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Biology

एक विधि के रूप में मजबूर लार मच्छरों की वेक्टर क्षमता का विश्लेषण करने के लिए

doi: 10.3791/57980 Published: August 7, 2018
* These authors contributed equally

Summary

मच्छर जनित वायरस संचरण के कुशल नियंत्रण के लिए, संबंधित मच्छरों के वेक्टर क्षमता का ज्ञान विशेष रुचि का है । हम एक विधि के रूप में मजबूर लार का वर्णन करने के लिए एडीज albopictus की वेक्टर क्षमता का विश्लेषण और Zika वायरस के संचरण के लिए तीन अलग Culex taxa ।

Abstract

वेक्टर क्षमता एक मच्छर प्रजातियों के एक हड्डीवाला मेजबान के लिए एक मच्छर जनित वायरस (mobovirus) संचारित करने की क्षमता के रूप में परिभाषित किया गया है । व्यवहार्य वायरस कणों एक संक्रमित मच्छर की लार के माध्यम से एक रक्त भोजन के दौरान प्रेषित कर रहे हैं । मजबूर लार परख एकल मच्छरों के आधार पर वेक्टर क्षमता का निर्धारण करने की अनुमति, पशु प्रयोगों के उपयोग से परहेज । विधि समय की एक छोटी अवधि के भीतर एक प्रयोग में मच्छरों की एक बड़ी संख्या का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त है । मजबूर लार परख के लिए ८५६ व्यक्तिगत जर्मनी में फंसे मच्छरों का विश्लेषण, दो अलग Culex pipiens pipiens के रूप में, Culex torrentium के रूप में अच्छी तरह के रूप में एडीज albopictus, जो प्रयोग से संक्रमित थे शामिल किया गया Zika वायरस (ZIKV) और दो और तीन सप्ताह के लिए 18 डिग्री सेल्सियस या 27 डिग्री सेल्सियस पर मशीन के साथ । परिणाम ZIKV के लिए अलग Culex taxa के सदिश क्षमता की कमी का संकेत दिया । इसके विपरीत, एडीज albopictus ZIKV के लिए अतिसंवेदनशील था, लेकिन केवल 27 डिग्री सेल्सियस पर, एक एडीज aegypti प्रयोगशाला कॉलोनी के समान संचरण दरों के साथ समानांतर में परीक्षण किया ।

Introduction

२०१५ में, Zika वायरस (ZIKV), एक मच्छर जनित वायरस (mobovirus) परिवार Flaviviridae से संबंधित , कोलंबिया और ब्राजील में उभरा और अमेरिका और कैरेबियन में तेजी से फैल गया, जुड़े की उल्लेखनीय संख्या के साथ एक महामारी के कारण microcephaly और Guillain के नैदानिक मामलों – Barré सिंड्रोम1. प्रजातियों के मच्छर एडीज aegypti और एडीज albopictus ZIKV2के प्राथमिक और माध्यमिक वैक्टर माना जाता है, लेकिन जीनस एडीज की अन्य प्रजातियों को भी प्रयोगात्मक सदिश क्षमता 3 साबित कर दिया है . एडीज प्रजातियों के विपरीत, अब तक परीक्षण Culex प्रजातियों में से अधिकांश वायरस4संचारित करने में सक्षम नहीं हैं । केवल, Culex quinquefasciatus के लिए डेटा अनिर्णायक परिणाम3प्रदान की है । वर्तमान में, जानकारी ZIKV के लिए मच्छर वेक्टर क्षमता पर उदारवादी तापमान शर्तों के तहत कमी है (< 20 ° c) । हालांकि, यह जानकारी इस तरह के मध्य यूरोप के रूप में शीतोष्ण जलवायु के साथ क्षेत्रों के लिए संभव फैलता के जोखिम आकलन के लिए पर्याप्त है ।

ZIKV के लिए एक सक्षम वेक्टर प्राप्त करने, बनाए रखने, बढ़ाना और अंत में वायरस संचारित करने में सक्षम है । इसलिए, मच्छर निकायों या शरीर के कुछ हिस्सों, पैर, midgut, सिर या लार ग्रंथियों सहित परीक्षण, ZIKV के लिए वेक्टर क्षमता निर्धारित करने के लिए पर्याप्त नहीं है । यह जारी लार के भीतर संक्रामक वायरस कणों के लिए परीक्षण करने के लिए अनिवार्य है । वेक्टर क्षमता का आकलन करने के लिए, दोनों संक्रमण दर (आईआर, engorged मच्छरों की संख्या प्रति ZIKV-सकारात्मक मच्छर निकायों की संख्या) और संचरण दर (TR, ZIKV के साथ मच्छरों की संख्या-ZIKV पॉजिटिव मच्छर निकायों की संख्या प्रति सकारात्मक लार), होना करने के लिए है निर्धारित. आईआरएस मच्छरों की आसानी से बस अनुमन्य मच्छरों द्वारा पीछा किया जा सकता है एक रिवर्स transcriptase वास्तविक समय पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (RT-qPCR) लक्ष्यीकरण ZIKV । इसके अलावा, संक्रमण मच्छर प्रति वायरल प्रति संख्या का निर्धारण करके आगे की विशेषता हो सकती है । इसके विपरीत, संचरण दरों के विश्लेषण व्यक्तिगत मच्छरों की लार में व्यवहार्य वायरस कणों का पता लगाने पर निर्भर करता है । यह अतिसंवेदनशील मेजबान पशुओं पर संक्रमित मच्छरों की खिला द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, viremia के विश्लेषण के बाद मेजबान5में । हालांकि, इस विधि उपयुक्त मॉडल जीवों पर निर्भर करता है, और महंगा है और पशु कल्याण नियमों द्वारा प्रतिबंधित है । संचरण दरों के विश्लेषण के लिए प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग से बचने के लिए और लागत को कम करने के लिए रक्त की बूंदों का उपयोग कर कृत्रिम पुनः खिला प्रणालियों6बताया गया है । हालांकि, व्यक्तिगत पैमाने पर व्यक्तियों की एक उच्च संख्या के साथ संयुक्त परीक्षण मुश्किल और समय लेने वाली है । व्यक्तिगत पैमाने पर एक लार परख का पहला विवरण १९६६7 में प्रकाशित किया गया था और हाल के वर्षों के दौरान, मजबूर लार प्रयोगों पसंद की विधि के लिए3मच्छरों के वेक्टर क्षमता का मूल्यांकन हो गया है,8 .

हमारे वेक्टर मध्य यूरोपीय हाल ही में प्रकाशित मच्छरों के क्षमता अध्ययन के आधार पर9, हम लार मजबूर के रूप में एंडरसन एट अलद्वारा रिपोर्ट का वर्णन । 8 कुछ संशोधनों के साथ । इस विधि उच्च सुरक्षा स्तर की स्थिति (बीएसएल-3) के तहत उच्च प्रवाह मानकीकृत प्रयोगों की अनुमति देता है और सेल संस्कृति आधारित परख द्वारा सक्रिय वायरस की पहचान भी शामिल है । यहां बताए गए प्रयोगों में ८५६ मच्छर शामिल हैं । वे कृत्रिम रक्त भोजन द्वारा ZIKV से संक्रमित थे और बाद में लार में संक्रामक वायरस कणों की उपस्थिति के लिए विश्लेषण किया । इस मच्छरों के प्रयोगों में शुरू की दो लंबे समय एई की प्रयोगशाला आबादी की स्थापना की । aegypti और Culex pipiens pipiens molestus (Cx. पी. molestus), साथ ही साथ फील्ड पकड़ा Culex pipiens pipiens pipiens (Cx. पी. pipiens), Culex torrentium (Cx.torrentium) और दो एई. albopictus आबादी । दो एई. albopictus आबादी है , जो इटली में एकत्र किया गया था में से एक के अपवाद के साथ, सभी मच्छरों जर्मनी में एकत्र किए गए ।

Protocol

1. मादा मच्छरों को तैयार करें

  1. एक बड़े पिंजरे से एक aspirator का उपयोग करके मच्छरों इकट्ठा (लगभग ४०० बड़े पिंजरे प्रति मच्छरों) ।
  2. 7 एस के लिए कार्बन डाइऑक्साइड (CO2) के साथ मच्छरों को Anesthetize ।
  3. सॉर्ट 20 मादा प्रति प्लास्टिक की शीशी (Ø ५० mm × १०० mm) ।
    नोट: यदि मच्छरों जाग, एक और 3 CO 2 के एस का उपयोग करें
  4. रात भर मच्छरों का भूखा रहना ।

2. कृत्रिम रक्त भोजन

नोट: सभी कदम बीएसएल-3 शर्तों के तहत किया जाता है ।

  1. संक्रामक रक्त भोजन तैयार करते हैं ।
    1. 1 x 108 पट्टिका बनाने इकाइयों (PFU)/mL. की एकाग्रता के लिए वायरस स्टॉक पतला
      नोट: स्टॉक एकाग्रता ऊतक संस्कृति संक्रमण खुराक ५० विधि (TCID50) प्रदर्शन और स्पीमरन और Kärber एल्गोरिथ्म10,11द्वारा गणना द्वारा निर्धारित किया गया था ।
    2. मिश्रण समाप्त मानव रक्त (रक्त संरक्षण) रक्त बैंक से (मानव के लिए अब उपयुक्त नहीं है, लेकिन मच्छरों के लिए उपयोगी) फ्रुक्टोज के साथ (8% समाधान), निस्पंदन गोजातीय सीरम (FBS) और वायरस स्टॉक के काम समाधान (समाप्त हो गई मानव रक्त: फ्रुक्टोज: FBS: समाधान कार्य = 5:3:1:1) ।
      नोट: हम मानव रक्त चुना है, क्योंकि यह ZIKV के ज्ञात प्राकृतिक स्तनधारी मेजबान है ।
  2. फ्रीज १४० µ TCID50 के माध्यम से आगे विश्लेषण के लिए रक्त भोजन मिश्रण के एल ।
  3. विभिन्न खिला तरीकों का उपयोग करके कृत्रिम खिलाने, प्रजातियों के आधार पर प्रदर्शन:
    1. एडीज aegypti: 30 मिनट (फीडर प्रति 1 मिलीलीटर) के लिए एक झिल्ली खिला प्रणाली का प्रयोग करें ।
    2. Culex एसपीपी.: एक कपास रात भर छड़ी के माध्यम से संक्रामक रक्त उपलब्ध कराने और रक्त (३०० µ एल प्रति शीशी) गर्म नहीं है ।
    3. एडीज albopictus: प्लास्टिक की शीशी में रक्त भोजन मिश्रण की दो बूंदें (५० µ l प्रत्येक) रखें और मच्छरों को 2 एच के लिए खिला दें । खून को गर्म न करें ।
      नोट: मच्छरों को पहले 15 मिनट में फीड करेंगे । लंबे समय तक मशीन सुरक्षा कारणों के कारण आवश्यक है । रक्त की बूंदों 2 ज के बाद सूखा रहे हैं, इस प्रकार दूषित जोखिम खिलाया मच्छरों की छंटाई के दौरान कम हो जाता है ।
  4. Anesthetize के साथ मच्छरों को2 के लिए 7 एस ।
    नोट: यदि मच्छरों जाग, एक और 3 CO2के एस का उपयोग करें ।
  5. क्रमबद्ध करें और एक नई शीशी में पूरी तरह से engorged मच्छरों गिनती ।
  6. एक सूती पैड जोड़ें, शीशी और एक प्लग के बीच फ्रुक्टोज (8% समाधान) के साथ संतृप्त ।
  7. 14 या 21 दिनों के लिए ८०% की आर्द्रता में 18 ° c या 27 ° c के निर्दिष्ट तापमान पर मच्छरों रखें ।
  8. फ्रुक्टोज-संतृप्त सूती पैड के साथ मच्छरों को खिलाएं । प्रति शीशी (20 मच्छरों, खिला दर पर निर्भर करता है, चरण २.५) को देखने के फ्रुक्टोज (8% समाधान) के १.५ मिलीलीटर के साथ हर ७२ एच भरपाई ।

3.14 या 21 दिन पर मजबूर लार परख

नोट: सभी कदम बीएसएल-3 शर्तों के तहत किया जाता है ।

  1. बीज 2 x 104 वीरो कोशिकाओं/विकास माध्यम के २०० µ एल के साथ एक ९६ अच्छी तरह से थाली में (Dulbecco ´ एस संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 3% FBS के साथ पूरक, १०० यू/एमएल पेनिसिलिन, १०० mg/एमएल streptomycin, 5 µ जी/एमएल amphotericin बी, 2 एमएम एल-glutamine , 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (NEAA), 1% सोडियम पाइरूवेट) ।
  2. लार डिवाइस तैयार करें:
    1. 30 ° के एक कोण में बेंच पर एक वर्गित ग्लास प्लेट (20 × 20 सेमी) रखें ।
      नोट: यह सुरक्षा प्रयोगशाला में दबाव के कारण आवश्यक है । यदि प्लेट क्षैतिज या ऊर्ध्वाधर है, तरल रिसाव होगा ।
    2. जगह कांच की थाली के शीर्ष पर डबल पक्षीय चिपकने वाला टेप ।
    3. भूमिका मॉडलिंग क्ले जब तक यह ०.५ सेमी की एक व्यास तक पहुंच जाता है और यह क्षैतिज 1 सेमी दूर डबल पक्षीय चिपकने वाला टेप से देते हैं ।
    4. एक 10 µ एल फिल्टर टिप के टिप के पहले ०.३ सेमी कट ।
      नोट: यह करने के लिए इस तैयारी की सलाह दी जाती है के बाहर प्रयोग शुरू करने से पहले सुरक्षा प्रयोगशाला ।
    5. 10 µ एल के साथ फ़िल्टर युक्तियां भरें फास्फेट बफर खारा (पंजाब, पीएच ७.४) ।
    6. चिपचिपा टेप की ओर टिप के साथ मॉडलिंग क्ले पर फिल्टर युक्तियां प्लेस ।
    7. कोमल दबाव के साथ फिल्टर सुझावों को सुरक्षित ।
  3. मच्छरों को तैयार करें:
    1. सीओ2के साथ मच्छरों को Anesthetize ।
    2. मच्छरों को भगाने के लिए पैरों और पंखों को हटा दें ।
    3. एक फिल्टर टिप के ऊपर चिपचिपा टेप पर रहने वाले मच्छर निकायों को ठीक करें ।
    4. सूंड धीरे फिल्टर टिप में जगह है ।
    5. 30 मिनट के लिए लार परख भागो ।
    6. फ़िल्टर युक्तियां निकालें और मिट्टी और टेप त्यागें ।

4. लार का प्रसंस्करण

नोट: चरण 4.1 – 4.6.2 बीएसएल-3 शर्तों के तहत किया जाता है ।

  1. की प्रतिक्रिया ट्यूब में सामग्री निष्कासित 10 µ पंजाब के एल ।
  2. धीरे मिश्रण और तैयार ९६ के कुओं में सामग्री हस्तांतरण अच्छी तरह से नमूना प्रति अच्छी तरह से एक का उपयोग कर थाली ।
  3. 5% सह2के साथ ३७ ° c पर 7 दिनों के लिए थाली मशीन ।
  4. cytopathic प्रभाव (सीपीई) की उपस्थिति के लिए कोशिकाओं की जांच करने के लिए दूरबीन का प्रयोग करें ।
  5. अच्छी तरह से सीपीई के लिए सकारात्मक है, तो आरएनए निष्कर्षण के लिए एक प्रतिक्रिया ट्यूब में pipetting १४० µ एल द्वारा supernatant फसल ।
  6. एक आरएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करके आरएनए शुद्ध.
    1. मिश्रण AVL बफर के ५६० µ एल के साथ supernatant के १४० µ एल (वायरल lysis बफर) और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मशीन ।
    2. इथेनॉल के ५६० µ एल जोड़ें (९६%) और भंवर नमूना ।
      नोट: नमूने इस कदम के बाद निष्क्रिय कर रहे हैं और बीएसएल-3 प्रयोगशाला से बाहर डिस्चार्ज किया जा सकता है ।
    3. प्लास्टिक ६३० µ एक कॉलम पर नमूना के एल और 1 मिनट के लिए ६,००० x g के साथ केंद्रापसारक ।
    4. छोड़ो छानने का प्लास्टिक, कॉलम पर शेष ६३० µ एल और दोहराने के केंद्रापसारक ।
    5. आरएनए धो, स्तंभ की झिल्ली से बंधे, स्तंभ के लिए 1 धोने बफर के ५०० µ एल जोड़कर और 1 मिनट के लिए ६,००० x g पर केंद्रापसारक ।
    6. संग्रह ट्यूब छोड़ें और स्तंभ को एक नए संग्रह ट्यूब में रखें । जोड़ें ५०० µ एल धोने बफर 2 और 3 मिनट के लिए १२,५०० x g पर केंद्रापसारक ।
    7. संग्रह ट्यूब छोड़ें और स्तंभ को एक १.५ मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में रखें ।
    8. रेफरेंस बफर के ५० µ एल जोड़ें और कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए मशीन ।
    9. 1 मिनट के लिए ६,००० x g पर केंद्रापसारक और फिर कॉलम त्यागें ।
  7. RT-qPCR के माध्यम से ZIKV आरएनए के लिए नमूनों का विश्लेषण.

5. मच्छरों के शवों का प्रसंस्करण

नोट: चरण 5.1 – 5.5 बीएसएल-3 शर्तों के तहत किया जाता है ।

  1. मच्छर के शरीर को निकालें और एक प्रतिक्रिया ट्यूब में जगह प्रत्येक शरीर ।
    नोट: यह इस बिंदु पर प्रयोग को थामने के लिए संभव है और-८० डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान.
  2. प्रतिक्रिया ट्यूब में homogenization मीडिया (किसी भी पूरक के बिना DMEM) के ५०० µ एल जोड़ें ।
  3. हाथ मोटर मिक्सर का उपयोग कर शरीर Homogenize और हर नमूने के लिए एक नया pistil का उपयोग करें ।
  4. शुद्धि के लिए एक ९६-अच्छी तरह से थाली में homogenate के २०० µ एल जोड़ें ।
    नोट: यह इस बिंदु पर प्रयोग को थामने के लिए संभव है और-८० डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान.
  5. ६० डिग्री सेल्सियस पर ६० मिनट के लिए मशीन द्वारा प्लेट को निष्क्रिय ।
  6. स्वचालित न्यूक्लिक एसिड शुद्धि द्वारा आरएनए शुद्ध ।
    नोट: यह इस बिंदु पर प्रयोग को थामने के लिए संभव है और-८० डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान.

6. विश्लेषण

  1. आरटी-qPCR का उपयोग कर वायरल आरएनए प्रतियां बढ़ाता है ।
    नोट: आरएनए प्रतियां सभी ZIKV पॉजिटिव मच्छर निकायों पर और ZIKV-नकारात्मक मच्छरों सहित बिना औसत थे ।
  2. आईआर की गणना, फेड महिलाओं की संख्या के अनुसार ZIKV पॉजिटिव मच्छर निकायों की संख्या के रूप में परिभाषित किया ।
  3. TR की गणना, ZIKV के साथ मच्छरों की संख्या के रूप में परिभाषित-ZIKV पॉजिटिव मच्छर निकायों की संख्या प्रति सकारात्मक लार. कोई ZIKV-धनात्मक निकायों के साथ प्रजातियों-तापमान संयोजनों के लिए संचरण दर की गणना नहीं की जा सकी ।

Representative Results

एडीज aegypti के लिए एक सक्षम सदिश के रूप में जाना जाता है ZIKV के लिए उष्णकटिबंधीय जलवायु की स्थिति12कम । इसलिए, हम एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में एई. aegypti इस्तेमाल के लिए परख स्थापित करने और आईआरएस विश्लेषण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से 27 डिग्री सेल्सियस और ८०% की नमी के एक मशीन तापमान पर टीआरएस । IR और TR पहले Fortuna एट अलद्वारा वर्णित के रूप में परिभाषित किया गया । 13. चुनौती दी एई. aegypti ५०% और ७२% और ४२% और 14 और 21 दिनों के बाद संक्रमण (डीपीआई), क्रमशः (आंकड़ा 1a और 1b) में 31% के एन आर के आईआर दिखाया । बाद में, यूरोपीय मच्छरों ZIKV संक्रमण और उष्णकटिबंधीय का उपयोग कर के रूप में अच्छी तरह से शीतोष्ण जलवायु परिस्थितियों संचरण के लिए परीक्षण किया गया ।

27 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर, सभी मच्छर प्रजातियों में 14 डीपीआई के साथ ही 21 डीपीआई पर ZIKV संक्रमण दिखाया, Cx. p. pipiens और Cx. torrentium व्यक्तियों को छोड़कर, जो केवल 14 डीपीआई पर सकारात्मक थे । सभी एडीज प्रजातियों उच्च आईआरएस दिखाया (५०% और ७२% के बीच) के रूप में अच्छी तरह से उच्च वायरल आरएनए एकाग्रता (106 तक 109 आरएनए प्रतियां/मच्छर नमूनों) की तुलना में अलग Culex taxa है, जो 0 के बीच लेकर आईआरएस पता चला % और ३२% और वायरल लोड 103 से 104 आरएनए प्रतियां/ सभी एडीज प्रजातियों ZIKV प्रदर्शित-सकारात्मक लार (TR 13-42%), जबकि Culex taxa से लार के नमूनों में से कोई भी निहित ZIKV (आंकड़ा 1a और 1b) । दिलचस्प है, 21 डीपीआई पर संचरण दरों में इसी तरह थे ae. aegypti और ae. albopictus जर्मनी से (30%), लेकिन थे काफी कम एई. albopictus में इटली से (13%) ।

18 ° c के एक उदारवादी तापमान पर चुनौती दी मच्छरों की मशीन एडीज प्रजातियों में आम तौर पर कम वायरस भार से पता चला (104– 106 आरएनए प्रतियां/साथ ही अलग Culex taxa में (102 –104 आरएनए प्रतियां/ हालांकि, 18 डिग्री सेल्सियस की मशीन तापमान पर, ZIKV के संचरण की जांच की मच्छर प्रजातियों में से किसी के लिए नहीं देखा गया था ।

Figure 1
चित्रा 1: ZIKV के साथ प्रयोग से संक्रमित मच्छरों की संचरण दरों । विभिंन मच्छर प्रजातियों में ZIKV के साथ वेक्टर क्षमता अध्ययन के परिणाम । छह अलग मच्छर taxa ZIKV से संक्रमित थे और 27 ° c या 14 () या 21 () दिनों के लिए 18 ° c पर मशीन । TR ZIKV पॉजिटिव मच्छर निकायों की संख्या के प्रति ZIKV-सकारात्मक लार के साथ मच्छरों की संख्या के रूप में परिभाषित किया गया है । जांच की मच्छरों की कुल संख्या ८५६ था, हर बार बिंदु के लिए 30 व्यक्तियों की एक ंयूनतम के साथ/तापमान/ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

यह पहले से दिखाया गया है कि परिणाम मजबूर लार के साथ प्राप्त शास्त्रीय पुनः खिला प्रयोगों6के साथ लाइन में हैं । हालांकि, दोनों फिर से खिला प्रयोगों में और हमारे प्रस्तुत विधि में मजबूर लार, यह असंभव है सीधे सबूत लार गतिविधि या लार की रिहाई की निगरानी । लार गतिविधि साबित करने के लिए, नमूनों लार (जैसे, प्रोटीन, कार्बोहाइड्रेट, आदि) में मौजूद अन्य घटकों के लिए परीक्षण किया जा सकता है । इसके अलावा, अतिरिक्त qPCRs वायरल आरएनए प्रतियां का पता लगाने की अनुमति होगी । यह, तथापि, विभिंन विश्लेषण के लिए लार के नमूनों के बंटवारे की आवश्यकता है, जो बहुत कम कण संख्या के मामले में सेल संस्कृति परख में संवेदनशीलता को सीमित कर सकते हैं । बदले में, यह निर्धारित संचरण दरों के एक अनुमान के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।

reproducible परिणामों के लिए यह सुनिश्चित करना आवश्यक है कि प्रयोग के अंत तक सभी मच्छर जीवित रहें । यह नेत्रहीन मच्छरों के शरीर आंदोलन गतिविधि की निगरानी द्वारा नियंत्रित किया जाता है । इसके अलावा, एक दिया मच्छर प्रजातियों के लिए लार परख के सिद्धांत का उपयोग नियंत्रण वायरस, जो इस विशिष्ट मच्छर प्रजातियों द्वारा प्रेषित किया जाना जाता है खिला द्वारा परीक्षण किया जाना है । इसके विपरीत, हर वायरस एक प्रयोग में पेश करने के लिए एक अतिसंवेदनशील मच्छर में परीक्षण किया जाना है ।

मजबूर लार परख कई फायदे हैं । मच्छरों की उच्च संख्या पशु कल्याण विनियम9के साथ परस्पर विरोधी बिना नियंत्रित मानकीकृत शर्तों के तहत एक एकल नमूना आधार पर एक साथ परीक्षण किया जा सकता है ।

विधि कई प्रयोगशालाओं द्वारा प्रयोग किया जाता है । हालांकि, सटीक setups अलग हो सकता है, जो प्रयोगशालाओं के बीच परिणामों में अंतर करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । एक महत्वपूर्ण घटक लार, जो गिलास14 या प्लास्टिक15से बनाया जा सकता है इकट्ठा करने के लिए केशिका है । एक के उच्च सुरक्षा नियमों का अनुपालन करने के लिए एक सुरक्षा 3 कीट स्तर, हम बजाय कांच केशिकाओं के प्लास्टिक फिल्टर सुझावों का इस्तेमाल किया, इस प्रकार चोटों के जोखिम को कम करने. इसके अलावा, फिल्टर सुझावों का लाभ है कि एकत्र तरल आसानी से एक पिपेट का उपयोग कर स्थानांतरित किया जा सकता है ।

मजबूर लार यहां प्रस्तुत परख के सेटअप दो एक साथ काम कर रहे जांचकर्ताओं और साझा करने के कर्तव्यों पर आधारित है । मच्छर के मैटीरियल एक व्यक्ति द्वारा किया जाता है, जबकि दूसरे एक साथ मजबूर लार सेटअप तैयार करता है । यह काफी समय से निपटने कम कर देता है और के रूप में स्थिरीकरण-कार्यस्थल और लार-प्लेट आवश्यक नहीं है के बीच बदलने के रूप में नमूना स्विचन के जोखिम को कम करता है । इसके अलावा, यह मजबूर लार डिवाइस पर मच्छरों के तुरंत जमावड़े के बाद रखने की अनुमति देता है । इस जगह कम मच्छर हैंडलिंग समय सफल मजबूर लार के लिए आवश्यक है । अन्त में, मच्छरों के पूरे प्रयोग भर गतिशीलता के लिए सीधे निगरानी की जा सकती है.

यहां प्रस्तुत लार परख मच्छर प्रजातियों के वेक्टर क्षमता में अंतर्दृष्टि लाभ के लिए प्रयोग किया जाता है । हालांकि, कुछ अंय विशिष्ट प्रश्नों का उत्तर देने के लिए (जैसे, मच्छर के काटने की संख्या है कि रीढ़ को संक्रमित करने की जरूरत है), पशु प्रयोगों अभी भी आवश्यक हो सकता है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम धंयवाद एला Weinert, मिशेल पतवार और मारलीस Badusche उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए, जेसिका Börstler Culex मच्छरों के विश्लेषण के लिए, Norbert बेकर और Björn Pluskota के लिए एडीज albopictus अंडे और ोली Vapalahti प्रदान करने के लिए वायरस स्टॉक प्रदान करना. एमएल लाइबनिट्स एसोसिएशन द्वारा समर्थित किया गया था; अनुदान संख्या देखा-२०१४-SGN-3.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inject+matic Sleeper Inject+matic
Bugdorm-1 Insect Rearing Cage BugDorm Store
Drosophila cultivation tubes carl roth PK11.2 plastic vial for mosquitoes
Plug for drosophila cultivation tubes carl roth PK15.1
Constant climate chamber Binder KBF-240
Blood banked human blood, expired, not usable for medical application
Dumont-Pincette Electronic SS Dumont B40c
Vero cells BNITM
Flash light aspirator Bioquip 2809
double-sided adhesive tape no specific provider
Gammex Powder-free gloves with AMT Ansell for safety reasons necessary during work with pricks in the BSL3 laboratory
RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit altona diagnostics 591013
MagMax Pathogen RNA/DNA Kit Thermo fisher scientific 4462359 RNA isolation of mosquito bodies
Qiamp viral RNA Mini Kit Qiagen 52906 RNA-Isolation of supernatant
filter tips (20 µL) Sarstedt 701,116,210 Cut the first 3 mm of the tip
hand motor mixer carl roth sold out
micro pestles for hand motor mixer carl roth CXH8.1
DMEM P0403550
L Glutamine Penicilin/Streptomycin PAN P0819100
Amphotericin B PAN P06-0110
Fructose carl roth 4981.5
Phosphate buffered saline PAN P04-36500
FBS PAN
Sodium Pyruvat PAN P0443100
MEM NAA PAN P0832100
Hemotek Feeder Hemotek PS6
Light Cycler Roche 480 II
Light Cycler Software Roche 480 SW 1.5.1
Modeling clay no specific provider
King Fisher Flex Purification System ThermoFisher scientific
Aedes albopictus eggs were collected in Freiburg, Germany
Binocular MOTIC SMZ-168
Binocular light MOTIC MLC-150C
CO2-Incubator Thermo scientific MIDI 40

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Heitmann, A., Jansen, S., Lühken, R., Leggewie, M., Schmidt-Chanasit, J., Tannich, E. Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes. J. Vis. Exp. (138), e57980, doi:10.3791/57980 (2018).More

Heitmann, A., Jansen, S., Lühken, R., Leggewie, M., Schmidt-Chanasit, J., Tannich, E. Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes. J. Vis. Exp. (138), e57980, doi:10.3791/57980 (2018).

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