedes Albopictus Eier und Olli Vapalahti für Bereitstellung den Virus bestand. ML wurde von der Leibniz-Gemeinschaft unterstützt; Nummer Säge-2014-SGN-3 zu gewähren.
Inject+matic Sleeper | Inject+matic | ||
Bugdorm-1 Insect Rearing Cage | BugDorm Store | ||
Drosophila cultivation tubes | carl roth | PK11.2 | plastic vial for mosquitoes |
Plug for drosophila cultivation tubes | carl roth | PK15.1 | |
Constant climate chamber | Binder | KBF-240 | |
Blood | banked human blood, expired, not usable for medical application | ||
Dumont-Pincette Electronic SS | Dumont | B40c | |
Vero cells | BNITM | ||
Flash light aspirator | Bioquip | 2809 | |
double-sided adhesive tape | no specific provider | ||
Gammex Powder-free gloves with AMT | Ansell | for safety reasons necessary during work with pricks in the BSL3 laboratory | |
RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit | altona diagnostics | 591013 | |
MagMax Pathogen RNA/DNA Kit | Thermo fisher scientific | 4462359 | RNA isolation of mosquito bodies |
Qiamp viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52906 | RNA-Isolation of supernatant |
filter tips (20 µL) | Sarstedt | 701,116,210 | Cut the first 3 mm of the tip |
hand motor mixer | carl roth | sold out | |
micro pestles for hand motor mixer | carl roth | CXH8.1 | |
DMEM | P0403550 | ||
L Glutamine Penicilin/Streptomycin | PAN | P0819100 | |
Amphotericin B | PAN | P06-0110 | |
Fructose | carl roth | 4981.5 | |
Phosphate buffered saline | PAN | P04-36500 | |
FBS | PAN | ||
Sodium Pyruvat | PAN | P0443100 | |
MEM NAA | PAN | P0832100 | |
Hemotek Feeder | Hemotek | PS6 | |
Light Cycler | Roche | 480 II | |
Light Cycler Software | Roche | 480 SW 1.5.1 | |
Modeling clay | no specific provider | ||
King Fisher Flex Purification System | ThermoFisher scientific | ||
Aedes albopictus | eggs were collected in Freiburg, Germany | ||
Binocular | MOTIC | SMZ-168 | |
Binocular light | MOTIC | MLC-150C | |
CO2-Incubator | Thermo scientific | MIDI 40 |