Virüs iletim kaynaklı sivrisinek verimli kontrol ilgili sivrisinekler vektör potansiyelini bilgisine özel ilgi içindir. Biz zorla salya vektör yetkinlik Aedes albopictus ve üç farklı Culex takson Zika virüs iletimi için analiz etmek için bir yöntem olarak tanımlamak.
Vektör yetkinlik bir sivrisinek yoluyla bulaşan virüs (mobovirus) omurgalı bir ana bilgisayara iletmek için potansiyel bir sivrisinek türün olarak tanımlanır. Uygun virüs parçacıkları virüslü bir sivrisinek tükürük yoluyla kan yemek sırasında iletilir. Zorla salya deneyleri tek sivrisinekler, hayvan deneyleri kullanımı kaçınarak temelinde vektör potansiyeli belirleme sağlar. Sivrisinekler bir deneyde kısa bir süre içinde çok sayıda analiz etmek uygun bir yöntemdir. Zorla salya deneyleri 856 bireysel sivrisinekler de dahil olmak üzere iki farklı Almanya’da tuzağa çözümlemek için kullanılan Culex pipiens pipiens biotypes, Culex torrentium yanı sıra deneysel olarak enfekte Aedes albopictus, Zika virüsü (ZIKV) ve 18 ° C veya 27 ° C iki ve üç hafta boyunca inkübe. Sonuçlar farklı Culex özellikleri vektör yetkinlik eksikliği için ZIKV belirtti. Buna ek olarak, Aedes albopictus duyarlı ZIKV için ama sadece 27 ° C’de, iletim hızları benzer şekilde paralel olarak test bir Aedes aegypti laboratuvar kolonisi ile.
2015 yılında, Zika virüs (ZIKV), Flaviviridae, Columbia ve Brezilya ortaya çıktı ve bir salgın ile dikkate değer sayıda neden Amerika ve Karayipler, arasında hızla yayıldı ailesine ait olan sivrisinek yoluyla bulaşan bir virüs (mobovirus) ilişkili klinik durumlarda microcephaly ve Guillain-Barré sendromu1. Sivrisinekler Aedes aegypti ve Aedes albopictus türlerin birincil ve ikincil vektörel çizimler ZIKV2kabul edilir ama Aedes diğer türü de deneysel vektör yeterlilik3 var kanıtlanmıştır . Aedes tür aksine şimdiye kadar test Culex türlerin çoğu virüs4iletimi mümkün değildir. Sadece, Culex quinquefasciatus için verileri kesin sonuçları3sağlanan. Şu anda, bilgileri sivrisinek vektör yetkinlik üzerinde ZIKV için orta sıcaklık koşullarında bulunmamaktadır (< 20 ° C). Ancak, bu bilgiler Orta Avrupa gibi ılıman iklime sahip bölgelerde mümkün yayılır risk değerlendirmesi için önemli olur.
ZIKV için yetkili bir vektör elde etmek, korumak, yükseltmek ve son olarak virüs iletimi yapabiliyor. Bu nedenle, sivrisinek organları veya ceset parçalarını test, bacaklar, midgut, ya da tükürük bezleri, ZIKV için de dahil olmak üzere vektör yetkinlik belirlemek yeterli değildir. Bulaşıcı virüs parçacıkları yayımlanan tükürük içinde sınamak için zorunludur. Vektör yetki değerlendirmek için enfeksiyon oranını (IR, ZIKV pozitif sivrisinek ceset sayısına göre tıkanmış sivrisinekler sayısı) ve iletim hızı (TR, sivrisinek ZIKV pozitif tükürük sayısına göre ZIKV-pozitif sivrisinek organları ile sayısı), olmak zorunda belirledi. IRS sivrisinek kolayca ters transkriptaz gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) tarafından takip sadece homojenizasyon sivrisinekler tarafından analiz ZIKV hedefleme. Ayrıca, enfeksiyon daha fazla sivrisinek başına viral kopya numaraları belirlenerek karakterize edilebilir. Buna ek olarak, iletim hızları Analizi uygun virüs parçacıkları bireysel sivrisinekler tükürük içinde tespiti kullanır. Bu virüslü sivrisinek viremi5ana bilgisayar analizini ardından duyarlı ana bilgisayar hayvanlar üzerinde besleme tarafından sağlanabilir. Ancak, bu yöntem uygun model organizmalar üzerinde dayanır ve pahalı ve hayvan refahı düzenlemeleri tarafından kısıtlanmış. İletim hızları analiz etmek için Laboratuvar hayvanlarının kullanımını önlemek ve maliyetleri azaltmak için yapay besleme sistemleri yeniden kan damlacıkları olmuştur kullanarak6açıklanır. Ancak, bireysel ölçekte yüksek sayisi ile kombine test zor ve zaman alıcı. Son yıllarda zorla salya deneyler sivrisinekler3,8 vektör yetki değerlendirmek için seçtiğiniz yöntemi haline gelmiştir ve bireysel ölçekte bir salya testin ilk açıklama 19667 ‘ de yayınlanan .
Temel, Orta Avrupa bizim vektör yetkinlik çalışma sivrisinekler son zamanlarda9yayınladı, Anderson ve arktarafından belirlendiği şekilde zorla salya tarif. 8 bazı değişikliklerle. Bu yöntem, standart yüksek işlem hacmi yüksek Biyogüvenlik düzeyi koşullarda (BSL-3) deneysel ve aktif virüs tanımlaması hücre tabanlı kültürü deneyleri tarafından içerir sağlar. Burada açıklanan deneyler 856 sivrisinekler içerir. Onlar yapay kan yemek tarafından ZIKV ile enfekte olduğunu ve daha sonra tükürük bulaşıcı virüs parçacıkları varlığı için analiz. Culex oluşan deneyler iki köklü laboratuvar nüfus alanının yanı sıra Ae. aegypti ve Culex pipiens pipiens biotype molestus (Cx. s. molestus) tanıttı sivrisinekler yakaladı pipiens pipiens biotype pipiens (Cx. s. pipiens), Culex torrentium (Cx. torrentium) ve iki Ae. albopictus nüfus. İtalya’da toplanmıştır, iki Ae. albopictus nüfus, biri dışında tüm sivrisinekler Almanya’da toplanmıştır.
Daha önce zorla salya ile elde edilen sonuçların klasik yeniden beslenme deneyler6ile uyumlu olduğunu gösterilmiştir. Ancak, deneyler yeniden beslenme hem de zorla salya sunulan bizim Yöntem, doğrudan salya aktivite kanıt veya tükürük yayın izlemek imkansız. Diğer bileşenler tükürük sunmak için salya etkinliğini kanıtlamak için örnekleri test olabilir (Örn., proteinler, karbonhidratlar, vs.). Ayrıca, ek qPCRs viral RNA kopyaları algılama sağlayacak. Ancak, bu, duyarlılık durumunda çok düşük parçacık sayılar hücre kültür tahlil sınırlayabilir çeşitli analizler için tükürük örnekleri bölme gerektirir. Buna karşılık, bu kararlı iletim hızları bir küçümseme için neden olabilir.
Tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için tüm sivrisinekler deneme sonuna kadar hayatta kalmak emin olmak gereklidir. Bu görsel olarak sivrisinek vücut hareket etkinliğini izlemeye tarafından denetlenir. Ayrıca, bu belirli sivrisinek türlerin iletilmesi için bilinen kontrol virüs besleme tarafından test edilecek salya tahlil ilke kullanımı verilen sivrisinek türler vardır. Tersi, bir deney tanıttı her virüs duyarlı bir sivrisinek test edilmesi gerekiyor.
Zorla salya deneyleri pek çok avantajı var. Sivrisinekler sayısının fazlalığı aynı anda tek bir örnek kontrollü standart koşullar altında temel üzerinde hayvan refahı düzenlemeleri9ile çakışmadan test edilebilir.
Yöntemi birkaç laboratuvarları tarafından kullanılır. Ancak, tam kurulumları, hangi sonuçları farklılıkları laboratuvarlar arasında yol açabilir farklı olabilir. Cam14 veya plastik15yapılmış tükürük toplamak için kılcal bir kritik bileşenidir. Biyogüvenlik seviye 3 insectary yüksek güvenlik düzenlemeleriyle uyum sağlamak için biz plastik filtre ipuçları yerine cam kılcal, böylece yaralanma riskini azaltarak kullanılır. Ayrıca, filtre ipuçları toplanan sıvı kolayca bir pipet kullanarak transfer edilebilir avantajı var.
Burada sunulan zorla salya tahlil Kur üzerinde birlikte çalışma ve görev paylaşımı iki müfettişler dayanmaktadır. Diğer aynı anda zorla salya Kur hazırlanırken sivrisinek demobilizing bir kişi tarafından gerçekleştirilir. Bu önemli ölçüde işlem süresi azaltır ve riski en aza indirir örnek olarak değişen terhis İşyeri ve salya-plaka arasında geçiş gerekli değildir. Ayrıca, bu sivrisinekler zorla salya aygıtta hemen sonra terhis yerleştirerek sağlar. İşlem süresi oldukça kısa bu sivrisinek için başarılı Zorlanmış salya esastır. Son olarak, sivrisinekler doğrudan bütün deneyin boyunca hareketliliği için takip edilebilir.
Burada sunulan salya tahlil sivrisinek tür vektör potansiyelini anlayışlar kazanmak için kullanılmaktadır. Ancak, bazı belirli diğer soruları cevaplamak için (Örneğin., omurgalıların bulaştırmak için gerekli olan sivrisinek ısırıkları numaralarını), hayvan deneyleri hala gerekli olabilir.
The authors have nothing to disclose.
Biz Ella Weinert, Michelle Helms ve Marlis Badusche mükemmel teknik destek için analizleri Culex sivrisinekler, Jessica Börstler, Norbert Becker ve Björn Aedes albopictus yumurta ve Olli Vapalahti için sağlamak için Pluskota teşekkür ederim virüs hisse senedi sağlanması. ML Leibniz Derneği tarafından desteklenen; TESTERE-2014-SGN-3 verin.
Inject+matic Sleeper | Inject+matic | ||
Bugdorm-1 Insect Rearing Cage | BugDorm Store | ||
Drosophila cultivation tubes | carl roth | PK11.2 | plastic vial for mosquitoes |
Plug for drosophila cultivation tubes | carl roth | PK15.1 | |
Constant climate chamber | Binder | KBF-240 | |
Blood | banked human blood, expired, not usable for medical application | ||
Dumont-Pincette Electronic SS | Dumont | B40c | |
Vero cells | BNITM | ||
Flash light aspirator | Bioquip | 2809 | |
double-sided adhesive tape | no specific provider | ||
Gammex Powder-free gloves with AMT | Ansell | for safety reasons necessary during work with pricks in the BSL3 laboratory | |
RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit | altona diagnostics | 591013 | |
MagMax Pathogen RNA/DNA Kit | Thermo fisher scientific | 4462359 | RNA isolation of mosquito bodies |
Qiamp viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52906 | RNA-Isolation of supernatant |
filter tips (20 µL) | Sarstedt | 701,116,210 | Cut the first 3 mm of the tip |
hand motor mixer | carl roth | sold out | |
micro pestles for hand motor mixer | carl roth | CXH8.1 | |
DMEM | P0403550 | ||
L Glutamine Penicilin/Streptomycin | PAN | P0819100 | |
Amphotericin B | PAN | P06-0110 | |
Fructose | carl roth | 4981.5 | |
Phosphate buffered saline | PAN | P04-36500 | |
FBS | PAN | ||
Sodium Pyruvat | PAN | P0443100 | |
MEM NAA | PAN | P0832100 | |
Hemotek Feeder | Hemotek | PS6 | |
Light Cycler | Roche | 480 II | |
Light Cycler Software | Roche | 480 SW 1.5.1 | |
Modeling clay | no specific provider | ||
King Fisher Flex Purification System | ThermoFisher scientific | ||
Aedes albopictus | eggs were collected in Freiburg, Germany | ||
Binocular | MOTIC | SMZ-168 | |
Binocular light | MOTIC | MLC-150C | |
CO2-Incubator | Thermo scientific | MIDI 40 |